Rolle und pharmakologische Beeinflussung dendritischer Zellen in Modellen allergischer Hauterkrankungen

Wie mehrfach erwähnt, spielen dendritische Zellen (DC) eine entscheidende Rolle sowohl bei der Induktion als auch bei der Elizitation/Challenge allergischer Hauterkrankungen (Krasteva et al., 1999; Novak et al., 1999). In der Induktionsphase wird das Allergen/Hapten von Langerhans-Zellen und/oder dermalen DC aufgenommen, prozessiert und im drainierenden Lymphknoten naiven T-Zellen präsentiert. Die dann allergenspezifischen T-Zellen verlassen den Lymphknoten und zirkulieren im Körper. Die Induktionsphase ist in der Regel klinisch inapparent. Beim Zweitkontakt nehmen Langerhans-Zellen/dermale DC erneut das Antigen auf und präsentieren es direkt allergenspezifischen T-Zellen, wodurch eine Entzündungskaskade in Gang gesetzt wird, die sich bei der allergischen Kontaktdermatitis als

Ekzem manifestiert. Der Höhepunkt der entzündlichen Reaktion ist nach etwa 24 Stunden erreicht. Es gelang uns, nachzuweisen, dass DC das Allergen nicht nur in der Dermis allergenspezifischen T-Zellen präsentieren, sondern dass DC auch in der Elizitationsphase erneut zum drainierenden Lymphknoten wandern. Diese Wanderung und deren Inhibition durch Immunmodulatoren war Schwerpunkt der Publikationen [6] und [7]. Die Ergebnisse aus Publikation [5] stellten hierfür wichtige Vorarbeiten dar, da wir zeigen konnten, dass Cilomilast die Migration von dendritischen Zellen durch die Haut inhibierte. Um eine Beeinflussung der DC-Funktion durch PDE4-Inhibitoren (Cilomilast) zu untersuchen, sind die Tiere nicht aktiv sensibilisiert, sondern mit pulsed DC behandelt worden. In diesem Fall werden die Mäuse durch DC sensibilisiert, die zuvor mit dem relevanten Hapten/Allergen inkubiert worden sind. Voraussetzung dafür ist die Generierung einer möglichst reinen und homogenen Population von DC aus dem Knochenmark. Hierfür ist 1999 eine Methode beschrieben worden, mit der man sehr zuverlässig und mit geringem Aufwand eine große Menge reiner DC produzieren kann. Etwa 450 Zitationen bis Mitte 2006 belegen, dass diese Methode (Lutz et al., 1999) zu einem internationalen Standard für die Generierung muriner bone marrow derived DC geworden ist. Die einheitliche Weise der Zellkultivierung ermöglicht eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen, obwohl DC eine sehr heterogene, plastische Zellpopulation darstellen (Banchereau und Steinman, 1998).

Nach Lutz et al. (1999) kultivierte DC wurden am 11. Tag der Kultivierung 30 Minuten mit TDI (100 µg/ml) inkubiert und dann gewaschen. Die mit dem Hapten „gepulsten“ Zellen wurden schließlich BALB/c-Mäusen subcutan verabreicht. Kontrollmäuse erhielten unbehandelte DC oder TDI-behandelte DC, die durch mehrfaches Auftauen und Einfrieren abgetötet waren. 5 Tage danach wurden 20 µl 0,5 %iges TDI auf ein Ohr verabreicht.

Während die Mäuse, die lebende, TDI-gepulste DC erhielten, mit einer deutlichen Ohrschwellung reagierten, blieb diese Reaktion bei den Kontrollmäusen aus. Der Einfluss von Cilomilast auf die DC-Funktion wurde getestet, indem DC am 10. Tag der Kultivierung mit 10 µmol/l Cilomilast prä-inkubiert und am 11. Tag mit TDI gepulst wurden. Hatte man diese DC Mäusen verabreicht und provozierte man die Mäuse am 5. Tag mit 0,5 % TDI, so war die Ohrschwellung vergleichbar zur Positivkontrolle. Wenn aber die Mäuse zum Zeitpunkt der subcutanen Applikation TDI-gepulster DC systemisch unter hohen Dosen von Cilomilast standen, blieb 5 Tage später die allergische Reaktion aus (Publikation [5]). Dieses Ergebnis würde dafür sprechen, dass weniger die DC-Funktion als vielmehr die T-Zellreaktion durch Cilomilast moduliert wird. Dies entspräche Ergebnissen von Gantner et al. (1999) und

