Phosphodiesterase-4-Inhibitoren zur Behandlung allergischer Hauterkrankungen bei Mensch und Tier

Aus dem

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Phosphodiesterase-4-Inhibitoren zur Behandlung allergischer

Hauterkrankungen bei Mensch und Tier

Habilitationsschrift

zur Erlangung der Venia legendi

an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von

Dr. med. vet. Wolfgang Bäumer Hannover 2006

Inhaltsverzeichnis

Seite

Liste der Publikationen,

die Bestandteil der Habilitationsschrift sind 4

Abkürzungsverzeichnis und Glossar 6

1 Einleitung 10

Allergische Hauterkrankungen bei Mensch und Tier 10 Pharmakotherapie allergischer Hauterkrankungen bei Mensch und Tier 16 Phosphodiesterase-4-Inhibitoren (PDE4-Inhibitoren) 20 2 Fragestellungen der vorliegenden Untersuchungen 27

Sind PDE4-Inhibitoren in Modellen allergischer Entzündungen wirksam? 27 Wirken PDE4-Inhibitoren in Th1/Th2-dominierten Entzündungsgeschehen

unterschiedlich? 27

Wird die Funktion von Keratinozyten durch PDE4-Inhibitoren beeinflusst? 27 Wird die Funktion dendritischer Zellen durch PDE4-Inhibitoren beeinflusst? 28 3 Zusammenfassende Darstellung der

Ergebnisse und gemeinsame Diskussion 29 3.1 Effekte von PDE4-Inhibitoren in Modellen allergischer Hauterkrankungen 29 3.2 Pharmakologische Beeinflussung caniner, muriner und humaner

Keratinozyten durch PDE4-Inhibitoren 38

3.3 Rolle und pharmakologische Beeinflussung dendritischer Zellen in Modellen

allergischer Hauterkrankungen 39

3.4 Vergleich der pharmakologischen Wirkung von

Glucocorticoiden und PDE4-Inhibitoren 46

3.5 Übertragbarkeit tierexperimenteller Ergebnisse auf die klinische Situation 48 3.6 Bietet eine neue Substanzklasse einen Vorteil für die

Behandlung der atopischen Dermatitis? 50

4 Zusammenfassung 52

5 Literaturverzeichnis 54

6 Danksagung 63

7 Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Arbeiten 64

8 Anhang 68

Liste der Publikationen, die Bestandteil der Habilitationsschrift sind

Bei der Auflistung der Originalarbeiten (Volltext siehe Anhang) wurde nicht die chronologische Reihenfolge ihres Erscheinens berücksichtigt, sondern eine für die gemeinsame Diskussion der Ergebnisse sinnvolle Reihenfolge. Die Liste schließt eine zur Veröffentlichung eingereichte Studie mit ein ([8]), die der Übersichtlichkeit halber in die durchgehende Nummerierung aufgenommen wurde.

Effekte von PDE4-Inhibitoren in Modellen allergischer Hauterkrankungen

[1] Bäumer, W., Gorr, G., Hoppmann, J., Ehinger, A.M., Ehinger, B., Kietzmann, M. (2002)

Effects of the phosphodiesterase 4 inhibitors SB 207499 and AWD 12-281 on the inflammatory reaction in a model of allergic dermatitis.

Eur. J. Pharmacol. 446: 195-200

[2] Bäumer, W., Gorr, G., Hoppmann, J., Ehinger, A.M., Rundfeldt, C., Kietzmann, M. (2003)

AWD 12-281, a highly selective phosphodiesterase 4 inhibitor, is effective in the prevention and treatment of inflammatory reactions in a model of allergic dermatitis.

J. Pharm. Pharmacol. 55: 1107-14

[3] Bäumer, W., Seegers, U., Braun, M., Tschernig, T., Kietzmann, M. (2004)

TARC and RANTES, but not CTACK, are induced in two models of allergic contact dermatitis. Effects of cilomilast and diflorasone diacetate on T-cell-attracting

chemokines.

Br. J. Dermatol. 151: 823-30

[4] Hoppmann, J., Bäumer, W., Galetzka, C., Höfgen, N., Kietzmann, M., Rundfeldt, C. (2005)

The phosphodiesterase 4 inhibitor AWD 12-281 is active in a new guinea-pig model of allergic skin inflammation predictive of human skin penetration and suppresses both Th1 and Th2 cytokines in mice.

J. Pharm. Pharmacol. 57: 1609-1617

Rolle und pharmakologische Beeinflussung dendritischer Zellen in Modellen allergischer Hauterkrankungen

[5] Bäumer, W., Tschernig, T., Sülzle, B., Seegers, U., Lührmann, A., Kietzmann, M. (2003)

Effects of cilomilast on dendritic cell function in contact sensitivity and dendritic cell migration through skin.

Eur. J. Pharmacol. 481: 271-279

[6] Bäumer, W., Sülzle, B., Weigt, H., De Vries, V.C., Hecht, M., Tschernig,T., Kietzmann, M. (2005)

Cilomilast, tacrolimus and rapamycin, modulate dendritic cell function in the elicitation phase of allergic contact dermatitis.

Br. J. Dermatol. 153: 136-144

[7] Bäumer, W., Krekeler, S., De Vries, V.C., Niedorf, F., Tschernig, T., Kietzmann, M. (2006)

Non-steroidal and steroidal anti-inflammatory drugs vary in their modulation of dendritic cell function in the elicitation phase of allergic contact dermatitis.

Exp. Dermatol. 15: 322-329

Pharmakologische Beeinflussung caniner, muriner und humaner Keratinozyten durch PDE4-Inhibitoren

[8] Bäumer, W., Kietzmann, M. (2006)

Effects of cyclosporin A and cilomilast on activated canine, murine and human keratinocytes.

Vet. Dermatol. (eingereicht)

Übersichtsarbeit zur Pharmakologie des PDE4-Inhibitors Cilomilast [9] Bäumer, W., Szelenyi, I., Kietzmann, M. (2005)

Cilomilast, an orally active phosphodiesterase 4 inhibitor for the treatment of COPD.

Expert Rev. Clin. Immunol. 1(1) 27-36

Abkürzungsverzeichnis und Glossar

AD: Atopische Dermatitis. Chronische, allergisch-entzündliche Hauterkrankung, die mit erhöhtem Juckreiz einhergeht. Es wird beim Menschen zwischen einer extrinsischen (allergischen), IgE-vermittelten und einer intrinsischen (nicht-allergischen), IgE- unabhängigen Form der AD unterschieden. 80 % der erwachsenen Patienten zeigen erhöhte Serum-IgE-Spiegel, 20 % der Erwachsenen mit AD haben normale IgE-Spiegel. Diese Form der AD entsteht oft erst nach dem 20. Lebensjahr.

APC: Antigenpräsentierende Zellen. Zellen, die in der Lage sind, Antigene, Allergene und Fremdstoffe aufzunehmen und T-Zellen zu präsentieren. Wichtige Vertreter sind DC (s. dort) und Makrophagen.

Apoptose: Programmierter Zelltod. Im Gegensatz zur Nekrose wird die Apoptose aktiv von der betreffenden Zelle durchgeführt. Die Zelle geht ohne Schädigung des Nachbargewebes zugrunde.

ASIT: Allergen-spezifische Immuntherapie. Es werden kontinuierlich steigende Dosen eines Allergenextraktes einem gegenüber diesem Allergen überempfindlich reagierenden Patienten (Mensch oder Hund) verabreicht, um die Symptome zu mildern, die bei dem Patienten bei Allergenkontakt auftreten. Eine bei der Behandlung der AD des Hundes Erfolg versprechende Therapie. Die Erfolge beim Menschen sind geringer (vgl. Tabelle 1).

Calcineurin-Inhibitoren: Cyclosporin A, Tacrolimus und Pimecrolimus sind Calcineurin- Inhibitoren, die bei der Behandlung der atopischen Dermatitis des Menschen und des Hundes angewendet werden. Über die Calcineurinhemmung wird u. a. der Transkriptionsfaktor NFAT (nuclear factor of activated T cells) in einer Reihe von Immunzellen, aber auch beispielsweise in Keratinozyten, gehemmt.

CD: Cluster of differentiation. CD80 und CD86 sind Oberflächenmarker auf antigenpräsentierenden Zellen, die eine Aktivierung von T-Zellen bewirken; so genannte Ko- Stimulatoren, die gemeinsam mit MHC II an der Präsentation von Fremdantigen beteiligt sind. Eine Präsentation von Antigenen ohne Ko-Stimulation führt zur Anergie oder Toleranz.

Challengephase: Synonyme: Elizitationsphase, Effektorphase. Allergisch-entzündliche Reaktion nach erneutem Kontakt einer sensibilisierten Person oder eines sensibilisierten Tieres mit dem relevantem Allergen bzw. Hapten.

Chemokine: Proteine, die die Chemotaxis von Entzündungszellen (z.B. Monozyten, Lymphozyten, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten) induzieren und so für den spezifischen Influx inflammatorischer Zellen in das Entzündungsgebiet verantwortlich sind.

In eigenen Arbeiten wurden beispielsweise RANTES (CCL5), TARC (CCL17) und CTACK (CCL27) untersucht.

Cytokine: Proteine, die vor allem von Zellen des Immunsystems synthetisiert werden. Sie regulieren deren Differenzierung und Aktivierung und sind für die Effektorfunktion (z.B.

Entzündung) verantwortlich. Typische proinflammatorische Cytokine sind TNFα, IL-1β und IL-6. Einige Cytokine können das Entzündungsgeschehen in Richtung Th1 (IFNγ, IL-12, IL- 18) oder Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) polarisieren.

DC: Dendritische Zellen, nehmen Antigene, Allergene und Fremdstoffe auf, prozessieren diese und präsentieren sie T-Zellen. Wichtigste antigenpräsentierende Zellen, die in der Lage sind, durch Interaktion mit T-Zellen Immunität oder Anergie/Toleranz zu induzieren.

