der Indikationsgruppe Herz-Kreislauf-Erkrankungen der Aventis Pharma Deutschland GmbH
Effekte einer chronischen Behandlung mit dem ACE-Inhibitor Ramipril, dem ACE/NEP-Inhibitor AVE 7688 sowie in Kombination mit dem B2-
Rezeptor-Antagonisten HOE 140 in adulten diabetischen und nicht- diabetischen Ratten
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Alexandra Hahn
aus New York Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Manfred Kietzmann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Manfred Kietzmann 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Reinhard Mischke
Tag der mündlichen Prüfung: 26. Mai 2003
Meiner Familie
Abkürzungsverzeichnis
1. EINLEITUNG... 13
2. LITERATURÜBERSICHT ... 15
2.1 Diabetes ... 15
2.1.1 Definition, Epidemiologie und Diagnose... 15
2.1.2 Pathophysiologie des Typ-2-Diabetes ... 18
2.2 Diabetische Nephropathie und terminale Niereninsuffizienz... 20
2.2.1 Therapeutische Ansätze und Epidemiologie... 20
2.2.2 Pathophysiologie... 23
2.3 Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System... 25
2.4 Das Kallikrein-Kinin-System ... 27
2.4.1 Bradykinin... 28
2.5 Angiotensin-Konversionsenzym-Inhibitoren... 29
2.6 Angiotensin-Konversionsenzym/Neutrale Endopeptidase-Inhibitoren ... 30
2.7 Tiermodell... 34
2.8 Fragestellung... 37
3. MATERIAL UND METHODEN ... 39
3.1 Tiere und deren Haltungsbedingungen ... 39
3.2 Verwendete Sustanzen... 39
3.2.1 Ramipril ... 39
3.2.2 Substanz AVE 7688... 43
3.2.3 Substanz HOE 140... 44
3.3 Untersuchungen ... 46
3.3.1 Allgemeiner Versuchsablauf... 46
3.3.2 Gruppenzusammensetzung ... 47
3.3.3 Implantation der osmotischen Minipumpen ... 48
3.3.4 Bestimmung der Körpermasse, der Futter- und Wasseraufnahme ... 50
3.3.6.1 Bestimmung von Gesamtcholesterin... 53
3.3.6.2 Bestimmung der Angiotensin-Konversionsenzym-Aktvität ... 53
3.3.6.3 Bestimmung von Glukose und HbA1c... 54
3.3.7 Blutdruckmessung... 55
3.3.8 Oraler Glukose-Toleranztest ... 56
3.3.9 Enduntersuchung nach 26-wöchiger Behandlung... 56
3.3.9.1 Herz- und Blutentnahme... 56
3.3.9.2 Sektion... 57
3.3.10 WORKING HEART ... 58
3.3.10.1 Modell... 58
3.3.10.2 Meßbare Parameter... 65
3.3.10.3 Berechnete Parameter... 65
3.3.10.4 Belastungstest am WORKING HEART... 68
3.3.10.4.1 Nachlasterhöhung ... 68
3.3.11 Bestimmung von Insulin im Plasma ... 68
3.3.12 Bestimmung der Substanz MDL 108.048 im Plasma ... 69
3.3.13 Autoradiographische-Bindungsuntersuchung der Substanz AVE 7688 in der Rattte ... 70
3.3.14 Nierenhistologie... 71
3.4 Statistik ... 72
4. ERGEBNISSE... 74
4.1 Körpermasse, Futter und Wasseraufnahme ... 74
4.1.1 Körpermasse... 74
4.1.2 Futteraufnahme ... 75
4.1.3 Wasseraufnahme ... 77
4.2 Ergebnisse der Urinuntersuchungen ... 78
4.2.1 Ergebnisse der Untersuchung von Albumin und Creatinin im Urin... 78
4.2.2 Ergebnisse der Untersuchung von Glukose im Urin... 81
4.3 Ergebnisse der Bestimmung von Cholesterin im Plasma ... 83
4.4 Angiotensin-Konversionsenzym-Aktivität ... 85
4.5 Ergebnisse der Bestimmung von Glukose und HbA1c im Plasma... 88
4.6 Ergebnisse der Blutdruck- und Herzfrequenzmessung... 91
4.8 Ergebnisse im WORKING HEART ... 96
4.8.1 Ergebnisse der Nachlasterhöhung... 96
4.8.2 Basalwerte bei 80 mmHg Nachlast... 102
4.9 Ergebnisse der Bestimmung von Insulin ... 106
4.10 Nachweis der Substanz MDL 108.048 im Plasma ... 108
4.11 Ergebnisse der autoradiographischen-Bindungsuntersuchung von der Substanz AVE 7688 in der Ratte... 109
4.12 Organgewichte ... 110
4.13 Nierenhistologie... 114
5. DISKUSSION... 120
5.1 Effekte von ACE-Inhibitoren, ACE/NEP-Inhibitoren und B2-Rezeptorblockade auf renale Funktion und Morphologie ... 120
5.1.1 Einfluss auf den Blutdruck... 120
5.1.2 Einfluss auf Glukose im Urin ... 124
5.1.3 Einfluss auf Nierenhistologie und Albumin/Creatinin-Ausscheidung im Urin 125 5.1.4 Radiobindungsstudie... 130
5.1.5 Einfluss auf Angiotensin-Konversionsenzym-Aktivität ... 131
5.1.6 Einfluss auf Cholesterin im Plasma ... 132
5.1.7 Einfluss auf Plasma-Glukose und HbA1c... 135
5.1.8 Einfluss auf den oralen Glukose-Toleranztest und Plasma-Insulin ... 137
5.2 Untersuchung der kardialen Funktion... 139
5.3 Ergebnisse weiterer Untersuchungen... 140
5.3.1 Körpermasse, Futter- und Wasseraufnahme ... 140
5.3.2 Organgewichte ... 142
5.4 Mögliche Rolle der Kinine – Effekte der Behandlung mit der Substanz HOE 140 ... 144
5.5 Abschliessende Betrachtung ... 146
6. ZUSAMMENFASSUNG ... 148
7. SUMMARY ... 151
Abkürzungen
Α alpha Abb. Abbildung
ACE Angiotensin-Konversionsenzym ADA American Diabetes Association
AF Aortenfluss ALP afterload pressure/ Nachlast Ang I Angiotensin I
Ang II Angiotensin II
ANP atriales natriuretisches Peptid aqua dest. destilliertes Wasser
ARB Angiotensin-Rezeptor-Blocker AT1 Angiotensin-1 (Subtyp)-(Rezeptor) AT2 Angiotensin-2 (Subtyp)-(Rezeptor) β beta
BD Blutdruck BNP “brain” natriuretisches Peptid bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
ca. circa
cAMP cyklisches Adenosinmonophosphat CF Koronarfluß
cGMP cyklisches Guanosinmonophosphat cm Zentimeter
CNP „c“ Typ natriuretisches Peptid
CoA Coenzym A
D Durchmesser dl Deziliter
dLVP/dt max maximale Druckanstiegsgeschwindigkeit des linken Ventriles dLVP/dt min maximale Druckabfallsgeschwindigkeit des linken Ventriles DNP dendroaspis natriuretisches Peptid
Dr. Doktor E Effizienz
EDTA ethylene diamine tetraacetic acid/Ethylendiaminteraessigsäure
ESRD/ESRF end-stage renal disease/ end-stage renal failure/ terminale Niereninsuffizienz ET ejection time/ Auswurfzeit
et al. “et alii“
Fa. Firma
FDA Food and Drug Administration g Gramm
g (phys) Gravitation
GTP Guanosintriphosphat
h hour/ Stunde
HbA1c glykolisiertes Hämoglobin1c
HDL „high density lipoprotein“
Hg Quecksilber
HMG 3-Hydroxy-3-methyl-glutarsäure HP heart power/ Herzleistung
HR heart rate/ Herzfrequenz HW heart work/ Herzarbeit
IC inhibitory constant/ inhibitorische Konstante
I.E. internationale Einheit
i.G.T. impaired glucose tolerance/ eingeschränkte Glukosetoleranz i.m. intramuskulär
i.p. intraperitoneal J Joule
JCR James C. Russell
KD Dissoziationskonstante
kDa Kilodalton kg Kilogramm
Ki Hemmkonstante
l Liter LDL „low density lipoprotein“
LH Langendorff-Herz
LVEDP left ventricular enddiastolic pressure/ linksventrikulärer enddiastolischer Druck
LVSP left ventricular systolic pressure/ linksventrikulärer systolischer Druck m Masse
µ mikro min Minute mg Milligramm (10-3 Gramm) ml Milliliter (10-3 Liter) mm Millimeter (10-3 Meter) mmol Millimol (10-3 Mol)
ms Millisekunde (10-3 Sekunde) µg Mikrogramm (10-6 Gramm) µmol Mikromol (10-6 Mol)
MVO2 myokardialer Sauerstoffverbrauch n Anzahl der in einem Versuch verwendeten Tiere N Newton
NaCl Natriumchlorid
NADPH Nikotinamidadenindinukleotidphosphat NDDG National Diabetes Data Group
NEP neutrale Endopeptidase
NF-κB nuclear factor-κB/ Nuklearfaktor-κB ng Nanogramm (10-9 Gramm)
nm Nanometer (10 -9 Meter) nmol Nanomol (10-9 Mol)
NO Stickstoffmonoxid (“nitric oxide“) NYHA New York Heart Association
OGTT oraler Glukose-Toleranztest
p Irrtumswahrscheinlichkeit/ Signifikanz P Druck
Pa Pascal
PAS Periodsäure-Schiff PD Privatdozent
PDGF platelet derived growth factor/ Plättchen-aktivierter Wachstumsfaktor PKC Protein Kinase C
PLP preload pressure/ Vorlast pmol Picomol (10-12 Mol)
p.o. per os
pO2 Sauerstoffpartialdruck
Prof. Professor
ρ Dichte
r Radius
RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System RAS Renin-Angiotensin-System
RIA Radioimmunoassay s Sekunde
SEM standard error of the mean/ mittlerer Standardfehler SV Schlagvolumen
t time/ Zeit
Tab. Tabelle
TNFβ Tumor-Nekrose-Faktor beta
t-test statistischer Test
U Units /Einheiten
U.S.A. United States of America/ Vereinigte Staaten von Amerika v Geschwindigkeit
V Volumen
Vdia enddiastolisches Volumen
Vol. % Volumenprozent
VPI Vasopeptidase-Inhibitor vs. versus
Vsys endsystolisches Volumen
W Watt
WH WORKING HEART/ arbeitendes Herz
WHO World Health Organisation/ Weltgesundheitsorganisation
χ Mittelwert
z.B. zum Beispiel
ZDF Zucker Diabetic Fatty
ZF Zucker Fatty
1. EINLEITUNG
Die weltweite Zunahme der Inzidenz und Prävalenz des humanen Typ-2-Diabetes hat zu einem massiven Therapiebedarf dieser wachsenden Patientenpopulation geführt. Bei diesem benötigtem Therapiebedarf handelt es sich um einer der kostenintensivsten chronischen Behandlungen unserer Zeit (KING et al. 1998). Der Diabetes gilt als „Krankheit der Komplikationen“, sprich seiner Folgekrankheiten. Im Vordergrund stehen hierbei ein deutlich erhöhtes kardiovaskuläres Risiko, höhere Inzidenz von peripherer arterieller Verschlusskrankheit und Erkrankungen von Auge, Nerven und Nieren. Während die Anzahl der kardiovaskulären Todesfälle beim Menschen in der westlichen Welt langsam abnimmt, steigt sie überproportional bei Diabetikern an. Über 75 % der Patienten mit Diabetes mellitus sterben an ischämischen Gefäßkrankheiten. Im Vergleich zu stoffwechselgesunden Personen weisen Diabetiker ein deutlich erhöhtes kardiovaskuläres Risiko auf (HAFFNER et al. 1998).