die PDE4-Aktivität drastisch reduzieren, dafür aber eine erhöhte PDE3-Aktivität aufweisen (Gantner et al., 1999; Hatzelmann und Schudt, 2001). Trotzdem konnten wir einen deutlichen inhibitorischen Effekt auf die durch LPS induzierte TNFα- und IL-1β-Sekretion muriner DC durch Cilomilast sehen (Publikation [5]). Dies konnte auch für die Sekretion von IL-12 bestätigt werden (Publikation [6]). Allerdings war die Kombination mit einem PDE3-Inhibitor (Saterinon) noch wirksamer als die alleinige Gabe von Cilomilast (unveröffentlichte Daten, Tabelle 5), was die Bedeutung der PDE3 in DC, wie sie von Gantner et al. (1999) beschrieben ist, bestätigt. Es gelang uns allerdings nicht in allen Experimenten, diesen synergistischen Effekt darzustellen, während Cilomilast, allein verabreicht, in allen Experimenten eine klare Hemmwirkung zeigte. Dies könnte damit zusammenhängen, dass der PDE3-Effekt nur in einem kurzen Zeitfenster (Reifungsstadium) der DC voll ausgeprägt ist.

Tabelle 5: Einfluß von Cilomilast (PDE4-Inhibition) und Cilomilast/Saterinon (PDE3/PDE4-Inhibition) auf die LPS induzierte TNFα- und IL-1β-Sekretion muriner DC. Murine BM-DC (Tag 10 der Kultivierung) wurden 30 min vor LPS-Stimulation mit Cilomilast (10 µmol/ml) und Saterinon (10 µmol/ml) prä-inkubiert. Die Überstände wurden 24 h nach LPS-Stimulation genommen (genaue Methodenbeschreibung in [5], *p<0,05 im Vergleich zu LPS).

IL-1β (pg/ml) TNFα (pg/ml) Kontrolle < 4 50 ± 19*

LPS 68 ± 9 1147 ± 117

LPS + Cilomilast 36 ± 12* 654 ± 121*

LPS + Cilomilast/Saterinon 19 ± 6* 251 ± 10*

Eine Beeinflussung der für die T-Zell-Stimulation wichtigen Aktivierungsmarker CD80 (B 7-1) und CD86 (B 7-2) durch die Immunmodulatoren Tacrolimus, Rapamycin oder Cilomilast konnte nicht gezeigt werden. Mittels fluorescence absorbed cell sorting (FACS) wurden die Oberflächenmarker CD80 und CD86 auf DC untersucht. Wie die Histogramme für CD80 (Abb. 6) und CD86 (Abb. 7) zeigen, induziert LPS eine Aufregulierung der Aktivierungsmarker. Eine Prä-Inkubation an Tag 8 und 9 der DC-Kultivierung mit Tacrolimus (100 nmol/l), Rapamycin (1 µmol/l) und Cilomilast (10 µmol/l) führt zu keiner nennenswerten Inhibition der Aufregulierung (zusätzliche, nicht veröffentlichte Daten zu Publikation [6]).

Abbildung 6: FACS-Analyse CD80⁺ DC; Darstellung von unbehandelten DC (gefülltes Histogramm) sowie von LPS-, Tacrolimus-, Cilomilast- und Rapamycin-behandelten DC;

deutliche Zunahme CD80⁺ DC nach LPS-Stimulation, kaum eine Beeinflussung von CD80 durch die Testsubstanzen (Abbildung aus Sülzle, 2004, Vet.-med. Diss., Hannover).

Abbildung 7: FACS-Analyse CD86⁺ DC; Darstellung von unbehandelten DC (gefülltes Histogramm) sowie von LPS-, Tacrolimus-, Cilomilast- und Rapamycin-behandelten DC;

deutliche Zunahme CD86⁺ DC nach LPS-Stimulation, kaum eine Beeinflussung von CD86 durch die Testsubstanzen (Abbildung aus Sülzle, 2004, Vet.-med. Diss., Hannover).