FACS: Fluorescence absorbed cell sorting. Verfahren zur Unterscheideung und Sortierung von Zellen anhand von spezifischen Oberfklächenmolekülen (z.B. CD, siehe dort) aber auch, nach Permeabilisierung von Zellen, durch intrazelluläre Strukturen. Da oft nur eine Messung von Eigenschaften der Zellen und keine Sortierung stattfindet, wird auch der allgemeinere Begriff „Durchflusszytometrie“ benutzt.

Glucocorticoide: Synonym: Corticosteroide. Glucocorticoide werden seit Jahrzehnten in der Dermatologie bei allergisch-entzündlichen Prozessen eingesetzt. Glucocorticoide wirken durch die Suppression einer Reihe von proinflammatorischen Genen, unter anderem durch die Interaktion mit den Transkriptionsfaktoren NFκB und AP-1. Glucocorticoide interagieren zusätzlich mit MAP-Kinasen. Durch Hemmung der Phospholipase A2 kommt es zu einer Hemmung der Eicosanoidsynthese. Die topischen Glucocorticoide werden entsprechend ihrer Wirkungsstärke in 4 Klassen eingeteilt. Relativ schwach wirksam ist Hydrocortison (0,25- 0,5%) aus der Klasse I, sehr stark wirksam ist das Clobetasol-17-Propionat (Klasse IV).

Haptene: Kleine Moleküle, die allein nicht immunogen sind, sondern erst im Zusammenhang mit einem Trägerprotein zum Allergen werden (z.B. Nickelsulfat oder die in eigenen Arbeiten benutzten Haptene Dinitrochlorbenzen, Toluendiisocyanat).

MAP-Kinasen: MAP = Mitogen activated protein. Proteinkinasen, die im Rahmen der Signaltransduktion aktiviert werden und zum einen Zellproliferation induzieren, zum anderen aber auch bei entzündlichen Prozessen eine zentrale Rolle spielen. Klassische MAP-Kinasen sind p38, JNK und ERK1/2.

MHC: Major histocompatibility complex. Stark polymorphe Gruppe von Membranglycoproteinen, die essentieller Bestandteil der Antigenpräsentation sind. Über MHC Klasse I werden Peptide CD8⁺ T-Zellen und über MHC Klasse II werden Peptide CD4⁺ T-Zellen präsentiert.

MLR: Mixed leucocyte (lymphocyte) reaction. DC werden mit T-Zellen eines anderen Individuums oder eines anderen Mausstammes gemeinsam kultiviert. Alloreaktive T-Zellen werden daraufhin proliferieren. Diese Proliferation kann nach etwa 4-5 Tagen mit Hilfe des Einbaus radioaktiv markierten Thymidins gemessen werden. Genutzt werden kann die MLR einerseits beispielsweise bei der Knochenmarkstransplantation, um festzustellen, ob zwischen Spender und Empfänger Unverträglichkeiten vorliegen, anderseits, um Immunmodulatoren auf ihr immunsuppressives Potential zu testen (vgl. Publikation [6]).

MMP: Matrixmetalloproteinase. MMPs sind Proteinasen, die eine Vielzahl (patho)physiologischer Funktionen besitzen. Ein gemeinsames Merkmal aller MMPs ist, dass sie extrazelluläre Matrix degradieren können. Ein großes Interesse liegt z.B. bei der Tumortherapie in einer möglichst breiten MMP-Inhibition zur Verhinderung von Tumormetastasen. Die MMP-2 und MMP-9 sind wichtige Proteinasen, die zu einer lokalen Gewebsdegradation führen und so eine Voraussetzung für die Migration von DC schaffen.

NFκB: Nuclear faktor κB. Eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die in nahezu allen Zelltypen gefunden wird. In unstimulierten Zellen liegt NFκB als inaktiver Komplex, gebunden an IκB, vor. Eine Stimulation durch Cytokine, oxidativen Stress oder Wachstumshormon bewirkt eine Degradation der IκB-inhibitorischen Proteine. NFκB kann

Zielgenen. Im Zusammenhang mit Entzündung führt diese Aktivierung vor allem zu proinflammatorischen Signalen.

PBMC: Peripheral blood mononuclear cells. Blutmonozyten und -lymphozyten, die beispielsweise von AD-Patienten gewonnen werden, um zu testen, ob sich die spontane oder stimulierte Expression oder Sekretion von Cytokinen im Vergleich zu gesunden Kontrollen verändert zeigt.

PDE4: Phosphodiesterase 4. Eines von 11 bekannten cAMP- oder cGMP-metabolisierenden Isoenzymen. Die PDE4 hydrolisiert und inaktiviert den second messanger cAMP.

PDE4-Inhibitoren: Phosphodiesterase-4-Inhibitoren. Neue Klasse von Immunmodulatoren.

Da die PDE4 das wichtigste cAMP metabolisierende Isoenzym in nahezu allen Immun- und Entzündungszellen ist, stellt diese ein attraktives Target zur Modulation einer ganzen Reihe von allergisch bedingten Entzündungen dar.

Sensibilisierungsphase: Synonym: Induktionsphase. Erstkontakt mit einem Allergen (Hapten), der zur Induktion von allergenspezifischen T-Zellen führt.

Th: T-Helfer-Zellen. CD4⁺ T-Zellen, die durch ihre Cytokinproduktion charakterisiert sind.

Th1-Zellen produzieren z.B. IFNγ und sind so an der zellulären Immunität durch Makrophagenaktivierung beteiligt. Th2-Zellen produzieren z.B. IL-4, was hauptsächlich zu einer B-Zellaktivierung führt.

Zymographie: Eine spezielle Form der Gelelektrophorese zum quantitativen Nachweis einer MMP-Aktivität. In eigenen Untersuchungen lag der Schwerpunkt auf dem Nachweis der MMP-9-Aktivität, da diese essentiell für die DC-Migration ist. Die MMP-9 ist eine Gelatinase, daher enthält das Gel Gelatine, die von der MMP-9 degradiert wird.

1 Einleitung

Ziel der dieser Habilitationsschrift zugrunde liegenden Arbeiten war die Evaluierung einer neuen Klasse von Immunmodulatoren (Phosphodiesterase-4–Inhibitoren) als mögliche Therapeutika allergischer Hauterkrankungen bei Mensch und Tier.

Allergische Hauterkrankungen bei Mensch und Tier

Die atopische Dermatitis (AD) ist eine chronische, entzündliche Hauterkrankung, die mit erhöhtem Juckreiz einhergeht. Beim Menschen beginnt die Krankheit zumeist im Kindesalter.

Die Prävalenz der AD steigt seit Jahrzehnten kontinuierlich an: Einige Studien kommen zu dem Ergebnis, dass >10 % der Kinder in Nordeuropa in ihrer Kindheit mindestens einmal an AD erkranken (Leung und Bieber, 2003). Die ersten Symptome zeigen sich in 85 % der Fälle im Alter von 6 Monaten bis 5 Jahren (Akdis et al., 2006). Die Prävalenz der AD liegt bei Erwachsenen mit 1-3 % erheblich niedriger (Leung und Bieber, 2003). Beim Hund variieren die Zahlen zur Prävalenz erheblich: In einer großen retrospektiven Studie (> 30 000 Hunde) in den USA wurde bei 8,7 % der in tierärztlichen Praxen vorgestellten Hunde AD festgestellt (Hillier und Griffin, 2001). Da die AD bei anderen Tierarten (z.B. Katze, Pferd) eine vergleichsweise untergeordnete Rolle spielt, beschränkt sich diese Übersicht auf die AD des Hundes.

Bei der AD des Menschen und des Hundes gibt es einige Gemeinsamkeiten, die so weit gehen, dass der atopische Hund als Modelltier für die atopische Dermatitis des Menschen diskutiert wird (Nuttall et al., 2002a). Ein direkter Vergleich wurde von Bieber (Klinik für Dermatologie, Medizinische Fakultät Bonn) im Rahmen des 4. Weltkongresses der Veterinärdermatologen angestellt (Wien 2004). Tabelle 1 fasst Gemeinsamkeiten und Unterschiede bei Mensch und Hund zusammen.

Tabelle 1 Übersicht über Gemeinsamkeiten und Unterschiede bezüglich der AD bei Mensch und Hund (vorgestellt von T. Bieber im Rahmen des 4. WCVD, Wien 2004).

Mensch Hund

Epidemiologie Ansteigend Ansteigend

Genetik Genetisch komplexe

Erkrankung Genetisch komplexe

Erkrankung (?) Natürlicher Verlauf 3 Phasen ???

Pathophysiologie Bedeutung von IgE Bedeutung von IgE

Bedeutung von APC¹ Bedeutung von

Mastzellen Nahrungs-, Inhalationsallergene,

Autoantigene Inhalationsallergene Diagnose Klinische Manifestation,

Anamnese, IgE, Prick-, Patch- test

Klinische Manifestation, Anamnese, IgE,

Intradermaltest

Therapie Zuchtberatung

Allergenvermeidung Allergenvermeidung

Hautpflege +++ Hautpflege +

Topische Steroide Systemische, topische

Steroide

Antihistaminika +/- Antihistaminika +/-

ASIT ¹+/- ASIT ++++

Immunosuppressiva Immunosuppressiva

Bei beiden Spezies präsentiert sich die AD als chronisch rezidivierende Ekzemerkrankung mit einer Akkumulation von T-Lymphozyten und dendritischen Zellen (DC) in den entzündeten Hautläsionen (Olivry und Hill, 2001; Ring et al., 2001). Die Mehrzahl der hautinfiltrierenden Lymphozyten gehört zu den CD4⁺ T-Helfer-Zellen (Th-Zellen). Beim Menschen wird in akuten Läsionen vor allem eine Infiltration durch aktivierte Th2-Lymphozyten (gekennzeichnet durch Produktion der Th2-Cytokine IL-4, IL-5, IL-13) beschrieben, während chronische Läsionen eher von einer Th1-Antwort (gekennzeichnet durch Produktion von Th1- Cytokinen wie IFN-γ) geprägt sind (Grewe et al., 1998; Ramb-Lindhauer et al., 1991; Werfel et al., 1996). Neuere Untersuchungen beim Hund zeigen, dass auch hier sowohl Th1- als auch Th2-Cytokine in läsionaler Haut erhöht sein können (Nuttall et al., 2002b). Wie es zu einer

1 Abkürzungen werden im Abkürzungsverzeichnis und Glossar erklärt.

Aktivierung der Lymphozyten kommt und worin dieser Wechsel des Cytokinmusters begründet liegt, ist Gegenstand laufender Untersuchungen.

