Untersuchungen zur intrauterinen
Geschlechtsfeststellung bei Feten kleiner Wiederkäuer mittels Ultrasonographie
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N
Zur Erlangung des Grades einer D o k t o r i n d e r V e t e r i n ä r m e d i z i n
( D r . m e d . v e t . )
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Daniela-Miriam Bürstel aus Düsseldorf
Hannover 2002
Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. Sabine Meinecke-Tillmann
1. Gutachter: PD Dr. Sabine Meinecke-Tillmann
2. Gutacher:
Tag der mündlichen Prüfung:
„Was bringt uns die Zukunft?“-
„Die Zukunft bringt uns gar nichts, wir müssen uns auf den Weg machen und herausfinden, was es für uns dort zu holen gibt.“
(Frau I. Corneli; ABI 2001)
Inhaltsverzeichnis
Seite
1 Einleitung
92 Literaturübersicht
112.1 Grundlagen der Ultrasonographie 11
2.2 Embryologie der äußeren Geschlechtsorgane 14 2.3 Anwendungsmöglichkeiten der bildgebenden
Ultrasonographie am Geschlechtsapparat kleiner
Wiederkäuer 19
2.3.1 Ovardiagnostik 19
2.3.2 Trächtigkeitsdiagnostik 21
2.3.3 Pathologische Uterusbefunde 24
2.3.4 Fetale Diagnostik 27
2.3.5 Geschlechtsdiagnostik 30
2.4 Weitere Methoden zur Geschlechtsfeststellung bei
kleinen Wiederkäuern und anderen Tierarten 32 2.4.1 Vorherbestimmung des Geschlechts der Spermien 32
2.4.2 Geschlechtsfeststellung an Embryonen 34
2.4.3 Bestimmung des fetalen Geschlechts nach Fruchtwasseraspiration
37 2.4.4 Geschlechtsfeststellung durch die Analyse fetaler Zellen im
maternalen Blut 38
2.5 Die ultrasonographische Geschlechtsdiagnostik bei
anderen Tierarten und dem Menschen 39 2.5.1 Die ultrasonographische Geschlechtsfeststellung beim Rind 39 2.5.2 Die ultrasonographische Geschlechtsfeststellung beim Pferd 40 2.5.3 Die ultrasonographische Geschlechtsfeststellung beim Menschen 42
3 Eigene Untersuchungen
453.1 Material und Methoden 45
3.1.1 Untersuchungen an graviden Uteri bzw. Feten von
Schlachtschafen im Wasserbad 45
3.1.2 Untersuchungen unter Versuchsbedingungen 46
3.1.2.1 Tiere 46
3.1.2.2 Ultraschallgerät 47
3.1.2.3 Brunstkontrolle, Paarung und Trächtigkeitsfeststellung bei Schafen
und Ziegen 47
3.1.2.4 Zeitplan der Untersuchungen und Versuchsübersicht 48 3.1.2.5 Ultrasonographische Untersuchungen zur pränatalen
Geschlechtsfeststellung bei Schaf- und Ziegenlämmern 49
3.1.2.6 Ablammung 51
3.1.3 Untersuchungen unter Feldbedingungen an Tieren in externen
Betrieben 52
3.1.4 Statistische Auswertungen 54
3.2 Ergebnisse 55
3.2.1 Ultrasonographische Untersuchungen zur Geschlechtsfeststellung
an Schaffeten im Wasserbad 55
3.2.2 Institutsinterne Untersuchungen 56
3.2.2.1 Bestimmung des fetalen Geschlechts bezogen auf die Feten
individueller Muttertiere 56
3.2.2.2 Ultrasonographische Bestimmung des fetalen Geschlechts
bezogen auf die untersuchten Lämmer 57
3.2.2.3 Ultrasonographische Bestimmung des fetalen Geschlechts:
Vergleich zwischen männlichen und weiblichen Feten
60 3.2.2.4 Der früheste Untersuchungszeitpunkt zur ultrasonographischen
Geschlechtsfeststellung 62
3.2.2.5 Der optimale Untersuchungszeitraum zur ultrasonographischen
Geschlechtsfeststellung 62
3.2.2.6 Einfluss der Präsentation der Feten auf die ultrasonographische
Geschlechtsfeststellung 66
3.2.2.7 Vergleich der ultrasonographischen Geschlechtsfeststellung
zwischen den Tierarten 69
3.2.3 Externe Betriebe 70
3.2.3.1 Ultrasonographische Bestimmung des fetalen Geschlechts in einmalig untersuchten Herden bezogen auf die Feten individueller
Muttertiere 70
3.2.3.2 Ultrasonographische Bestimmung des fetalen Geschlechts in einmalig untersuchten Herden bezogen auf die untersuchten
Lämmer 72
3.2.3.3 Ultrasonographische Bestimmung des fetalen Geschlechts:
Vergleich zwischen männlichen und weiblichen Geschlecht 73 3.2.3.4 Ultrasonographische Untersuchungen in einem Betrieb in den als
optimal ermittelten Untersuchungszeiträumen 74 3.2.3.5 Vergleich der Ergebnisse der einmalig ultrasonographisch
untersuchten Betriebe mit denen aus Betrieb 7 (zweimalige
Untersuchung) 76
3.2.3.6 Vergleich zwischen Weide- und Stallhaltung 77
4 Diskussion
784.1 Ultrasonographische Darstellung der Schaf- und Ziegenfeten 78 4.2 Ultrasonographische Darstellung der Geschlechtsorgane bei
Schaf- und Ziegenfeten 82
4.3 Ultrasonographische Darstellbarkeit des männlichen und
weiblichen Geschlechts im Vergleich 84
4.4 Der optimale Untersuchungszeitraum zur
ultrasonographischen Geschlechtsfeststellung bei Schaf- und
Ziegenfeten 85
4.5 Untersuchungen in externen Betrieben 88 4.6 Weiter Faktoren, die die ultrasonographische Untersuchung
beeinflussen 90
5 Zusammenfassung
936 Summary
957 Literaturverzeichnis
978 Abkürzungsverzeichnis
1159 Anhang
1179.1 Diagramme und Tabellen 117
9.2 Abbildungen 124
Danksagung 140
Veröffentlichungen 142
1 Einleitung
Der Einsatz der Ultraschalldiagnostik in der Reproduktionsmedizin ermöglicht als nicht invasive Methode die Untersuchung der graviden und nicht-graviden Geschlechtsorgane unter minimaler Beeinträchtigung und mit guter Toleranz der Patienten. Während die ultrasonographische Diagnostik bei großen Nutztieren seit geraumer Zeit in vielen Bereichen der tiermedizinischen Praxis angewendet wird und dort bereits weitgreifende Erfolge in der Diagnose physiologischer und pathologischer Zustände, insbesondere auch des weiblichen Genitaltraktes, erzielt werden, wobei schon frühzeitig sichere Aussagen über fetale Strukturen, inkl. der Geschlechtsorgane gemacht werden konnten, war die Anwendung des Prinzips bei kleinen Wiederkäuern zunächst nur begrenzt möglich. So konnten die bildgebenden Ultraschallverfahren bei der Erkennung von Trächtigkeiten eingesetzt werden, jedoch erforderte die detaillierte Darstellung fetaler Strukturen eine höhere Bildauflösung und somit auch eine höhere Frequenz des Ultraschalls. Die aufgrund anatomischer Verhältnisse nicht mögliche rektale manuelle Kontrolle erschwert zudem die transrektale Untersuchung des tragenden Uterus, so dass die transabdominelle Untersuchung als Ergänzung bzw.
Alternative angewendet werden musste.
Während die ultrasonographische Geschlechtsbestimmung bei den großen Nutztieren bereits einen wichtigen Stellenwert in der pränatalen Diagnostik bei tragenden Stuten und Kühen eingenommen hat, ist dies für die kleinen Wiederkäuer nur von experimentellem Interesse.
Durch die Möglichkeit eine fetale Geschlechtsfeststellung in der frühen Gravidität vornehmen zu können, eröffnen sich experimentelle Möglichkeiten (z.B. frühzeitige Kontrolle einer erfolgreich durchgeführten Besamung mit „gesextem“ Sperma), die eine Schlachtung der Muttertiere bzw. das Abwarten der rund 150 Tage Tragzeit überflüssig machen.
In der vorliegenden Arbeit sollte bei kleinen Wiederkäuern, bei denen das Auftreten von Mehrlingsgraviditäten als physiologisch anzusehen ist, die Möglichkeit analysiert werden, die Untersuchungen des Geschlechts der Feten mit einer ähnlich hohen Erfolgsquote durchzuführen, wie dies bereits bei den großen Nutztierrassen praktiziert wird. Zunächst musste analysiert werden, zu welchem Zeitpunkt und in welcher Lokalisation die Geschlechtsorgane erstmalig ultrasonographisch darstellbar sind und wie sie sich im Ultraschallbild darstellen. Des weiteren sollte ein optimaler Untersuchungszeitraum
beschrieben werden, in dem die höchste Genauigkeit der Geschlechtsfeststellung, insbesondere der Mehrlingsgraviditäten zu erreichen ist. Untersuchungen in externen Betrieben dienten der Klärung der Frage, ob auch die bei optimalen Bedingungen erzielten Ergebnisse, unter Praxisbedingungen zu erreichen sind.
2 Literaturübersicht
2.1 Grundlagen der Ultrasonographie
Bei der Anwendung des Ultraschalls als bildgebendes Diagnostikum kommen hochfrequente Schallwellen oberhalb der menschlichen Hörschwelle (ca. 20 kHz) zum Einsatz. Zu seiner Erzeugung werden Piezokristalle verwendet, die bei Anlegen einer Wechselspannung kurze Schallimpulse von wenigen Mikrosekunden Dauer aussenden (BARR 1992). Treffen nun akustische Wellen auf die Wandlerelemente, tritt der reziproke piezoelektrische Effekt ein, wobei die Schwingungen in elektrische Ströme umgewandelt werden (FRITSCH u.
GERWING 1993). Die Echos des ausgesendeten Schalls werden im Ultraschallgerät aufbereitet und zu einem Bild, bestehend aus Lichtpunkten unterschiedlicher Helligkeit, zusammengesetzt. Das Gerät berechnet hierfür die Entfernung der Struktur, die den Schall reflektiert, die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Ultraschallwellen in den verschiedenen Geweben (Weichteile ca. 1540 m / sec) und die Zeit zwischen Aussendung und Empfang des Impulses (EBERSPÄCHER 1991; BARR 1992; FRITSCH u. GERWING 1993).
