Tys^Ti WELTORGANISATION FOR GEISTIGES EIGENTUM MT L Internationales Biiro
INTERNATIONALE ANMELDUNG VEROFFENTLICHT NACH DEM VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ZUSAMMENARBEIT AUF DEM GEBIET DES PATENTWESENS (PCT) (51) Internationale PatentkJassifikation:
Nicht klassifiziert A2
(11) Internationale Veroffentlichungsnummer: WO 89/11211 30. November 1989(30.11.89) (43) Internationales
Veroffentlichungsdatiim:
(21) Internationales Aktenzeichen:
(22) Internationales Anmeldedatum:
PCT/EP89/00579 24. Mai 1989 (24.05.89) (30) Prioritatsdaten:
P38 17 591.6 24. Mai 1988(24.05.88) DE (71) Anmelder (fur alle Bestimmungsstaaten ausser US): GESELL- SCHAFT FOR BIOTECHNOLOGISCHE FOR- SCHUNG MBH (GBF) [DE/DE]; Mascheroder Weg I, D-3300 Braunschweig (DE).
(72) Erfinder; und
(75) Erfinder/Anmelder (nur fur US): BLOCKER, Helmut [DE/
DE]; Mascheroder Weg I, D-3300 Braunschweig (DE).
(74)Anwalt: BOETERS, Hans, D.; Thomas-Wimmer-Ring 14, D-8000 MOnchen (DE).
(81) Bestimmungsstaaten: AT (europaisches Patent), BE (euro- paisches Patent), CH (europaisches Patent), DE (euro- paisches Patent), FR (europaisches Patent), GB (euro- paisches Patent), IT (europaisches Patent), JP, LU (euro- paisches Patent), NL (europaisches Patent), SE (europai- sches Patent), US.
Veroffentlicht
Mit einer Erkldrung gemass Artikel 17 Absatz 2(a).
Ohne Klassifikation und ohne Zusammenfassung; Bezeich- nung von der Internationalen Recherchenbehdrde nicht uberprufi.
(54)Title: OLIGONUCLEOTIDE BANK AND PROCESS FOR DNA SEQUENCING
(54) Bezeichnung: OLIGONUCLEOTIDBANK UND VERFAHREN ZUR DNA-SEQUENZIERUNG
LEDIGUCH ZUR INFORMATION
Code, die zur Identifizierung von PCT-Vertragsstaaten auf den Kopfbogen der Schriften, die international Anmeldungen gemass dem PCT veroffentlichen.
AT Osterceicrt AU Australien BB Barbados BE Belgwn BF Burkina Faiso BG Bulgaxicn BJ Benin BR Brasilien
CF Zentrale Afhkanischc Republik CG Kongo
CH Schweiz CM Kamerun
DE Deuischland. Bundeircpublik DK DSnemark
ES Spanien
Fl Finnland FR Frankreich GA Gabon
GB Vcrcinigtes Konigreich HU Ungarn
tT Italien JP Japan
KP Demokratische Volksrepubtik Korea KR Republik Korea
U Liechtenstein LK Sri Unka LU Luxemburg MC Monaco MG Madagaskar ML Mali
MR Mauritanien MW Malawi NL Ntederfande NO Norwegen RO Rumanien SO Sudan SE Schweden SN Senegal SU Soviet Union TD Tschad TG Togo
US Vereinigte Siaaien von Amerika
WO 89/11211 PCT/EP89/00579 -4-
Oligonucleotidbank und Verfahren zur DNA-Sequenzierung
Die Sequenzanalyse von Nucleinsaurefragmenten, insbesondere von DNA, ist als ein Schlusselverfahren der modernen Biowissen- schaften und der modernen Biotechnologie anzusehen. In letzter Zeit gerat rait der standigen Verfeinerung der Sequenzierungs- techniken auch die Analyse von ganzen, komplexen Genomen in den Bereich des Moglichen.
Neben einigen weniger popularen Methoden werden heutzutage vor allera zwei grundsatzlich unterschiedliche Methoden zur Sequenz- analyse angewandt, und zwar
- die Sequenzierung durch chemische Modifizierung und Abbau (Maxam/Gilbert-Methode) sowie
- die Sequenzierung durch kontrollierten Polymerase-Einbau unterschiedlicher Nucleotide (Sanger-Methode); vgl. beispiels- weise Gassen & Schafer, Sequenzbestimmung von Nucleinsauren und Proteinen, in: Gassen et al, Gentechnik, 2. Auflage, Gustav- Fischer-Verlag, 1987, Seite 241 ff.
Die Sanger-Methode kann sowohl mit einzelstrangiger DNA, die speziell fur den Zweck der Sequenzierung hergestellt wird, als auch seit wenigen Jahren mit jeder ausreichend reinen doppel- strangigen DNA durchgefiihrt werden. Ein durchgehendes Wesens- raerkmal der Sanger-Methode bleibt jedoch unter anderem die Ab- hangigkeit der verwendeten Einbauenzyme (DNA-Polymerasen) sowohl von einer Matrize (Teraplat = zu sequenzierende DNA) als auch von einem Startmolekiil (Primer). Der Primer ist in der Regel ein kurzes, chemisch synthetisiertes Oligonucleotid, das in seiner
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ganzen Lange zu einem 3' von dem zu sequenzierenden DNA-Ab- schnitt gelegenen Teilstiick basenkomplementar ist:
zu sequenzieren
Primer
3'
Die Anheftungsstelle (Hybridisierungsstelle ) des Primers mu(3 derart gewahlt sein, daS unter den experimentellen Bedingungen der Primer nur die gewtinschte und keine einzige weitere An- hef tungsstelle findet, um ein lesbares Sequenzierungsergebnis erreichen zu konnen. Die Spezifitat des Primers hangt direkt von seiner Lange und der Koraplexitat der im Experiment verwendeten DNA ab, Aus statistischen Erwagungen und praktischer Erfahrung ergibt sich, dafl Primer mit einer Kettenlange von bis zu 24 Basen fur alle denkbaren Falle ausreichen sollten.