Das terminale Nierenversagen, dem ätiologisch am häufigsten Bluthochdruck und Diabetes zugrunde liegen, ist ein wichtiges medizinisches Problem in den Industrienationen. Diabetes ist in 75% der klinischen Fälle die Ursache für eine derart schwerwiegend ausgeprägte Nephropathie (UNITED STATES RENAAL DATA SYSTEM 1999). Die Mehrzahl der Diabetiker mit Nephropathie enden im terminalen Nierenversagen.
Die Verhinderung der Nephropathie, oder zumindest eine Verlangsamung der Progression der Nephropathie wäre daher von großem Vorteil. Substanzen, die das Renin-Angiotensin- Aldosteron-System (RAAS) und/oder das Kallikrein-Kinin-System beeinflussen, zeigen hier die größte Wirksamkeit.
Eine Klasse von Substanzen, die erwiesenermaßen einen Behandlungseffekt in der diabetischen Nephropathie erzielen, sind Angiotensin-Konversionsenzym (ACE)-Hemmer (CHAN et al. 1992; LEWIS et al. 1993; RITZ u. STEIN 1994; REMUZZI u. BERTANI 1998). Sie bewirken eine Verlangsamung der Progression der Nephropathie in Patienten mit einem Typ-1 oder Typ-2-Diabetes, aber auch in Patienten, die Nephropathien anderen Ursprungs aufweisen. Gleichzeitig senken ACE-Hemmer das kardiovaskuläre Risiko dieser Patienten und gehören wegen dieser dualen Wirkung zur Standardtherapie bei Patienten mit
diabetischer Nephropathie (MANN et al. 2001). Über welchen Mechanismus sie beim Diabetiker kardio- und/oder renoprotektiv wirken, wird jedoch noch kontrovers diskutiert.
Die ACE/Neutrale Endopeptidase (NEP)-Inhibitoren stellen eine neue Klasse dar, die zusätzlich zum ACE auch das Enzym NEP hemmen. Seit etwa zehn Jahren sind mehrere Substanzen dieser Klasse in Entwicklung, es befindet sich jedoch noch kein ACE/NEP- Inhibitor auf dem Markt. Möglicherweise sind diese Substanzen wegen ihrer dualen Blockade in ihrer kardio- und renoprotektiven Wirkung effektiver als ACE-Hemmer.
In der vorliegenden experimenteller Arbeit sollten folgende Fragen unter Einsatz von diabetischen und nicht-diabetischen Ratten untersucht werden:
Ist eine Interventionsbehandlung mit einem ACE- oder ACE/NEP-Inhibitor möglich? Ist ein Einfluss auf das kardiovaskuläre oder renale System mit diesen Substanzen möglich?
Wenn die Behandlung mit diesen Substanzen Effekte zeigt, was ist die Rolle der Kinine?
Welche Rolle spielt die Blockade des B2-Rezeptors?
2. LITERATURÜBERSICHT 2.1 Diabetes
2.1.1 Definition, Epidemiologie und Diagnose
Der Diabetes mellitus stellt eine komplexe Stoffwechselstörung mit multifaktoriellem Ursprung dar. Er ist charakterisiert durch eine chronische Hyperglykämie und mit dieser einhergehenden Störungen des Kohlenhydrat-, Fett- und Proteinstoffwechsels, welche aus einer fehlerhaften Insulinsekretion, Insulinaktion oder einer Kombination von beiden heraus resultieren (ALBERTI u. ZIMMET 1999). In den letzten Jahrzehnten hat es eine drastische Zunahme an der Prävalenz des Diabetes mellitus beim Menschen gegeben; mit Veränderungen der Umwelt durch Modernisierung und Fortschritt sind auch Veränderungen im menschlichen Verhalten und deren Lebensweise einher gegangen. Hat früher körperliche Arbeit das Leben bestimmt, so wird es heute von sitzender Tätigkeit, wie z.B. Computerarbeit und automatisierten Produktionswegen dominiert. Hinzu kommt der steigende Konsum von kalorienreicher, industriell gefertigter Nahrung und Süßigkeiten. Diese tiefgreifenden Änderungen haben zu einer weltweit steigenden Prävalenz von Obesitas (Fettleibigkeit) und Diabetes geführt.
Innerhalb der nächsten 25 Jahre soll sich die Anzahl der an Diabetes mellitus erkrankten Personen weltweit verdoppeln, was heißt, dass im Jahr 2025 voraussichtlich ca. 300 Millionen Personen weltweit an Diabetes erkrankt sein werden. Während im Jahr 2025 in den Industrienationen voraussichtlich vorwiegend Personen über 65 Jahre an Diabetes mellitus erkranken, werden es in den Entwicklungsländern aufgrund von fortschreitender Urbanisierung und der größeren Anzahl von jüngeren Leute in der Population vorwiegend Personen im Alter von 45–65 Jahren sein (KING et al. 1998). Diese Verteilung macht deutlich, dass sozio-ökonomischer Wandel eine veränderte Epidemiologie mit sich bringt in Form einer Verjüngerung der an Diabetes mellitus erkrankten Personen. Gerade der als positiv angesehene Wohlstand bringt die „Wohlstandskrankheit“ Diabetes mit sich. Somit stellt der Diabetes eines der am häufigsten vorkommenden und kostenintensivsten Krankheiten unserer Zeit dar. Kostete der Diabetes z.B. dem amerikanischen
(NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH 2002). In Deutschland kann man von einer vergleichbaren Entwicklung ausgehen.
1979 stellte die World Health Organisation (WHO) und die National Diabetes Data Group (NDDG) eine Liste von Kriterien und ein Klassifikationssystem zusammen, die als Richtlinie für die Erstellung der Diagnose „Diabetes mellitus“ gelten sollte (NATIONAL DIABETES DATA GROUP 1979). Diese Richtlinien basierten auf einer Kombination von klinischer Manifestation und notwendiger Behandlung, z.B. insulinabhängigen und nicht- insulinabhängigem Diabetes mellitus. 1985 wurden die Kriterien leicht modifiziert (WORLD HEALTH ORGANISATION 1985), und 1997 war es aufgrund von einer Fülle an neuen Daten soweit, die Klassifikation und Kriterien erneut zu überarbeiten, um auch neugewonnenen ätiologischen Informationen gerecht zu werden. 1999 erschienen die neuen Richtlinien für die Definition, Diagnose und Klassifikation des Diabetes mellitus, die sowohl von der WHO als auch der American Diabetes Association (ADA) zusammengestellt worden sind und die anstatt auf Behandlung auf Ätiologie basieren. Als diagnostische Kriterien für die Diagnose „Diabetes mellitus“ wurden festgelegt:
1. Plasma-Glukosekonzentrationen >200 mg/dl (11.1 mmol/l) bei Symptomen des Diabetes wie Polyurie, Polydipsie und unerklärlichem Gewichtsverlust.
2. Nüchterner Plasma-Glukosewert (keine Nahrungsaufnahme innerhalb der vorhergehenden 8 Stunden) >126 mg/dl (7.0 mmol/l).
3. Plasma-Glukosewerte >200 mg/dl (11.1 mmol/l) während eines oralen Glukose- Toleranztests (OGTT) 2 Stunden nach Gabe von 75 g Glukose.
Aufgrund ihrer Pathogenese und Ätiologie wird prinzipiell zwischen vier Untergrupppen des Diabetes mellitus unterschieden (The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus, 2002):
1. Der Typ-1-Diabetes wird durch Destruktion der β-Zellen im Pankreas verursacht und führt meist zu einem absoluten Insulinmangel. Die β-Zellen des Pankreas sind für die Insulinproduktion und Sekretion verantwortlich. Miteingeschlossen sind autoimmune und idiopathische Ätiologien.
2. Der Typ-2-Diabetes kann die Insulinresistenz mit relativer Insulindefizienz als Ätiologie im Vordergrund haben oder es kann sich um einen vorwiegend sekretorischen Defekt mit oder ohne Insulinresistenz handeln.
3. Andere Typen. Hierbei handelt es sich um: genetische Defekte der β-Zell-Funktion oder der Insulinwirkung, Erkrankungen des exokrinen Pankreas, Endokrinopathien, medikamentös oder toxisch induzierte Typen (z.B. durch Glukokortikoide oder Nikotinsäure), infektiös (durch z.B. Röteln oder Zytomegalie Virus), immunologisch (z.B. Insulinantikörper), genetische Syndrome (z.B. Down Syndrom oder Porphyrie).
4. Gestationsdiabetes ist ein Typ-2-Diabetes, der erstmalig während einer Schwangerschaft auftritt, wobei ein erhöhtes Risiko bei übergewichtigen Frauen und Frauen mit familärer Diabetes mellitus Belastung vorliegt. Der Gestationsdiabetes kann zu pränatalen Entwicklungstörungen im Embryo führen, wie u.a.