Der medizindiagnostisch genutzte Bereich des Ultraschalls liegt im allgemeinen zwischen 2 - 15 MHz. Aus der frequenzabhängigen Dämpfung des Schalls im Gewebe (1 dB / cm und MHz) resultiert eine höhere Eindringtiefe bei geringeren Frequenzen, was jedoch mit einem Verlust des Auflösungsvermögens einhergeht. So arbeitet eine 3,5-MHz-Sonde theoretisch im Bereich bis 25 cm und stellt Einzelstrukturen im Abstand von 1 mm separat dar, während ein 10-MHz-Schallkopf 4 cm weit in das Gewebe eindringt und dabei über eine Auflösung von 0,2 mm verfügt. In der Regel werden am lebenden Organismus solch hohe Auflösungen jedoch nicht erreicht, hier müssen voneinander abgrenzbare Strukturen einen Abstand von 1 - 2 mm aufweisen (FLÜCKIGER 1990; BARR 1992; FRITSCH u. GERWING 1993). Des weiteren soll die zu analysierende Struktur in der Fokuszone liegen, da hier eine optimale Auflösung für nur geringe Verluste durch Divergenz sorgt (BARR 1992; FRITSCH u.
GERWING 1993).
Die einzelne Gewebe eines Körpers weisen gegenüber der Schallausbreitung einen unterschiedlichen Widerstand, die akustische Impedanz, auf. Sie ist das Produkt aus Dichte des Gewebes und Ausbreitungsgeschwindigkeit. Treffen nun Schallwellen auf eine Grenzfläche zwischen zwei Geweben mit unterschiedlicher akustischer Impedanz, wird ein
Teil des Schalls reflektiert. Die Reflexion ist dabei abhängig von der Größe der Impedanzwechsel. Das Ultraschallbild eines Organs hängt demzufolge von den untersuchten Strukturen, also den Anteilen an Muskulatur, Fettgewebe etc. ab. Gas sowie mineralisierte Strukturen reflektieren den Schall fast vollständig (FLÜCKIGER 1990; EBERSPÄCHER 1991; BARR 1992; FRITSCH u. GERWING 1993). Ebenso ist die Bildwiedergabe abhängig von der Lage der Grenzfläche zur einfallenden Schallwelle. Steht diese senkrecht zur Schallquelle werden die Wellen ohne Ablenkung zur Quelle zurückgesendet. Ist dies nicht der Fall entstehen Streuechos, die ebenfalls zu einer Abschwächung der Schallwelle führen (BARR 1992).
In der Medizin kommen sowohl elektronische als auch mechanische Sonden zum Einsatz. Bei den mechanischen Sonden schwingt das Wandlerelement um eine Achse. Durch diese rotierenden oder oszillierenden Bewegungen des Piezokristalles entsteht einzweidimensionales Bild, wodurch zusammen mit einer asynchronen Aktivierung der Wandlerelemente, eine Fokussierung in zwei Ebenen und vielen verschiedenen Tiefen möglich wird. Diese Sektorschallköpfe benötigen nur eine kleine Ankopplungsfläche, haben aber den Nachteil, dass sie auch nur einen kleinen Bildausschnitt abbilden, was eine Zuordnung des Bildes in das entsprechende Gewebe erschwert. In einer Reihe angeordnete Kristalle werden als elektronische Sonden bezeichnet, wobei sich der Linearscanner vom Konvexscanner (Blickfeld im Nahbereich kleiner, laterale Auflösung nimmt mit der Eindringtiefe ab) unterscheidet. Die Vorteile eines Linearscanners liegen darin, dass das Blickfeld direkt unter der Ankopplungsfläche beginnt, was die Identifizierung und anatomische Zuordnung wesentlich erleichtert. Elektronische Wandler ermöglichen ein Fokussieren in drei bis vier Tiefen (FLÜCKIGER 1990; EBERSPÄCHER 1991; BARR 1992).
Es stehen drei Auswertungstechniken zur Verfügung: Beim „(Time-) Motion-Mode (M-Mode)“ werden eindimensionale Ultraschallsignale ausgesandt und empfangen und bei der bildlichen Wiedergabe als sogenannte B-Linien auf der Ordinate gegenüber der Zeit aufgetragen, sodass sich die Bewegung der auf einer Linie befindlichen Punkten gegenüber der Zeit abzeichnet. Diese Technik wird in der Kardiologie vielfach angewendet. Das in der Gynäkologie gebräuchliche Verfahren ist der auch in der übrigen medizinischen Diagnostik angewendete „B-(brightness) Mode“, bei welchem gebündelte, zweidimensionale
Schallwellen in die Gewebe ausgesendet werden, was ein entsprechendes zweidimensionales Bild des Gewebes auf dem Monitor erzeugt (FLÜCKIGER 1990; BARR 1992). Durch das Echtzeitverfahren („Real-Time-Mode“) wird der abgetastete Bereich innerhalb von Sekundenbruchteilen auf dem Monitor neu aufgebaut (Bildfolgesequenz >15 / s). Es entsteht ein dynamisches System, welches somit auch die Darstellung von Bewegungsabläufen ermöglicht (FRITSCH u. GERWING 1993). Eine weitere Möglichkeit, vornehmlich angewendet in der Herz-Kreislauf-Diagnostik, ist die Nutzung des Doppler-Effektes, bei dem Schallwellen eine Änderung ihrer ursprünglichen Frequenz durch Reflexion an sich selbst bewegenden Strukturen erfahren. Es ist möglich zwischen Strukturen, die sich vom Schallkopf weg bewegen und solchen, die sich auf diesen zu bewegen, zu unterscheiden, da erstere die Frequenz vergrößern, während letztere diese verkleinern. Dies wird auf dem Monitor farbig (blau / rot) gekennzeichnet. Zusätzlich können sogenannte Dopplergeräusche hörbar gemacht werden (FLÜCKIGER 1990).
2.2 Embryologie der äußeren Geschlechtsorgane
Die Entwicklung der äußeren Geschlechtsorgane bei den Haussäugetieren geht sowohl beim weiblichen als auch männlichem Individuum von dem indifferenten Genitalhöcker bzw.
Phallus aus. Dieser entsteht aus mesenchymalem Gewebe an der ventralen Bauchwand zwischen Schwanzwurzel, Hintergliedmaßen und Nabelstrang, nachdem die Teilung der Kloake in den dorsalen Enddarm und den ventralen Sinus urogenitalis erfolgt und der Damm entstanden ist (ZIETSCHMANN u. KRÖLLING 1955; RÜSSE 1991).
Der zunächst kurze, gerade und ventral gerichtete Höcker wächst nun in die Länge und kann in eine apikale Pars nuda und einen breiten basalen Teil, die Pars basalis, gegliedert werden (ZIETSCHMANN u. KRÖLLING 1955). Letztere wird von RÜSSE (1991) Pars tecta genannt und wird nach ZIETSCHMANN u. KRÖLLING (1955) von einem basalen Wulst, der Schafthaut, umgeben. Während dieser Umbildungen teilen sich die an der Kloakenmembran entstanden Kloakalfalten in Anal- und Urogenitalfalten und in der Peripherie zu diesen entstehen lateral des Tuberculus genitalis die Genitalwülste (NODEN u.
DE LAHUNTA 1985; RÜSSE 1991). Dieses Stadium wird von INOMATA et al. (1982) bei Rinderfeten mit einer Größe von 2,5 cm (EVANS u. SACK 1973: ca. 30. Trächtigkeitstag) und bei Schweinefeten am 35. Tag der Trächtigkeit (INOMATA et al. 1989) beschrieben, wobei schon ab ca. 2 cm Größe (Rind) bzw. ab dem 30. Tag (Schwein) eine erste histologische Geschlechtsunterscheidung der Gonaden vorgenommen werden kann.
INOMATA et al. (1982, 1989) beobachten die ersten makroskopischen Geschlechtsunterschiede im Erscheinen der Öffnung des Urogenitalsinus beim männlichen Rinder- und Schweinekonzeptus früher (Rind: SSL 2,5 - 3 cm, Schwein: 35. Trächtigkeitstag) als beim weiblichen (Rind SSL 3 - 4 cm, Schwein: 40. Tag). Diese ersten makroskopischen Unterschiede in der Entwicklung des Geschlechtes werden weder von ZIETSCHMANN u.
KRÖLLING (1955) noch von RÜSSE (1991) so erwähnt. RÜSSE (1991) beschreibt die Öffnung des Sinus urogenitalis bei männlichen Tieren als kurz und oval sowie mit größerem Abstand vom After, als die bei weiblichen Früchten ansatzweise dreieckig erscheinende Öffnung.
Untersuchungen von BÖHM (1905) an Schaf- und Ziegenfeten zeigen erste Geschlechtsunterschiede bei einer SSL von 2,6 cm (EVANS u. SACK 1973: 30. Tag der
Gravidität) durch schnelles Längerwerden des Dammes beim männlichen Individuum. Dieses Wachstum bringt den Genitalhöcker relativ schnell kaudal des Nabels an der ventralen Bauchwand in seine endgültige Lage. Dabei werden die Genitalwülste zusammen mit den von BÖHM (1905) beschriebenen Zitzenanlagen zwischen den Hintergliedmaßen zurückgelassen.
INOMATA et al. (1982) finden diese Vorgänge bei männlichen Rinderfeten ab einer SSL von 3 - 4 cm bis der GT bei etwa 5 cm (EVANS u. SACK 1973: ca. 55. Trächtigkeitstag) die endgültige Lage ventral hinter dem Nabel erreicht hat. Beim Schwein erfolgt dieser Prozess in der Zeit zwischen dem 40. - 60. Tag der Trächtigkeit (INOMATA et al. 1989).
Während dieser Verschiebung wächst der Genitalhöcker hakenförmig nach kaudal (BÖHM 1905, ZIETSCHMANN u. KRÖLLING 1955). Der männliche Schaffetus hat während dieser Entwicklung eine SSL von 2,6 cm (ZIETSCHMANN u. KRÖLLING 1955) bzw. 3 – 3,5 cm (BÖHM 1905). Diese Angaben entsprechen nach EVANS u. SACK (1973) etwa einer Trächtigkeitsdauer von 35 Tagen. Während BÖHM (1905) und ZIETSCHMANN u.
KRÖLLING (1955) nun von einer Verschiebung durch Wachstum der gesamten Bauchwand sprechen, beschreibt RÜSSE (1991) ein Längenwachstum des Genitalhöckers mit darauf folgender Verwachsung desselben mit der Bauchwand. Nach ZIETSCHMANN u.
KRÖLLING (1955) beginnt jetzt das Wachstum der Schafthaut über die Pars nuda des Phallus hinweg. Das Präputium mit seinem Ostium präputiale wird gebildet. BÖHM (1905) findet diese Umwandlungsprozesse zum männlichen Präputium ab einer SSL von 6 cm (entspricht etwa dem 45. Graviditätstag, EVANS u. SACK 1973), wobei er die relative Verkleinerung des prominenten Genitaltuberkels zum wenig prominenten Schamhügel durch das stete Wachstum der Frucht erklärt. Daher ist die Höhe des Präputiums bei Feten von 9,5 - 14 cm (ca. 58 - 75 Tage) geringer und beginnt auch erst dann wieder zuzunehmen. Mit 11 cm SSL ist bei den männlichen Tieren das noch mit Epithel verschlossene Ostium präputiale zu erkennen. Der Schaffetus ist nun ca. 60 Tage alt (EVANS u. SACK 1973).