Dendritische Zellen (DC) spielen ebenfalls eine Rolle in der Immunpathogenese der AD. DC sind die wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen. In der Haut unterscheidet man epidermale DC (Langerhans-Zellen) und dermale DC, die sich im Phänotyp und in ihrer Funktion deutlich unterscheiden. So exprimieren Langerhans-Zellen exklusiv das Typ-II-Lektin Langerin (CD207), während dermale DC durch das Lektin DC-SIGN (CD209) charakterisiert sind. Im Gegensatz zu Langerhans-Zellen sind dermale DC von Morphologie und Funktion den Makrophagen sehr ähnlich (Valladeau und Saeland, 2005).

DC kommen in läsionaler Haut von Menschen und Hunden mit atopischer Dermatitis in höherer Dichte vor als in normaler Haut (Olivry und Hill, 2001; Taylor et al., 1991;

Wollenberg et al., 1996). DC in läsionaler Haut von Atopikern haben eine erhöhte stimulatorische Kapazität für T-Lymphozyten, d.h. es handelt sich um reife DC (Pastore et al., 1997; Taylor et al., 1991). Auch die aus peripherem Blut von Patienten mit Atopie isolierten myeloiden DC zeigen andere Eigenschaften als DC von Nicht-Atopikern. So zeichnen sich DC, welche aus Monozyten generiert wurden, bei Atopikern durch eine erhöhte Expression von MHC Klasse II, CD11b und FcεRI aus, einhergehend mit einer erhöhten Stimulationsfähigkeit in Kostimulationsassays (van den Heuvel et al., 1998).

Tiermodelle, die notwendig sind für die pharmakologische Untersuchung potentieller Therapeutika für die Behandlung der AD, sind nur begrenzt aussagefähig. Ein Mausmodell, das alle Aspekte der AD widerspiegelt, ist nicht bekannt (Gutermuth et al., 2005). Ein Modell, das zumindest einige Aspekte der AD zeigt, ist von Spergel et al. (1998, 1999) etabliert worden. Hier führt die okklusiv-epicutane Applikation von Ovalbumin nach wiederholter Applikation zu Hautveränderungen, die einige Gemeinsamkeiten zum atopischen Ekzem aufweisen: So entsteht eine ausgeprägte Entzündung mit epidermaler Hyperproliferation an ovalbuminbehandelten Stellen. Eine Untersuchung der mRNA aus behandelter Haut zeigt eine Hochregulation sowohl von IL-4, IL-5 als auch IFNγ. Im Serum sind erhöhte spezifische IgE- Spiegel nachzuweisen (Spergel et al., 1998; Spergel et al., 1999).

In einer Übersichtsarbeit, die Mausmodelle für das atopische Ekzem kritisch begutachtet, wird herausgestellt, dass ein durch Proteinsensibilisierung induziertes Ekzem, wie nach Spergel et al. (1998), dem atopischen Ekzem des Menschen nahe kommt (Gutermuth et al., 2005). Bei dem Versuch, dieses Modell in unserer Arbeitsgruppe zu etablieren, stellte sich jedoch heraus, dass die Sensibilisierung nur sehr unzuverlässige Ergebnisse lieferte, mit einer maximalen

Beim allergischen Kontaktekzem unterscheidet man eine symptomfreie Sensibilisierungsphase, in der antigenspezifische T-Zellen geprimt werden, und eine Effektor- phase, in der sich das Kontaktekzem bei erneutem Antigenkontakt manifestiert (Grabbe und Schwarz, 1998). Bei der Sensibilisierung wird das Allergen von antigenpräsentierenden Zellen (APC) der Haut (vor allem Langerhans-Zellen und dermale DC) aufgenommen, prozessiert und in den regionären Lymphknoten den T-Zellen präsentiert. Die Migration und Maturierung der APC wird durch inflammatorische Cytokine (insbesondere IL-1β und TNFα) ausgelöst und verstärkt. Diese Cytokine werden entweder durch direkte Hapteneinwirkung auf die Langerhans-Zellen von den APC selbst produziert oder durch Keratinozyten nach Haptenkontakt freigesetzt (Becker und Knop, 1993). Zu den direkten Haptenwirkungen gehören eine vermehrte Tyrosinphosphorylierung (Kuhn et al., 1998), die Induktion von IL-1β (Enk und Katz, 1992) und die Hochregulation von MHC Klasse I und II sowie von CD86 (Aiba et al., 2000). In der Effektorphase kommt es nach der erneuten Haptenapplikation auf die Haut zur Freisetzung einer Reihe von Chemokinen und Cytokinen (z.B. RANTES, TARC, IP-10, MCP-1), die chemotaktisch Entzündungszellen in das betroffene Gebiet locken (Publikation [3]; Goebeler et al., 2001), mit einer nachfolgenden Stimulation und Proliferation von T-Zellen in der Haut und Entstehung eines Kontaktekzems.

In läsionaler Haut finden sich vermehrt T-Zellen (insbesondere T-Helfer-Zellen) und DC (Bangert et al., 2003; Wollenberg et al., 2002). Kürzlich konnten wir zeigen, dass auch in der Challenge-Phase ein erneutes Auswandern von dendritischen Zellen aus der Haut in den regionalen Lymphknoten stattfindet und dass dieses erneute Einwandern durch Immunmodulatoren wie Tacrolimus unterbunden werden kann (Publikation [6]). Die Bedeutung dieser erneuten Migration in den drainierenden Lymphknoten ist Gegenstand aktueller Untersuchungen.

Cytokine Chemokine KC

LC

T

T

Th1

Th2

KC MMP-9

Allergen/Hapten

IL-12

IL-4

N Mph

Epi- der- mis

Der- mis

Blut- gefäß

Abbildung 1. Vereinfachte, schematische Darstellung einer allergischen Hautentzündung. Allergene oder Haptene werden durch Keratinozyten und Langerhans-Zellen aufgenommen. Aktiviert durch ein sogenanntes Dangersignal (z.B. TNFα und IL-1β), das durch den Kontakt mit dem Allergen von Keratinozyten oder auch Langerhans-Zellen selbst sezerniert wird, wandern Langerhans-Zellen, begleitet von einer erhöhten MMP-9-Aktivität, aus der Epidermis durch die Dermis in den regionären Lymphknoten (hier nicht mit eingezeichnet). Dort werden naive T-Zellen zu allergenspezifischen T- Zellen geprimt. Dieser Erstkontakt mit dem Allergen ist in der Regel klinisch inapparent. Bei einem wiederholten Kontakt mit dem Allergen, nehmen Langerhans-Zellen erneut das Allergen auf, wandern aus der Epidermis und präsentieren das Allergen T-Zellen in der Dermis und im regionären Lymphknoten. Durch Cytokine und Chemokine, die von Keratinozyten und aktivierten T-Zellen produziert werden, gelangen weitere Entzündungszellen (z.B. neutrophile Granulozyten, T-Zellen, Makrophagen) aus dem Blutgefäßsystem in die Haut, wodurch eine Entzündung entsteht. Ob diese Entzündung eher Th1- oder Th2-geprägt ist, hängt unter anderem vom Cytokinmilieu in der entzündeten Haut ab. Dieses kann abhängig vom Allergen/Hapten sein, aber auch unter dem Einfluss einer Chronifizierung der Entzündung stehen. KC = Keratinozyt, LC = Langerhans-Zelle, MMP-9 = Matrixmetalloproteinase-9, Mph = Makrophage, N = neutrophiler Granulozyt, T = T-Zelle.

Modelle der allergischen Kontaktdermatitis

Wie erwähnt, lässt sich die allergische Kontaktdermatitis in eine klinisch inapparente Induktionsphase nach Erstkontakt mit dem Hapten und die klinisch manifeste Elizitationsphase nach erneutem Haptenkontakt unterteilen. Eine systematische Untersuchung relevanter Cytokine in der Induktionsphase der Kontaktallergie wurde von Enk und Katz im Mausmodell durchgeführt (Enk und Katz, 1992). Der Vergleich mit einem Irritanz (Sodiumdodecylsulfat) und einem Tolerogen (Dichloronitrobenzen) macht deutlich, dass Haptene (Dinitrochlorbenzen, Trinitrochlorbenzen) selektiv zu einer Induktion von IL-1β führen, während eine Induktion von TNFα und IFNγ auch durch Irritanzien und Tolerogene herbeigeführt werden kann. Enk und Katz (1992) postulieren, dass IL-1β ein entscheidendes Signal für die Migration der Langerhans-Zellen zum drainierenden Lymphknoten ist. Dies wird in späteren Studien bestätigt (Cumberbatch et al., 1999; Stoitzner et al., 1999).