Kardiomyopathie und Organhypertrophie. Es besteht ein erhöhtes Risiko der Frühgeburt, des intrauterinen Todes und erhöhte perinatale Mortalität.
Klinisch bedeutsam beim Menschen sind der Typ-1 und der Typ-2-Diabetes, die dritte und vierte Untergruppe wird zusammengefasst als „sekundärer Diabetes“ bezeichnet. Von allen an Diabetes erkrankten Personen leiden 90% bis 95% an dem Typ-2-Diabetes. Der Typ-2-
milde Veränderungen von Stoffwechselfunktionen gekennzeichnet ist, die oft von den Betroffenen nicht wahrgenommen werden. Wurde der Typ-2-Diabetes früher noch als
„Alters“-Diabetes bezeichnet, so erkranken immer häufiger Jugendliche und Kinder an dieser Krankheit. Aktuelle Zahlen belegen, dass es sich bei 30% der neudiagnostizierten Fälle mit einem Typ-2-Diabetes um Personen unter 20 Jahren handelt (NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH 2002).
2.1.2 Pathophysiologie des Typ-2-Diabetes
Der Typ-2-Diabetes beginnt meist als Insulinresistenz, eine Stoffwechselstörung, bei der die Körperzellen Insulin nicht mehr richtig verwerten können. Hierzu zählen Zellen im Skelettmuskel, Fettgewebe und in der Leber. Unter anderem wird Glukose nicht mehr in genügendem Maße aus dem Blut resorbiert, die Glykolyse in der Leber ist negativ beeinträchtigt, und der negative-Feedback Mechanismus in den α-Zellen der Langerhansinseln des Pankreas, wo Insulin normalerweise die Freisetzung von Glukagon hemmt, ist geschwächt. Eine Insulinresistenz liegt vor, wenn eine physiologische Insulinkonzentration nicht mehr in der Lage ist, die biologischen Prozesse zu steuern (PESSIN u. SALTIEL 2000). Die Insulinresistenz kann sich als Resistenz der Skelettmuskulatur, des Fettgewebes und der Leber darstellen (REAVEN 1997). Es gibt Hinweise, dass die muskuläre Insulinresistenz der klinischen Manifestation des Typ-2- Diabetes bis zu 30 Jahre vorrausgehen kann, und somit bereits im Stadium des Prädiabetes vorhanden ist (MARTIN et al. 1992). Molekulare Mechanismen, die zu einer Insulinresistenz führen könnten sind bis heute weitgehend ungeklärt ( SCHIMABUKURO et al. 1998; KAHN u. FLIER, 2000; SCHULMAN 2000). Zunehmend wird eine Beteiligung der Lipide an der Insulinresistenz dikutiert (MCGARRY 1992; FRAYN 1993; LEE et al. 1994; UNGER u.
ORCI 2001).
Im weiteren Verlauf der diabetischen Erkrankung folgt die Phase der sogenannten impaired Glukose Tolerance (iGT), wo sich zu der schon vorhandenen Insulinresistenz eine fortschreitende Dekompensation durch die pankreatischen β-Zellen gesellt. Anfänglich liegt eine kompensatorische Hyperinsulinämie vor, um eine glykämische Homöostase im Körper zu erreichen. Mit der Zeit stellt sich ein dekompensierter Mechanismus ein und die
Insulinproduktion der β-Zellen fällt stark ab. Diese Patienten zeigen im Rahmen von einem OGTT nach Gabe von Glukose klinisch eine Hyperglykämie, können aber in ihrem täglichen Leben Werte haben, die euglykämisch sind (REAVEN 1972). 40 % der Patienten mit einer solchen iGT entwickeln innerhalb von fünf bis zehn Jahren einen manifesten Typ-2-Diabetes (ZIMMET 2001). Patienten bei denen eine iGT vorliegt, weisen ein höheres Risiko auf, mikro- und makrovaskuläre Schäden zu entwickeln (JARRETT u. KAHN 1976; FULLER et al. 1980; MCCARTNEY et al. 1983; KLEIN et al. 1991; CHARLES et al. 1996).
Der Typ-2-Diabetes ist durch das Vorliegen einer Insulinresistenz, Hypoinsulinämie und Hyperglykämie im nüchternen Zustand gekennzeichnet. Das Pankreas verliert seine Fähigkeit, Insulin zu produzieren, es liegt ein manifester Defekt in der Funktion der β-Zellen der Langerhans-Inseln vor. Zwischen dem Auftreten der Insulinresistenz und der Manifestation des Diabetes liegen häufig mehrere Jahre bis Jahrzehnte (WARRAM et al.
1990; ZIMMETT et al. 2001). Bereits in der prädiabetischen Phase, gekennzeichnet durch muskuläre Insulinresistenz und veränderte Insulinsekretionskinetik des Pankreas, kommt es oft schon zu chronischen Schädigungen verschiedener Organsysteme.
Der Diabetes mellitus stellt eine erhebliche chronische Stoffwechselerkrankung dar, die in viele physiologische Prozesse des Körpers eingreift. Eine zentrale Rolle spielt die aus der mangelhaften peripheren Glukoseverwertung und gesteigerten Gluconeogenese resultierenden Hyperglykämie, die aufgrund einer fehlenden Hemmung der Induktion von gluconeogenetischen Schlüsselenzymen beruht. Zusätzlich fehlt in der Leber die induzierende Wirkung des Insulins auf die glykolytischen Schlüsselenzyme Glukokinase, Phosphofructokinase-1 und Pyruvatkinase.
Insulin stellt das einzige Hormon dar, welches anti-lipolytisch wirkt. Die bei Insulinmangel fehlende Lipolysehemmung führt zu einem Anstieg der freien Fettsäuren im Serum.
Zusätzlich ist durch das Fehlen von α-Glycerophosphat die Triglyceridsynthese im Fettgewebe beeinträchtigt. Bei unbehandeltem Diabetes ist die hepatische Cholesterinsynthese allgemein gesteigert und sinkt auch im Hungerzustand nicht ab.
Vermutlich spielt hier die 3-hydroxy-3-methyl-glutarsäure-Coenzym A (HMG-CoA)-
Das resultierende Überangebot an freien Fettsäuren und die verminderte Verwertung von Acetyl-CoA führt zu einer vermehrten Bildung von Ketonkörpern (β-Hydroxybuttersäure, Aceton, und Acetessigsäure). Diese sauren Endprodukte des Fettstoffwechsels können nur teilweise verwertet oder ausgeschieden werden. Ihre Anreicherung im Körper schränkt die Alkalireserve ein, es kommt zu Azidose, Praecoma und im schlimmsten Fall zum Coma diabeticum.
2.2 Diabetische Nephropathie und terminale Niereninsuffizienz 2.2.1 Therapeutische Ansätze und Epidemiologie
Der diabetische Patient ist durch die Folge- und Begleiterkrankungen seiner eigentlichen Krankheit gekennzeichnet, wobei zwischen mikro- und makrovaskulären Komplikationen oder Erkrankungen differenziert wird. Zu den mikrovaskulären Komplikationen zählen die diabetische Nephropathie, die diabetische Retinopathie und die diabetische Neuropathie. Zu den makrovaskulären Komplikationen zählen die koronare Herzkrankheit, die periphere arterielle Verschlusskrankheit und zerebrovaskuläre Erkrankungen (WILD et al. 1999). Wie schon angedeutet, fängt die Entwicklung dieser Erkrankungen allerdings nicht zum Zeitpunkt der Diagnose „Diabetes“, an sondern in einigen Fällen viele Jahre vorher. HAFFNER et al.
(1990) postulieren eine „tickende Uhr“ Hypothese, bei der die mikrovaskulären Schäden bei Eintreten der Hyperglykämie anfangen sich zu verschlechtern, die makrovaskulären Schäden sich aber schon Jahre oder Jahrzehnte vorher während der prä-diabetischen Phase entwickeln.
Diese Tatsache macht eine sorgfältige Überwachung von Personen die, aufgrund ihres Übergewichtes oder aufgrund erblicher Faktoren, als Diabetes-gefährdet gelten zwingend, um Diagnose und Behandlung des Diabetes möglichst früh zu erreichen und so die Gefahr für Folgeschäden zu reduzieren. Eine Möglichkeit, die Uhr zurückzudrehen, d.h. eventuell schon vorliegende Schäden wieder rückgängig zu machen wäre von entscheidendem Vorteil.
Klinische Studien wie der „Diabetes Control and Complications Trial“ haben deutlich gemacht, wie wichtig die stringente Überwachung des Blutglukosespiegels ist, um Folgeerkrankungen an Auge, Niere und Nerven zu verhindern (DIABETES CONTROL and COMPLICATIONS TRIAL RESEARCH GROUP 1993). Die „United Kingdom Prospective
Diabetes Study“ (UKPDS) zeigte die Wichtigkeit einer engmaschigen Blutglukosekontrolle bei Typ-2-Diabetikern (UNITED KINGDOM PROSPECTIVE DIABETES STUDY GROUP 1998). Es folgten mehrere Studien, die belegen konnten, wie wichtig medizinische Intervention in Form von Überwachung der Blutglukose, des Blutdruckes und der Lipide ist, um das Risiko von Diabetes-assozierten Komplikationen wie mikro- und makrovaskuläre Erkrankungen zu senken.
Mikrovaskuläre Erkrankungen wurden in der „MICRO HOPE“ Studie (HEART OUTCOMES PREVENTION EVALUATION (HOPE) STUDY 2000), „Stockholm“ Studie (REICHARD et al. 1993), und „Kumamoto“ Studie (OHKUBO et al. 1995) untersucht. In Studien wie z.B. „4S“ (PYÖRÄLÄ et al. 1997) und „MICRO HOPE“ (HEART OUTCOMES PREVENTION EVALUATION (HOPE) STUDY 2000) wurden Effekte auf makrovaskuläre Erkrankungen untersucht.
So zeigte z.B. die „MICRO HOPE“ Studie, dass der Angiotensin-Konversionsenzym- Inhibitor (ACE-Inhibitor) Ramipril das Risiko an einer diabetischen Nephropathie zu erkranken um 22% bei Typ-2-Diabetikern senken konnte. Die „HOPE“ Studie konnte sogar eine Reduktion des Neuauftretens eines Typ-2-Diabetes innerhalb des Beobachtungszeitraums um 34% zeigen (HEART OUTCOMES PREVENTION EVALUATION (HOPE) STUDY 2000). Die Behandlung mit ACE-Inhibitoren gehört zur Basistherapie bei der Nephropathie.
