Bestimmung der Körpermasse, der Futter- und Wasseraufnahme

In der 21. und 31. Woche wurden bei den Tieren die Stoffwechselparameter Körpermasse, Futter- und Wasseraufnahme gemessen, um eine Aussage über die Stoffwechsellage und das Fress- und Trinkverhalten der Tiere zu erhalten. Zusätzlich wurden so bei den mit der Substanz AVE 7688 und Ramipril behandelten Tieren die aufgenommenen Behandlungsdosen überwacht. Entsprechend dem Wasserverbrauch wurde die Ramiprildosis für die jeweilige Gruppe angepasst, so dass eine hohe Genauigkeit der Dosierung von 1mg/kg Körpermasse Ratte über die gesamte Behandlungsdauer gewährleistet war.

Die ZDF- und Wistar-Ratten kamen im Alter von 21 und 31 Wochen nach vorherigem Wiegen für 24h in Einzel-Stoffwechselkäfige (Firma Tecniplast, Buguggiate, Italien). Diese Stoffwechselkäfige ermöglichen eine genaue Kontrolle der Aufnahme von Futter und Wasser, welches den Tieren ad libitum abgeboten wird sowie über die Ausscheidung von Kot und Urin. Zusätzlich erfolgte in der 39. Woche und am Tag der Enduntersuchung die Ermittlung der Körpermasse der einzelnen Tiere.

Zu Behandlungsbeginn waren alle Tiere 21 Wochen alt, daher wurden in der ersten Untersuchung repräsentativ 12 ZDF Placebo und 13 Wistar Placebo Tiere untersucht. Diese Werte dienten als Ausgangswerte für die späteren Untersuchungen.

3.3.5 Bestimmung von Albumin, Creatinin und Glukose im Urin

In der 21. und 31. Woche wurden die Tiere in Stoffwechselkäfige gesetzt. Der Urin wurde in separaten Gefäßen als Spontanurin aufgefangen.

Im Alter von 39 Wochen wurde bei den ZDF-und Wistar-Tieren der Urin als Spontanurin gewonnen. Hierfür wurden die Ratten auf einer kalten Metallunterlage platziert. Der Kältestress löste bei den Tieren eine Niktation aus. Der Urin wurde sofort aufgefangen und in sterile Röhrchen verbracht.

Im Rahmen der Behandlung wurden bei den Tieren im Alter von 21, 31 und 39 Wochen Glukose, Albumin und Creatinin im Urin bestimmt. Die Parameter wurden im klinisch-chemischen Labor der Firma Aventis Pharma GmbH Deutschland ermittelt nach Eichung der Geräte mit einem mitgelieferten Standard. Die jeweiligen Testkits enthielten Standards, mit dem eine Eichung erfolgte. Diese Stoffwechselparameter dienten dazu, eine Aussage über die Nierenfunktion zu erhalten.

Albuminbestimmung:

Die Bestimmung des Albumins erfolgte mit dem Testkit „Mikrofluoral“ (Firma Progen Biotechnik, Heidelberg), im „Fluoreszenz Microplate Reader“ (Firma Progen Biotechnik, Heidelberg). Hierbei handelte es sich um ein Fluoreszenz-Test zur quantitativen Bestimmung von Albumin im Urin. Die Methode basiert auf Albumin Blue 580, welches nur eine geringe Eigenfluoreszenz hat. Nach der Bindung an Albumin, entwickelte Albumin Blue 580 eine rote Fluoreszenz, die bei 590-600 nm Anregung und 630-645 nm Emission direkt proportional zu der in der Probe enthaltenen Albuminkonzentration war.

Creatininbestimmung:

Die Bestimmung des Creatinins erfolgte mittels eines enzymatischen Farbtests (Creatinin PAP, SYS1, BM/ Hitachi 704, Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) mit frischem Urin. Durch die in der Testsubstanz vorhandenen Enzyme Kreatininkinase, Kreatinase und Sarkosinoxidase sowie Wasser und Sauerstoff, wurde das Creatinin zunächst zu Creatin umgewandelt. Es folgte die Umwandlung zu Sarkosin und schließlich zu Glycin. Neben andern Abbauprodukten fiel Wasserstoffperoxid an, welches mit 2,4,6-Tribrom-3-hydroxybenzoesäure und 4-Aminophenazon mit Hilfe einer Peroxidase einen Chinonimin-Farbstoff bildete. Die Konzentration dieses Chinonimin-Farbstoffs wurde photometrisch gemessen.

Glukosebestimmung:

Die Glukosebestimmung im Urin erfolgte mit dem Testkit „Gluco-quant“ (Firma Roche

computergesteuerten Analyzer, der für die klinische Chemie konzipiert wurde und dessen maximaler Output 360 Tests/h beträgt. Die Methode ist ein enzymatischer in-vitro-Test zur quantitativen Bestimmung von Glukose im Urin, basierend auf der Hexokinase-Methode.

Hierbei wurde Glukose durch Hexokinase und ATP zu Glukose-6-Phosphat phosphoryliert.

Glukose-6-Phosphat wurde in Gegenwart von NADPH über Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase zu Gluconat-6-Phosphat oxidiert. Es fand keine Oxidierung von anderen Kohlenhydraten statt. Die Zunahme von NADPH war direkt proportional zu der vorhandenen Glukosekonzentration und wurde photometrisch gemessen.