Sobald der Phallus nach kranial gerückt ist und den Platz zwischen den Genitalwülsten freigibt, beginnen sich diese, nun als Skrotalwülste bezeichnet, einander in der Medianen anzunähern (ZIETSCHMANN u. KRÖLLING 1955; NODEN u. DE LAHUNTA 1986;
RÜSSE 1991). Dabei erfolgt zunächst noch eine Trennung durch die sich median als feine Erhebung abzeichnende Crista perinealis (ZIETSCHMANN u. KRÖLLING 1955). BÖHM (1905) beobachtet während der Annäherung der Skrotalhöcker bei Schaffeten von 4 - 5,5 cm
SSL nahezu eine Verdopplung der Ausdehnung der Skrotalhöcker nach ventral.
HABERMEHL (1975) schildert diese Entwicklung ebenfalls bei 5 cm SSL, welche er in der 8. Graviditätswoche misst und INOMATA et al. (1982) beschreiben dies bei Rinderfeten ab einer SSL von 5 cm und mehr. Bei einer SSL des Schafkonzeptus von 7,7 cm (EVANS u.
SACK 1973: ca. 50. Trächtigkeitstag) erscheint der Hodensack unpaar und hat somit seine bleibende Gestalt erlangt (BÖHM 1905). Bei Schweinen wird dieses Stadium nach INOMATA et al. (1989) dieses Stadium mit dem 60. Tag der Gravidität erreicht. Es erfolgt jetzt nur noch ein Größenwachstum. So erreicht das Skrotum etwa bei einem 12,5 cm (ca. 62.
Tag; EVANS u. Sack 1973) großen Schaffetus eine Höhe von 7 mm.
BÖHM (1905) beschreibt die Entstehung der Zitzenanlagen zwischen den Hintergliedmaßen bei einer SSL von 2 cm (25. Graviditätstag; EVANS u. SACK 1973) als fixen Punkt während der Entwicklung der Geschlechtsorgane an der oralen Seite der Skrotalhöcker bei Schaf und Ziege bei beiden Geschlechtern, während ZIETSCHMANN u. KRÖLLING (1995) bei den männlichen Embryonen diese nur beim Pferd erwähnen. Die Zitzenbildung beobachtet BÖHM (1905) bei Schaf und Ziege etwa bei 6 cm SSL, analog zu EVANS u. SACK (1973), die diese erstmalig am 43. Tag der Trächtigkeit beschreiben.
Beim männlichen Schaf sind somit alle Oberflächenformen des männlichen Geschlechtsapparates mit einer SSL von 14 cm vollständig ausgebildet (BÖHM 1905). Dies entspricht in den Untersuchungen von EVANS u. SACK (1973) einem Trächtigkeitsstadium von ca. 70 Tagen. Ähnliches schildert CLOETE (1939) in seinen Untersuchungen an Merinoschafen: Hier sind Penis und Präputium ab der 11. Graviditätswoche deutlich zu erkennen.
Nach Angaben von EVANS u. SACK (1973) ist der Descensus testis mit dem 80.
Trächtigkeitstag bereits im Uterus vollständig abgeschlossen, während dies nach HABERMEHL (1975) erst bei einer SSL von 27 cm, was etwa der 16. Woche entspricht, der Fall ist.
Die Differenzierung zum weiblichen Genitale erfolgt als erstes durch Erweiterung der Urogenitalöffnung. Weibliche Rinderembryonen erreichen zu diesem Zeitpunkt eine SSL von 3 - 4 cm (INOMATA et al. 1982). Hierbei verbleibt der sehr prominente Tuberculus genitalis dauerhaft nahe dem After und es entsteht dadurch nur ein sehr kurzer Damm (BÖHM 1905;
ZIETSCHMANN u. KRÖLLING 1955; RÜSSE 1991). Die von BÖHM (1905)
beschriebenen Formveränderungen des weiblichen Phallus erfolgen durch ein stetiges Wachstum bei gleichzeitiger Krümmung nach kaudal, ähnlich denen des männlichen Konzeptus, jedoch etwas später.
Nach ZIETSCHMANN u. KRÖLLING (1955) wächst die Schafthaut auch hier über den Phallusstamm und bildet zusammen mit den Seitenteilen des Sinus die Labien aus. Nach NODEN u. DE LAHUNTA (1986) und RÜSSE (1991) formen lediglich die Genitalfalten die Labien, welche die Klitoris umschließen. Eine Schafthaut wird hier nicht beschrieben.
Der Phallus bildet nun die Klitoris und wird von den Labien überwachsen (ZIETSCHMANN u. KRÖLLING 1955; NODEN u. DE LAHUNTA 1986; RÜSSE 1991). BÖHM (1905) beschreibt in seinen Untersuchungen ein „Clitorium“, welches durch Einwachsen einer Epithellamelle in die Phallusbasis von dieser abgetrennt wird. Das „Clitorium“ überwächst nun die aus dem Rest der Phallusbasis entstandene Klitoris langsam und lässt dadurch den Vulvahügel entstehen, der bis zu einer Fetengröße von 33 cm (EVANS u. SACK 1973: ca.
110. Graviditätstag) bestehen bleibt. Die Entwicklung des weiblichen Genitales bis zur Ausbildung des Vulvahügels wird von BÖHM (1905) bei Schafen ab einer SSL von ca. 4 cm (40. Tag der Trächtigkeit, EVANS u. SACK 1973) und von INOMATA et al. (1982) bei Rindern mit einer SSL von 5 - 6 cm (EVANS u. SACK 1973: ca. 55. Tag), erstmalig beobachtet und endet etwa bei einer SSL von 10 cm (ca. 58. Tag) beim Schaf, bzw. 9 cm beim Rind. Das „Clitorium“ kann mit der von ZIETSCHMANN u. KRÖLLING (1955) beschriebenen Schafthaut gleichgesetzt werden.
Erst in der späten Entwicklungsphase entsteht durch die sich wulstig erhebenden Labien die Rima vulva, der Vulvahügel verschwindet zwischen diesen in der Tiefe.
Die im indifferenten Stadium deutlich sichtbaren Genitalwülste kommen im Laufe der Umwandlungen kranial des Genitaltuberkels zu liegen und flachen sich mehr und mehr ab, bis sie in der späten Fetalentwicklung schließlich ganz verstreichen (ZIETSCHMANN u.
KRÖLLING 1955; NODEN u. DE LAHUNTA 1986; RÜSSE 1991). Das Verstreichen wird bei Schaffeten bei einer SSL von 15 - 25 cm beobachtet (BÖHM 1905), was nach EVANS u.
SACK (1973) einem Trächtigkeitsstadium vom 70. - 95. Tag entspricht, während die Genitalwülste bei Rindern bereits mit 10 cm (ca. 78. Graviditätstag, EVANS u. SACK 1973) vollkommen zurückgebildet sind (INOMATA et al. 1982).
Die Zitzenanlagen befinden sich auch hier in engster Nachbarschaft zu den Genitalwülsten und verändern ihre Lage nicht (BÖHM 1905). Ab der 15. Graviditätswoche (SSL 27 cm) sind die Milchdrüsenanlagen dann deutlich zu erkennen und auch die Inguinaltaschen werden hier erstmalig sichtbar (HABERMEHL 1975).
2.3 Anwendungsmöglichkeiten der bildgebenden Ultrasonographie am Geschlechtsapparat kleiner Wiederkäuer
2.3.1 Ovardiagnostik
Die durch Ultrasonographie ermöglichte nicht-invasive Analyse der Eierstocksdynamik findet vielfältigen Einsatz. So wurde die Methode von SCHRICK et al. (1993), RAVINDRA et al.
(1994) und BARTLEWSKI et al. (1998) zur Erforschung der ovariellen Vorgänge bei Schafen im unbeeinflussten Zyklus genutzt.
BARTLEWSKI et al. (2000) konnte während der Frühträchtigkeit von Schafen bis zum 30. Tag der Gravidität die ovariellen Strukturen deutlich mit einem 7,5-MHz- Linearschallkopf transrektal identifizieren. Danach erschwerte der sich schnell ausdehnende, gravide Uterus die Auffindung der Ovarien. Mittels Ultrasonographie konnte zum einen eine Suppression des Follikelwachstums in der Trächtigkeit beobachtet werden, zum anderen fand die Beobachtung Bestätigung, dass sich bei Einlingsgraviditäten der Fetus immer im Horn des C.l.-tragenden Ovars befindet.
Die Anwendung eines Superovulationsverfahrens führt zu einer deutlichen Vergrößerung der Ovarien mit Ausbildung prominenter Follikel bzw. Corpora lutea (KÄHN 1991).
KAULFUSS et al. (1995) konnten nach hormoneller Stimulation bei in Rückenlage verbrachten Merinofleischschafen während der Brunst bei 90 %, und am 8. Zyklustag bei 60 % der Tiere beide Ovarien ultrasonographisch auffinden. RIESENBERG (1997) konnte während ihrer Untersuchungen an stehenden Merinoschafen die Ovarien in 74,2 % darstellen.
Bei Untersuchungen von KÜHHOLZER et al. (1995) wurden bereits einen Tag nach Injektion von Intergonan® bei allen untersuchten Merinoschafen und Kreuzungen lokaler österreichischer Rassen immer beide Ovarien gefunden. An den Tagen 2 - 4 der Superovulationsbehandlung von Ziegen (spanische Züchtungen) fanden DORN et al. (1989) in 80,4 % aller Untersuchungen beide Ovarien, während RIESENBERG et al.(2001) in 98,6 % aller Beobachtungen bei Bunten Deutschen Edelziegen (BDE) die Ovarien darstellen konnten. Dabei verwendeten DORN et al. (1989), KÄHN (1991) McBRIDE-JOHNSON et al.
(1994), KÜHHOLZER et al. (1995, 1998) und RIESENBERG et al. (2001) einen 7,5-MHz- Linearschallkopf, und auch KAULFUSS et al. (1994, 1995) erzielten im Vergleich mehrerer Wandlerfrequenzen die besten Resultate mit 7,5 MHz. Inaktive Ovarien sind dagegen häufig
nicht auffindbar, da sie sich von der Umgebung nicht deutlich abheben (KÄHN 1991;
KAULFUSS et al. 1995).
Tertiärfollikel werden im Ultraschallbild als echolose runde Strukturen dargestellt, welche ab einem Durchmesser von 2 (DORN et al. 1989; SCHRICK et al. 1993; McBRIDE-JOHNSON 1994; RAVINDRA et al. 1994; KÜHHOLZER et al. 1998) bis 3 mm (KAULFUSS et al.
1995; BARTLEWSKI et al. 1998; RIESENBERG et al. 2001) sichtbar werden. Sie werden in Untersuchungen von McBRIDE-JOHNSON et al. (1994) zu 62,5 % nach Superovulation von Ziegen korrekt diagnostiziert.
Gelbkörper stellen sich auf zwei verschiedene Arten dar, welche auch nebeneinander gefunden werden können. Die kompakten Corpora lutea erscheinen als echogene, runde Einheiten. Corpora lutea mit Hohlraum weisen eine im Ultraschallbild charakteristische Ringstruktur auf (SCHRICK et al. 1993; KAULFUSS et al. 1995; BARTLEWSKI et al.