Neue Behandlungansätze wie kombinierte ACE/Neutrale Endopeptidase (NEP)-Inhibitoren und Endothelin-Rezeptor-Antagonisten befinden sich zur Zeit noch in der Phase der prä- klinischen und klinischen Forschung.
Neuere Studien belegen, dass Angiotensin-1 (AT1)-Rezeptor-Blocker (ARBs) wie Losartan und Irbesartan renoprotektive Effekte aufweisen. Hierzu gehören die „Irbesartan Diabetic Nephropathy Trial“ (IDNT) (LEWIS et al. 2001), IRMA 2 (Irbesartan Micoalbuminuria Study) (PARVING et al. 2001) und „The Reduction of Endpoints in Non-insulin-dependent Diabetes Mellitus Trial“ (RENAAL) (BRENNER et al. 2001). Beide ARBs, Losartan und Irbesartan wurden 2002 für die Behandlung der diabetischen Nephropathie des Typ-2- Diabetes zugelassen. Sie stellen somit die einzigen für diese Indikation zugelassenen
Hauptverursacher der Nephropathie sind Bluthochdruck und Diabetes (Typ-1 und Typ-2), wobei in beiden Fällen typische histologische Veränderungen in den Glomeruli vorliegen. Bei mehr als 75% aller klinischen Fälle der Nephropathie ist Diabetes die Ursache. Mehr als 90%
dieser diabetischen Nephropathien erfolgen in Patienten mit einem Typ-2-Diabetes.
Umgekehrt entwickeln etwa 40 % der Typ 2-Diabetiker eine Nephropathie (UNITED STATES RENAL DATA SYTEM 1999).
In Europa, Japan und U.S.A. ist die diabetische Nephropathie die Hauptursache der terminalen Niereninsuffizienz und verursacht jährlich zwischen 25 und 42 Prozent der vorhandenen Fälle von akutem Nierenversagen (PARVING et al. 2001). Ein Behandlungsziel des diabetischen Patienten ist es, die sogenannte „end-stage renal disease“ (ESRD), auch
„end-stage renal failure“ (ESRF) genannt, zu verhindern. Hierbei handelt es sich um die
„Endstation“ der Niere des Patienten-nur durch Dialyse oder einer Nierentransplantation kann das Überleben des Patienten gewährleistet werden.
In allen westlichen Ländern beobachtet man eine dramatische Zunahme von Diabetikern, die eine Nierentransplantation benötigen. Waren es 1984 noch 29, 23, und 4 Fälle/Million Einwohner die in jeweils U.S.A., Japan und Australien an ESRD erkrankten, so waren es 1994 schon jeweils 107, 66 und 14 Fälle/Million Einwohner in diesen Ländern (RAINE 1995;
RITZ et al. 1999).
Eine retrospektive Analyse an der Medizinischen Universitätsklink in Heidelberg über den Jahren 1998 bis 2000 belegt die Bedeutung des Diabetes für die Epidemiologie der Niereninsuffizienz und die Tatsache, dass sie bisher oft unterschätzt wurde. Betrug in dem lokalen Einzugsbereich die Häufigkeit der Diabetiker mit ESRD 1993-1994 noch 52 Patienten pro Million Einwohner pro Jahr (Lippert et al. 1995), so waren es 1998-2000 schon 98 Patienten pro Million Einwohner pro Jahr. Diese Zahl macht deutlich, dass Deutschland bezüglich des Problems „Diabetes und Niereninsuffizienz“ in erstaunlicher Übereinstimmung mit der in U.S.A. gefundenen jährlichen Zuwachsrate liegt. Bei den Patienten, die zur Einleitung einer Nierentransplantation aufgenommen wurden, lag bei 13 % der Patienten mit akutem Nierenversagen und 49 % der Patienten mit chronischem Nierenversagen ein Diabetes vor, vornehmlich ein Typ-2-Diabetes. Bei 10% der diabetischen Patienten wurde die
Diagnose Diabetes erst nach Überweisung gestellt. Bei 60% der diabetischen Patienten lagen klassische Zeichen einer diabetischen Nephropathie vor. Bei 13% lagen atypische Nierenveränderungen vor, bei 27% war zusätzlich zum Diabetes mellitus eine primär chronische Nierenkrankheit bekannt (SCHWENGER et al. 2001)
Diese Zahlen verdeutlichen die aktuelle Häufigkeit des Diabetes bei Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz in Deutschland und weltweit. Die hohen medizinischen Kosten der terminalen Niereninsuffizienz geben der Prävention und Therapie von diabetischer Nephropathie immer mehr Bedeutung. Zur Zeit liegen die jährlichen Kosten der ESRD bei diabetischen Patienten in Amerika bei über $6 Milliarden, wobei Dialyse oder Nierentransplantation zur Zeit Kosten von ca. $50,000 pro Patient verursachen. Ohne Dialyse oder Transplantation würden fast 70,000 diabetische Personen in U.S.A. jährlich an ESRD sterben (RITZ et al. 1999).
2.2.2 Pathophysiologie
Die Pathogenese der fokalen Glomeruloskerose, welche als gemeinsamer Endpunkt der progressiven renalen Schädigung unabhängig von der Ätiologie gilt, beeinhaltet mehrere, sich überschneidende Mechanismen. Hierzu zählen der Anstieg des arteriellen Blutdrucks, der Verlust der Autoregulation der renalen Zirkulation, die glomeruläre Hypertrophie, die renale Fibrose und Veränderungen in der Permeabilität der glomerulären Membran.
Oft wird die Nephropathie sowohl im diabetischen als auch im nicht-diabetischen Patient von einer Hypertension begleitet. Systemische Hypertension geht mit erhöhtem intraglomerulären Druck einher. Eine Senkung des arteriellen Blutdrucks bewirkt eine Nephroprotektion, auch wenn keine Hypertension vorhanden ist (SUSIC u. FROHLICH 1999; WEIR 1999). Die Rolle der Blutdrucksenkung in Bezug auf die nephroprotektive Wirkung von Antihypertensiva ist etabliert. Die Frage, ob einige Antihypertensiva einen zusätzlichen nephroprotektiven Effekt zusätzlich zu und unabhängig von dem blutdrucksenkenden Effekt haben, ist noch offen, ebenso wie die Frage des genauen Wirkmechanismus. So haben z.B.
einige Studien mit ACE-Hemmern gezeigt, dass nephroprotektive Effekte vorlagen, die
unabhängig von dem antihypertensiven Effekt waren (THE GISEN GROUP 1997; HEART OUTCOMES PREVENTION EVALUATION (HOPE) STUDY 2000).
Histopathologisch zeichnet sich die diabetische Nephropathie durch eine glomeruläre und tubuläre Hypertrophie aus, was wiederum zu der Entwicklung der Glomerulosklerose, tubulären Atrophie und interstitiellen Fibrose beiträgt (ANDERSON u. BRENNER 1995;
COOPER 1998; WOLF u. ZIYADEH 1999).
Übermäßige Proteinausscheidung mit dem Urin ist ein etabliertes Merkmal, welches auf glomeruläre Schäden hindeutet. Patienten mit Typ-2-Diabetes, bei denen eine sogenannte Mikroalbuminurie vorliegt, also eine Urinausscheidungrate von 20-200 µg Albumin pro Minute oder ein Verhältnis von Albumin/Creatinin > 20 mg/g, haben ein um 10- bis 20-fach erhöhtes Risiko, an Nephropathie zu erkranken, als Patienten mit Normoalbuminurie (PARVING 1996; GAEDE et al. 1999; HEART OUTCOMES PREVENTION EVALUATION (HOPE) STUDY 2000). Eine persistierende Mikroalbuminurie wird definiert als ein Albumin/Creatinin-Quotient von 30-299 µg/mg in mindestens zwei Urinproben (TABEI et al. 2001).
Bei Vorliegen von Werten, die über den genannten Parametern für die Mikroalbuminurie liegen, spricht man von einer Proteinurie. Mehrere experimentelle Modelle der Glomerulopathie konnten belegen, dass persistierende Proteinurie nicht nur mit der Entwicklung von Glomerulosklerose assoziert ist, sondern auch mit der Entwicklung einer progressiven interstitiellen Fibrose der Niere (EDDY 1989; REMUZZI u. BERTANI 1998).
Veränderungen glomerulärer Filtrationsmechanismen beeinflussen die makromolekuläre Passage in den Urin. Die Basalmembran, welche das Endothel der Kapillare von dem Endothel des Tubulus trennt, besteht aus negativ geladenen Glykoproteinen und bildet für höhermolekulare Stoffe, in Abhängigkeit von deren Ladung und Größe, eine unterschiedlich dichte Filtrationsbarriere (DEEN et al. 1982). Bei der diabetischen Nephropathie kommt es unter anderem zu einer Verdickung der Basalmembran und einer diffusen Expansion der glomerulären mesangialen Matrix mit einer Zunahme der Ablagerung von mesangialen Matrixkomponenten wie Kollagen, Fibronektin und Proteoglykanen (sogenannte diffuse
Glomerulosklerose). Als typisches histologisches Merkmal für eine diabetische Nephropathie gelten auch noduläre Läsionen, die aus unterschiedlich großen, hyalinen Kugelbildungen zwischen den Kapillarschlingen der Glomeruli resultieren. Dies wurde schon von Kimmelstiel und Wilson 1936 beschrieben (KIMMELSTIEL u. WILSON 1936) und heute tragen diese Veränderungen den Namen „Kimmelstiel-Wilson-Läsionen“. Die noduläre Form der Glomerulosklerose stellt den Endzustand der diabetes-bedingten Glomerulusveränderungen dar.
Wenn die glomeruläre Filtration normal funktioniert, werden gelöste Stoffe, deren Größe kleiner als 5 kDa ist, ungehindert von dem Glomerulus in den Primärharn filtriert. Größere Moleküle bis zu einer Größe von 50 kDa werden nur eingeschränkt filtriert. Diese auch Permselektivität genannte Filterwirkung wird teils durch die mechanische Wirkung, für die vor allem die Basalmembran verantwortlich ist, und andererseits durch die negative Ladung sowohl von Endothelzellen als auch Podozyten an der Basalmembranaußenseite, erreicht. Im gesunden Zustand werden nur kleinste Mengen von Albumin in den Primärharn filtriert, das meiste hiervon wird wiederum von den proximalen Tubuli resorbiert. Wenn jedoch Ladungsänderungen vorliegen, die negative elektrische Ladung der Basalmembran verloren geht, oder die Poren in der Basalmembran sich vergößern, können größere Mengen von Protein in den Harn filtriert werden (LAPINSKI et al. 1996).