Bei der Sequenzanalyse sehr langer DNA (beispielsweise bei Ge- nomsequenzierungen) werden gegenwartig im wesentlichen zwei ver- schiedene Strategien verfolgt.
Strategie 1: Die Ein-Primer-Methode. Hierbei wird die zu sequen- zierende DNA (je nach Verfahrensvariante) mehr oder weniger in Zufallsfragmente oder teilweise geordnete Fragmente zerlegt, wonach die Fragmente in ein und denselben Vektor inseriert
werden. Nach Transformation von Zellen werden DNA-Praparationen von einzelnen Klonen hergestellt und der Sequenzanalyse unter- worfen. Da sich alle DNA-Praparationen maximal um die inserierte DNA unterscheiden, kann fur alle anstehenden Sequenzanalysen im Prinzip ein einziger Primer verwendet werden, der beispielsweise direkt neben der Insertionsstelle auf der Vektor-DNA hybridi- siert. Diesem Vorteil stehen jedoch auch erhebliche Nachteile gegenuber,
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- denn da die Klone zufallig ausgesucht werden miissen, werden einzelne Abschnitte der Original-DNA sehr oft weit haufiger als notig sequenziert, und
- schlieBlich klaffen in der mit Hilfe von geeigneten Computer- Programmen zu einer Gesamtsequenz geordneten Sammlung der Teil- sequenzierungsergebnisse haufig betrachtliche Lticken, da bei- spielsweise gewisse Abschnitte der zu analysierenden Original- DNA "schwer klonierbar" sind.
Strategie 2: Die Mehr-Primer-Methode. Die zu sequenzierende DNA wird hier nicht wie bei Strategie 1 nach der SchrotschuB-Me- thode, sondern gezielt progressierend analysiert. Der in einem Experiment noch sicher zu entschlusselnde Sequenzabschnitt dient
zur Auswahl einer Primer-Anheftungsstelle fiir das nachste Ex- periment und so fort. Der Vorteil dieser Methode liegt vor allem darin, daB unnotige Mehrfachsequenzanalysen wie bei der
Strategie 1 vermieden werden. Der wohl wesentliche Grund, warum diese Methode nicht allein fiir die Analyse langer DNA-Abschnitte verwendet wird, liegt in der Beschrankung durch die gegenwartig verfiigbaren Methoden zur chemischen DNA-Synthese.
Es hat nicht an Versuchen gefehlt, die jeweiligen Nachteile der oben beschriebenen Verfahren zu mildern, beispielsweise durch das "Multiplex-Sequencing" bei Strategie 1 und das simultane progressierende Sequenzieren von verschiedenen Stellen aus bei Strategie 2. Ein Weg, den wesentlichen Nachteil der Strategie 2 ganz zu beseitigen, liegt theoretisch darin, eine Bank aller denkbaren Primer anzulegen. Dies ist jedoch durch direkte che- mische Synthese praktisch nicht moglich, da es allein 424 ver- schiedene Primer der Kettenlange 24 gibt.
ErfindungsgemaB wird daher vorgeschlagen, kurzere, cheraisch syn- thetisierte Oligonucleotide zu verwenden. Da jede langere Se- quenz im Prinzip aus zwei oder mehr kiirzeren Sequenzen zusammen- setzbar ist, werden die dem gewunschten Primer entsprechenden
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kurzen Oligonucleotide anstelle des gewiinschten Primers zu der zu sequenzierenden DNA gegeben und durch eine
geeignete Prozedur, beispielsweise mit T4-DNA-Ligase, zu dem gewiinschten Primer zusammengefiigt• Die Sequenzierungsreaktion kann dann anschlieflend praktisch unter Standardbedingungen durchgefiihrt werden.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird durch die Gegen- stande der Anspruche gelost.
Beispiel 1
In typischen Experimenten wurden ca. 2,5 pMol DNA des Plasmids PTZ18R (Pharmacia-LKB) mit NaOH denaturiert, mit Ethanol ge-
fallt, getrocknet und in Wasser aufgenommen. Die DNA-L6sung wurde mit je 2,5 pMol zweier verschiedener Oligonucleotidlosun- gen versetzt. Die Oligonucleotide der Kettenlange 8 (Octamere) waren derart gewahlt, daJ3 sie unmittelbar benachbart auf einem Abschnitt bekannter Nucleotidsequenz der Plasmid-DNA hybridi- sieren konnten. Das 5f-Ende des im hybridisierten Zustand be- nachbart zum 3'-Ende des anderen Oligonucleotids gelegenen
Octamers war zuvor nach gangigen Verfahren mit T4-Polynucleotid- Kinase und ATP phosphoryliert worden. Nach Einstellen der be- kannten Pufferbedingungen fur Ligationen mit T4-DNA-Ligase und Versetzen mit 1 Einheit des Enzyms wurde die Losung (10 ul End- volumen) 4 h lang bei 15 °C inkubiert. Diese Ligationslosung wurde vor der Sequenzierung 5 min lang bei 37 °C aufbewahrt, um moglichst viele durch Ligation entstandene 16-mere und moglichst wenige 8-mere hybridisieren zu lassen.
Die folgende Sequenzierung sollte dazu dienen, die Sequenz des gewahlten Vektors zu iiberprufen. Fur die Sequenzierungsreaktion nach dem Standardprotokoll der Firma United States Biochemical Corporation (USB) wurden 8 pi der Ligationslosung eingesetzt.
Abweichend von diesem Protokoll wurde auf das "Annealing" von Templat und Primer verzichtet.
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- 5 -
PCT/EP89/00579
Sofern die genannte Phosphorylierung in Gegenwart von [gamma-
32P]ATP durchgefiihrt worden war, wurde auf die spatere Verwendung von [a-32P]dATP verzichtet.