3.3.6 Retrobulbäre Blutentnahme

Im Alter von 21, 31 und 39 Wochen wurde eine retrobulbäre Blutentnahme duchgeführt. Zur Durchfühung dieser Blutentnahme wurden die Tiere unter Einsatz von 4 l/min Sauerstoff, 3 l/min Lachgas und 3-3,5 Vol.% Isofluran in einem Gefäß betäubt. Anschließend wurde eine Einmal-Mikropipette (20 µl-Einmal-Pipette, intraEND^®, Fa. Brand, Wertheim) über den medialen Augenwinkel am Bulbus entlang zum Augenhintergrund vorsichtig eingeführt. Der retrobulbäre Venenplexus wurde mit einer drehenden Bewegung eröffnet, das Blut über die Mikropipette entnommen und unter EDTA-Zusatz (1,6 mg Kalium-EDTA/ml Blut) für die Dauer von zehn Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Alle Parameter wurden im klinisch-chemischen Labor der Firma Aventis Pharma GmbH Deutschland ermittelt nach Eichung eines mitgelieferten Standards.

Alle Entnahmen dienten dazu, Glukose und HbA1C zu bestimmen. In der 31. und 39.

Lebenswoche wurden zusätzlich bei den Wistar- und ZDF-Tieren die ACE-Aktivität und das Cholesterin bestimmt. Zu Behandlungsbeginn waren alle Tiere 21 Wochen alt, daher wurden in der ersten Untersuchung repräsentativ 12 ZDF Placebo und 13 Wistar Placebo Tiere untersucht. Diese Werte dienten als Ausgangswerte für spätere Untersuchungen.

3.3.6.1 Bestimmung von Gesamtcholesterin

Die quantitative Bestimmung von Gesamtcholesterin erfolgte in einem klinisch-chemischen Analyseautomaten von Hitachi (Hitachi Type 912 Automatic Analyzer, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim.

Grundlage für die quantitative Bestimmung von Cholesterin im Plasma ist der In-vitro-Test

„Cholesterin CHOD-PAP“ (Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim). Das Cholesterinreagenz wurde zum Plasma dazugegeben, unter Einwirkung der Cholesterinesterase wurden die Cholesterinester in freies Cholesterin und Fettsäuren gespalten. Unter Mitwirkung von Cholesterinoxidase wurde Cholesterin von Sauerstoff zu ∆⁴ -Cholestenon und Wasserstoffperoxid umgesetzt. Unter katalytischer Wirkung von Peroxidase bildete das enstandene Wasserstoffperoxid mit Aminophenazon und Phenol einen roten Farbstoff. Die Farbintensität dieses Farbstoffs ist direkt proportional zur Cholesterinkonzentration im Plasma und wurde photometrisch gemessen werden.

3.3.6.2 Bestimmung der Angiotensin-Konversionsenzym-Aktvität

Die quantitative Bestimmung der ACE-Aktivität erfolgte photometrisch bei 340 nm mit Hilfe eines klinisch-chemischen Analyseautomaten von Hitachi (Hitachi Type 912 Automatic Analyzer, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim).

Durch Zugabe von Tripeptidsubstrat N-[3-(2-furyl)acryloyl]-L-Phenyl-alanyl-Glycyl-Gylycin (FAPGG) (Firma Sigma, Deisenhofen) wirkte ACE als Katalysator. FAPGG wurde hydrolysiert und zu Furylacryloyl-Phenylalanin (FAP) und Glycin-Glycin (GG) gespalten.

Durch den hydrolytischen Abbau kam es zu einer Absorptionsabnahme bei 340 nm. Im etablierten und evaluierten spektralphotometrischen Verfahren wurde die ACE-Aktivität in der Probe durch einen Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeit der Probe mit der eines ACE-Kalibrators (Firma Sigma, Deishofen) ermittelt.

3.3.6.3 Bestimmung von Glukose und HbA1c

Glukosebestimmung:

Die Bestimmung von Glukose im Plasma erfolgte photometrisch mit dem Testkit „Gluco-quant“ (Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) im „Roche/Hitachi 912“ Analyzer der Firma Hoffmann-La Roche GmbH, Mannheim. Die Methode und Auswertung erfolgte analog der Durchführung der Glukosebestimmung im Urin.

HbA1c-Bestimmung:

Die HbA1c-Bestimmung erfolgte mit dem Roche/Hitachi Kit Tina-quant (Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim). Das Testprinzip dieses Kits beruht auf dem turbudimetrischen immunologischen Inhibierungsassay (TINIA) für hämolysiertes Vollblut.

Das zu untersuchende Blut wurde mit einer Einmalkapillare entnommen. Die gefüllte Kapillare wurde in ein Reagenzglas gegeben, welches die 100-fache Menge an Hämolysereagenz enthielt. Das Reagenzglas wurde verschlossen und durch kräftiges Schütteln das Blut aus der Kapillare gespült. Durch Verwendung eines Vibrationsmischers wurde das Blut vermischt, nach Abklingen der Schaumbildung und Einsetzten des Farbumschlags von rot auf bräunlichgrün wurde das Hämolysat verwendet. Zur Messung von HBA1c wurde die so aufbereitete Probe mit Puffer und HbA1c-Antikörpern versetzt. Durch Zugabe von HbA1c-Polyhapten wurde die Reaktion gestartet. Glykohämoglobin aus der Probe bildet mit HBA1c-Antikörpern einen löslichen Antigen-Antikörper-Komplex. Der HbA

1c-Antikörper besitzt eine spezifische Bindungsstelle, welche nur einmal am gesamten HbA1c -Molekül vorhanden ist, aus diesem Grund können sich keine komplexen Strukturen bilden.

Nach der Zugabe von Polyhaptenen bildeten diese mit vorhandenen überschüssigen HbA1c -Antikörpern einen unlöslichen Antikörper-Polyhapten-Komplex. Dieser wurde turbidimetrisch nachgewiesen. In einem zweiten Kanal erfolgte die Messung der Hämoglobinkonzentration. Aus der HbA1c-Konzentration und der Hämoglobinkonzentration wurde der Anteil von HbA1c am Gesamthämoglobin in Prozent berechnet.