Während in der Induktionsphase hauptsächlich Keratinozyten und Langerhans-Zellen die Quellen proinflammatorischer Mediatoren sind, gestaltet sich die Situation in der Elizitationsphase der allergischen Kontaktdermatitis komplizierter: Durch chemotaktische Signale kommt es zum Influx aktivierter T-Zellen, neutrophiler und eosinophiler Granulozyten, die ihrerseits proinflammatorische Mediatoren sezernieren, so dass eine Zuordnung von produzierenden Zellen und Effektorzellen kaum möglich ist (Grabbe und Schwarz, 1998; Xu et al., 2000). Beschränkt man die Analyse der Cytokinexpression (mRNA) auf die Epidermis, so wird ersichtlich, dass in der Sensibilisierungs- und der Elizitationsphase grundsätzlich die gleichen Cytokine hochreguliert werden, die Reaktion aber in der Elizitation stärker ausgeprägt ist (Kondo et al., 1994). Eine Studie von Goebeler et al. (2001) befasst sich mit dem komplexen Zusammenspiel einer Reihe von Chemokinen in der Elizitationsphase (Goebeler et al., 2001). Noch komplexer wird das Entzündungsgeschehen dadurch, dass das Hapten selbst auch Einfluss auf die Entzündungsqualität haben kann. Klassischerweise ist die allergische Kontaktdermatitis eine Th1-mediierte Entzündung, bei der cytotoxische CD8⁺ T- Zellen eine entscheidende Rolle spielen. Es gibt jedoch Haptene, die eher eine Th2-Antwort induzieren. Dies sind vor allem Haptene, die auch atemwegssensibilisierende Eigenschaften haben (z.B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Toluendiisocanat (TDI), Benzol-1,2,4- tricarbonsäure-1,2-anhydrid (trimellitic anhydrid; TMA)). In der Elizitation dieser Reaktion spielen CD4⁺ Th2-Zellen eine zentrale Rolle (Dearman und Kimber, 2000). Zusätzlich induzieren die oben genannten Haptene allergenspezifische IgE-Spiegel, während klassische Kontaktallergene (wie DNCB) keine oder eine nur moderate Elevation von IgE herbeiführen

(Ban und Hettich, 2001; Dearman und Kimber, 1991). Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die Migration der Langerhans-Zellen in der Sensibilisierungsphase eine Th1/Th2- Polarisierung herbeiführen kann. Das Th1-mediierende Hapten DNCB führt zu einer schnellen Migration der Langerhans-Zellen, während das Th2-mediierende Hapten TMA eine verzögerte Migration induziert, die von hohen IL-10-Konzentrationen in der Haut begleitet wird (Cumberbatch et al., 2005).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es möglich ist, ein Entzündungsmodell zu etablieren, das eher Charakteristika einer Th1- oder Th2-dominierten Entzündung trägt. Da bei Krankheitsbildern, wie der atopischen Dermatitis in akuten Schüben, eher eine Th2-geprägte Entzündung vorliegt, die chronischen Hautläsionen aber eher von einer Th1-dominierten Entzündung geprägt sind (Ring et al., 2001), sollten Tiermodelle zur Untersuchung möglicher Therapeutika für die atopische Dermatitis sowohl Th1- als auch Th2-mediierte Entzündungen abdecken. Daher sind für eigene Untersuchungen das eher Th1-dominierte DNCB-Modell sowie das durch erhöhte IgE-Spiegel und Th2-Cytokine geprägte TDI-Modell gewählt worden.

Pharmakotherapie allergischer Hauterkrankungen bei Mensch und Tier Atopische Dermatitis

Die atopischen Dermatitis (AD) des Menschen wird, je nach Schweregrad der Erkrankung, in einer Stufentherapie behandelt (Abb. 2). Diese wird in eine Lokaltherapie und eine systemische Therapie eingeteilt (Akdis et al., 2006; Heratizadeh et al., 2003).

Basistherapie

Hautpflege und rückfettende Maßnahmen Meiden von irritierenden Substanzen Stufe 1

Schwache bis mittelstarke topische Calcineurininhibitoren

und/oder Corticosteroide Stufe 3

Stufe 2

Stufe 4

Mittelstarke bis starke topische Calcineurininhibitoren und/oder Corticosteroide

Systemische Therapie (z.B. Cyclosporin A)

oder UV-Therapie

Nur trockene Haut

Mäßige bis schwere AD

Leichte bis mäßige AD Schwere,

therapieresistente AD

In te ns itä t

Abbildung 2: Stufentherapie der atopischen Dermatitis des Menschen (Akdis et al., 2006).

Die Lokaltherapie beinhaltet in ihrer Basistherapie eine intensive Hautpflege, um einer gestörten Barrierefunktion der Epidermis entgegenzuwirken. Antiseptika werden zusätzlich zur Keimreduktion (vor allem zur Verhinderung der Superantigenbildung durch Staphylococcus aureus) empfohlen. Bei bakteriellen Superinfektionen wird eine lokale antibiotische Therapie mit Fusidinsäure oder evtl. Erythromycin durchgeführt, obwohl zunehmend von Resistenzen gegenüber Erythromycin berichtet wird (Akdis et al., 2006). Seit Jahrzehnten hat die topische Steroidbehandlung einen festen Platz in der Dermatologie.

Aufgrund des starken antiinflammatorischen Potentials werden bei AD leicht bis mittelstark (Klasse I und II) wirksame topische Steroide eingesetzt. Selbst mit S. aureus besiedelte Hautbezirke können behandelt werden, da die Besiedlung unter Steroidtherapie wider Erwarten drastisch reduziert wird (Heratizadeh et al., 2003). Bei Kindern sollten nur 20 % der Körperoberfläche mit maximal mittelstark wirksamen Glucocorticoiden behandelt werden.

Das Gesicht stellt auch bei der Behandlung mit schwach wirksamen Steroiden einen Problembereich dar, da die Gefahr einer steroidinduzierten Rosazea besteht. Etwa jeder fünfte erwachsene Patient spricht auch auf eine mehrmonatige Behandlung mit stark wirksamen Corticoiden nicht an. In Einzelfällen kommt es sogar zu einer Exazerbation (Furue et al.,

2003). Es wird daher angenommen, dass chronisch rezidivierende Läsionen in einigen Fällen nur unzureichend auf Dermatocorticoide ansprechen (Furue et al., 2003; Heratizadeh et al., 2003). Die seit einigen Jahren verfügbaren topischen Immunmodulatoren Tacrolimus (Salbe 0,03 %, 0,1 %) und Pimecrolimus (Creme 1%) sind ab dem 2. Lebensjahr einsetzbar.

Tacrolimus und Pimecrolimus sind Makrolide, die, wie Cyclosporin A als Calcineurininhibitoren vor allem die T-Zellaktivierung hemmen (Hemmung des nuclear factor of activated T cells, NFAT). Anders als Cyclosporin A sind die genannten Makrolide auch topisch appliziert hoch wirksam. Vorteile der Makrolide sind das Fehlen typischer Nebenwirkungen der Glucocorticoide, wie Hautverdünnung oder Glaukomgefahr und die sehr geringe Resorption der Stoffe. Als nachteilig werden ein initiales „Brennen der Haut“, gerade bei Tacrolimus, und die unklare Datenlage bezüglich möglicher Langzeittoxizität und Photokarzinogenität angesehen.

Einen besonderen Stellenwert hat die Phototherapie, die z.T. mit der Steroidtherapie kombiniert wird. Kombinierte Lichttherapiemaßnahmen (UVA/UVB) kommen vor allem bei akuten Schüben zum Einsatz. UVB verbunden mit der oralen Gabe von Psoralen wird vor allem bei erwachsenen Patienten mit mittelschwerer bis schwerer AD eingesetzt, die UVA1- Phototherapie wird bei Exazerbationen und schwer ausgeprägter AD empfohlen. Alle Phototherapien führen in der Regel zur Verbesserung des klinischen Bildes, einschließlich der Verminderung von Juckreiz, und haben eine ausgeprägte bakterizide Wirkung. Als unerwünschte Wirkungen werden eine vorzeitige Hautalterung und ein erhöhtes karzinogenes Risiko genannt (Heratizadeh et al., 2003).

Bei der systemischen Therapie werden Antihistaminika mit nur geringem Erfolg eingesetzt.

Antihistaminika der älteren Generation wirken offensichtlich vor allem durch eine mit der Sedation einhergehenden Unterbrechung des Juckreiz-Kratz-Zirkels (Akdis et al., 2006;

Heratizadeh et al., 2003). Schwere bakterielle Superinfektionen erfordern den systemischen Einsatz von Antibiotika, wie beispielsweise Cephalexin. Die systemische Gabe von Glucocorticoiden führt, gerade in akuten Schüben, zu schnell einsetzender Linderung. Die Gabe erfolgt möglichst als kurzzeitige Stoßtherapie (Akdis et al., 2006). Bei Patienten, die auf eine konventionelle Therapie nicht ansprechen und unverändert hohe Schubhäufigkeiten zeigen, wird die systemische immunsuppressive Therapie mit dem Calcineurininhibitor Cyclosporin A empfohlen, der seit 1997 für diese Indikation für den Menschen in Deutschland zugelassen ist. Die Therapie verlangt, im Gegensatz zum Einsatz beim Hund, eine engmaschige Kontrolle des Blutdruckes und von Nierenfunktionsparametern, da gerade

(Akdis et al., 2006; Heratizadeh et al., 2003). Andere Immunsuppressiva, wie Mycophenolatmofetil oder Azathioprin, sind zur Behandlung der atopischen Dermatitis nicht zugelassen, so dass die Verordnung „Off-label“ erfolgt. Mycophenolatmofetil ist in der Regel nicht mit hepato- und nephrotoxischen Nebenwirkungen assoziiert und kann deshalb für die Behandlung von Patienten geeignet sein, bei denen Kontraindikationen gegenüber Cyclosporin A vorliegen (Heratizadeh et al., 2003).

Eine umfassende Meta-Analyse gebräuchlicher Therapeutika für die Behandlung der atopischen Dermatitis des Hundes ist 2003 von der International Task Force on Canine Atopic Dermatitis veröffentlicht worden (Olivry und Mueller, 2003). Die Güte der für diese Meta-Analyse herangezogenen Studien wurde danach beurteilt, ob sie placebokontrolliert, verblindet und randomisiert waren. Erfüllten Studien nicht diese Voraussetzung, wurden sie schwächer gewichtet. Von Olivry und Mueller (2003) wird vor allem auf die Effektivität von Antihistaminika, Leukotrien- und Prostaglandinantagonisten, Glucocorticoiden, Calcineurininhibitoren und Phosphodiesterase-Inhibitoren eingegangen.

Die kritische Evaluierung von 15 klinischen Studien lässt die Einstufung der Antihistaminika als unwirksam oder zumindest als wenig wirksam zu. Diese Einstufung ist unabhängig davon, ob es sich dabei um zentral dämpfend wirkende Antihistaminika der ersten Generation (z.B.