1998).
Die meisten Arbeitsgruppen führten ihre Untersuchungen aufgrund der anatomischen Verhältnisse des weiblichen Genitales beim Schaf transrektal durch. Es wird dazu die Verwendung einer Führungsschiene empfohlen, die eine Lenkung des Schallkopfes im Rektum erleichtert (SCHRICK et al. 1993; RAVINDRA et al. 1994). KAULFUSS et al.
(1995) empfehlen die Anwendung der transrektalen Ultrasonographie am „sitzenden“ bzw. in Rückenlage verbrachten Schaf, hierbei ergab sich eine Ovarauffindungsrate von 75 %. Das weibliche Genitale inkl. der Ovarien kommt auf dem Ultraschallkopf zu liegen und erleichtert das Auffinden. Studien der Arbeitsgruppe um KAULFUSS et al. (1995) an stehenden Schafen brachten nur eine Auffindungsrate beider Ovarien von 50 - 75 %. RAVINDRA et al. (1994) und RIESENBERG (1997) hingegen untersuchen Schafe in stehender Position und auch McBRIDE-JOHNSON (1994), RIESENBERG (1997) und RIESENBERG et al. (2001) berichteten bei Ziegen über die Ovardiagnostik im Stehen. Untersuchungen zur Ovarauffindung bei adulten Schafen mittels transkutaner oder transvaginaler Ultrasonographie führten im ersten Fall zu keinerlei Erfolgen und erbrachten auch im zweiten Fall nur unzureichende Ergebnisse (KAULFUSS et al. 1994). Auch beschreiben KAULFUSS et al. (1995) eine Abhängigkeit der Erfolgsraten von Rasse und Rahmen der untersuchten Mutterschafe sowie von deren bisherigen Ablammungen, was RIESENBERG (1997) bei Schafen nur tendenziell und für Ziegen (RIESENBERG 1997; RIESENBERG et al. 2001)
jedoch nicht bestätigen konnten. RIESENBERG (1997) und RIESENBERG et al. (2001) fanden jedoch heraus, dass die Untersuchung bei pluriparen Ziegen eine etwas höhere Ovarrauffindungsrate brachte, als die von nulliparen Ziegen.
Die Möglichkeit der ultrasonographischen Überprüfung der Ovarien nach stattgefundener Superovulation hilft, die Reaktion der Donoren frühzeitig zu erfassen und Nichtreagenten auszusortieren, womit Embryotransferprogramme zu einem schnelleren Fortschreiten gebracht werden können (McBRIDE-JOHNSON et al. 1994, KAULFUSS et al. 1995, KÜHHOLZER et al. 1998).
2.3.2. Trächtigkeitsdiagnostik
Die traditionellen Methoden der Trächtigkeitsuntersuchungen bei Schaf und Ziege (Einsatz eines Suchbockes, Zervikalschleim-Kochprobe, Milchdrüsenentwicklung, Fruchtgegenstoß, Stabmethode, Nachweis von Progesteron und später Östrogen im Blut bzw. Kot, Röntgen;
BOSTEDT u. DEDIE 1996) wurden nach Einführung der bildgebenden Ultraschalldiagnostik zur routinemäßigen Untersuchung in großen Herden weitgehend abgelöst. Dabei stellt sich die Ultrasonographie als nicht-invasive, sehr schnell durchführbare, genaue Möglichkeit heraus, welche nicht nur die Unterscheidung tragend / nicht tragend möglich macht, sondern auch ein weites Feld an Diagnosemöglichkeiten eröffnet (WHITE et al. 1984; DAVEY 1986;
GARCIA et al. 1993; KÄHN et al. 1993; HESSELINK u. TAVERNE 1994; KAULFUSS et al. 1999).
Die zuvor schon häufig zum Einsatz gekommene A-Mode (MEREDITH u. MADANI 1980;
WATT et al. 1984) und Doppler-Verfahren (RICHARDSON 1972; WATT et al. 1984; WANI et al. 1998) brachten zwar bei der Unterscheidung tragend / nicht tragend ab dem 50. (WATT et al. 1984) bis 60. (MEREDITH et al. 1980; WANI et al. 1998) bzw. 80. (RICHARDSON 1972) Graviditätstag eine ausreichende Aussagekraft, jedoch blieb jede weitere Diagnostik unbefriedigend (RICHARDSON 1972; MEREDITH et al. 1980). Dabei ergab nach WATT et al. (1984) die Feststellung von fetalem Herzschlag und Nabelblutfluss eine höhere Genauigkeit, als die der Uterinarterienpulsation, was Untersuchungen von WANI et al. (1998) bestätigten.
Ein sehr früher Hinweis auf das Vorliegen einer Gravidität ist der Nachweis kleiner, echoloser Ansammlungen von Flüssigkeit im Uterus. Während erste Beobachtungen einzelner Autoren (GARCIA et al. 1993; SCHRICK u. INSKEEP 1993; KAULFUSS et al. 1996a, b) gelegentlich bereits zwischen dem 13. - 19. Trächtigkeitstag gemacht werden, werden flüssigkeitsgefüllte Hohlraume im Uterus aber erst ab dem 17. - 25. Tag regelmäßig beschrieben (GEARHART et al. 1988). Hier kann die Trächtigkeitsdiagnose schon mit über 95 % Genauigkeit gestellt werden (KAULFUSS et al. 1996a).
SCHRICK u. INSKEEP (1993), KANDIL et al. (1997) und MARTINEZ et al. (1998) untersuchten bei der ultrasonographischen Trächtigkeitsfeststellung vor dem 15. Tag parallel dazu die Ovarien auf vorhandene Gelbkörper. Bei der zu diesem Zeitpunkt von den meisten Autoren (GEARHART et al. 1988; GARCIA et al. 1993; SCHRICK u. INSKEEP 1993;
KAULFUSS et al. 1996a) empfohlenen transrektalen Untersuchung kamen 5-MHz- Linearschallköpfe zum Einsatz. Lediglich SCHRICK u. INSKEEP (1993) verwendeten eine 7,5-MHz-Linearsonde.
Der Uterus lässt sich kranioventral der Harnblase auffinden und zeigt im Sagittalschnitt meist mehrere anechogene Bereiche mit Durchmessern von etwa 10 mm (GEARHART et al. 1988;
GARCIA et al. 1993, KAULFUSS et al. 1996a). KÄHN (1991) rät von routinemäßigen Trächtigkeitsdiagnosen vor dem 20. Tag ab, da zu einem späteren Zeitpunkt die Diagnosen genauer werden und die embryonale Mortalität abnimmt, auch ALAN et al. (1994) und GARCIA et al. (1993) beschreiben vor dem 25. Tag noch eine relativ hohe Fehlerrate.
Ab dem 25. Trächtigkeitstag (SCHRICK u. INSKEEP 1993), in Studien von GARCIA et al.
(1993) schon ab dem 21. Tag, werden dann die ersten Embryonen sichtbar, die sich zunächst noch der Uteruswand unmittelbar anschmiegen (KAULFUSS et al. 1996a). Häufig erkennt man schon die embryonalen Hüllen, welche als schmale, echointensive Linie den Embryo bogenförmig umgeben (KÄHN 1991). In etwa zur gleichen Zeit beginnt auch die Entwicklung der Plazentome, welche nun im Ultraschallbild als wenige Millimeter starke, knopfartige Erhebungen sichtbar werden (KAULFUSS et al. 1996a).
KÄHN (1991) ebenso wie KAULFUSS et al. (1996b) beschreiben die transrektale Ultrasonographie bei stehenden Schafen bzw. Ziegen bis zum 35. Tag der Gravidität als Mittel der Wahl und empfehlen für Untersuchungen zu einem späteren Zeitpunkt die transkutane Diagnostik am stehenden (GEARHART et al. 1988; ALAN et al. 1994;
HESSELINK u. TAVERNE 1994; KAULFUSS et al. 1996a, 1999) oder „sitzenden“ Tier (DAVEY 1986; KANDIL 1997), da hier eine positive Trächtigkeitsfeststellung ab dem 50.
Tag mit einer Sicherheit von über 99 % möglich ist (DAVEY 1986). Vergleiche beider Methoden (KÄHN et al. 1993; KAULFUSS et al. 1996b) zeigen, dass sie nahezu gleich zuverlässig sind. Dabei ist die transrektalen Untersuchung bei Schafen bis zum dritten Monat der Gravidität vorzuziehen, während danach eine Überlegenheit der transabdominellen Ultrasonographie besteht. Es erweisen sich nicht tragende Tiere als schwieriger zu diagnostizieren, als tragende. KÄHN et al. (1993) empfiehlt die Wahl der Untersuchungsmethode von äußeren Umständen, wie z.B. Vorlieben des Untersuchers, abhängig zu machen. DAVEY (1986) verwendet für seine Untersuchungen in großen Herden einen 3,5-MHz-Linearschallkopf, während ALAN (1994) und KAULFUSS et al. (1996a) einen 5 MHz-Sektorschallkopf bevorzugen. HESSELINK u. TAVERNE (1994) verwenden in ihren Untersuchungen bei Ziegen sowohl einen 5-MHz-Linearschallkopf, als auch einen Sektorskanner gleicher Frequenz, empfehlen aber für Stadien ab dem 100. Tag einen Wechsel der Frequenz zu 3,5 MHz. KAULFUSS et al. (1996b, 1999) raten bei Herdenuntersuchungen unter Praxisbedingungen zunächst zu einer transkutanen Untersuchung, der bei unsicheren Diagnosen eine transrektale folgen sollte, um auch Tiere während der Frühträchtigkeit zu erfassen. Für solche Erhebungen erweist sich ein 5-MHz-Linearschallkopf für die transkutane und ein 7,5-MHz-Linearschallkopf für transrektale Untersuchungen als sinnvoll. WHITE et al. (1984) untersuchten in ihren Herden „sitzende“ Schafe mit Frequenzen von 2,25 – 3,5 MHz.
Mit fortschreitender Trächtigkeit dehnt sich der gravide Uterus nach kranial und ventral aus, was bei unbekanntem Deckdatum zu falsch negativen Trächtigkeitsdiagnosen mittels transrektaler Ultraschalluntersuchung führen kann (KÄHN 1993). Kommt der Uterus auf der Bauchdecke zu liegen, nimmt eine Trächtigkeitsdiagnose von transkutan nur noch wenige Sekunden in Anspruch (DAVEY 1986), weswegen KAULFUSS et al. (1996b, 1999) ab dem 60. Tag der Gravidität nur noch transkutane Ultraschalluntersuchungen vornehmen. Eine geringe Fehlerquote bei den positiven Trächtigkeitsdiagnosen wird von GEARHART et al.
(1988), KÄHN et al. (1993) und KAULFUSS et al. (1996a, b) mit dem Auftreten von pathologischen Uterusbefunden erklärt. Auch kommt es vor, dass tragende Tiere als nicht tragend beurteilt werden (GEARHART et al. 1988).