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PCT/EP89/00579
Patentanspruche
1. Oligonucleotidbank, urafassend alle denkbaren 46 verschie- denen hexameren Oligonucleotide.
2. Oligonucleotidbank, umfassend alle denkbaren 47 verschie- denen heptameren Oligonucleotide.
3. Oligonucleotidbank, umfassend alle denkbaren 48 verschie- denen octameren Oligonucleotide.
4. Oligonucleotidbank, umfassend alle denkbaren 49 verschie- denen Oligonucleotide.
5. Verfahren zur DNA-Sequenzierung nach der Mehr-Primer- Methode, dadurch gekennzeichnet, da0 man
(a) bei der zu sequenzierenden DMA eine einzelstrangige Pr imeranheftungsstelle bekannter Sequenz wahlt,
(b) auf dieser Primeranheftungsstelle unmittelbar benachbart zwei hexamere, heptamere oder octamere Oligonucleotide (bei- spielsweise einer Oligonucleotidbank gemaB einem der vorher- gehenden Anspruche 1 bis 4) hybridisiert und
(c) ggf» gleichzeitig mit Stufe (b) oder nach Stufe (b) ein weiteres hexameres, heptameres oder octameres 01igonucleotid (beispielsweise einer Oligonucleotidbank gemap einem der vorhergehenden Anspruche 1 bis 4) unmittelbar benachbart zu
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einem der beiden anderen Oligonucleotide auf der Primeran- hef tungsstelle hybridisiert und
(d) die Oligonucleotide zu einem Primer ligiert.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, da{3 man auf der Primeranheftungsstelle zwei Oligonucleotide hybridi- siert und miteinander zu einem Pra-Primer ligiert und erst danach auf der Primeranheftungsstelle ein drittes Oligomeres hybridisiert und mit dem Pra-Primer ligiert.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, da{3 man fur die Primerbildung hexamere, heptamere und/oder octamere Oligonucleotide verwendet.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspriiche, dadurch gekennzeichnet, da(3 roan Oligonucleotide verwendet, die an ihrem S'-Ende, sofern dieses Ende mit einem benachbarten Oligonucleo- tid rait Hilfe von T4-DNA-Ligase ligiert werden soil, phosphory- liert sind.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspriiche, dadurch gekennzeichnet, da0 man nach der Ligation und vor der Sequen- zierung nicht zum gewiinschten Primer ligierte Oligonucleotide durch Warraebehandlung entfernt.
PATENT COOPERATION TREATY
DECLARATION Of NON-ESTABLISHMENT OF INTERNATIONAL SEARCH REPORT issued pursuant to PCT Article 17(2) (a) tx)
IDENTIFICATION OF THE INTERNATIONAL
APPLICATION OR AGENT'S FILE REFERENCE
International Aooiication No, PCT/EP 89/00579
International Filing Date 24 May 1989
Receiving Office RO/EP
Priority Date Claimed 24 May 1988 Applicant (NameGES ELLSCHAFT FOR
BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG mbH (GBF) et al.
Int. CI.4 c 12 N 15/00 C 12 Q 1/68 DECLARATION
This International Searching Authority hereby declares that no international search report will be established on the above-identified international apDii- cation for the reasons indicated belcv.d)
1.
a.
b.
c.
d.
e.
The subject matter of the international application relates to:(2) scientific theories ■
mathematical theories • plant varieties•
animal varieties •
essentially biological processes for the production of plants and.
animals, other than microbiological processes and the products of such processes.
f. | schemes, rules or methods of doing business.
schemes, rules or methods of performing purely mental'acts.
| schemes, rules or methods of playing games.
j methods for treatment of the human body by surgery or therapy.
j methods for treatment of the animal body by surgery or therapy.
j diagnostic methods.
| mere presentations of information.
□computer programs for which this International Searching Authority is not equipped to search prior art.
HThe failure of the following parts of the international application to comply with prescribed requirements prevents a meaningful search from being carried out: (3)
| |the description.
| X j the claims.
Q | the drawings.
comment; Art. 17.2(a) (ii) The patent claims are not fully supported by the description,
g.
h.
i.
j.
k.
1.
m.
CERTIFICATION International Searching
Authority
European Patent Office
Date of Mailing
12 September 19 89 (12.09.89)
Authorized Officer
Pons PCT/ISA/20J (January 1935)
VEK .{AG OBER DIE INTERNATIONALE ZUS:, .MENAR8EIT AUF DEM GEBIET DES PATENTWESENS
ERKLARUNG OBER DIE Nt-HTERSTELLUNG E1NES INTERNATIONALEN RECHERCHENBERICHTS gemaS Artikel 17 Absaxz 2 Buchstabe a PCT1
KENNZEICHNUNG DER INTERNATIONALEN ANMELDUNG
AKTENZEICHEN DES ANMELOERS OOER ANWALTS 5352-GBF
Internationales Aktenzeicnen PCT/EP 89/00579
Internationale) Anmeidedatum 24. Mai 1989 Anmeideamt
RO/EP
Beantpruchtee Prioritatsdatum 24. Mai 1988
Anm.id.r (N.m.» QESELLSCHAFT FUR 7~"I~"oT"4"T "^"V-,~M" -, cTnn 3IOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG mbH (GIF) (lnt' C1 ' J *« J "£"U
klassifikation der aruneldung
■r aJ C 12 Q 1/68
ERKLARUNG
Oie Internationale Recherchenbehdrde erklirt hiermit. daS fur die oben genannte Internationale Anmeldung aus den nachstenenden Grunden kein internationaler Recherchenbericht erstellt wird.1
1. Oer Gegensiand der internationalen Anmeldung betrifft foigende Gebiete:2 a. CZ3 wissenschafTliche Theorien,
b. I I mathematische Theorien.
c 1 1 Pflanzensonen.
d. a Tieranen.
e. I ! im wesemlichen biologische Verfahren zur Zuchtung von Pflanzen und Tieren mil Ausnahme mikrobiologischer Verfahren und der mil Hilfe dieser Verfahren gewonnenen Erzeugnisse.
f. I I Plane, Regeln und Verfahren fur eine gescharttiche Tatigkeit.
g. 1 I Plane, Regeln und Verfahren fur rein gedankiiche Tatigkeiten.
h. I I Plane. Regeln und Verfahren fur Spiele.
i. I I Verfahren zur chirurgischen Oder therapeutischen 8ehandlung des menschlichen Korpers.
j I i Verfahren zur chirurgischen Oder therapeutischen Behandlung des tierischen Korpers.