Diphenhydramin, Pheniramin, Promethazin) oder um neuere Entwicklungen wie Terfenadin oder Loratadin handelt (Olivry und Mueller, 2003). Leukotrien- wie auch Prostaglandinantagonisten zeigen sich bei der Therapie caniner AD ebenfalls als wenig wirksam bis unwirksam (Olivry und Mueller, 2003). Topisch wie auch systemisch applizierte Glucocorticoide hemmen den Juckreiz und die allergische Entzündung. Die unerwünschten Arzneimittelwirkungen werden als moderat eingestuft. Allerdings wurden in den Studien für die systemische Gabe nur schwach wirksame Glucocorticoide (Prednison, Prednisolon, Methylprednisolon) eingesetzt. Aus der Gruppe der Calcineurininhibitoren nimmt Cyclosporin A einen besonderen Platz ein, da es zur Behandlung der AD beim Hund zugelassen ist (Atopica^). Cyclosporin A ist sehr wirksam bei der Unterdrückung des Juckreizes und hat dem Methylprednisolon vergleichbare antiinflammatorische Wirkung. Als Nebenwirkung wird nur Erbrechen und Durchfall beobachtet. Diese Ergebnisse werden in einer aktuellen Meta-Analyse von 10 klinischen Studien mit insgesamt etwa 800 Hunden bestätigt. Das Nebenwirkungspotential wird daher für einen Behandlungszeitraum von weniger als 6 Monaten als minimal angesehen (Steffan et al., 2006). Allerdings fehlen noch Langzeitstudien zur Abschätzung der Sicherheit. So wird ein mögliches erhöhtes Risiko einer

Lymphombildung diskutiert (R. Müller, Kleintierklinik, Veterinärfakultät München, mündliche Mitteilung 2005). Auch Tacrolimus wurde beim Hund als 0,1 %ige Salbe an umschriebenen Läsionen gegen Vehikel getestet. Es bewirkte über den 6-wöchigen Behandlungsverlauf eine signifikante Reduktion der Entzündung ohne nennenswerte Nebenwirkungen (Bensignor und Olivry, 2005). Der nicht-selektive Phosphodiesterase- Inhibitor Pentoxifyllin und der PDE4-Inhibitor Arofylline waren wirksam, aber Erbrechen und Durchfall (s.u.) erwiesen sich als dosislimitierend (Ferrer et al., 1999; Olivry und Mueller, 2003).

Allergisches Kontaktekzem

Die Behandlung des allergischen Kontaktekzems des Menschen geschieht in der Regel mit topischer Gabe von Glucocorticoiden (Mark und Slavin, 2006), wobei oft mittelstark wirksame Glucocorticoide, z.B. Triamcinolonacetat, in Form von Salben oder Cremes (0,1 - 0,5 %), angewendet werden. Im Gesichtsbereich und bei Intertrigus wird das schwach wirksame Hydrocortison empfohlen. Nur bei schwersten Formen werden sehr stark wirksame Corticoide, wie Clobetasolpropionat eingesetzt. Eine systemische Therapie mit Corticoiden wird bei Behandlungsflächen, die mehr als 20 % der Körperoberfläche ausmachen, empfohlen (Li und Cruz, 2004). Neuere Untersuchungen legen den Schluss nahe, dass auch die topische Applikation von Tacrolimus und Pimecrolimus eine geeignete Behandlung des allergischen Kontaktekzems darstellt (Grassberger et al., 2004; Li und Cruz, 2004).

Beim Hund wird die allergische Kontaktdermatitis selten beobachtet, eine eindeutige Diagnose ist schwer durchzuführen. Auch hier sind Glucocorticoide Standardtherapeutika (Olivry et al., 1990).

Phosphodiesterase-4-Inhibitoren

Phosphodiesterase-4-Inhibitoren (PDE4-Inhibitoren) stehen im Fokus des Interesses als mögliche Therapeutika allergischer Erkrankungen (Dyke und Montana, 2002). Vor allem für die Behandlung allergischer oder obstruktiver Atemwegserkrankungen ist die Entwicklung weit vorangeschritten. So befinden sich die hochselektiven PDE4-Inhibitoren Roflumilast und Cilomilast in der klinischen Phase III zur Behandlung des allergischen Asthmas (Roflumilast) und der chronisch obstruktiven pulmonalen Erkrankung (COPD, Roflumilast und Cilomilast).

Zulassung (Giembycz, 2001; Lipworth, 2005 und Publikation [9]). Da die PDE4 das wichtigste cAMP-metabolisierende Isoenzym in nahezu allen Immun- und Entzündungszellen ist, stellt dieses (von 11 bekannten Isoenzymen, Tabelle 2) ein attraktives Target zur Modulation einer ganzen Reihe von allergisch bedingten Entzündungen dar (Publikation [9]).

Tabelle 2. Phosphodiesterase-Isoenzymfamilien und deren biochemische Eigenschaften (nach Publikation [9]).

Isoenzymfamilie Modulator Affinität (Km) [µmol/l] Inhibitoren, Bemerkung PDE1 Ca²⁺/Calmodulin

stimuliert

cGMP 1-3 cAMP 2 - 70

IC224²

PDE2 cGMP stimuliert cAMP 30 - 100 Erythro-9-(2-hydroxy-3- nonyl)adenin

PDE3 cGMP inhibiert cAMP 0.1 - 0.5 cGMP 0.1 - 0.5

Milrinon, Motapizon, Saterinon

PDE4 cAMP spezifisch cAMP 0.5 - 2

cGMP > 50 Rolipram, Roflumilast, Cilomilast, AWD 12- 281²

PDE5 cGMP spezifisch cGMP 1 Sildenafil, Tadalafil, Vardenafil

PDE6 Photorezeptor cAMP > 500 cGMP 17 - 20

Zaprinast, Dipyridamol, (Sildenafil)

PDE7 cAMP spezifisch cAMP 0.1 - 0.2 BRL 50481², IC242², nicht sensitiv für Rolipram

PDE8 cAMP spezifisch

(nicht cGMP inhibiert)

cAMP 0.05 Sensitiv auf

Dipyridamol, insensitiv bezüglich anderer Inhibitoren PDE9 cGMP spezifisch cAMP 230

cGMP 0.2

Zaprinast, Sildenafil (~750 schwächer wirksam als gegen PDE5)

PDE10 dual spezifisch cAMP 0.02-0.05

cGMP 3-14 Keine Inhibitoren bekannt

PDE11 dual spezifisch cAMP 1-6

cGMP 0.5-4 Keine Inhibitoren bekannt

Tabelle 3 verdeutlicht die dominante Rolle der PDE4 in Immun- und Entzündungszellen.

2 Für IC242 und IC244 sind keine chemischen Namen offengelegt. AWD 12-281: N-(3,5-dichloropyrid-4-yl)- [1(4-fluorobenzyl)-5-hydroxy-indole-3yl]-glyo xylic acid amide, BRL 50481: 3-(N,N-dimethylsulfonamido)-4- methyl-nitrobenzene.

Tabelle 3. PDE-Isoenzym Profile in humanen Zellen (nach Szelenyi und Pahl, 2002).

Ergänzt wurden die Daten zu dendritischen Zellen aus Gantner et al. (1999).

Zelltyp PDE 1

PDE 2

PDE 3

PDE 4

PDE 5

PDE 6

PDE 7

PDE 8

PDE 9

Mastzellen x x x

Basophile Granulozyten x x

Eosinophile Granulozyten x

Neutrophile Granulozyten x

Monozyten x

Makrophagen x x x x

B-Lymphozyten x x

T-Lymphozyten x x x x

Thrombozyten x x x

Dendritische Zellen x x x x

Endothelzellen x x x

Epithelzellen x x x x x x x

Die Inhibition der PDE4 und der damit einhergehende Anstieg von cAMP führt zu einer komplexen und bisher noch nicht vollständig verstandenen Reaktion nachgeschalteter Signalkaskaden. Am intensivsten untersucht ist die Aktivierung der Proteinkinase A (PKA) die zu einer Phosphorylierung weiterer Signalproteine führt. Reguliert wird durch die PKA zusätzlich das cAMP responsive element binding protein (CREB), wodurch beispielsweise die Transkription proinflammatorischer Cytokine moduliert wird. Es wird auch eine Interaktion von CREB mit dem proinflammatorischen Transkriptionsfaktor NFκB beschrieben (Sanz et al., 2005). Es entsteht aus dem komplexen Eingriff in die Signalkaskaden ein antiinflammatorischer Effekt, der sich auf zahlreiche Funktionen von Immun- und Entzündungszellen auswirkt (Tabelle 4).

In einer neueren Untersuchung konnte für den PDE4-Inhibitor Roflumilast eine Suppression von NFκB und der MAP-Kinase-Aktivierung (p38) in LPS-stimulierten Makrophagen gezeigt werden. Auffällig ist hierbei allerdings, dass Roflumilast diese Eigenschaften erst bei Konzentrationen von 10-30 µmol/l aufweist, eine PDE4-Inhibition aber schon im niedrigen nanomolaren Bereich erreicht wird. So konnten die Autoren selbst zeigen, dass ein signifikanter cAMP-Anstieg in Makrophagen bei 1 nmol/l induziert wird und dieser Anstieg bei 10-100 nmol/l nahezu auf Plateauhöhe ist (Kwak et al., 2005). Daher ist fraglich, ob der inhibierende Effekt auf NFκB und die MAP-Kinase-Aktivität ein allein über PDE4-Inhibition

Inhibition von NFκB sowie NFAT sind bereits in einer früheren Studie mit Rolipram untersucht worden; aber auch dort fällt auf, dass die inhibitorischen Effekte des PDE4- Inhibitors erst bei der sehr hohen Konzentration von 100-500 µmol/l auftreten (Jimenez et al., 2001), das PDE4-inhibitorische Potential von Rolipram aber im nanomolaren bis niedrigen micromolaren Bereich liegt. In einer Studie von MacKenzie und Houslay (2000) wurde hingegen in einer Monozytenzelllinie die Phosphorylierung der p38-MAP-Kinase mit einer IC50 von etwa 300 nmol/l gehemmt. Dies entsprach der IC50 für die Inhibition der PDE4A/B durch Rolipram in der untersuchten Zelllinie (MacKenzie und Houslay, 2000).