Größere epidemiologische Studien konnten belegen, dass eine erhöhte Proteinurie in Form von z.B. Albuminurie das Risiko, an einer kardiovaskulären Krankheit zu erkranken oder gar daran zu sterben, dramatisch erhöht (COLLINS et al. 1989; WINCOUR et al. 1992;
BENNETT et al. 1995; CERASOLA et al. 1996; GRIMM et al. 1997). Patienten mit einem manifesten Diabetes und Hypertension haben ein 4-fach erhöhtes kardiovaskuläres Risiko.
Patienten mit einem manifesten Diabetes und Nephropathie haben ein 100-fach erhöhtes kardiovaskuläres Risiko (PIEHLMEIER et al. 1999).
2.3 Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) ist ein potenter Modulator der
Globulin Angiotensinogen wird über die Aspartyl-Protease (Renin), welche aus der Macula densa der Niere stammt, das Dekapeptid Angiotensin I abgespalten. Die Reninfreisetzung wird über Barorezeptoren in den Vasa afferentes bei sinkendem Perfusionsdruck der Nieren, noradrenalinvermittelt über β-Rezeptoren im juxtaglomerulären Apparat der Niere und bei erhöhtem Natrium- und Chlorid- Gehalt in der Macula densa des distalen Nierentubulus stimuliert. Das biologisch inaktive Angiotensin I wird durch das ACE, eine Dipeptidylkarboxypeptidase, unter Abspaltung der beiden endständigen Aminosäuren in das biologisch aktive Octapepetid Angiotensin II umgewandelt (KEETON u. CAMPBELL 1980).
Angiotensin II ist einer der stärksten endogenen Vasokonstriktoren im Körper und bewirkt in der Zona glomerulosa der Nebennierenrinde die Synthese und Ausschüttung von Aldosteron.
Aldosteron führt zu einer verstärkten Natrium- und Wasserretention in den Nieren und somit zu einer Zunahme des Blutvolumens. Dies führt zu einer langanhaltenden Blutdruckerhöhung.
Angiotensin II erhöht das Blutvolumen, indem es die glomeruläre Filtrationsrate drosselt. Der resultierende Volumenanstieg führt zu einem Blutdruckanstieg und zu einer Erhöhung der Vor- und Nachlast. Die Halbwertszeit von Angiotensin II im Plasma beträgt etwa ein bis zwei Minuten (MANLEY 2000). Die Wirkung von Angiotensin II wird im Menschen über zwei Rezeptoren vermittelt, dem Subtyp Angiotensin-1(AT1)- und Subtyp Angiotensin-2-(AT2)- Rezeptor. Diese scheinen gegensätzliche Wirkungen zu vermitteln. Der AT1-Rezeptor vermittelt die klassischen Angiotensinwirkungen wie z.B. an der Niere die Natrium- und Wasserabsorption und intraglomeruläre Hypertrophie, am Herzen Hypertrophie und an den Gefäßen Vasokonstriktion und Wandhypertrophie. Der AT2-Rezeptor bewirkt u.a. eine Vasodilatation und Antiproliferation (COOPER et al. 2001).
Angiotensin II scheint eine zentrale Rolle in mehreren der multiplen Prozesse zu haben, die in der Pathogenese der diabetischen Nephropathie eine Rolle spielen. Im Vordergrund stehen die glomerulären hämodynamischen Effekte von Angiotensin II. In der Niere führt das Angiotensin II, welches intraglomerulär gebildet wird, durch eine Kontraktion der Mesangiumzellen, der afferenten und der efferenten Arteriole zu einer glomerulären Hypertension (MYERS et al. 1975; MILLER et al. 1991). Unabhängig von den glomerulären hämodynamischen Effekten des Angiotensin II liegen andere, wichtige Effekte vor. So führt
Angiotensin II in perfundierten Nieren zu einer Abnahme der Permselektivität der glomerulären Filtration und zu einer Proteinurie (LAPINSKI et al. 1996).
In vitro stimuliert Angiotensin II die mesangiale Zellproliferation und die Apoptose, welches eine negative Auswirkung auf die glomeruläre Hypertrophie hat. Es induziert die Expression des transforming growth factor-β (TGF-β). Dieser bewirkt die Modulation des Zellwachstums und des Zellphänotyps und führt zu einer gesteigerten Synthese von extrazellulärer Matrix (WOLF et al. 1992; KAGIMI et al. 1994). Intrazelluläre Mediatoren wie nuclear factor-κB (NF-κB) und die Protein Kinase C, die zu Entstehung einer diabetischer Nephropathie beitragen können, werden möglicherweise von Angiotensin II beeinflußt (HANEDA et al.
2001). Zusätzlich wirkt Angiotensin II proinflammatorisch und steigert die Expression vaskulärer Adhesionsmoleküle, die Produktion von Chemokinen und den oxidativen Stress (GALLE u. HEERMEIER 1999).
DZAU zeigte, dass zwei Renin-Angiotensin-Syteme vorliegen, zum einen das zirkulierende RAS und zum anderen das gewebeständige oder lokale RAS (DZAU 1988). Dem zirkulierenden RAS ordnet man Akut- bzw. Kurzzeiteffekte der kardiovaskulären und renalen Homöostase zu. Hierzu zählen Blutdruckerhöhung oder Vasokonstriktion.
Das gewebeständige RAS ist verantwortlich für Langzeiteffekte und bezieht sich auf Angiotensin, welches von lokalem Gewebe wie z.B. Nierengewebe synthetisiert wird und dort seine Wirkung entfaltet. Das ACE liegt im Körper zu über 90% gewebeständig vor. Dem überaktivierten gewebsständigen ACE wird eine Schlüsselrolle in kardialen- und renalen Erkrankungen zugesprochen. Hohe lokale Angiotensinkonzentrationen könnten eine wichtige Rolle bei intrarenalen Prozessen spielen und gänzlich unabhängig vom Plasma- Angiotensinspiegel sein. Hohe endogene Angiotensinkonzentrationen in der Niere deuten darauf hin, dass möglicherweise das lokale RAS einen autokrinen/parakrinen Modulator der renalen Struktur und Funktion darstellt (LEUNG u. CARLSSON 2001).
2.4 Das Kallikrein-Kinin-System
Injektion einer Alkohol-unlöslichen Fraktion des menschlichen Urins eine Blutdrucksenkung beim narkotisierten Hund bewirkte. Nachdem 1928 die für den Effekt verantwortliche Substanz aus menschlichem Urin isoliert wurde (KRAUT et al. 1928; FREY et al. 1928), haben KRAUT et al. 1930 festgestellt, dass im Pankreas hohe Konzentrationen der Substanz, bisher „Substanz F“ genannt, vorlagen. Sie tauften die „Substanz F“ um in „Kallikrein“.
Die moderne Molekularbiologie hat es ermöglicht, die Kallikreine, ihre Vorläufer das Plasma- Präkallikrein und das gewebsständige Prokallikrein sowie die Kininogene zu isolieren und zu charakterisieren.
Kallikrein ist eine Peptidase, welche in verschiedenen Geweben und Organen des Körpers einschließlich der Niere produziert wird. Es wirkt auf ein bestimmtes Substrat, das Kininogen und trennt von ihm Peptide ab, die Kinine. Die Kinine werden von Gewebs- und Plasma- Peptidasen (Kininasen) abgebaut (WYNGAARDEN et al. 1992).
2.4.1 Bradykinin
Als Prototyp der Kinine gilt das Bradykinin, welches 1949 von ROCHA e SILVA et al.
entdeckt wurde. Hierbei handelte es sich um eine langsam reagierende Substanz, die kontrahierende Wirkung auf die glatte Muskelatur zeigte und stark gefäßdilatierend wirkte.
Die Namensgebung leitet sich von dieser schon 1949 beobachteten Reaktionsweise ab und kommt aus dem Griechischen: brady bedeutet langsam und kinin Bewegung. Die Vasodilatation wird durch eine vermehrte Bildung von Stickstoffmonoxid und Arachidonsäuremetaboliten wie Prostazyklin im vaskulären Endothel bewirkt (VANHOUTTE 1989).
Das Bradykinin ist ein basisches Nonapeptid. Die aktive Form des Bradykinins wird aus einem als Kininogen bezeicheneten α-Globulin des Serums durch das Kallikrein, einer Kininogenase mit trypsinähnlicher Wirkung, abgespalten.
Kininrezeptoren modulieren die zellulären Effekte des Kallikrein-Kinin-Systems.
Pharmakologische Untersuchungen Ende der 1970er Jahre (REGOLI et al. 1977) haben in
einer Rezeptorklassifizierung in Typ B1- und B2-Rezeptoren resultiert, die mit modernen Methoden der Molekularbiologie in späteren Jahren validiert werden konnte.
Nachdem der B1-Bradykinin-Rezeptor in Kaninchenaorten identifiziert worden war (REGOLI et al. 1980), wurde 1985 der B2-Rezeptor von VAVREK und STEWART charakterisiert. Die Entdeckung des B2-Rezeptors wurde durch erstmals synthetisierte Antagonisten ermöglicht, als VAVREK und STEWART D-Phenylalanin gegen Prolin an der Position 7 in der Bradykinin Sequenz [D-Phe 7] austauschten. Durch die Entwicklung der B2-Rezeptor- Antagonisten, wie die Substanzen FR 173657 (ARAMORI et al. 1997) und HOE 140 (WIRTH et al. 1991), öffneten sich neue Möglichkeiten in der pharmakologischen Erforschung von Bradykinin-B2-Rezeptor-Mechanismen.
Das ACE, als unspezifische Metallopeptidase, katalysiert nicht nur die Bildung von Angiotensin II, sondern trägt auch zur Inaktivierung der Kinine bei, und somit inaktiviert es auch den potenten Vasodilatator Bradykinin (YANG et al.1970). Das ACE bildet damit eine Brücke zwischen dem RAAS und dem Kallikrein-Kinin-System.
In der Niere vermittelt Bradykinin die Vasodilatation durch Stimulation der Stickstoffmonoxidproduktion und und löst durch direkte Effekte auf die Tubuli eine gesteigerte Natriurese aus (GAINER et al. 1998).