Diagnosiizierverfahren.
1. 1 1 bloSe Wiedergabe von Informationen.
m. I [ Programme von Datenverarbeitungsaniagen, fur die die Internationale Rechercnenoehorde nicht zur OurchfOhrung einer Recherche uber den Stand der Technik ausgerustet ist.
2. 1 X 1 Oie folgenden Teile der internationalen Anmeldung entsprechen den vorgeschriebenen Anforderungen so wenig, da& eine sinnvolle Recherche nicht durchgefuhn werden kann :3
a. 1 1 die Beschreibung.
b. I ^ 1 die Anspruche.
c. I 1 die Zeichnungen.
Bemerkungen Art. 17.2 (a)(ii) Die Patentanspriiche werden nicht in vollen Umfang durch die Beschreibung gestUtzt.
BESCHEINIGUNG Internationale Recherchenoenorde
EUROPAISCHES PATENTAMT Zweigytelle in Oen Haag
P.B. 5818 Patentlaan. 2
2280 HV RIJSWUK (ZH) / Niedertande
Telex 31651 «M070I 4O204Q frSREVPATENT
Abaendadatum
12 c SEF.1989
Bavollmacntigter Bedtenneter
T.K. WILLIS Formalin PCT/1SA/203 (Jinmr 1985)
BERICHTIGTE FASSUNG*
p/^T» WELTORGANISATION FOR GEfSTIGES EIGENTUM IT V^J. Internationales Buro
INTERNATIONALE ANMELDUNG VEROFFENTLICHT NACH DEM VERTRAG UBER DIE INTERNATIONALE ZUSAMMENARBEIT AUF DEM GEBIET DES PATENTWESENS (PCT) (51) Internationale Patentklassifikation 4
C12Q 1/68, C12N 15/00 A3
(11) Internationale Veroffentlichungsoummer; WO 89/11211 30. November 1989 (30.11.89) (43) Internationales
Veroffentlichungsdatum:
(21) Internationales Aktenzeichen: PCT/EP89/00579 (22) Internationales Anmeidedarum': 24. Mai 1989 (24.05.89) (30) Prioritatsdaten;
P38 17 591.6 24. Mai 1988 (24.05.88) DE (71) Anmelder (fur alle Bestimmungsstaaten ausser US): GESELL- SCHAFT FUR BIOTECHNOLOGISCHE FOR- SCHUNG MBH (GBF) [DE/DE]; Mascheroder Weg I, D-3300 Braunschweig (DE).
(72) Erfinder;und
(75) Erfinder/Anmelder (nur fir US) : BLOCKER, Helmut [DE/
DE]; Mascheroder Weg I, D-3300 Braunschweig (DE).
(74)Anwalt: BOETERS, Hans, D.; Thomas-Wimraer-Ring 14, D-8000 Munchen (DE).
(81) Bestimmungsstaaten: AT (europaisches Patent), BE (euro- paisches Patent), CH (europaisches Patent), DE (euro- paisches Patent), FR (europaisches Patent), GB (euro- paisches Patent), IT (europaisches Patent), JP, LU (euro- paisches Patent), NL (europaisches Patent), SE (europai- sches Patent), US.
Veroffentltcht
Mil iniernaiionalem RecherchenberichL
Vor Ablauf der filr Anderungen der Ansprikhezugelassen Frist Veroffendichwg wird wiederholt falls Anderungen eintreffen.
(88) Veroffentlichungsdatum des intemationalen Recherchen- taichts: 8. Marz 1990 (08.03.90)
(54)Title: OLIGONUCLEOTIDE-BANK AND PROCESS FOR DNA SEQUENCING
(54) Bezetchnung: OLIGONUCLEOTIDBANK UND VERFAHREN ZUR DNA-SEQUENZIERUNG (57) Abstract
Oligonucleotide bank and process for DNA sequencing according to the multi-primer method.
(57) Zusammenfassung
Die Ertlndung betriffi eine Oligonucleotidbank und ein Verfahren zur DNA-Sequenzierung nach der Mehr-Primer-Mcthode.
LEDIGUCHZUR INFORMATION
Code, die zur Identifizierung von PCT-Vertragsstaaten auf den Kopfbogen der Schriften. die internationale Anmeldungen geraass dem PCT veroffendichen.
ML Mali MR Mauritaoieo MW Malawi NL Nfederlande NO Norwegeo RO Ruminien SD Sudan SE Scbwcden SS Senegal SU Soviet Union TD Tschad TG Togo
US Vereinigte Staaien von Amerika AT Oficrreich
AU Auaraben B8 Barbados BE Belgicn BF Burkina Fasso BG Bulgarieo RJ Benin BR Brasben CA Kanada
CF ZcntraJe Arrianiache Rcpubli CG Kongo
CH Sccwea.
CM Kamenin
DE Deutacnlafld. Bundcartpubli DK Dane mart
ES Spanien n Ftnntand FR Frankreieb GA Gabon
GB VeremigteiKonigreidi HU Ungarn
rr Italien
JP Japan
KP DemokrattEbe Volksrepublik Korea KR Republik Korea
U Liechtenstein UC Sri Unka LU Luxemburg MC Monaco MG Madagaskar
WO 89/11211
PCT/EP89/00579
Oligonucleotidbank und Verfahren zur DNA-Sequenzierung
Die Sequenzanalyse von Nucleinsaurefragmenten, insbesondere von DNA, ist als ein Schliisselverfahren der modernen Biowissen- schaften und der modernen Biotechnologie anzusehen. In letzter Zeit gerat mit der standigen Verfeinerung der Sequenzierungs- techniken auch die Analyse von ganzen, komplexen Genomen in den Bereich des Moglichen.