Tabelle 4: Inhibitorische Effekte von PDE4-Inhibitoren auf humane and murine Zellen, mit []

gekennzeichnete Effekte sind Ergebnisse eigener Studien, alle anderen sind Angaben aus der Übersichtsarbeit [9].

Zelltyp Suppression der

Funktion/Bildung/Freisetzung von Basophile Histamin

Mastzellen Histamin LTC4/D4/E4

Neutrophile Adhäsion Chemotaxis [1,3]

LTB4

Myeloperoxidase Superoxid

IL-8 [2]

MMP-9

Eosinophile Superoxid Chemotaxis

Peroxidase Leukotriene

Monozyten TNFα

Makrophagen TNFα

IL-10 (Elevation) B-Lymphozyten, IgE

produzierende mononukleäre Zellen

IgE

T-Lymphozyten Proliferation [3]

IL-2 IL-4 IL-5 IFNγ

Endothelzellen Reduktion der Permeabilität [1-3]

Keratinozyten CCL2, KC, IP-10 [8]

Dendritische Zellen IL-1β [5]

IL-12 [6]

TNFα [5]

Es gibt vier genetisch unterscheidbare Subtypen der PDE4 (PDE4A-D). Die Subtypen sind im Verteilungsmuster verschiedener Zellen unterschiedlich und haben wahrscheinlich unterschiedliche regulatorische Funktionen, auch wenn sich die Studien zum Teil in der Bestimmung dieser Funktionen widersprechen. Es scheint jedoch gesichert, dass die Inhibition der PDE4A und/oder PDE4B mit dem antiinflammatorischen Potential korreliert, während die PDE4D-Hemmung kontrovers diskutiert wird (Publikation [9]).

Der Archetyp Rolipram gehört chemisch zu den Dialkoxyphenylen (Catecholen). Rolipram hat, wie viele PDE4-Inhibitoren der ersten Generation (z.B. Zardaverin, Piclamilast), nur ein enges therapeutisches Fenster. Die Nebenwirkungen, insbesondere Übelkeit und Erbrechen, führten zum Abbruch klinischer Studien. Ein Ansatz zur Verminderung des Nebenwirkungspotentials beruht auf der Feststellung, dass die PDE4 in zwei Konformationen vorkommt, PDE4L und PDE4H, für die Rolipram eine niedrige (low=L) respektive hohe (high=H) Affinität aufweist. Es wird davon ausgegangen, dass Nebenwirkungen, wie Emesis und Übelkeit, vor allem mit der Bindung an die PDE4H verbunden sind. Das in eigenen Studien benutzte Cilomilast ist eine Weiterentwicklung des Rolipram. Cilomilast besitzt wie Rolipram eine 3-(Cyclopentyloxy)-4-Methoxybenzaldehyd-Gruppe, die für die PDE4- Inhibition essentiell ist (Abb. 3). Die Substitution eines Cyclohexanringes erhöht jedoch die Affinität zur PDE4L und damit die therapeutische Breite erheblich. So hat Cilomilast beispielsweise bei vergleichbarer Suppression von LPS-induzierter TNFα-Synthese in Mäusen eine etwa 100fach höhere ED50 für das Auslösen von Erbrechen bei Hunden. Hunde neigen schnell zum Erbrechen und werden daher häufig zur Testung des emetischen Potentials herangezogen (Publikation [9]). Die ebenfalls in eigenen Untersuchungen benutzte Substanz AWD 12-281 (N-(3,5-dichloropyrid-4-yl)-[1(4-fluorobenzyl)-5-hydroxy-indole- 3yl]-glyo xylic acid amide) stellt eine neue Klasse von PDE4-Inhibitoren dar (Indolderivat, Abb. 3). AWD 12-281 ist im Gegensatz zu Cilomilast oral nahezu nicht bioverfügbar. Die Substanz wird deshalb für die topische Applikation (inhalativ, transdermal) entwickelt und zeigt bei der topischen Applikation eine gute Verträglichkeit (Kuss et al., 2003).

HN O

O O

HO O

N

O

O

N

NH

O Cl N

O F

HO Cl

Abb. 3: Strukturformeln von Rolipram (a), Cilomilast (b) und AWD 12-281 (c). Während es zwischen den Catecholen Rolipram und Cilomilast strukturelle Übereinstimmungen gibt, gehört das Indolderivat AWD 12-281 zu einer gänzlich anderen Substanzklasse.

Neben Asthma und allergischer Rhinitis stellt auch die atopische Dermatitis eine mögliche Indikation für hochselektive PDE4-Inhibitoren dar (Dyke und Montana, 2002). Es gibt bislang aber nur wenige klinische Studien zur Effektivität von PDE4-Inhibitoren bei der atopischen Dermatitis des Menschen (Griffiths et al., 2002; Hanifin et al., 1996) und des Hundes (Ferrer et al., 1999). Die bisherigen Studien wurden mit nicht hochselektiven PDE4-Inhibitoren durchgeführt, zeigten aber eine Wirksamkeit, die bei Cipamfyllin über dem Placeboeffekt, jedoch unter dem des Klasse-II-Corticoids Hydrocortison-17-Butyrat lag (Griffiths et al., 2002). Der topisch applizierte PDE4-Inhibitor CP-80,633 (Atizoram) führte zu einer signifikanten Verbesserung aller untersuchten Parameter bei atopischen Dermatitispatienten (Hanifin et al., 1996). Noch im Jahr 2000 soll sich Atizoram in der klinischen Phase II für die Behandlung der AD befunden haben (Souness et al., 2000). Allerdings scheint Atizoram nicht weiter verfolgt worden zu sein (Zhang et al., 2005). Das an atopischen Hunden getestete Arofyllin hatte eine dem Prednison vergleichbare Wirkung. Als dosislimitierend erwies sich aber der stark emetische Effekt des systemisch verabreichten Arofyllins. Diese ersten Studien

a)

b)

c)

legen den Schluss nahe, dass PDE4-Inhibitoren grundsätzlich als Therapeutika für die Behandlung der atopischen Dermatitis bei Mensch und Hund in Frage kommen, wobei sich die topische Applikation aufgrund des emetischen Potentials dieser Stoffgruppe anbietet.

Weitaus bedeutsamer als die Nebenwirkungen wie Nausea und Emesis sind Vasculitiden, die bei Nagern in zumeist hohen Dosierungen (toxikologischen Studien) nach Verabreichung von PDE4-Inhibitoren unterschiedlicher chemischer Struktur (Rolipram, CI-1018³, SCH-351591³, BYK169171³) aufgetreten sind (Zhang et al., 2005). Histologisch zeigten sich eine Nekrose der Media, Hämorrhagien mit perivasculärem Ödem und inflammatorischem Zellinflux. Oft sind Mesenterialgefäße betroffen, eine aktuelle Studie gibt Hinweise, dass der Vasculitis eine Mesenteritis vorausgeht (Mecklenburg et al., 2006). Für den potenten PDE4-Inhibitor SCH- 351591 wurden Arteritiden nicht nur bei Ratten, sondern auch in Cynomolgusaffen beobachtet. Da das Auftreten dieser Arteriopathien dosisabhängig ist, kann auch hier wieder die topische Applikation, die mit niedriger systemischer Bioverfügbatkeit einhergehen kann, von Vorteil sein. Neben Arteriopathien weisen neuere Studien auch auf eine mögliche Gefahr von Cardiomyopathien nach chronischer PDE4D-Inhibition hin (Zhang et al., 2005). Obwohl Cilomilast eine etwa zehnfach niedrigere IC50 für die Hemmung der PDE4D im Vergleich zu PDE4A und PDE4B besitzt, gab es jedoch in den klinischen Phase-III-Studien über 6 Monate keinen Hinweis auf cardiovasculäre Veränderungen (Giembycz et al., 2001 und Publikation [9]).

3 CI-1018: (+)-N-[3,4,6,7-tetrahydro-9-methyl-4-oxo-1-phenylpyrrolo-[3,2,1-jk]{1,4] benzodiazepin-3-yl]-4-

2 Fragestellung der vorliegenden Untersuchung

Sind PDE4-Inhibitoren in Modellen allergischer Entzündungen wirksam?

Der Großteil publizierter Daten zur In-vitro- wie auch In-vivo-Wirkung von PDE4-Inhibitoren hat, wie bereits erwähnt, den Schwerpunkt bei der Therapie von Atemwegserkrankungen (Asthma/COPD) (Giembycz, 2002; Jeffery, 2005). Da aber die PDE4 das wichtigste cAMP- metabolisierende Isoenzym in nahezu allen Immun- und Entzündungszellen ist, liegt der Schluss nahe, dass PDE4-Inhibitoren auch bei allergischen Hauterkrankungen antientzündlich wirken. Vor den eigenen Arbeiten gab es bezüglich der Wirksamkeit bei allergischen Hauterkrankungen nur wenige Daten zu Cilomilast (Cooper et al., 1999; Griswold et al., 1998) und keine Daten zu AWD 12-281. Insgesamt sind nur sehr limitiert präklinische Daten zum Einsatz von PDE4-Inhibitoren bei allergischen Hauterkrankungen verfügbar (Souness et al., 2000). Daher war es wichtig, robuste Modelle allergischer Hauterkrankungen zu etablieren und mit diesen mögliche Therapeutika topisch sowie systemisch zu testen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind Bestandteil der Publikationen [1] bis [4].

Wirken PDE4-Inhibitoren in Th1/Th2-dominierten Entzündungsgeschehen unterschiedlich?

Da die AD des Menschen und des Hundes sowohl Th1- als auch Th2-dominiert sein kann (oder auch eine Mischform darstellen kann), wurde die Wirkung von Cilomilast in 2 Modellen der allergischen Kontaktdermatitis vergleichend untersucht, die sich in ihrem Cytokinprofil deutlich unterscheiden (Publikation [3]).

Wird die Funktion von Keratinozyten durch PDE4-Inhibitoren beeinflusst?