2.5 Angiotensin-Konversionsenzym-Inhibitoren
Als erster ACE-Inhibitor wurde 1976 das Captopril entwickelt (CUSHMAN et al. 1977). Ihm folgte das Enalapril (CUSHMANN u. ONDETTI 1991), der erste wirksame ACE-Inhibitor ohne Sulfhydrylgruppe. Captopril hatte viele Nebenwirkungen, welche der Sulfhydrylgruppe zugeschrieben wurden. Alle nach dem Captopril entwickelten ACE-Inhibitoren wurden ohne Sulfhydrylgruppe entwickelt. Außer dem Captopril und dem Lisinopril sind alle ACE- Inhibitoren sogenannte „Prodrugs“, welche durch enzymatische Verstoffwechslung im Körper durch Esterhydrolyse in die eigentliche Wirksubstanz überführt werden. Deswegen, und weil sie keine Sulfhydrylgruppe enthalten, werden sie als ACE-Inhibitoren der zweiten Generation
Das ACE ist im Körper weitverbreitet, und kommt membrangebunden in Endothel-, Gehirn-, Epithel- und Neuroepithel vor. In löslicher Form findet man es im Blut und in verschiedenen Körperflüssigkeiten (BÜNNING 1984). Allen ACE-Inhibitoren liegt aber der gleiche Mechanismus, nämlich die Hemmung der Angiotensin-II-(Ang II)-Synthese und die Hemmung des Abbaus von Bradykinin in seine inaktiven Metabolite zugrunde. Hierdurch wird eine Blutdrucksenkung bewirkt.
ACE-Inhibitoren zeigen eine nephroprotektive Wirkung. Die allgemeine Blutdrucksenkung führt zu einer Reduktion des intraglomerulären hydrostatischen Druckes. Zusätzlich verhindern ACE-Inhibitoren eine glomeruläre und tubuläre Fibrose. Ein möglicher Wirkmechanismus hierfür ist, dass die glomeruläre Hypertrophie über die Hemmung des Angiotensin-II-vermittelten Wachstums im Glomerulum und die Expansion der Mesangiummatrix verhindert wird (RITZ u. STEIN 1994).
ACE-Inhibitoren bewirken in der diabetischen Nephropathie eine Senkung der glomerulären Filtrationsrate und eine Reduktion der Proteinurie. Letzteres wurde in der „Ramipril Efficacy in Nephropathy“ (REIN) Studie (RUGGENENTI et al. 2001) und in der „MICRO HOPE“
Studie (HEART OUTCOMES PREVENTION EVALUATION (HOPE) STUDY 2000) bewiesen. Möglicherweise beruht die Reduktion der Proteinurie nicht nur auf hämodynamischen Effekten, sondern auch auf die direkten Wirkungen der ACE-Inhibitoren auf die glomeruläre Membran und auf eine durch ACE-Inhibitor-Gabe herbeigeführte Reduktion der Porendurchlässigkeit (REMUZZI u. BERTANI 1998; MACCONI et al. 2000).
2.6 Angiotensin-Konversionsenzym/Neutrale Endopeptidase-Inhibitoren
Die ACE/NEP-Inhibitoren, auch Vasopeptidase-Inhibitoren (VPI) genannt, stellen eine neue Klasse dar, die zusätzlich zu dem ACE auch die Neutrale Endopeptidase (NEP) hemmen. Das Enzym Neutrale Endopeptidase katalysiert den Abbau der atrialen natriuretischen Peptide (ANP), von Adrenomedullin, Urodilatin und von Bradykinin. Somit bewirken Vasopeptidase- Inhibitoren eine Anreicherung von Peptiden mit vasodilatorischer und möglicherweise organprotektiver Wirkung und hemmen simultan die Produktion von Angiotensin II.
Die Neutrale Endopeptidase kommt hauptsächlich in der Niere vor, aber auch in Lungen-, Nebennieren-, Gehirn-, Verdauungstrakt- und peripheren Geweben (BURNETT 1999). Die ANP´s spielen eine zentrale Rolle in der Blutdruckregulation und Volumenhomöostase. Es sind vier Peptidhormone bekannt: das atriale natriuretische Peptid (ANP), das brain natriuretische Peptid (BNP), das C-type natriuretische Peptid (CNP) und das dendroaspis natriuretische Peptid (DNP).
Das ANP wird in den Vorhöfen bei Dehnung durch Volumenerhöhung freigesetzt. Das BNP wird in den Gehirnventrikeln produziert und als Reaktion auf eine ventrikuläre Druck- und Volumensteigerung freigesetzt. Sowohl dem BNP als auch dem ANP liegen ähnliche physiologische Eigenschaften zugrunde. So fördern beide die Natriurese und Diurese, inhibieren das RAAS System und wirken vasodilatorisch. Das ANP verhindert die Produktion des Vasokonstriktors Endothelin.
Das CNP kommt im Lungen-, Nieren-, Gefäß- und Herzgewebe vor und wird als Reaktion auf Scherkräfte, wie sie bei Kreislaufbelastungen vorkommen, freigesetzt. Im Gegensatz zu anderen natriuretischen Peptiden zeigt es kaum diuretische oder natriuretische Wirkung. Das CNP ist ein potenter Vasodilatator und hemmt die Proliferation von vaskulärem Endothel (VEELKEN u. SCHMIEDER 2002).
Das DNP, welches vor kurzem aus dem Gift der grünen Mambaschlange isoliert wurde, wirkt in synthetischer Form stark diuretisch und natriuretisch. Eine DNP-ähnliche Immunreaktion (DNP-like immunoreactivity; DNP-LI) wurde in erhöhtem Maße in menschlichem Plasma und Vorhofgewebe bei chronischer Herzinsuffizienz entdeckt. Die genaue Wirkung von DNP ist noch unerforscht (SCHIRGER et al. 1999).
Die natriuretischen Peptide binden an zelloberflächengebundene Rezeptoren. ANP, CNP und BNP sind Liganden für einen Guanylatzyklase gekoppelten Rezeptor. Es wird durch Bindung dieser Peptide vermehrt Guanosintriphosphat (GTP) zu zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) umgewandelt. Dies führt zu einer Vasodilatation.
In einem Rattenmodell mit Reninmangel-bedingter Hypertension zeigte sich nach NEP- Inhibitor-Behandlung eine Blutdrucksenkung, ein erhöhtes Urinvolumen und eine erhöhte Ausscheidung von cGMP und ANP im Urin (SYBERTZ et al. 1990). Vergleichbare Effekte wurden nach NEP-Inhibitor-Gabe bei Affen beobachtet (SEYMOUR et al. 1995).
Die Peptidasen ACE und NEP weisen strukturelle Ähnlichkeiten auf. Bei beiden Enzymen handelt es sich um membrangebundene Metallopeptidasen mit einem aktiven Zinkzentrum.
Die Entwicklung von einem Molekül, welches beide Enzyme hemmt, würde es ermöglichen, eine synergistische Wirkung zu erzielen. Dies war die Grundlage der Entwicklung der ACE/NEP-Inhibitoren Anfang der 1990er Jahre. Zu den ersten entwickelten kombinierten ACE/NEP-Hemmern zählen Glycoprilat und Alatrioprilat.
Seitdem sind weitere Substanzen dieser Klasse entwickelt worden, hierzu zählen Sampatrilat (UK 81252), Fasidotril (BP 1.137), Z13752A, MDL 100.240, AVE 7688, Mixanpril, Gemopatrilat (BMS 189921) und Omapatrilat (Vanlev®).
Omapatrilat stellt die am weitesten erforschte Substanz dieser Klasse dar. Die inhibitorische Konstante Ki liegt bei8. 9 nmol/l für NEP und 6 nmol/l für ACE. Eine Studie von TAAL et al.
(2001) in Ratten konnte zeigen, dass eine verzögerte Behandlung mit Omapatrilat vier Wochen nach Nephrektomie eine Proteinurie stärker verringern konnte und das Enstehen einer Glomerusklerose effektiver verzögerte als durch die Behandlung mit einem ACE- Inhibitor. Diese Effekte waren blutdruckunabhängig.
Der blutdrucksenkende Effekt von Omapatrilat konnte in mehreren vorklinischen Studien in verschiedenen Tiermodellen gezeigt werden. In „salzsensitiven“ Dahl-Ratten ging der endothelprotektive Effekt aber über den durch die Blutdrucksenkung zu erwartenden Effekt hinaus (QUASCHNING et al. 2000). Für Omapatrilat konnten auch Effekte im Hinblick auf eine verbesserte kardiale Funktion bei der Herzinsuffizienz nachgewiesen werden. Es konnte eine Verminderung des linksventrikulären Druckes und eine verbesserte Überlebensrate im kardiomyopathischen Hamstermodell (TRIPPODO et al. 1999) und eine verbesserte myokardiale Funktion im Hundemodell mit induzierter Herzinsuffizienz gezeigt werden (THOMAS et al. 1998).
Klinische Studien liefern weitere Beweise für die günstigen Effekte von Omapatrilat aber auch über unerwünschte Nebeneffekte. In der „Inhibition of Metalloprotease by Omapatrilat in a Randomized Excercise and Symptom“ (IMPRESS) Studie, eine Studie mit 573 Patienten die unter Herzinsuffizienz litten, konnte erstmalig der klinische Vorteil von Omapatrilat gegenüber dem konventionellen ACE-Inhibitor Lisinopril bei kombinierter Auswertung nach den Kriterien stationäre Aufnahme, Tod, Absetzen der Therapie und Verschlechterung der Herzinsuffizienz gezeigt werden (ROULEAU et al. 2000).
Die Ergebnisse der „Omapatrilat Cardiovascular Treatment Assessment Versus Enalapril“
(OCTAVE) Studie wurden im März 2002 vorgestellt. In dieser Studie wurde an 25,267 hypertensiven Patienten die blutdrucksenkende Wirkung von Omapatrilat und die Sicherheit der Substanz, insbesondere das Vorkommen von Angioödemen untersucht.