Neben einigen weniger popularen Methoden werden heutzutage vor allem zwei grundsatzlich unterschiedliche Methoden zur Sequenz- analyse angewandt, und zwar
- die Sequenzierung durch chemische Modifizierung und Abbau (Maxam/Gilbert-Methode ) sowie
- die Sequenzierung durch kontrollierten Polymerase-Einbau unterschiedlicher Nucleotide (Sanger-Methode); vgl. beispiels- weise Gassen & Schafer, Sequenzbestimmung von Nucleinsauren und Proteinen, in: Gassen et al, Gentechnik, 2. Auflage, Gustav- Fischer-Verlag, 1987, Seite 241 ff.
Die Sanger-Methode kann sowohl mit einzelstrangiger DNAf die speziell fur den Zweck der Sequenzierung hergestellt wird, als auch seit wenigen Jahren mit jeder ausreichend reinen doppel- strangigen DNA durchgefuhrt werden. Ein durchgehendes Wesens- merkmal der Sanger-Methode bleibt jedoch unter anderem die Ab- hangigkeit der verwendeten Einbauenzyme (DNA-Polymerasen) sowohl von einer Matrize (Teraplat = zu sequenzierende DNA) als auch von einem Startraolekul (Primer). Der Primer ist in der Regel ein kurzes, chemisch synthetisiertes Oligonucleotid, das in seiner
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ganzen Lange zu einem 3' von dem zu sequenzierenden DNA-Ab- schnitt gelegenen Teilstiick basenkomplementar ist:
5'
Primer zu sequenzieren
3'
Die Anheftungsstelle (Hybridisierungsstelle) des Primers mu(3 derart gewahlt sein, daS unter den experimentellen Bedingungen der Primer nur die gewunschte und keine einzige weitere An- heftungsstelle findet, urn ein lesbares Sequenzierungsergebnis erreichen zu konnen. Die Spezifitat des Primers hangt direkt von seiner Lange und der Komplexitat der im Experiment verwendeten DNA ab. Aus statistischen Erwagungen und praktischer Erfahrung ergibt sich, daB Primer mit einer Kettenlange von bis zu 24 Basen fur alle denkbaren Falle ausreichen sollten.
Bei der Sequenzanalyse sehr langer DNA (beispielsweise bei Ge- nomsequenzierungen) werden gegenwartig im wesentlichen zwei ver- schiedene Strategien verfolgt.
Strategie 1: Die Ein-Primer-Methode. Hierbei wird die zu sequen- zierende DNA (je nach Verfahrensvariante) mehr oder weniger in Zufallsfragmente oder teilweise geordnete Fragmente zerlegt, wonach die Fragmente in ein und denselben Vektor inseriert
werden. Nach Transformation von Zellen werden DNA-Praparationen von einzelnen Klonen hergestellt und der Sequenzanalyse unter- worfen. Da sich alle DNA-Praparationen maximal urn die inserierte DNA unterscheiden, kann fur alle anstehenden Sequenzanalysen im Prinzip ein einziger Primer verwendet werden, der beispielsweise direkt neben der Insertionsstelle auf der Vektor-DNA hybridi- siert. Diesem Vorteil stehen jedoch auch erhebliche Nachteile gegeniiber,
WO 89/11211
PCT/EP89/00579 - 3 -
- denn da die Klone zufallig ausgesucht werden mussen, werden einzelne Abschnitte der Original-DNA 3ehr oft weit haufiger als notig sequenziert, und
- schlieBlich klaffen in der mit Hilfe von geeigneten Computer- Programmen zu einer Gesamtsequenz geordneten Sammlung der Teil- sequenzierungsergebnisse haufig betrachtliche Liicken, da bei- spielsweise gewisse Abschnitte der zu analysierenden Original- DNA "schwer klonierbar" sind.
Strategie 2: Die Mehr-Primer-Methode. Die zu sequenzierende DNA wird hier nicht wie bei Strategie 1 nach der SchrotschuG-Me- thode, sondern gezielt progressierend analysiert. Der in einem Experiment noch sicher zu entschliisselnde Sequenzabschnitt dient zur Auswahl einer Primer-Anheftungsstelle fiir das nachste Ex- periment und so fort. Der Vorteil dieser Methode liegt vor allem darin, da0 unndtige Mehrfachsequenzanalysen wie bei der
Strategie 1 vermieden werden. Der wohl wesentliche Grund, warum diese Methode nicht allein fiir die Analyse langer DNA-Abschnitte verwendet wird, liegt in der Beschrankung durch die gegenwartig verfiigbaren Methoden zur chemischen DNA-Synthese.
Es hat nicht an Versuchen gefehlt, die jeweiligen Nachteile der oben beschriebenen Verfahren zu mildern, beispielsweise durch das "Multiplex-Sequencing11 bei Strategie 1 und das simultane progressierende Sequenzieren von verschiedenen Stellen aus bei Strategie 2. Ein Weg, den wesentlichen Nachteil der Strategie 2 ganz zu beseitigen, liegt theoretisch darin, eine Bank aller denkbaren Primer anzulegen. Dies ist jedoch durch direkte che- mische Synthese praktisch nicht raoglich, da es allein 424 ver- schiedene Primer der Kettenlange 24 gibt.
ErfindungsgemaP wird daher vorgeschlagen, kiirzere, chemisch syn- thetisierte Oligonucleotide zu verwenden. Da jede langere Se- quenz im Prinzip aus zwei oder mehr kiirzeren Sequenzen zusammen- setzbar ist, werden die dem gewiinschten Primer entsprechenden
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kurzen Oligonucleotide anstelle des gewunschten Primers zu der zu sequenzierenden DNA gegeben und durch eine
geeignete Prozedur, beispielsweise mit T4-DNA-Ligase, zu dem gewunschten Primer zusammengefiigt. Die Sequenzierungsreaktion kann dann anschlieBend praktisch unter Standardbedingungen durchgefuhrt werden.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird durch die Gegen- stande der Anspriiche gelost.