Keratinozyten wurden in der Vergangenheit als passives Ziel immunologischer Angriffe infiltrierender T-Zellen angesehen. Doch jüngere Studien deuten klar darauf hin, dass Keratinozyten durch die Sekretion einer Reihe von Cytokinen und Chemokinen aktiv an der cutanen immunologischen Antwort beteiligt sind (Steinhoff et al., 2001). Da Keratinozyten die oberste Barriere der Haut bilden und der erste Kontakt mit Allergenen/Haptenen sowie mit topisch verabreichten Arzneistoffen über diese Zellen läuft, interessierte uns ein direkter Effekt von Cilomilast auf canine und murine Keratinozyten. Hier wurde ein Vergleich mit

Cyclosporin A angestellt, da dieses seit etwa 2 Jahren für die Behandlung der atopischen Dermatitis des Hundes (Atopica^®) zugelassen ist.

Wird die Funktion dendritischer Zellen durch PDE4-Inhibitoren beeinflusst?

In vitro ist die Wirkung von PDE4-Inhibitoren an einer Reihe von Entzündungszellen, aber auch z.B. Fibroblasten getestet worden. Publikation [9] enthält eine Übersicht dieser Untersuchungen. Seit einigen Jahren erhalten dendritische Zellen ein erhöhtes Augenmerk, da diese antigenpräsentierenden Zellen die Immunantwort entscheidend beeinflussen können. Je nach Aktivierungsgrad können DC zu Toleranz, Anergie oder Immunität führen (Banchereau und Steinman, 1998). Im Falle allergischer Hauterkrankungen wäre eine Induktion von Toleranz oder zumindest eine reduzierte Immunantwort wünschenswert. Es gab vor unseren Studien zur Wirkung von PDE4-Inhibitoren auf die DC-Funktion nur wenige publizierte Daten (Gantner et al., 1999; Hatzelmann und Schudt, 2001). Parallel zu den eigenen Untersuchungen wurde eine Studie über die Wirkung von Cilomilast an humanen DC publiziert (Heystek et al., 2003). Der Vorteil der eigenen Studien (Publikationen [5] bis [7]) ist die Untersuchung in situ und nicht rein in vitro, da In-vitro-Studien allein den Schluss nahe legen, dass PDE4-Inhibitoren nur einen moderaten Effekt auf die DC-Funktion ausüben (Gantner et al., 1999; Hatzelmann und Schudt, 2001), was sich aber in vivo anders darstellt (Publikationen [5] und [6]).

3 Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse und Diskussion

3.1 Effekte von PDE4-Inhibitoren in Modellen allergischer Hauterkrankungen

Die PDE4-Inhibitoren Cilomilast und AWD 12-281 wurden zuerst topisch im Modell der allergischen Kontaktdermatitis, ausgelöst durch das Hapten Toluendiisocyanat (TDI), getestet [1]. TDI ist ein respiratory chemical allergen. Das heißt, dass TDI nicht nur ein Kontaktallergen ist, sondern auch atemwegssensibilisierende Eigenschaften besitzt (Scheerens et al. 1999). Kontaktallergene, die auch atemwegssensibilisierend wirken (z.B. FITC, TMA, TDI), zeichnen sich durch eine präferenzielle Th2-Antwort aus. Eine kürzlich publizierte Studie bringt diesen Umstand damit in Zusammenhang, dass Langerhans-Zellen unterschiedlich schnell zum drainierenden Lymphknoten wandern (Cumberbatch et al., 2005).

In der ersten Studie wurden die PDE4-Inhibitoren präventiv verabreicht, d.h. vor der Challenge mit TDI. Die Ohrschwellung wurde als Messparameter für die Entzündung 4, 8 und 16 Stunden nach Challenge gemessen. Auch die Entnahme von Gewebeproben für die histologische Untersuchung und zur Cytokinbestimmung erfolgte zu den genannten Zeiten.

Der Fokus richtete sich bei dieser Studie somit vor allem auf frühe entzündliche Prozesse und deren Beeinflussung durch AWD 12-281 und Cilomilast. Zusätzlich wurden Ohrdickenbestimmungen auch 24 und 48 h nach Challenge durchgeführt, wobei die Entzündungsreaktion relativ moderat war. Beide PDE4-Inhibitoren hemmten die durch TDI provozierte Entzündung signifikant. Dies zeigte sich zum einen in einer reduzierten Ohrschwellung, aber auch in der histologischen Auswertung und bei der Bestimmung von IL- 1β im Hauthomogenat [1]. Auch wenn die IL-4-Konzentration signifikant reduziert werden konnte, so war die Induktion in diesem Versuchsaufbau eher marginal. Die insgesamt recht schwache Reaktion auf TDI hatte 2 Ursachen: Erstens ist das Kontaktallergiegeschehen erst nach 24 Stunden voll ausgeprägt, mit den frühen Messungen hat man den Höhepunkt der Reaktion somit noch nicht erfasst. Zweitens sind die Tiere in dieser Studie noch nicht nach einem standardisierten Schema sensibilisiert worden, da eine Sensibilisierung nach Angaben von Gad et al. (1986) über Wochen anhält. Unsere Erfahrungen aber zeigten, dass die entzündliche Reaktion, erneut provoziert zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Sensibilisierung, in der Stärke der Ausprägung stark variieren kann. Um diese Variation zu mindern, wurde in den folgenden Arbeiten ein starres Sensibilisierungs- und Challengeregime

verwendet. Es zeigte sich, dass dies zu einer robusten Reaktion in der Vehikelkontrolle führt [1-4; 6-7]. Um den optimalen Zeitpunkt der Probenahme zu bestimmen, wurde in einem nicht publizierten Vorversuch ein Zeitprofil erstellt, bei dem Proben von jeweils 2 Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach TDI-Challenge entnommen wurden. Abbildung 4 zeigt die Zeitabhängigkeit der Cytokinkonzentration von IL-1β, IL-4, IL-10 und MIP-2. Es wird ersichtlich, dass die Kinetik nicht einheitlich verläuft, aber 24 Stunden nach Challenge alle Cytokine deutlich erhöht sind. Aus diesem Vorversuch wurde geschlossen, dass der geeignetste Zeitpunkt für die Probennahme (Cytokinbestimmung, histologische Untersuchung) 24 Stunden nach Challenge ist.

Abb. 4: Zeitabhängigkeit der Bildung von IL-1β, IL-4, IL-10 und MIP-2 in Mausohren eine bis 48 Stunden nach TDI-Challenge. Mittelwert aus je 2 TDI-behandelten Mäusen pro Zeitpunkt (schwarze Balken), im Vergleich zu 2 unbehandelten Mäusen (graue Balken).

In der zweiten Studie wurden AWD 12-281 und Cilomilast systemisch und topisch eingesetzt. Eine topische Applikation erfolgte zusätzlich auch therapeutisch, d.h. eine Stunde nach Challenge, als schon deutliche Entzündungssymptome vorlagen (Publikation [2]).

Verglichen mit der topischen Applikation sind AWD 12-281 und Cilomilast bei systemischer Verabreichung (i.p. und oral) erheblich schwächer wirksam. Während nach oraler Gabe keine Suppression der Ohrschwellung durch AWD 12-281 zu induzieren war, hemmte Cilomilast die Ohrschwellung signifikant. Dies erklärt sich durch die hohe orale Bioverfügbarkeit von Cilomilast (Giembycz, 2001), während AWD 12-281 zu weniger als 3 % bioverfügbar ist (Kuss et al., 2003).

Die topische Applikation führte, präventiv verabreicht, wieder zu einer signifikanten Inhibition der Ohrschwellung durch Cilomilast (3 %) und AWD 12-281 (1 %). Das sehr stark wirksame Dermatocorticoid (Klasse III) Diflorason-Diacetat (0.05 %) war nur unwesentlich stärker wirksam als die PDE4-Inhibitoren. Bei der therapeutischen Intervention war neben Diflorason-Diacetat nur AWD 12-281 in der Lage, die Entzündung signifikant zu beeinflussen. Cilomilast hatte selbst in Konzentrationen von bis zu 10 % keinen signifikanten antiinflammatorischen Einfluss, wenn es auf bereits entzündetes Gewebe verabreicht wurde.

Es muss jedoch einschränkend hinzugefügt werden, dass die IC50 des PDE4-Inhibitors AWD 12-281 etwa 10fach niedriger liegt als die von Cilomilast (9 nmol/l zu 95 nmol/l).

Eine Langzeitbehandlung mit TDI führt zeitabhängig zu einer Erhöhung von TDI- spezifischem IgE (Scheerens et al., 1999). Daher wurden Mäuse über 120 Tage wiederholt im Abstand von je 10 Tagen mit TDI abdominal sensibilisiert. Eine stärkere Frühreaktion (1 Stunde nach TDI-Challenge) kann Ausdruck einer IgE-mediierten Sofortreaktion sein. 3 % AWD 12-281, topisch verabreicht 1 h nach Challenge, hemmt die Ohrschwellung nahezu vollständig, was durch histologische Untersuchungen bestätigt wird. Vergleichbar zu Diflorason-Diacetat sind weder Entzündungszellen noch Plasmaextravasationen zu erkennen, während vehikelbehandelte Ohren nach TDI-Challenge durch Mikroabszesse und massive Ödembildung gekennzeichnet sind (Abb. 5).

Abbildung 5: Histologischer Querschnitt von Mausohren. Effekt von topisch appliziertem AWD 12-281 (b) auf die TDI induzierte Ohrschwellung. Im Vergleich zu vehikelbehandelten Kontrollmäusen (a), inhibiert AWD 12-281 (3 %), auch wenn es eine Stunde nach TDI Challenge verabreicht wird, die Entzündungsreaktion nahezu vollständig (Probennahme 24 Stunden nach Challenge, Messbalken: 100 µm, Material und Methoden in Publikation [2]).