Ein nicht tragender Uterus ist durch transrektale (KÄHN 1991; BRETZLAFF et al. 1993;
GARCIA et al. 1993; HESSELINK u. TAVERNE 1994; KAULFUSS et al. 1996), seltener auch durch transkutane (KÄHN 1991) Sonographie kranial der Harnblase aufzufinden, wobei bei starker Blasenfüllung mit einer Verschiebung des Uterus nach dorsal gerechnet werden muss (GARCIA et al. 1993). Er stellt sich im sagittalen Anschnitt von rektal als homogene grobkörnige Struktur ohne Lumen dar (KÄHN 1991, HESSELINK u. TAVERNE 1994, KAULFUSS et al. 1996). Dieser nur sehr geringe Kontrast zur Umgebung führt nach HESSELINK et al. (1994) häufig zu einem Übersehen der Gebärmutter. Lediglich bei Tieren im Östrus konnten geringe Flüssigkeitsansammlungen im Uteruslumen registriert werden (KÄHN 1991; KAULFUSS et al. 1996). BRETZLAFF et al. (1993) konnten während ihrer Untersuchungen den nicht graviden Uterus von Ziegen nur in Östrusnähe darstellen.
Untersuchungen von KAULFUSS et al. (1998) zur Bestimmung des Trächtigkeitsstadiums unter Zuhilfenahme der Plazentome ergaben, dass die ermittelten Plazentomdurchmesser zwar gut zur Beschreibung der Plazentafunktion herangezogen werden konnten, aber aufgrund hoher individueller Unterschiede bei Schafen nur bedingt eine korrekte Einschätzung des Trächtigkeitsstadiums möglich war. Dies bestätigen die Aussagen von DOIZE et al. (1997), die für ihre Untersuchungen mit einer 5-MHz-Rektalsonde definierte Plazentome in Blasennähe bis zum 90. Trächtigkeitstag heranzogen. Die Korrelation zwischen Plazentomgröße und Trächtigkeitsstadium bei Schafen war auch hier aufgrund der starken individuellen Schwankungsbreite nur sehr gering. Bei Untersuchungen an Ziegen jedoch fanden DOIZE et al. (1997) heraus, das hier eine wesentlich bessere Korrelation vorlag, welche sie mit einem eher einheitlichen, weniger vom Individuum beeinflussten Wachstum zu erklären versuchten. Hier besteht nach Aussagen das Autors die Möglichkeit, die Plazentomgröße zur Bestimmung des Trächtigkeitszeitraumes heranzuziehen.
2.3.3. Pathologische Uterusbefunde
Ein vor allem bei älteren Ziegen während Ultraschalluntersuchungen relativ häufig vorgefundener (PIETERSE u. TAVERNE 1986; HAIBEL 1990; BRETZLAFF et al. 1993;
HESSELINK 1993a u. 1993b; HESSELINK u. TAVERNE 1994), bei Schafen (KAULFUSS et al. 1999) jedoch eher selten beobachteter Uterusbefund ist die Hydrometra. Dabei kommt
es intrauterin zur Ansammlung größerer Mengen Flüssigkeit bei Abwesenheit eines Konzeptus oder fetaler Hüllen. Im Ultraschallbild fallen die großen, echoarmen Flüssigkeitskammern auf, die jeweils durch die dünne Uteruswand der Kammern gegeneinander abgrenzbar sind. Dabei ist die Diagnose mit einem 5-MHz-Linear- oder Sektorschallkopf am stehenden Tier sowohl transrektal als auch transabdominal zu stellen (PIETERSE u. TAVERNE 1986; HAIBEL 1990; BRETZLAFF et al. 1993; HESSELINK 1993a u. 1993b; HESSELINK u. TAVERNE 1994; KAULFUSS et al. 1999). Befindet sich die Hydrometra noch im Anfangsstadium ihrer Entwicklung ähnelt das ultrasonographische Bild dem einer Frühgravidität. Es sollte daher, nach Empfehlungen von PIETERSE u.
TAVERNE (1986), HESSELINK (1993a) und HESSELINK u. TAVERNE (1994), eine weitere Untersuchung frühestens 40 Tage nach dem letzten Decken der Tiere erfolgen, da dann bei einer intakten Gravidität sowohl Früchte als auch Plazentome deutlich nachweisbar sind. BRETZLAFF et al. (1993) empfehlen eine Wiederholungsuntersuchung nach 14 Tagen, in der ein entsprechender Uterusbefund die Diagnose bestätigen kann. Eine Behandlung mit Prostaglandinen führt zu einer Entleerung des Uterus, wobei aber häufig noch Restmengen an Flüssigkeit sonographisch sichtbar bleiben (PIETERSE u. TAVERNE 1986, HAIBEL 1990, HESSELINK 1993b).
Ein ähnliches Bild liefert die Eihautwassersucht (GEARHART et al. 1988, KÄHN 1991).
Auch hier stellen sich die stark vermehrten Fruchtwässer als echoarme Flüssigkeit, durchzogen von echointensiven, dünnen Uterusabschnitten dar. Im Gegensatz zur einer Hydrometra können aber hier Plazentome und auch fetale Strukturen dargestellt werden. Als Therapie empfehlen GEARHART et al. (1988) eine Punktion des Uterus unter Ultraschallkontrolle mit einem 5-MHz-Linearschallkopf, zur Reduzierung der vorliegenden Hydrallantoisflüssigkeit.
Die Pyometra wird bei Schaf und Ziege als sehr selten auftretender pathologischer Uterusbefund beschrieben (HAIBEL 1990; BRETZLAFF et al. 1993; HESSELINK u.
TAVERNE 1994; KAULFUSS et al. 1999). Dabei kommt es zu Flüssigkeitsansammlungen, die im Ultrasonogramm deutliche Reflexionen aufweisen, welche von KÄHN (1991) und BRETZLAFF et al. (1993) als schneegestöberartig beschrieben werden. Unter Umständen wird der Uterus bei einer Pyometra vollständig mit anechogenem Material ausgefüllt (HESSELINK et al. 1994). Des weiteren beschreiben HAIBEL (1990) und KAULFUSS et al.
(1999) die Abwesenheit von Fetus und Plazentomen. Eine Pyometra trat bei Untersuchungen von HESSELINK et al. (1994) während eines 5-jährigen Zeitraumes einmal bei nahezu 2000 Ultraschalluntersuchungen auf, ähnliches schildern KAULFUSS et al. (1999) die bei 27378 Untersuchungen innerhalb von 5 Jahren bei 10 Schafen den gekammerten, dünnwandigen Uterus mit dem typischen „Schneegestöber“ darstellen konnte.
Die Abwesenheit fetaler Eigenbewegungen und das Fehlen des Herzschlages sind erste Anzeichen, die während einer routinemäßigen Trächtigkeitsuntersuchung mitttels Ultrasonographie auf ein Absterben der Frucht hinweisen (GEARHART et al. 1988;
BRETZLAFF et al. 1993; SCHRICK u. INSKEEP 1993; HESSELINK u. TAVERNE 1994;
KAULFUSS et al. 1999). Auch ein Abort einzelner Früchte einer Mehrlingsgravidität kommt vor (BRETZLAFF et al. 1993). Mit fortschreitender Degeneration des Fetus erscheint dann der Uterusinhalt anechogen bzw. hyperechogen, während die fetalen Hüllen zunächst noch erhalten bleiben. Abhängig vom Trächtigkeitsstadium lassen sich entweder mumifizierte Früchte oder aber Überreste fetaler Knochen darstellen (HESSELINK u. TAVERNE 1994).
Erstere werden im Ultrasonogramm von nur geringen Fruchtwassermengen umgeben und, bei bekannter Trächtigkeitsdauer, mit unterdurchschnittlicher SSL und Plazentomgröße dargestellt (GEARHART et al. 1988, SCHRICK u. INSKEEP 1993). Eine Fruchtmazeration stellt sich als echogener Inhalt des Uterus dar, in dem man hyperechogene Anteile beobachten kann. (KAULFUSS et al. 1999). Liegt ein Abort vor, so ist in Untersuchungen von BRETZLAFF et al. (1993) und KAULFUSS et al. (1999) kurz nach dem Geschehen ein dilatierter, flüssigkeitsgefüllter Uterus mit noch intakten Plazentomen bzw. Karunkeln und Nachgeburtsteilen unter Abwesenheit des Konzeptus diagnostizierbar, während im späteren Verlauf eine Resorption der Flüssigkeit beobachtet werden kann, begleitet von einer Involution des Uterus und Rückbildung der Karunkeln. Die Uteruswand erscheint verdickt.
Eine weitere Möglichkeit zur Erfassung pathologischer Zustände am weiblichen Genitale von Schafen beschreiben SCOTT u. GESSERT (1998). Dabei werden unter Verwendung einer 5-MHz-Sektorsonde die vorverlagerte Scheidenschleimhaut des Vorfalls unmittelbar kaudal der Vulva gescannt, der Schweregrad des Vorfalls bestimmt, und, je nach Ergebnis, unterschiedliche Vorgehensweisen bei der Zurückverlagerung vorgenommen. Ebenso beschreiben SCOTT et al. (2001) die Anwendung der Ultrasonographie im Zusammenhang mit Schwergeburten. Dabei konnte der Einsatz eines 5-MHz-Sektorscanners in einem Fall zur
Klärung der Erkrankungsursache beitragen. Es handelte sich hier um eine vaginale Einschnürung die durch Vernarbung einer Verletzung, verursacht durch eine übergangenen Geburt mit nicht entferntem Bühnerband, entstand. Diese Striktur führte nun zu einer Verengung der Urethra, was zu einem Urinrückstau in Blase und Nieren des Muttertieres führte.
2.3.4 Fetale Diagnostik
Die erste Möglichkeit eine Aussage über die Anzahl der Embryonen zu treffen, ohne diese selber darstellen zu können, besteht vor dem 20. Trächtigkeitstag in der Darstellung deutlich voneinander abgesetzter Fruchtblasen (KAULFUSS et al. 1996a).
Das Zählen der Embryonen, welche zwischen dem 25. und 30. Graviditätstag erstmalig sichtbar werden, ist noch bis zum 40. Tag von rektal unter Verwendung eines 5-MHz- Linearschallkopfes (KÄHN 1992; KAULFUSS et al. 1996a; 1999 MARTINEZ et al. 1998), möglich. KAULFUSS et al. (1996a) können um den 20. Tag erstmals einen Embryo diagnostizieren und im Verlauf der Trächtigkeit ab dem 26. Graviditätstag alle Früchte eines Muttertieres zählen. GEARHART et al (1988) gelingt dies erst ab dem 31. Tag der Gestation.