Beispiel 1
In typischen Experimenten wurden ca. 2,5 pMol DNA des Plasmids pTZ18R (Pharmacia-LKB) mit NaOH denaturiert, mit Ethanol ge- fallt, getrocknet und in Wasser aufgenommen. Die DNA-Ldsung wurde mit je 2,5 pMol zweier verschiedener Oligonucleotidlosun- gen versetzt. Die Oligonucleotide der Kettenlange 8 (Octamere) waren derart gewahlt, da0 sie unraittelbar benachbart auf einera Abschnitt bekannter Nucleotidsequenz der Plasmid-DNA hybridi- sieren konnten. Das 5 *-Ende des im hybridisierten Zustand be- nachbart zum 3'-Ende des anderen Oligonucleotids gelegenen
Octamers war zuvor nach gangigen Verfahren mit T4-Polynucleotid- Kinase und ATP phosphoryliert worden. Nach Einstellen der be- kannten Pufferbedingungen fur Ligationen mit T4-DNA-Ligase und Versetzen mit 1 Einheit des Enzyms wurde die Losung (10 ul End- volumen) 4 h lang bei 15 °C inkubiert. Diese Ligationslosung wurde vor der Sequenzierung 5 min lang bei 37 °C aufbewahrt, urn moglichst viele durch Ligation entstandene 16-mere und moglichst wenige 8-mere hybridisieren zu lassen.
Die folgende Sequenzierung sollte dazu dienen, die Sequenz des gewahlten Vektors zu uberprufen. Fur die Sequenzierungsreaktion nach dem Standardprotokoll der Firma United States Biochemical Corporation (USB) wurden 8 ul der Ligationslosung eingesetzt.
Abweichend von diesem Protokoll wurde auf das "Annealing" von Templat und Primer verzichtet.
W089/"2" PCT/EP89/00579 - 5 -
Sofern die genannte Phosphorylierung in Gegenwart von (gamma-
32P]ATP durchgeftihrt worden war, wurde auf die spatere Verwendung von [a-32P]dATP verzichtet.
WO 89/11211 -6- PCT/EP89/00579
Patehtanspriiche
1. Oligonucleotidbank, urafassend alle denkbaren 4« verschie- denen hexameren Oligonucleotide.
2. Oligonucleotidbank, umfassend alle denkbaren 4* verschie- denen heptameren Oligonucleotide.
3. Oligonucleotidbank, umfassend alle denkbaren 4* verschie- denen octaraeren Oligonucleotide.
4. Oligonucleotidbank, umfassend alle denkbaren 49 verschie- denen Oligonucleotide.
5. Verfahren zur DNA-Sequenzierung nach der Mehr-Primer- Methode, dadurch gekennzeichnet, da3 man
(a) bei der zu sequenzierenden DNA eine einzelstrangige Primeranheftungsstelle bekannter Sequenz wahlt,
(b) auf dieser Primeranheftungsstelle unmittelbar benachbart
ZWei hexamere, heptamere oder octamere Oligonucleotide (bei- spielsweise einer Oligonucleotidbank gemaB einem der vorher- gehenden Anspruche 1 bis 4) hybridisiert und
(c) ggf. gleichzeitig mit Stufe (b) oder nach Stufe (b) ein weiteres hexameres, heptameres oder octameres Oligonucleotid
(beispielsweise einer Oligonucleotidbank gema0 einem der vorhergehenden Anspruche 1 bis 4) unmittelbar benachbart zu
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
International Application No PCT/EP 89/00579 I. CLASSIFICATION OF SUBJECT MATTER (if teveral clarification eymbola apply, Indlcata all) * According to International Patant Ciaaalfication (IPC) or to both National Claaaincation and IPC
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II. FIELDS SEARCHEO Minimum Documentation Searched 7
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Int.CI C12Q; C12N
Documentation Searched other than Minimum Documentation to the Extent that such Document! are Included In the Fields Searched *
III. DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT *
Category * | Citation of Document,11 with Indication, where appropriate, of the relevant paisages " Relevant to Claim No. "
"Pharmacia Molecular Biological Catalogue"
May 1986, Rahm, (Lund, SE) see pages 95 - 107
DE, A, 3312929 (6ESELLSCHAFT FUR BI0TECHN0L0GISCHE F0RSCHUNG) 08 December 1983
see page 7, lines 11-30 DNA
vol. 3, No. 4, 1984, M. A. Liebert, Inc., (New York, US)
pages 339 - 343; R. Sanchez-Pescador et al.:
"Laboratory methods. Use of unpurified synthetic deoxynucleotide primers for rapid dideoxynucleotide chain termination sequencing" see abstract
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* Speclel categories of cited documents: 1°
"A* document defining the general state of the art which is not considered to be of particular relevance
ME" earlier document but published on or attar the international filing date
MLH document which may throw doubts on priority clalm(s) or which is cited to establish tne publication date of another citation or other apecial reason (as specified)
"O" document referring to an oral disclosure, use, eihlbltlon or other meant
"P" document published prior to the International filing date but later than the priority date claimed
"T" later document published after the international filing date or priority date and not in conflict with the application but cited to understand the principle or theory underlying the invention
"X" document of particular relevance; the claimed invention cannot be considerea novel or cannot be considered to involve an inventive step
"Y" document of particular relevance; the clelmed Invention cannot be .anaidered to nvoive an inventive step when the document :i combined wsv me or more other auch docu- ments, sucn combination - :g obvioua to a parson skilled in the art.