Die Ergebnisse der „Omapatrilat versus Enalapril Randomized Trial of Utility in Reducing Events“ (OVERTURE) Studie wurden ebenfalls im März 2002 vorgestellt. Sie sollte die Effekte von Omapatrilat auf Mortalität und Herzversagen an 5770 Patienten mit Herzversagen im Vergleich zu Enalapril untersuchen. In der Studie OVERTURE konnte Omapatrilat keine Überlegenheit gegenüber Enalapril zeigen, es wurde jedoch eine fast zweifach erhöhte Inzidenz von Angioödemen beobachtet (Enalapril: 0,5%, Omapatrilat: 0,8%). In der Studie OCTAVE war Omapatrilat zwar signifikant besser in der Blutdrucksenkung, aber es traten knapp dreimal so viele Fälle von Angioödem verglichen mit Enalapril auf (2.17% verglichen mit 0.68%) (COATS 2002).
Die „Omapatrilat in Persons with Enhanced Risk of Artherosclerotic Events“ (OPERA) Studie soll an ca. 12,000 Personen den Effekt von Omapatrilat auf Patienten mit systolischer Hypertension ermitteln. Es soll untersucht werden, ob Omapatrilat in diesen Patienten signifikant die Mortalität und Morbidität aufgrund kardiovaskulärer Ereignisse senken kann.
Der Untersuchungszeitraum der Studie, die aktuell durchgeführt wird, beträgt fünf Jahre (WEBER 2001).
Somit zeigt Omapatrilat durchaus positive Effekte, aber auch eine hohe Inzidenz von Angioödemen. Dies war mitunter ein Hauptgrund für die Ablehnung der Zulassungsbeantragung durch die Food and Drug Administration (FDA) 2002.
2.7 Tiermodell
Die weltweit drastische Zunahme von an Typ-2-Diabetes erkrankten Personen und die proportionale Zunahme von Patienten, bei denen als Folge des Typ-2-Diabetes eine terminale Niereninsuffizienz vorliegt, zeigt die Notwendigkeit, die Pathogenese der diabetischen Nephropathie zu ergründen, um erfolgreiche Therapien entwickeln zu können. Bei der diabetischen Nephropathie, wie sie beim Typ-2-Diabetiker vorliegt, besteht ein progredient und sich graduell verschlechternder Verlauf, dessen Entwicklung oft Jahrzehnte dauert.
Obwohl zur Zeit auch klinisch intensiv geforscht wird, ist die Untersuchung der diabetischen Nephropathie in einem geeigneten Tiermodell unverzichtbar.
Die „Zucker-Diabetic-Fatty“-Ratte (ZDF-Ratte), dargestellt in Abbildung 1, stellt ein klinisch relevantes Modell für die Untersuchung der Typ-2-diabetischen Nephropathie des Menschen dar (VELASQUEZ et al. 1990; VORA et al. 1996 ; HOSHI et al. 2002). Die ZDF-Ratte wird seit mehr als 30 Generationen mittels fortlaufender Inzucht gezüchtet. Die ZDF-Ratte stammt von der „obesen-Zucker“ (Zucker Fatty, ZF)-Ratte ab, welche 1965 von dem Ehepaar Zucker beschrieben wurde (ZUCKER 1965). Bei der „obesen-Zucker-Ratte“ liegt eine autosomal rezessive Mutation in dem fa Gen vor, welches für den Leptinrezeptor kodiert. Die homozygoten [ fa/fa ] „Zucker-Fatty“ männlichen Tiere zeigen Hyperphagie, Hyperlipidämie, Obesitas und nur leicht erhöhte Plasma-Glukosespiegel (GODBOLE u. YORK 1978; IKEDA et al. 1981). Durch die Kreuzung von „obesen-Zucker-Fatty“-Ratten mit Wistar-Kyoto- Ratten, bei denen eine Insulinresistenz vorliegt und die eine herabgesetzte Glukosetoleranz besitzen, wurde die „Zucker-Diabetic-Fatty-“Ratte entdeckt (IKEDA et al. 1981). Nur durch fortlaufende Inzucht wird die Entwicklung eines spontanen Diabetes in den männlichen Tieren aufrechterhalten. Dies fand 1985 im Labor von Dr. Richard Peterson an der Indiana University Medical School statt, wo die ZDF-Inzucht-Ratte als Modell für den Humanen Typ- 2-Diabetes etabliert wurde (PETERSON et al. 1990).
Die männliche ZDF-Ratte weist im Alter von 7 Wochen eine Hyperglykämie auf, im Alter von 12 Wochen zeigt sich ein manifester Typ-2-Diabetes, im Alter von 21 Wochen entwickelt sich eine Proteinurie. Später auftretende Neuropathien und Nephropathien bewirken dann meist den Tod im Alter von einem Jahr. Somit schreitet die ZDF-Ratte in vorhersagbarer Zeit und in altersabhängiger Weise fort von einen hyperinsulinämischen, euglykämischen und insulinresistenten Zustand in einen hyperglykämischen Zustand der von einer Hypoinsulinämie gekennzeichnet ist (VORA et al. 1996; ZHOU et al. 1999; COIMBRA et al.
2000; ETGEN u. OLDHAM 2000).
Die ZDF-Ratte stellt eines der wenigen Tiermodelle dar, das als Modell des humanen Typ-2- Diabetes mit einer progressiven Glomerulosklerose dienen kann und das weitgehend erforscht ist. Es gibt viele Literaturhinweise, die anhand des Modell der ZDF-Ratte die Pathogenese der beim Diabetes entstehenden Glomerulosklerose zu ergründen versuchen (KASISKE et al.
1985; SCHMITZ et a. 1992; VORA et al. 1996; PHILIPS et al. 1999; COIMBRA et al. 2000;
HOSHI et al. 2002). Somit scheint dieses Modell geeignet zu sein, die Effekte einer chronischen Behandlung auf verschiedene Parameter und Begleiterkrankungen des Typ-2- Diabetes zu untersuchen.
Die Wistar-Ratte (Rattus norvegicus var. Albinos), dargestellt in Abbildung 2, entspringt der Albinoform der braunen Ratte (Rattus norvegicus). Sie wurde nach Selektion der Albinoform von der Zoologin Helen Dean King durch Inzucht am Wistar Institut in Philadelphia U.S.A.
gezüchtet (CLAUSE 1993). Die Mehrzahl aller Laborratten stammen von diesen im Wistar Institut gezüchteten Ratten ab. Die Wistar-Ratte wird heutzutage als Auszuchtkolonie gezüchtet. Im Gegensatz zum Inzuchtstamm liegt bei den Auszuchttieren eine Heterozygotie der Erbanlage vor. Diese gilt es zu erhalten. Die konstante Heterozygotie führt dazu, dass die Wistar-Ratte anpassungsfähiger, vitaler und fruchtbarer ist, als Tiere die durch Inzucht entstehen.
Die Wistar-Ratten dienten in dieser Studie dazu eine alternde, nicht-diabetische Population zu repräsentieren. In einer nicht veröffentlichten Studie der Firma Aventis Pharma wurden als Kontrollgruppe schlanke („lean“)-ZDF-Ratten, die heterozygot für das fa-Gen [ZDF/Gmi fa/-]
Tiere, die die Geschwistertiere der diabetischen ZDF-Ratten waren, blieben zwar dünn und euglykämisch, zeigten aber unerwarteterweise eine schlechtere Herz- und Endothelfunktion als die diabetischen ZDF-Ratten. Eine Studie von VORA et al. 1996 belegte das Vorkommen von schweren Formen der Hydronephrose ohne ergründbare anatomische Ätiologie bei lean- ZDF-Ratten. Sie schlossen daraus, dass diese Hydronephrose genetischen Ursprungs sein musste.
Auch in internen Studien, die als Vorstudien für die hier beschriebene Studie dienten, wurden an den Nieren der ZDF-lean-Ratten Pyelodilatationen gefunden. Hierbei handelt es sich um vererbbare Anomalien. Der Diabetes hat nachweislich ätiologisch eine starke heriditäre Komponente, somit schien die Wahl von nicht-verwandten Tieren als gesunde Kohorte von Vorteil. Aus diesen Gründen wurden für diese Studie als gesunde, nicht-diabetische Kontrollen Wistar-Ratten gewählt (persönliche Mitteilung PD Dr. W. Linz, Frankfurt 22.
November 2001).
Abb. 1: Bild einer ZDF-Ratte im Alter von ca. 7 Wochen, Körpermasse ca. 420 g.
Abb. 2: Bild einer Wistar-Ratte im Alter von ca.
7 Wochen, Körpermasse ca. 330 g.
2.8 Fragestellung
Unter den Folgekrankheiten des Diabetes stellen kardiovaskuläre und renale Erkrankungen nicht nur ökonomisch gesehen die kosten-intensivsten Komplikationen dar, sondern auch menschlich gesehen stellen sie ein erhebliches Leiden dar.
Die Häufigkeit eines nicht-diagnostizierten Diabetes zum Zeitpunkt der terminalen Niereninsuffizienz weist auf das Vorliegen gravierender Defizite in der Diagnostik und Versorgung diabetischer Patienten hin. Häufig erfolgt die Diagnose „Diabetes“ zu spät, um eine erfolgreiche Therapie zu initieren. Den größten Teil der Patienten mit Dialyse- pflichtigem Nierenversagen stellen weltweit Diabetiker dar. Das Mortalitätsrisiko in Diabetikern mit Nephropathie ist neunmal so hoch wie bei Diabetikern ohne diese Begleiterkrankung (REMUZZI 1993). HAFFNER et al. (1998) zeigten, dass das Risiko eines Diabetikers einen Myokardinfarkt zu erleiden, gleich hoch ist wie in Patienten ohne Diabetes aber mit vorausgegangenen Herzinfarkt oder mit kardiovaskulärer Erkrankung.
Seit der Entwicklung der ACE-Inhibitoren wird der genaue Mechanismus ihrer Wirkung erforscht. Die Hemmung der Umwandlung von Angiotensin I in Angiotensin II wurde als erstes intensiv untersucht. Die Entwicklung der Kininrezeptor-Antagonisten machte es möglich, die Bedeutung der Potenzierung von Bradykinin zu untersuchen. Welche Rolle die Kinine bei der Entstehung und Weiterentwicklung der diabetischen Nephropathie und der diabetischen Coronarerkrankungen spielen, ist noch unbekannt.
Die wesentlichen Fragen, die in dieser Arbeit untersucht werden sollten waren:
Ist eine Interventionsbehandlung mit einem ACE- oder ACE/NEP-Inhibitor möglich? Ist ein Einfluss auf das kardiovaskuläre oder renale System mit diesen Substanzen möglich?
Wenn die Behandlung mit diesen Substanzen Effekte zeigt, was ist die Rolle der Kinine?