Generell stellen KAULFUSS et al. (1996a) fest, dass es mit steigender Anzahl an Früchten zu einer Vorverlagerung der frühesten Darstellungsmöglichkeit des ersten Konzeptus kam, sich aber mit Zunahme der Gesamtzahl der Feten die korrekte Diagnose aller Individuen auf einen späteren Graviditätszeitpunkt verschob. Gleichzeitig mit der ersten Darstellung der Embryonen, in Studien bei Schafen von KAULFUSS et al. (1996a) um den 22. Tag, unter Verwendung eines 7,5-MHz-Rektalschallkopfes ab Tag 18 (SCHRICK u. INSKEEP 1993), nach Untersuchungen von MARTINEZ et al. (1998) an Ziegen um den 20. Tag, werden auch erste Herzaktionen erkennbar, die ab hier zur Einschätzung der Vitalität der ungeborenen Lämmer herangezogen werden können (KANDIL et al. 1997). Eine Altersbestimmung der Früchte unter zu Hilfenahme der Frequenz des fetalen Herzschlages wird von AIUMLAMAI et al. (1992) beschrieben. Jedoch ist dieser Parameter weniger aussagekräftig, als andere fetale Messgrößen. Zu dem gleichen Ergebnis kamen auch CHAVEZ MORENO et al. (1996) die für ihre Erhebungen an Schafen ab dem 70. Trächtigkeitstag die M-Mode-Funktion ihres Ultraschallgerätes nutzten.
KÄHN et al. (1992) erfassen in ihren Untersuchungen die SSL bei Schafen zwischen dem 26.
und 65. Tag regelmäßig. KAULFUSS et al. (1999) führten bei Schafen Messungen der SSL durch und konnten feststellen, dass bis zum 38. Trächtigkeitstag die Entwicklung der SSL bei allen Früchten annähernd gleich verlief. Dies bestätigten Untersuchungen von SCHRICK u.
INSKEEP (1993) an Schaffeten und MARTINEZ et al. (1998) an Ziegen bis zum 40. Tag der Gestation. Danach entwickelte sich ein eher individueller, exponentieller Wachstumsverlauf, der bei Einlingen meist steiler anstieg als bei Mehrlingen (KAULFUSS et al. 1999). KÄHN et al. (1992) und auch CHAVEZ MORENO et al. (1996) sprechen jedoch von einem durchgehend linearen Wachstumsverlauf. Ebenso konnten KAULFUSS et al. (1999) feststellen, dass bei Zwillingen zwischen dem 20. und 50. Tag der Gravidität zu 87 % eine der beiden Früchte ein schnelleres Wachstum zeigte als die andere. Demgegenüber sahen CHAVEZ MORENO et al. (1996) keinen Zusammenhang zwischen embryonalem Wachstum und Anzahl der Früchte während des zweiten Trächtigkeitsmonates. KAULFUSS et al. (1999) beschreiben eine Abhängigkeit der SSL von der Schafrasse.
Mit 40 Tagen wird das transkutane Zählen der Embryonen mit Sektorscannern (3 MHz:
HAIBEL 1990; 5 MHz: KÄHN et al. 1992) zunehmend besser möglich, die Genauigkeit nimmt zu. AIUMLAMAI et al. (1992) verwenden für ihre transabdominellen Ultraschalluntersuchungen am „sitzenden“ Tier Wandlerfrequenzen von 3,5 - 7,5 MHz, WHITE et al. (1984) benutzten 2,25 - 3,5-MHz-Schallköpfe. Auch die zunehmenden Eigenbewegungen der Früchte erleichtern diese Maßnahme (GEARHART et al. 1988). Eine Unterscheidung in Einlinge bzw. Mehrlinge kann mit hoher Zuverlässigkeit vorgenommen werden (WHITE et al. 1984), während eine genauere Differenzierung der Mehrlinge durch Übersehen einer Frucht unter Umständen zu einer höheren Fehlerquote führen kann (WHITE et al. 1984; GEARHART et al.1988; HAIBEL 1990). Auch kommt die doppelte Zählung einer Frucht gelegentlich vor (WHITE et al.1984). Dies tritt besonders dann auf, wenn der Untersucher transkutan von beiden Seiten untersucht. DAVEY (1986) stellt an Hand seiner Untersuchungen in großen Schafherden fest, dass das Volumen der Fruchtflüssigkeit bei Zwillingen höher ist, als das bei Einlingen und dass dieser Unterschied zur Differenzierung zwischen Einlingen und Zwillingen herangezogen werden kann.
Ab dem 100. Trächtigkeitstag wird nach WHITE et al. (1984), DAVEY (1986) und KANDIL et al. (1997) die Diagnose der Anzahl der Früchte durch ihre zunehmende Größe erschwert.
SCHEERBOOM u. TAVERNE (1985) und CHAVEZ MORENO et al. (1996) empfehlen ab diesem Graviditätsstadium die Verwendung eines 3,0 - 3,5-MHz-Schallkopfes.
Im zweiten Drittel der Gestation lassen sich eine Vielzahl von Organen an Schaf- und Ziegenfeten diagnostizieren (SCHEERBOOM u. TAVERNE 1985; AIUMLAMAI et al.
1992; CHAVEZ MORENO et al. 1996). KAULFUSS et al. (1996a) beschreiben diese Möglichkeit schon ab dem 30. Tag nach Bedeckung. Besonders deutlich lassen sich im Ultraschallbild Schädelhöhle mit Augen, Herz, Magen, Nabel sowie knöcherne Anteile darstellen, wobei zahlreiche Parameter zur Einschätzung der Trächtigkeitsdauer untersucht worden sind. Es wurden von KÄHN et al. (1992) der Augendurchmesser, Biparietaldurchmesser, der Rumpfdurchmesser und die Breite einer Rippe plus Interkostalraum vermessen. Der Querdurchmesser des Rumpfes wurde auf Höhe der letzten Rippe, kurz vor der Nabelschnur, festgestellt (AIUMLAMAI et al. 1992; KÄHN et al. 1992;
CHAVEZ MORENO et al. 1996). Während, neben der Messung der SSL, auch der Rumpfdurchmesser regelmäßig ab dem 26. Tag der Gravidität gemessen wurde (KÄHN et al.
1992), konnten die übrigen oben aufgezählten Parameter erst mit Einsetzen der Ossifikation ab dem 52. - 66. Tag deutlich dargestellt werden. Die Vermessung des Thoraxdurchmessers sowie der Kopfweite finden bei KLEEMANN et al. (1987) und SERGEEV et al. (1990) Eingang in Studien zum Wachstum von ovinen Feten. Dabei stellt sich heraus, dass die Kopfweite eine sehr genaue Messgröße darstellt, während der Thoraxdurchmesser starken Schwankungen unterliegt. Dagegen beschreiben SERGEEV et al. (1990) beide Messgrößen als hinreichend genau. Der Biparietaldurchmesser (BPD) nimmt bei Schaf- und Ziegenfeten im Verlauf der Entwicklung nahezu linear zu (HAIBEL et al. 1989b; HAIBEL u. PERKINS 1989a) und auch KÄHN et al. (1992) beschreiben die Entwicklung aller fetalen Strukturen als linearen Verlauf. Für die transkutanen Messungen verwenden HAIBEL u. PERKINS (1989a), HAIBEL et al (1989b) und SERGEEV et al. (1990) einen 5-MHz-Linearschallkopf, während KLEEMANN et al. (1987) einen 3,5-MHz-Linearwandler benutzen. Die SSL (KÄHN et al.
1992), der BPD sowie der Rumpfdurchmesser (KÄHN et al. 1992; CHAVEZ MORENO et al.
1996) lassen die höchste Genauigkeit bei der Einordnung in ein Trächtigkeitsstadium. zu AIUMLAMAI et al. (1992) stellen allerdings fest, dass 48,3 % der Daten welche für die Messung des BPD bei Schaffeten erhoben wurden, Positionen darstellten, in denen keine symmetrischen Messungen vorgenommen werden konnten. Dieselbe Problematik beschreiben
HAIBEL u. PERKINS (1989a), HAIBEL et al. (1989b), SERGEEV et al. (1990) und CHAVEZ MORENO et al. (1996). Demgegenüber soll sich der Rumpf wesentlich einfacher vermessen lassen (AIUMLAMAI et al. 1992). Rasse- und Entwicklungsunterschiede sind nach Aussagen von HAIBEL u. PERKINS (1989a) bis zum 80. Trächtigkeitstag zu vernachlässigen.
Zur Ermittlung des Graviditätsstadiums durch Vermessung fetaler Parameter empfehlen KÄHN et al. (1992) während des 2. und 3. Trächtigkeitsmonats die Messung der SSL, da hier das Wachstum aller Früchte im Uterus noch als uniform zu beschreiben ist. Zu einem späteren Zeitpunkt bevorzugen KÄHN et al. (1992) die Vermessung anderer Strukturen wie z.B.
Augen und Rumpfdurchmesser abhängig von der Lage des Fetus und somit der Erreichbarkeit. Dabei bevorzugen KÄHN et al. (1992) die Messung des Augendurchmessers, während AIUMLAMAI et al. (1992) und CHAVEZ MORENO et al. (1996) die Messung des Rumpfes hervorheben. Auch beschreiben KÄHN et al. (1992) eine Kombination aus der Vermessung mehrerer fetaler Strukturen als zuverlässiger, wohingegen CHAVEZ MORENO et al. (1996) dieser Aussage widersprechen. Nach ihren Aussagen bringt der Einsatz von Messkombinationen verschiedener fetometrischer Parameter keine bessere Bestimmung des Graviditätszeitpunktes mit sich.
2.3.5. Geschlechtsdiagnostik
Die Geschlechtsfeststellung bei Schaffeten wurde von COUBROUGH und CASTELL (1998) erstmalig bei 29 mit Einlingen tragenden Schafen durchgeführt. Hierbei wurden die genüchterten Tiere zwischen dem 60. und 69. Graviditätstag einmalig transrektal im Stehen untersucht. Bei ungünstigen Positionen des Fetus zum Schallkopf wurden auch vereinzelt Tiere zur Untersuchung in Rückenlage verbracht. BÜRSTEL et al. (2001a,b) und NAN et. al.
(2001) schlagen die transabdominelle Ultraschalluntersuchung am stehenden Tier von der rechten Seite vor. Dazu untersuchten BÜRSTEL et al. (2001a,b) zunächst mit bis zu vier Lämmern tragende Schafe und Ziegen in einem Zeitraum vom 50. - 75. Trächtigkeitstag, und NAN et al. (2001) untersuchten 5 mit Einlingen tragende Tiere täglich in einem Zeitraum zwischen dem 50. und 130. Trächtigkeitstag. Des weiteren wurde von beiden Arbeitsgruppen eine einmalige Untersuchung unter Praxisbedingungen durchgeführt, wobei NAN et al.
(2001) auch hier nur Einlingsgraviditäten untersuchte. Für die Ultraschalluntersuchungen wurden 5-MHz-Linearschallköpfe verwendet (COUGBROUGH u. CASTELL 1998;
BÜRSTEL et al. 2001a,b; NAN et al. 2001). Die Feten wurden sowohl von COUGBROUGH u. CASTELL (1998) als auch von NAN et al. (2001) als männlich definiert, wenn der Tuberculus genitalis direkt hinter der Nabelschnur zu lokalisieren war, wobei COUBROUGH u. CASTELL (1998) diesen als stark echogenen Punkt beschreiben. BÜRSTEL et al.