"4" document member of the « n* oatent family IV. CERTIFICATION
Oate of the Actual Completion ol the International Search 21 December 1989 (21.12.89)
Date of Mailing of thla International Search Report 08 February 1990 (08.02.90) International Searching Authority Signature of Authorized Officer
European Patent Office Form PCT/ISA/210 {second sheet) (January 1985)
WO 89/11211
-7- PCT/EP89/00579
einem der beiden anderen Oligonucleotide auf der Primeran- heftungsstelle hybridisiert und
(d) die Oligonucleotide zu einem Primer ligiert.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, da0 man auf der Primeranheftungsstelle zwei Oligonucleotide hybridi- siert und rniteinander zu einem Pra-Primer ligiert und erst danach auf der Primeranheftungsstelle ein drittes Oligoraeres hybridisiert und mit dem Pra-Primer ligiert.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, da0 man fur die Primerbildung hexamere, heptamere und/oder octaraere Oligonucleotide verwendet.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspruche, dadurch gekennzeichnet, da0 man Oligonucleotide verwendet, die an ihrem 5'-Ende, sofern dieses Ende mit einem benachbarten Oligonucleo- tid mit Hilfe von T4-DNA-Ligase ligiert werden soil, phosphory- liert sind.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspruche, dadurch gekennzeichnet, dafl man nach der Ligation und vor der Sequen- zierung nicht zum gewiinschten Primer ligierte Oligonucleotide durch Warraebehandlung entfernt.
International Application No. PCT/EP89/579
"I FURTHER INFORMATION CONTINUES FROM THE SECOND SHEET
V.Q OBSERVATIONS WHERE CERTAIN CLAIMS WERE FOUND MMBCHKOHMlgK not fully SearchaMe Thla International itarch report has not bean aatabllahad In respect of certain claims under Article 17(2) (e) for the following reasons:
*G Claim numbars because they ralate to aubject matter not required to be searched by this Authority, namely:
z£] c,a,m nwnb««L«-9~. because they relate to psrts of the Internstlonal application that do not comply with the prescribed require- ments to such an srtantthat no meaningful International ssarch can be carried out. ——
Neither the description nor the claims disclose the invention in a sufficiently clear manner for it to be
carried out by a person skilled in the art (PCT Article 5). A meaningful search could therefore not be carried out (PCT Article 17.2 (a) (ii)).
3 j [ Claim numbers . because may are dependent claims and are not dratted In accordance wttft me second and tfurd sent PCT Rule e.4(s).
VI.Q OBSERVATIONS WHERE UNITY Of INVENTION IS LACKING »
This Intemstionsl Searching Authority found multiple Inventions in this InlemeUonsI application aa loilowe;
1Q Ai4,1r«*u,r,d «d<J«lonal ■•««h taee were timely paid by the applicant, thla International aearch report covera all aaarchable cialma of the International application.
Aa only aome of the required additional aearch feea were timely paid by the applicant, thla international aearch report covers only thoae claima of the International application for which fees wsre paid, specifically claims:
3.Q No required additional aeerch feea were timely paid by the eppllcant Consequently, thla International aearch report Is restricted to the Invention first mentioned in the cialma; it la covered by claim numbers:
As all aaarchable claima could be aaarched without effort fuatifylno en sddltional fee. the International Searching Authority did not
— invite payment of any additional lee.
Remark on Protest
PI The additional search feea were eecompanied by eppllcant'a proteaL PI No protest sccompsnled the payment of additional aearch feea.
Form PCT/ISA/210 (eupplemental aheet (2» (January 1985)
ANNEX TO THE INTERNATIONAL SEARCH REPORT ON INTERNATIONAL PATENT APPLICATION NO
EP 89/00579 SA 29005
The Furopean Patent Office is in no way liable for these particulars which are merely giren for the purpose of information. 06/02/90
Patent family
memncr(s) Publication date EP-A,B 0103677
JP-A- 59026064
28-03-84 10-02-84 Patent document
cited in search report Publication date DE-A-3312929 08-12-83
For more details about this annex : see Official Journal of (he European Patent Office, No. 12/82
IN. RNATIONALER RECHERCHENBERICh
Internationales Aktenzcichen PCT/EP 89/00579 I. K LASS I l:l RATION PES ANMELDUNGSOECENSTANDS (bei mehtcren Klass.fikaiionssvmbolcn s.nd alle anzucchen.*
Nach der Inttrnatinnalen Patentklassifikatinn (IPC) oder nach der national™ Klassifikation und der IPC Int.Kl. 4 C12Q1/68 ; C12N15/00
II. RECIIERCHIERTE .SACIIOEHIETE
Recherchierter M indestprufstoff "
KJassifikaiionssvtem KJassifikationssymbole Int.Kl. 4 C12Q ; C12N
Rechcrcliirrte nicht rum Mindtstprufctoff gchorend. Vernffcnilichung.n, soweit diese unter die recherchierten Sachgchicte fallen *
HI. EINSCIU.AGIfiE VER0FFENTUC1IUNGEN •
Art.° Kennrcichnung der Vcrriffentlichung " , soweit erfnrderlich untcr Ant>abe der maGgeblichen feile12 ncir. Anspruch Nr.13
"Pharmacia Molecular Biological Catalogue"
Mai 1986, Rahm, (Lund, SE) siehe Seiten 95 - 107
DE.A,3312929 (GESELLSCHAFT FUR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG) 08 Oezember 1983
siehe Seite 7, Zeilen 11 - 30 DNA
vol. 3, no. 4, 1984, M. A. Liebert, Inc., (New York, US)
Seiten 339 - 343; R.Sanchez-Pescador et al.:
"Laboratory methods. Use of unpurified synthetic deoxynucleotide primers for rapid
dideoxynucleotide chain termination sequencing"
siehe Zusammenfassung
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1 Rcsnndere Kstegorien von angesebenen Vcrriffentlichungen 10 : 'A* Veroffentlichung, die den ailgemeinen Siand der Technik
definien, abcr mchf als besondors bedeutsam anzuschen ist 'E* 51 teres Ookumeni, das jedoch erst am oder nach dem interna-
linnalen Anmeldedalum veroffentlicht worden ist '\r Veroffentlichung, die geelgnet ist. einen Prioritatsanspruch
zweifelhaft erschetnen zu lassen, oder durch die das Verof- fentlichungsdatum einer andcren im Recherchenbericht ge- nannten Veroffentlichung belegl werden soli oder die aus einem anderen besonderen Crund angegeben ist (wie ausgefuhrt)
Veroffentlichung, die sich auf eine mundllche Offenbarung, eine Benutzung, cine Ausstellting oder andere MaOnahmen bezteht
T~ Veroffentlichung, die vor dem intcrnationalen Anmeldeda- lum, aber nach dem beanspruchten Prioritatsdatum veroffent- licht wnrden ist
Spatere Veroffentlichung, die nach dem internationalen An- meldedatum oder dem Prioritatsdatum veroffentlicht worden ist und mil der Anmeiduns nicht kollidiert. sondcrn nur zum Verstandnis des der Erfindung zugrundeliogenden Prinzip*
oder der ihr zugrundeliegenden Theoric angegeben ist
*X* Veroffentlichung von besonderer Bedeutung; die beanspruch- te Erfindung kann nicht als neu oder auf crfinderischer Tatie- keit beruhend betrachtet werden
"Y" Veroffentlichung von besonderer Bedeutung; die beanspruch- te Erfindung kann nicht als auf erfinderischcr Tatlgkeit be- ruhend betrachtet werden, wenn die Verdffenlllchung mit einer oder menreren anderen Veroffcntilchungen dteser Kate- gone In Verbindung gebracht wird und dlese Verblndung fllr cinen Fachmann naheliegcnd Ist
"A* Verdffentlichung. die Mltglled dcrsclben Patentfamilie ist IV. nESCIIEINICU.NG
Datum des Abschlusses der internalinnalcn Recherche 21.DEZEMBER 1989
Abscndedatum des internationalen Rechcrchenberichts 0 8 FEB 1930
Internationale Rectierehenbehdrde
EUROPAISCllFS PATENTAMT
Unterschrift ill r hn n||niJi htlptrn fMiuuiLtcn- T.K. Wl PormMtU PCT/ISA/ilO{8la(t 2MJan«v I9M)
Internationales Aktenzeichen PCT/ £p 89/00579 WEITERE ANGABEN ZU BLATT2
V. BEMERKUNGEN zu OEN ANSPRUCHEN, OIE SICH ALS unvoLlstandia recherchierbar erwiesen laben GemaQ Artikel 17 Absatz 2 Buchstabe a sind bestimmte Anspruche aus fofgenden Griinden nicht Gegenstand der internationalen
Recherche gewesen:
Anspniche Nr. weH sie sich auf Gegenstande beziehen, die zu recherchieren die Behorde nicht verpflichtet ist, namlich
2. 03 Anspniche Nr. ITS weil sie sich auf Teile der internationalen Anmeldung beziehen, die den vorgeschriebenen Anforderungen so wenig emsprechen, daS eine sinnvolle Internationale Recherche nicht durehgefuhrt werden kann, namlich
Der Erfindung ist nicht deutlich in der Beschreibung Oder Patentanspriiche zu offenbaren, dass ein Fachman Sie danach
ausfuhren kann (Art. 5, PCT). Fur diesen Grund war eine sinnvolle Recherche nicht moglich (Art. 17.2 (a)(ii) PCT).
I. CZ] Anspruche Nr. weil sie abhangige Anspruche und nicht emsprechend Sat2 2 und 3 der Regel 6.4 a) PCT abgefaflt sind.
VI. (' BEMERKUNGEN BEI MANGELNDER EINHEtTUICHKEIT OER ERFINDUNG2
Oie Internationale Recherchenbehdrde hat festgestelltPdaS diese Internationale Anmeldung mehrere Erfindungen enthalt:
Oa der Anmelder alle erforderlichen zusatzlichen Recherchengebuhren rechtzeitig entrichtet hatr erstreckt sich der internationale Recherchenbericht auf alle recherchierbaren Anspniche der internationalen Anmeldung.
Da der Anmelder nureintge der erforderlichen zusatzlichen Recherchengebuhren rechtzeitig entrichtet hat. erstreckt sich der Interna- tionale Recherchenbericht nur auf die Anspniche der internationalen Anmeldung, fur die Gebuhren gezahlt worden sind. namlich
Q Der Anmelder hat die erforderlichen zusatzlichen Recherchengebuhren nicht rechtzeitig entrichtet. Der internationale Recherchen- bericht beschrankt sich daher auf die in den Anspnichen zuerst erwahnte Erfindung; sie ist in folgenden Anspruchen erfaQt:
4. CD Da fur alle recherchierbaren Anspruche eine Recherche ohne einen Arbeitsaufwand durehgefuhrt werden konnte, der eine zu- satzliche Recherchengebiihr gerechtfertigt hatte, hat die Internationale Recherchenbehdrde eine solche Gebuhr nicht verlangt.
Bemerkung hinsichtlich eine* Widerspruchs
□ Otft zusatzlichen Gebuhren wurden vom Anmelder unter Widerspruch gezahlt.
Die Zahlung zusattllcher Gebuhren erfolgte ohne Widenpruch.
Formblaa PCT/ISA/210 (Erganzungsbogtn 2) (Januar 1985)
r,2P™ ™ZUM INTERNATIONALEN RECHERCHENBERICHT UBER DIE INTERNATIONALE PATENTANMELDUNG NR.
EP 8900579 .._„_...„_ _.. -rid
n!^Al«7.a^r rami,ienmite««*er entsprechen dem Stand der Date, des Europaischen Patentamts am Diese Angaben dienen nur zur Unterrichtung und erfolgen ohne Gewahr; raiemamis am
^ Patentfami,i€nderim internat.ona.en Recherchenberichtl^gefUhrtl005
06/02/90
Mitglied(er) der
Patentfamilie Datum der VerofTentltchung EP-A.B
JP-A- 0103677 59026064
28-03-84 10-02-84 [m Recherchenbericht
angefiihrtes Patenldokument Datum der VerofTentltchung 0E-A-3312929 08-12-83
Einzelheiten zu diesem Anhang : siehe Amtsblatt des Europaischen Patentamts, Nr. 12/82