Welche Rolle spielt die Blockade des B2-Rezeptors?
Um diese Fragen beantworten zu können, wurden an den Ratten unterschiedliche Parameter untersucht und zur Auswertung herangezogen:
Wird die renale Funktion und Morphologie durch Behandlung mit dem ACE-Inhibitor Ramipril, dem ACE/NEP-Inhibitor AVE 7688 oder durch die Kombination mit dem B2- Rezeptor-Antagonisten HOE 140 beeinflusst?
Wird die kardiale Funktion und Morphologie durch Behandlung mit dem ACE-Inhibitor Ramipril, dem ACE/NEP-Inhibitor AVE 7688 oder durch die Kombination mit dem B2- Rezeptor-Antagonisten HOE 140 beeinflusst?
Weisen die Ergebnisse weiterer Untersuchungen auf eine renoprotektive oder vaskuloprotektive Beeinflussung durch die Behandlung mit Ramipril, bzw. den Substanzen AVE 7688 oder HOE 140 hin?
3. MATERIAL UND METHODEN
3.1 Tiere und deren Haltungsbedingungen
Ziel dieser Studie war es, die Langzeitwirkung eines ACE/NEP (Vasopeptidase)-Inhibitors verglichen mit einem ACE-Hemmer auf die kardiale und renale Funktion an diabetischen und nicht-diabetischen Ratten zu untersuchen. Im Rahmen der Studie wurden insgesamt 140 adulte männliche Ratten eingesetzt. Hierbei handelte es sich um 75 Wistar-Ratten (Stamm HsdCpb:WU der Firma Harlan Winkelmann, D-Borchen) und 65 Zucker-Diabetic-Fatty- Ratten (Stamm ZDF/Gmi fa/fa ehem. GMI Indianapolis, U.S.A. jetzt Charles River, Wilmington U.S.A.). Alle Ratten waren bei Versuchsbeginn durchschnittlich 21 Wochen alt.
Die Tiere wurden in normierten Makrolonkäfigen der Größe 4 auf Standardeinstreu für Labortiere gehalten. In der Versuchstieranlage betrug die Raumtemperatur 18-20 ºC bei einer Luftfeuchtigkeit von 50-55%. Der Tag-Nachtzyklus betrug 12 Stunden, wobei die Tagphase von 6.00 Uhr bis 18.00 Uhr andauerte und mit Kunstlicht (400 Lux) aufrecht erhalten wurde.
Es wurde eine Standard-Diät für Ratten und Mäuse der Firma Altromin GmbH (Lage) in Pelletform gefüttert („Haltungsdiät 1320“; Inhaltsstoffe : 19% Rohprotein, 4% Rohfett, 7%
Rohasche, 6% Rohfaser, 11.9 MJ / kg umsetzbare Energie), Futter und Wasser standen den Tieren ad libitum zur Verfügung.
Alle Untersuchungen wurden unter Beachtung des Deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt.
3.2 Verwendete Sustanzen 3.2.1 Ramipril
Ramipril (Aventis Pharma Deutschland GmbH), dargestellt in Abbildung 3, ist eine Substanz aus der zweiten Generation der ACE-Hemmer. Die chemische Bezeichnung lautet : 2-[ N- [(S)-1-Ethoxycarbonyl –3-phenylpropyl]-L-alanyl]-(1S,3S,5S)-2-azabicyclo[3.3.0]octan-3-
Der ACE-Hemmer Ramipril hemmt, wie andere Substanzen seiner Wirkstoffklasse, die Spaltung des inaktiven Angiotensins I zum aktiven Metaboliten Angiotensin II. Diese Reaktion wird von dem Angiotensin-Konversionsenzym katalysiert. Ramipril hemmt dieses Enzym durch Bindung mit einer Carboxylgruppe an das Zink im aktiven Zentrum des Enzyms. Ramipril ist als sogenannte „Prodrug“ konzipiert worden. Als solche entwickelt sie ihre volle inhibitorische Kraft erst nach enzymatisch vermittelter Hydrolyse im Körper, hauptsächlich in der Leber, vom Ramipril (Ester) zu dem biologisch aktiven Metaboliten Ramiprilat (Säure) welcher blutdrucksenkend wirkt und dessen Molekulargewicht 388,46 g/mol beträgt. Ramiprilat ist in Abbildung 4 dargestellt.
Ramiprilat ist ein hochaffiner, aber langsam bindender kompetitiver Inhibitor, dessen Bindung an ACE über einen Zwischenschritt erfolgt. Zunächst wird durch Bindung des Inhibitors an das Enzym ein initialer Enzym-Inhibitor-Komplex gebildet. Dieser lagert sich durch Isomerisierung langsam um und bildet so einen stabilen Enzym-Inhibitor-Komplex der nur langsam wieder dissoziiert.
Ein Maß für die Bindung eines Hemmers an das zugehörige Enzym - in diesem Fall von Ramiprilat am Angiotensin-Konversionsenzym - ist die allgemeine Hemmkonstante Ki. Über den Ki-Wert kann die Affinität von zwei konkurrierenden Substraten zu einem Enzym abgeschätzt werden. Der Ki-Wert dient als Maß für die Potenz eines Substrates als kompetitiver Hemmer eines Enzyms zu agieren und es in seiner Funktion für andere Substrate zu hemmen. Hohe Ki-Werte bedeuten, dass hohe Konzentrationen zur Enzyminhibition notwendig sind, umgekehrt deutet ein niedriger Ki-Wert auf eine große inhibitorische Potenz hin. Bezüglich ACE Hemmung beträgt der Ki-Wert für Ramiprilat 7 pmol/l. Die Inhibitorische Konstante IC50 gibt an, wie viele µmol/l Substanz benötigt werden um 50% des Untersuchten Enzyms zu hemmen. Je niedriger der Wert ist, desto potenter die Substanz. Der IC50-Wert für Ramiprilat liegt bei 0.00015 µmol/l (CEREP FINAL STUDY REPORT, unpubliziert, 2002).
Die klinische Anwendung von Ramipril beim Patienten beruht auf einer oralen Applikation.
Sowohl in der Ratte als auch im Menschen setzt nach oraler Gabe von Ramipril eine schnelle Resorption von 56% ein, die durch gleichzeitig eingenommene Nahrung nicht signifikant
beeinflusst wird. Nach fast vollständiger Metabolisierung wird die Substanz hauptsächlich renal ausgeschieden. Die Halbwertszeit von Ramipril ist lang genug, dass eine einmalige Einnahme täglich genügt, um beim Patienten einen ausreichend hohen und konstanten Wirkspiegel zu erreichen (Eckert et al. 1984).
Während der gesamten Behandlungsdauer von 26 Wochen erhielten die Ratten Ramipril in einer Dosis von 1 mg/kg Körpermasse täglich, welches über das Trinkwasser verabreicht wurde. Diese orale Dosis hemmt in der Ratte das Plasma-ACE bis zu 24 Stunden und das Gewebs-ACE (in z.B. Niere und Lunge) bis zu 48 Stunden ( BECKER et al. 1984; UNGER et al. 1984).
Zusätzlich wurde im Verlauf dieser Studie gezeigt, dass diese Dosis eine fast vollständige Hemmung der Plasma-ACE-Aktivität gewährleistete (siehe „4.4. Angiotensin- Konversionsenzm-Aktivität“)
Abb. 3: Strukturformel des ACE-Inhibitors Ramipril (Molekulargewicht: 416,5 g/mol)
Abb. 4: Strukturformel von Ramiprilat, dem aktiven Metaboliten von Ramipril (Molekulargewicht:
388,46 g/mol)
H N
H
H C O
C C NH CH2
CH2
C H3 H C H
O HO
COOH H N
H
H C O
C C NH CH2
CH2
C H3 H C H
O H5C2O
COOH
3.2.2 Substanz AVE 7688
Der ACE/NEP-Inhibitor AVE 7688, dargestellt in Abbildung 5, ist ein Produkt der Firma Aventis Pharma Deutschland GmbH, welches sich in der präklinischen Entwicklung befindet.
Die chemische Bezeichnung lautet: 7[[(2S)-2-(acetylthio)-1-oxo-3-methyl-propyl]amino]- 1,2,3,4,6,7,8,12b-octahydro-6-oxo-,(4S,7S,12bR)-pyrido[2,1-a][2]benzazepine-4-carbonsäure, die Summenformel ist C22H28N2O5S. Die Substanz AVE 7688 ist eine “Prodrug”, deren Molekulargewicht 432,54 g/mol beträgt. Der biologisch aktive Metabolit ist die Substanz MDL 108,048 mit einem Molekulargewicht von 390,50 g/mol, die antihypertensiv wirkt. Die Substanz MDL 108,048 ist in Abbildung 6 zu sehen.
Wie Ramipril hemmt die Substanz AVE 7688 das Angiotensin-Konverversionsenzym, zusätzlich aber auch das membran-gebundene Metalloenzym Neutrale Endopeptidase, welches wie ACE auch ein aktives Zink Zentrum enthält. Der Ki-Wert für MDL 108.048, dem aktiven Metaboliten von der Substanz AVE 7688 beträgt 1.2 nmol/l für ACE und <1.5 nmol/l für NEP, der IC50-Wert beträgt 0.000052 µmol/l für ACE und 0.0050 µmol/l für NEP (CEREP FINAL STUDY REPORT, unpubliziert, 2002).
Die optimale orale Dosis des ACE/NEP-Inhibitors AVE 7688 bei Ratten wurde in einem nicht veröffentlichten Dosisfindungsversuch der Firma Aventis Pharma ermittelt. Eine abschließende Blutuntersuchung im Rahmen dieser Studie hat dazu gedient, die Plasmakonzentration der wirksamen Substanz MDL 108.048 zu bestimmen. Zusätzliche Bestimmungen der ACE-Aktivität in dieser Studie haben gezeigt, dass bei einer täglichen Dosis von 30 mg/kg Körpermasse täglich eine fast vollständige Hemmung des Enzyms vorlag (siehe „4.4 Angiotensin-Konversionsenzm -Aktivität“).
Während der gesamten Behandlungsdauer von 26 Wochen erhielten die Ratten die Substanz AVE 7688 in einer Dosis von 30 mg/kg Körpermasse täglich, was einer Futterzumischung von 0,075 % Substanz bei einer Futteraufnahme von 7.5 % der Körpermasse pro Tag entspricht.