In dieser Studie wurden zusätzlich IL-4, IL-6 und MIP-2 im Hauthomogenat gemessen. IL-4 ist ein typisches Th2-Cytokin, während IL-6, ähnlich wie IL-1β, ein pleiotropes, proinflammatorisches Cytokin darstellt. MIP-2, ein murines Analogon zu IL-8, ist ein wichtiger chemotaktischer Faktor für neutrophile Granulozyten, die im histologischen Bild deutlich dominieren (s. Abb. 5 und Publikation [3]). Alle drei Cytokine sind in TDI- behandelten Mausohren massiv induziert. Sowohl Cilomilast (3 %) als auch AWD 12-281 (3 %) und Diflorason-Diacetat (0,05 %) können die Cytokinkonzentrationen signifikant hemmen. Die massive Inhibition des chemotaktischen Faktors MIP-2 (zusammen mit der Reduktion von KC, das ebenfalls ein chemotaktischer Faktor für Neutrophile ist [4]) erklärt das fast vollständige Fehlen von Neutrophilen in PDE4-Inhibitor-behandelten Mäusen (Abb 5, und Publikation [1-3]). Mit Hilfe antikörpergekoppelter beads (Bioplex^ Technologie) war es uns zusätzlich möglich, insgesamt 17 Cytokine und Chemokine in kleinsten Probenvolumina simultan zu messen. Dabei zeigte sich, dass AWD 12-281 (3 %) die Konzentrationen nahezu aller in der Haut durch TDI induzierten Cytokine und Chemokine signifikant hemmen konnte.

AWD 12-281 reduzierte die Konzentration von IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL- 17, TNFα, IFNγ, GMCSF, G-CSF, KC, MIP-1α und RANTES (Publikation [4]). Die Reduktion der IL-12-Konzentration war zwar nicht signifikant, aber es konnte zuvor gezeigt werden, dass IL-12 auch keine zentrale Rolle im TDI-Modell spielt und sich somit auch die grundsätzlich niedrigen Werte erklären (Publikation [3]). Für nahezu alle von uns untersuchten Cytokine und Chemokine ist bekannt, dass sie bei Menschen mit AD eine Rolle spielen. So war IL-1β in der Haut von Atopikern nach einer epicutanen Applikation eines Hausstaubmilbenantigens erhöht (Junghans et al., 1998). In Monozyten von Atopikern fanden sich jedoch nach In-vitro-Stimulation erniedrigte IL-1β Werte (Jakob et al., 1995). T-Zellen, isoliert aus der Haut von AD-Patienten, produzierten nach Stimulation IL-2, unabhängig davon, ob die AD allergischen oder nicht-allergischen Ursprungs war (Akdis et al., 1999). Im Serum von AD-Patienten hingegen war IL-2 tendenziell erniedrigt und korrelierte signifikant invers mit Serum-IgE-Spiegeln (Yoshizawa et al., 2002). IL-3, IL-4 und IL-5 wurden von T- Zellen in allergisch entzündeter Haut sezerniert (Dubois et al., 1994). In Hautbioptaten von akut entzündeten Läsionen fand sich eine erhöhte Expression von IL-4 und IL-13, bei chronischen Läsionen nahm diese Expression zu Gunsten von IL-5, IL-12 und IFNγ ab (Hamid et al., 1994; Hamid et al., 1996). T-Zellen von AD-Patienten sezernierten spontan signifikant höhere Gehalte von IL-6 im Vergleich zu gesunden Probanden (Toshitani et al., 1993). Auch Monozyten (PBMC) von Kindern mit schwerer AD zeigten spontan eine im Vergleich zu gesunden Kindern erhöhte IL-6-, TNFα- und IL-8-Sekretion. Wurden

Monozyten (PBMC) von AD-Patienten mit Keratinozyten co-kultiviert, zeigte sich in den Überständen eine im Vergleich zur Kontrolle (Co-kultivierung mit PBMC gesunder Probanden) erhöhte IL-6- und IL-8-Konzentration (Neuber et al., 1995). Eine im Vergleich zu gesunden Kontrollen erhöhte IL-8-Expression wurde auch auf mRNA-Ebene in Blutmonozyten (PBMC) von AD-Patienten gefunden (Hatano et al., 1999). Im Plasma von AD-Patienten fanden sich im Gegensatz zu gesunden Kontrollen deutlich erhöhte Konzentrationen von IL-8 (Kimata und Lindley, 1994). In der Maushaut wurden statt IL-8 die funktionell homologen Chemokine KC und MIP-2 gemessen (Publikation [2, 4]). Auch die Expression von IL-10 zeigte sich in der Haut von AD-Patienten deutlich erhöht (Howell et al., 2005). Allerdings scheinen die Serum-Gehalte an IL-10 bei AD-Patienten nicht erhöht zu sein (Yoshizawa et al., 2002). Zu IL-17 liegen nur wenige Untersuchungen vor. Es zeigte sich aber gerade in akut entzündlichen Läsionen eine erhöhte Expression von IL-17 in der Haut von AD-Patienten (Toda et al., 2003). Die Expression der mRNA war, wie auch die spontane Sekretion des Chemokins MIP-1α, in Monozyten von AD-Patienten signifikant erhöht (Hatano et al., 1999; Kaburagi et al., 2001). Im Plasma von AD-Patienten zeigte sich hingegen keine signifikante Erhöhung von MIP-1α (Kaburagi et al., 2001). Das typische Th1- Cytokin IFNγ wurde auf mRNA-Ebene in läsionaler Haut von AD-Patienten immer gemeinsam mit einer erhöhten Expression von IL-4 gefunden (Grewe et al., 1994).

Allergenspezifische T-Zellen, die aus der Dermis von chronischen Hautläsionen isoliert wurden, zeigten zu über 70 % eine vermehrte Expression und Sekretion von IFNγ (Werfel et al., 1996). Die Expression von GM-CSF war in Epidermis und Dermis von AD-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden deutlich erhöht (Pastore et al., 1997). Wurden Keratinozyten aus atopischen Ekzemen gewonnen und kultiviert, sezernierten sie entweder spontan oder stimuliert im Vergleich zu Kontrollkeratinozyten erheblich höhere Gehalte an GM-CSF. Die Autoren konnten zusätzlich einen funktionellen Zusammenhang zwischen erhöhten GM-CSF-Gehalten und Aktivierung dendritischer Zellen darstellen (Pastore et al., 1997). Im Umkehrschluss könnte die in der Maushaut gemessene Reduktion der GM-CSF- Konzentration teilweise die Inhibition der DC-Aktivierung erklären (s.u.), die wir nach Behandlung mit dem PDE4-Inhibitor Cilomilast beobachtet haben (Publikation [6]). Auf die Expression von RANTES wird im Folgenden noch näher eingegangen (Publikation [3]).

Zur Charakterisierung der Cytokin- und Chemokinexpression in der Haut von Hunden mit AD ist die Datenlage zwar eingeschränkt, doch wurden auch in der Haut atopischer Hunde erhöhte mRNA-Expressionen von IL-4, IFNγ, TNFα und IL-2 gemessen. Für IL-10, IL-6 und

al., 2002b). In einer weiteren Studie konnten erhöhte mRNA-Expressionen von IL-4 und IL-5 in der Haut atopischer Hunde gemessen werden. IFNγ wurde in chronisch entzündeten Hautläsionen vermehrt gefunden (Olivry et al., 1999).

Es wird sowohl für den Hund als auch für den Menschen ersichtlich, dass gerade bei der Chronifizierung der AD eine erhöhte Aktivität von Th1- und Th2-Zellen vorliegt (Grewe et al., 1998; Olivry et al., 1999), so dass ein geeignetes Therapeutikum möglichst breit auf Th1- und Th-2-Cytokine wirken sollte. Dass AWD 12-281 sowohl Th1- als auch Th2-Cytokine signifikant inhibieren kann, konnte auch in vitro an stimulierten humanen Blutmonozyten demonstriert werden. Die IC50s lagen je nach Cytokin zwischen 30 und 190 nmol/l (Publikation [4]).

Die hohen IL-4-Gehalte und die in der Literatur beschriebenen erhöhten IgE-Spiegel in TDI- sensibilisierten Mäusen (Scheerens et al., 1999) geben klare Hinweise, dass TDI eine präferenzielle Th2-Antwort induziert. Da aber die AD bei Mensch und Hund, gerade in ihrem chronischen Verlauf, auch durch ein Th1-mediiertes Entzündungsgeschehen geprägt ist (Grewe et al., 1998; Nuttall et al., 2002b), haben wir Cilomilast in einem weiteren, präferentiellen Th1-Entzündungsmodell, ausgelöst durch das reine Kontaktallergen Dinitrochlorbenzen (DNCB), getestet⁴. Die Th1-Dominanz, die DNCB schon per se besitzt (Ban und Hettich, 2001; Dearman et al., 1996), wurde durch eine intradermale Gabe von komplettem Freund´schem Adjuvanz weiter verstärkt (Publikation [3]). Zur Kontrolle der Th1/Th2-Polarisierung wurden im Hauthomogenat die Konzentrationen von IL-4 und dem Th1-Cytokin IL-12(p70) gemessen. Während TDI-behandelte Mäuse einen signifikanten Anstieg von IL-4 zeigten, aber nur marginal erhöhte IL-12-Werte aufwiesen, war das Bild in DNCB-behandelten Mäusen genau umgekehrt. Da die allergische Kontaktdermatitis eine T- Zell-vermittelte Entzündungsreaktion ist, wurden zum einen der Influx von CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen in den beiden Allergiemodellen untersucht, zum anderen wurden die T-Zell- relevanten Chemokine TARC (Vestergaard et al., 2000), RANTES (Schall et al., 1990) und CTACK (Morales et al., 1999) im Hauthomogenat gemessen und immunhistologisch dargestellt. In beiden Modellen war der Influx von CD4⁺ T-Zellen etwa gleich stark ausgeprägt. Jedoch wurden in der Haut DNCB-behandelter Tiere erheblich höhere Gehalte an CD8⁺ T-Zellen festgestellt. Beide Kontaktallergien sind jedoch durch eine extrem hohe Anzahl GR-1⁺ Zellen (neutrophile Granulozyten) gekennzeichnet. Während sowohl TARC

4 AWD 12-281 stand uns für weitere Untersuchungen nicht mehr zur Verfügung, denn es wurde zu diesem Zeitpunkt an GlaxoSmithKline verkauft (dort nun unter der Nummer GSK 842470 in der klinischen Phase für die Behandlung der AD des Menschen). Doch in Publikation [4] sind auch Daten publiziert, die in unserer Arbeitsgruppe generiert worden sind.