(2001a,b) beschreiben zur Diagnose des männlichen Geschlechts das Auffinden eines häufig zweigelappten Präputiums hinter der Nabelschnur und / oder die Darstellung des dreieckig erscheinenden Skrotums zwischen den Hintergliedmaßen. Als weiblich wurden die Früchte von COUGBROUGH u. CASTELL (1998) angesprochen, wenn der Genitalhöcker im Bereich des Schwanzes zu finden war. BÜRSTEL et. al. (2001b) hingegen beschreiben den weiblichen Genitalhöcker als schwer darstellbar und meist von der Schwanzbasis verdeckt und auch NAN et al. (2001) bestätigen dies. Die ultrasonographisch festgestellten Geschlechter wurden mit den Geschlechtern der geborenen Lämmer verglichen (COUBROUGH und CASTELL 1998; BÜRSTEL et al. 2001a,b; NAN et al. 2001).
Während COUBROUGH und CASTELL (1998) den 60. - 69. Trächtigkeitstag als Untersuchungszeitpunkt angeben, wird von NAN et al. (2001) eine Zeitspanne vom 65. - 100.
Trächtigkeitstag als mögliches Untersuchungsintervall vorgeschlagen. BÜRSTEL et al.
(2001b) nennen zwei Untersuchungsperioden: den 50. - 56. und den 66. - 70. Tag der Gravidität, in denen auch bei mit Mehrlingen tragenden Muttern das Geschlecht der Feten genau bestimmt werden kann. Insgesamt konnten COUBROUGH u. CASTELL (1998) in 93
% der Fälle den Feten ein Geschlecht zuordnen, was zu 89 % eine korrekte Diagnose lieferte, bei NAN et al. (2001) traf dies in 78 % der Fälle zu. BÜRSTEL et al. (2001b) lieferten durch tägliche Untersuchungen bei Schafen in 86 % der Fälle eine korrekte Geschlechtsdiagnose, bei Ziegen traf diese zu 92 % zu. Unter Praxisbedingungen konnte bei einmaliger Untersuchung in 64 % der Fälle das Geschlecht korrekt bestimmt werden. Dabei schien die Untersuchung bei den männlichen Tiere leichter und genauer durchführbar, als bei den weiblichen Feten (COUBROUGH u. CASTELL 1998; BÜRSTEL et al. 2001a,b). Im Gegensatz dazu lieferten die transabdominellen Untersuchungen der Arbeitsgruppe um NAN et al. (2001) korrekte Ergebnisse von 88,5 % bei den männlichen und 88,9 % bei den weiblichen Feten.
2.4 Weitere Methoden zur Geschlechtsfeststellung bei kleinen Wiederkäuern und anderen Tierarten
2.4.1. Vorherbestimmung des Geschlechts der Spermien
Bei der Sortierung von Spermien mittels Durchflusszytometrie handelt es sich nicht um eine Geschlechtsfeststellung im eigentlichen Sinne, sondern um eine Vorherbestimmung des Geschlechtes, welche man durch eine ultrasonographische Geschlechtsdiagnostik überprüfen kann.
Seit dem 01.09.2000 ist es möglich, tiefgefrorenes „gesextes“ Sperma von Bullen in Großbritannien zur gezielten Produktion von Nachkommen eines gewünschten Geschlechtes zu erwerben (GARNER 2001).
Frühe Studien zur Entwicklung eines Verfahrens zur Trennung von X- und Y- Chromosomen tragenden Spermien mittels Durchflusszytometer wurden bereits von GARNER et al. (1983) durchgeführt. Die vorbereitenden Maßnahmen zur Durchführung des Sortiervorgangs führten jedoch in allen Fällen zum Verlust der Vitalität der Spermien. (GARNER et al. 1983;
TERVIT 1989). GARNER et al. (1983) fanden bei der Untersuchung gefärbter Spermienkerne heraus, dass sich bei den Säugetieren, deren Spermien X- und Y- Chromosomen enthalten, zwei überlappende Spitzen im Histogramm darstellen lassen. Dabei besitzt jede Spezies unterschiedlichen Differenzen in der Fluoreszenzintensität von
„männlichen“ und „weiblichen“ Spermien (GARNER et al. 1983).
Diese Differenz beträgt bei Schafböcken nach GARNER (2001) 4,0 % und nach GARNER et al. (1983) 4,1 %. JOHNSON u. WELCH (1999) und JOHNSON (2000) sprechen von 4,2 %.
Je größer die Differenz zwischen den X- und den Y- tragenden Spermien bei der durchflusszytometrischen Messung ist, desto genauer ist die Trennrate der unterschiedlichen Spermien (JOHNSON u. WELCH 1999; JOHNSON 2000).
Durchflusszytometrische Analysen der Spermien fertilitätsreduzierter Schafböcke zeigten im Flowzytometer neben den X- und Y- Spitzen mit 4,5 % Differenz, 3 weitere Peaks im Histogramm (LEWALSKI et al. 1991). Damit konnten unbalancierte Spermien von Trägern der 1 / 20 Translokation nachgewiesen werden.
Nach Einsatz von Lebendfarbstoffen, wie z.B. Hoechst 33342, und Verbesserungen an den Geräten gelang die Vorselektion lebender Spermien mit nahezu 90 %iger Reinheit
(JOHNSON u. WELCH 1999; JOHNSON 2000). „Gesexte“ Spermien wurden in der IVF (JOHNSON u. WELCH 1999; RATH et al. 1999; JOHNSON 2000) und Besamung (MORELL et al. 1988; JOHNSON u. WELCH 1999; JOHNSON 2000) eingesetzt. Dabei wurden bei Schweinen mittels X-„gesexter“ Spermien Würfe gezeugt, die zu 97 % aus weiblichen Tieren bestanden (RATH et al. 1999). Derartige Nachkommen zeigten keinerlei Missbildungen und normale Fertilität (MORELL et al. 1988; JOHNSON u. WELCH 1999;
GARNER 2001). Ebensolche Erfolge ließen sich auch beim Rind erzielen (MORELL et al.
1988; JOHNSON 2000).
Das erste Bocklamm, welches durch eine intrazytoplasmatische Injektion eines männlichen Spermiums gezeugt wurde, wurde 1995 geboren (CATT et al. 1996). Auch dieses Tier zeigte eine normale Entwicklung. Versuche von CRAN et al. (1997) bei Schafen konnten zeigen, dass eine laparoskopische Besamung mit geringen Dosen „gesexten“ Spermas zum Erfolg führen kann. Vier von 43 mit „weiblichen“ Spermien besamten Schafe trugen 6 Mutterlämmer aus, wohingegen keine der mit Y- Spermien besamten Muttern tragend wurde.
Eine Verbesserung der Orientierung der Spermien zur Laserquelle mittels einer speziellen Düse (Beltsville Sperm Sexing Technology) erhöhte die Genauigkeit von anfänglich 25 % - 30 % auf über 70 % und verbesserte somit auch die Sortiergeschwindigkeit auf 6 Millionen Spermien / h (JOHNSON u. WELCH 1999; RATH et al. 1999; JOHNSON 2000). Während des „sexing“-Vorganges kommt es bei einem hohen Anteil an Spermien bereits zu einer Präkapazitation, was einen Vorteil bei der Anwendung zur IVF darstellen soll (JOHNSON u.
WELCH 1999; RATH et al. 1999; JOHNSON 2000), aber bei der Tiefgefrierung zu Nachteilen führen kann (JOHNSON 2000).
Über eine neuere nicht-invasive Methode zur Geschlechtsfeststellung bei Spermien berichteten BLECHER et al. (1999). Dabei werden Antikörper gegen nicht- geschlechtsspezifische Proteine eingesetzt, diese Antigen-Antikörperkomplexe entfernt und anschließend mittels Geschlechtschromosom-spezifischen Antikörpern die geschlechtsspezifischen Proteine auf der Spermamembran nachgewiesen. Mit diesen Untersuchungen konnte zunächst bewiesen werden, dass die Möglichkeit der immunologischen Geschlechtsfeststellung von Spermien besteht und hierdurch lebende Spermien erfolgreich nach Geschlecht sortiert werden können.
Andere Methoden zur Spermientrennung (z.B. Zentrifugationsverfahren) erwiesen sich als nicht reproduzierbar und zu ungenau1.
2.4.2. Geschlechtsfeststellung an Embryonen
Eine Vielzahl von Methoden (Karyotypisierung, Nachweis von Geschlechtschromatin und Messung von Stoffwechselaktivitäten) das Geschlecht von Embryonen aus Embryotransferprogrammen vor Übertragung in das Empfängertier zu bestimmen konnten wegen fehlender Schnelligkeit oder mangelnder Genauigkeit nicht kommerziell zum Einsatz gebracht werden. (TERVIT 1989; BREDBACKA et al. 1995; BREDBACKA 1998).
Erst die Entwicklung der PCR erlaubte den praktischen Einsatz des „Embryonensexens“. Die Verwendung dieser Methode bringt sehr genaue Ergebnisse innerhalb weniger Stunden (2 Std.: PARK et al. 2001, 3 Std.: HERR et al. 1990; GUTIERREZ-ADAN et al. 1997; 4 Std.:
LEONIE et al. 2000). Ein Nachteil ist, dass den Embryonen einige Zellen entnommen werden müssen, was zu einer Einschränkung der Überlebensfähigkeit führen kann (BREDBACKA 1998).
Zur Biopsieentnahme empfehlen die verschiedenen Arbeitsgruppen unterschiedliche Techniken abhängig davon, wie viel Material benötigt wird und ob der Embryo frisch übertragen oder zur Tiefgefrierung genutzt werden soll. BREDBACKA et al. (1995) empfehlen die «scratched bottom»-Technik zur Fixierung der Embryonen, wobei mittels eines Rasierklingenfragmentes etwa 15 % der Zellen (Trophoblastzellen) entnommen werden.
LEONIE et al. (2000) verwendeten bei Schafembryonen Mikronadeln, die Zona pellucida zu perforieren. Die an der Perforationsstelle resultierende Trophoblasthernie von etwa 20 Zellen wurde anschließend entnommen und analysiert. Bei der Aspirationstechnik können Einzelzellen entnommen werden (AGCA et al. 1998; CHRENEK et al. 2001), jedoch birgt dies dann die Gefahr, dass sie bei der Übertragung in das Reaktionsgefäß verloren gehen (BREDBACKA 1998; CHRENEK et al. 2001). Morulae und frühe Blastozysten eignen sich besonders gut für die Entnahme der Biopsie, wobei bei letzteren der Embryonalknoten unversehrt bleiben sollte (HERR u. REED 1991; BREDBACKA 1998; LEONI et al. 2000).
1laut persönlicher Mitteilung von Frau S. Meinecke-Tillmann, Hannover am 11. Februar 2002
CHRENEK et al. (2001) und PARK et al. (2001) benötigen zur Geschlechtsdiagnostik bei Rinderembryonen im 16 - 32- bzw. 8 - 16-Zellstadium nur eine Blastomere. HERR u. REED (1991) zeigten in ihren Versuchen an Rinderembryonen, dass diese auch nach Entnahme von 4 - 10 Zellen eingefroren werden können. Des weiteren beobachteten PARK et al. (2001), dass sich „gesexte“ Rinderembryonen besser bis zur geschlüpften Blastozyste entwickelten, als Embryonen der Kontrollgruppe, da die Öffnung in der Zona pellucida zu einem assistierten Zonaschlupf verhalf.
Nach der Biopsie der Zellen wird die DNA denaturiert und mit spezifischen Primern amplifiziert. Dabei empfehlen HERR u. REED (1991), BREDBACKA (1998), CHRENEK et al. (2001) und PARK et al. (2001) bei Rindern die Kombination eines Y-spezifischen Primers mit einer autosomalen Sequenz, die als Kontrolle dient. Auch HERR et al.(1990) verwenden bei Schafen neben einer Y-spezifische Sequenz (OY11.1) einen autosomalen Primer, während GUTIERREZ-ADAN et al. (1997) einen schafspezifischen Y-Chromosom Primer (RAPD) benutzen und parallel dazu die ZFX / ZFY-Sequenz einsetzen. NG et al. (1996) nutzen die schafspezifische HMG - box aus der SRY-Sequenz, ebenfalls in Kombination mit einem autosomalen Primer. LEONIE et al. (2000) verwenden bei ihren Versuchen mit Schafembryonen einzig die ZFX / ZFY-Region als Primer, AGCA et al. (1998) nutzten dieselbe Region schon bei Rinderembryonen. Die Denaturierung und Amplifizierung der DNA wird mehrmals wiederholt, bis sich eine nachweisbare Menge des gewünschten Produktes im Reaktionsgefäß befindet. (BREDBACKA 1998). Danach werden die während der PCR entstandenen Produkte mittels Gelelektrophorese (NG et al. 1996; GUTIERREZ- ADAN et al. 1997; AGCA et al. 1998; BREDBACKA 1998; LEONIE et al. 2000; PARK et al. 2001) nachgewiesen. Dieser Schritt beinhaltet ein hohes Risiko der Kontamination, was zu falschen Diagnosen führen kann. Dennoch führt diese Methode im Rahmen der Geschlechtsfeststellung zu einer Genauigkeit von 85 % (AGCA et al. 1998), 91 % (CHRENEK et al. 2001), 90 - 100 % (BREDBACKA 1998) bzw. 100 % (GUTIERREZ- ADAN et al. 1997; LEONI et al. 2000). LIMANSKY u. LIMANSKAYA (1999) entwickelten ein universelles Analysesystem, bei dem die nicht speziesspezifischen SRY-Sequenzen von Rindern, Schafen, Ziegen und Schweinen zur Geschlechtsbestimmung herangezogen werden.
Eine Vereinfachung und Beschleunigung des „Sexens“ mittels PCR konnte nach BREDBACKA et al. (1995) und BREDBACKA (1998) durch Zugabe eines
Fluoreszenzfarbstoffs in den PCR-Behälter erreicht werden, das die Gelelektrophorese in der bisherigen Methode überflüssig wurde. Unter UV-Licht wird eine Rosafärbung erzielt, wenn männliche DNA-Fragmente von Rinderembryonen vorhanden sind. Dieser Nachweis liefert innerhalb von 2,5 Std. ein 95 %iges Resultat. Ein Nachteil des angewendeten Verfahrens besteht im Fehlen eines autosomalen Primers, der das Vorhandensein einer Probe im Reaktionsgefäß sicherstellt, weswegen der Autor eine Übertragung der zu analysierenden Zellen unter dem Stereomikroskop empfiehlt.
Untersuchungen von AGCA et al. (1998) an Kälbern nach Embryonensexing und Tiefgefrierung zeigten, dass auch nach Manipulationen im Morulastadium normale, gesunde Kälber ohne erhöhte Anzahl an Geburtsstörungen geboren wurden. Auch kann bei Zwillingsgraviditäten mit „gesexten“ Embryonen bei Rindern der Freemartinismus vermieden werden (AGCA et al. 1998).
Ein weiterer Fortschritt in der Anwendung der PCR zur Geschlechtsdiagnose kann die Kombination dieser mit dem Nachweis anderer genetischer Erkrankungen, z.B. BLAD bei Rindern, sein (BREDBACKA 1998; CHRENEK et al. 2001).
Ein immunologisches Verfahren zur Diagnose des Geschlechts bei Embryonen besteht aus dem Nachweis des H-Y-Antigens der männlichen Embryonen (BONDURANT et al. 1986;
HOSSEPIAN DE LIMA et al. 1993). Die aus einer Embryonenspülung gewonnenen Schaf- (BONDURANT et al. 1986) bzw. Rinderembryonen (HOSSEPIAN DE LIMA et al. 1993) werden zunächst mit Antikörpern von Mäusen gegen das H-Y-Antigen inkubiert.
Danach gibt es zum einen die Möglichkeit im zweiten Inkubationsschritt, die Embryonen mit Anti-Maus-Antikörpern, welche mit einem Fluoreszenzfarbstoff versehen sind, zu versetzen.
Diese Antikörper binden nun an die Mausantikörper gegen H-Y-Antigen und werden auf den männlichen Embryonen als Fluoreszenz nachgewiesen. Weibliche Embryonen hingegen zeigen lediglich eine diffuse Färbung. (BONDURANT et al. 1986; HOSSEPIAN DE LIMA et al. 1993).
Eine zweite Möglichkeit zur Geschlechtsbestimmung von Embryonen nach Inkubation mit Antikörpern gegen H-Y-Antigen besteht durch Anwendung eines Zytotoxizitätstests. Dabei wird den Embryonen im zweiten Inkubationsschritt Meerschweinchenserum zugegeben, was infolge der Komplementbindungsreaktion zu einer Lysis der H-Y-Antigen-exprimierenden
Embryonen führt. Mit dieser Methode können also nur weibliche, transferfähige Embryonen gewonnen werden (HOSSEPIAN DE LIMA et al. 1993).
Die Trächtigkeitsraten nach Anwendung immunologischer Nachweisverfahren zur Geschlechtsfeststellung bei Embryonen lagen bei Rindern um 75 % (HOSSEPIAN DE LIMA et al. 1993). BONDURANT et al. (1986) beschreiben dagegen die Trächtigkeitsraten bei Schafen nach „Embryonensexen“ durch Antikörperbehandlung als herabgesetzt.
2.4.3 Bestimmung des fetalen Geschlechtes nach Fruchtwasseraspiration
Nach Gewinnung von Zellen mittels Fruchtwasseraspiration kann beim Rind eine Bestimmung des Geschlechtes durch zytogenetische Analyse (LEIBO u. RALL 1990) oder mittels PCR (KAMIMURA et al. 1997) vorgenommen werden.
Dabei besteht zum einen die Möglichkeit, chirurgisch von der linken Flanke aus den Uterus zu punktieren (LEIBO u. RALL 1990), zum anderen kann man das Punktat unter transvaginaler Ultraschallkontrolle gewinnen (KAMIMURA et al. 1997). Unter Sichtkontrolle ist es in den meisten Fällen möglich, gezielt das Ammnion zu durchstechen und dort Flüssigkeit zu gewinnen, da die Ammnionflüssigkeit mehr Zellmaterial für die Geschlechtsbestimmung enthält (KAMIMURA et al. 1997). LEIBO u. RALL (1990) nehmen die Amniozentese zwischen der 7. und 22. Woche vor, KAMIMURA et al. (1997) führen die Punktion des Uterus zwischen dem 59. und 250. Tag der Gravidität durch, wobei von ihnen gute Erfolge frühestens ab dem 70. Tag der Trächtigkeit erzielt werden. Davor ist die Ammnionflüssigkeit in noch zu geringer Menge vorhanden und die Gefahr eines Abortes hoch. Beide Arbeitsgruppen beschreiben eine erhöhte Abortgefahr durch wiederholte Punktionen, einen erhöhten Keimeintrag oder Punktion der Frucht.
Es besteht durch das Durchstechen des Uterus eine erhöhte Gefahr der Kontamination der Probe mit maternalen Zellen (LEIBO u. RALL 1990; KAMIMURA et al. 1997), was LEIBO u. RALL (1990) durch Verwendung eines Systems mit zwei Spritzen, bei der das Punktat der ersten Spritze verworfen wird, zu umgehen versuchen.
Durch die Untersuchung der Chromosomen aus den gewonnenen und kultivierten Zellen konnte in 96,8 % eine korrekte Geschlechtsdiagnose durchgeführt werden (LEIBO u. RALL 1990). KAMIMURA et al. (1997) verwendeten für die Geschlechtsfeststellung durch PCR- Analyse sowohl einen spezifischen Primer für das männliche Geschlecht, als auch eine
geschlechtsneutrale DNA-Sequenz zum Nachweis der Probe im Reaktionsgefäß. Diese Methode brachte in 90,5 % der Untersuchungen ein korrektes Ergebnis (KAMIMURA et al.
1997).
2.4.4 Geschlechtsfeststellung durch die Analyse fetaler Zellen im maternalen Blut Neben der ultrasonographischen Geschlechtsfeststellung besteht als weitere nicht invasive Methode das Geschlecht des Ungeborenen zu ermitteln, der Nachweis fetaler DNA im mütterlichen Blut (HONDA 2001, RIJNDERS et al. 2001). Dabei gelingt der Nachweis der fetalen DNA sowohl im Serum als auch im Plasma unter Anwendung der PCR (LAGONA et al. 1998; HONDA et al. 2001, RIJNDERS et al. 2001). LAGONA et al. (1998) untersuchten schwangere Frauen zwischen der 6. und 36. Schwangerschaftswoche, HONDA et al. (2001) untersuchten zwischen der 10. und 17. Schwangerschaftswoche und RIJNDERS et al. (2001) hatten Patienten zwischen der 8. und 17. Woche der Gestation. Zum Nachweis der DNA eines männlichen Fetus im mütterlichen Blut werden Y-Chromosom-spezifische Primer verwendet und mittels Gelelektrophorese analysiert. Dabei verwenden HONDA et al. (2001) zwei Y- spezifische Primer und erreichen damit ein 100 %ige Genauigkeit bei der Analyse der Serumblutproben. Bei den 4 männlichen Feten die bei Analyse der Plasmablutproben nicht korrekt ermittelt werden konnten, handelte es sich um Schwangerschaften in der 11. - 13.
Woche, woraus die Arbeitsgruppe folgert, dass zu diesem Zeitpunkt die Konzentration der fetalen DNA im mütterlichen Blut noch zu gering ist. Die Analyse aller weiblichen Feten erfolgte sowohl im Serum, als auch bei Verwendung der Plasmablutprobe korrekt (HONDA et al. 2001). LAGONA et al. (1998) empfehlen die Verwendung einer 2 - 4fachen Wiederholung der PCR-Analyse, RIJNDERS et al. (2001) wiederholen den PCR- Vorgang dreimal. Die Untersuchung der Proben unter Verwendung der SRY- Sequenz als geschelchtsspezifischen Primer, brachte in den Experimenten von RIJNDERS et al. (2001) einen Erfolg von 97,8 %.