LPS Tacrolimus

Cilomilast Rapamycin Kontrolle

Kontrolle

LPS

Tacrolimus

Rapamycin Cilomilast

Ein zusätzlicher Befund legte nahe, dass eine weitere, zentrale DC-Funktion, nämlich die Migration, durch Cilomilast beeinflusst werden kann. In einem skin dendritic cell migration assay (Ortner et al., 1996) hemmte topisch verabreichtes Cilomilast massiv die Migration von epidermalen und dermalen DC. Dieser Befund wurde durch die immunhistologische Untersuchung der Langerhans-Zell-Dichte in der Epidermis vehikel- bzw. cilomilast-behandelter Mäuse bestätigt (Publikation [5]). Eine mögliche Erklärung hierfür ist die Inhibition der Matrix-Metalloproteinase 9 (MMP-9) in der Haut durch Cilomilast. Im Vergleich zu vehikelbehandelten Mausohren zeigt sich in einem Zymogramm bei cilomilastbehandelten Ohren eine nahezu vollständige Inhibition der MMP-9-Aktivität. Die MMP-9 ist eine für die DC-Migration essentielle Proteinase (Kobayashi et al., 1999;

Ratzinger et al., 2002). So konnte in dieser Arbeit die Modulation zweier wichtiger DC-Funktionen durch PDE4-Inhibition gezeigt werden: die Cytokinproduktion, die wichtig für die Vermittlung von „Dangersignalen“ ist, und die DC-Migration durch die Haut. Eigene Versuche mit „gepulsten“ DC legten den Schluss nahe, dass die Antigenpräsentation nicht moduliert wird und dass die Migration auch nicht primär affektiert ist, da cilomilastbehandelte DC im Mauskörper migrieren mussten, um eine Immunantwort zu induzieren. Dass die Antigenpräsentation nur marginal moduliert wird, konnte in einer weiteren Studie mit Hilfe der mixed leucocyte reaction (MLR) nachgewiesen werden (Publikation [6]). Für die MLR wurden DC von BALB/c-Mäusen mit T-Zellen aus Milzen von NMRI-Mäusen ko-inkubiert.

Cilomilast (10 µmol/l) führte zu einer signifikanten Reduktion der MLR im Vergleich zu vehikelbehandelten Kontrollen. Wurde Cilomilast jedoch nicht in Form einer Co-Inkubation gegeben, sondern wurden nur DC oder T-Zellen 1 Stunde mit Cilomilast prä-inkubiert, so führte nur die Prä-Inkubation der T-Zellen zu einer signifikanten Reduktion der MLR (Publikation [6]). In derselben Studie wurde die DC-Migration in vivo und ex vivo in aktiv TDI-sensibilisierten Mäusen untersucht. Cilomilast und die Makrolide Tacrolimus sowie Rapamycin hatten einen hemmenden Einfluss auf die DC-Migration nach TDI-Challenge, wobei der Effekt bei Tacrolimus am ausgeprägtesten war, denn nach Tacrolimus-Behandlung war nicht nur die Langerhans-Zelldichte signifikant höher als bei vehikelbehandelten Tieren, sondern der regionäre Lymphknoten zeigte nahezu keine Schwellung. Es konnte nach TDI-Challenge auch kein vermehrtes Einwandern von DC in den regionalen Lymphknoten beobachtet werden. In dieser Studie korrelierte die Migrationshemmung der DC erneut mit der Inhibition der MMP-9 in Dermis und Epidermis.

In der folgenden Studie sollte der Einfluss von nichtsteroidalen und steroidalen Antiphlogistika auf die immunvermittelte Entzündung verglichen werden. Das

Dermatocorticoid Diflorason-Diacetat wurde erneut als Positivstandard gewählt, da über die Beeinflussung von Corticoiden auf DC-Migration in der Elizitationsphase bis dahin nichts bekannt war und eine antientzündliche Wirkung bereits belegt ist (Publikation [3]). Die nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs) Acetylsalicylsäure und Indometacin wurden untersucht, da einerseits gezeigt worden ist, dass die Langerhans-Zell-Maturation und -Migration vom Prostaglandin E2-EP4 Signalweg abhängig ist (Kabashima et al., 2003) und dieser durch NSAIDs gehemmt werden kann. Zusätzlich können andererseits NSAIDs in höheren Konzentrationen auch die Funktion des proinflammatorischen Transkriptionsfaktors NFκB hemmen (Takada et al., 2004). Eine Spezifizierung der DC-Charakterisierung gelang uns dadurch, dass wir nicht nur CD11c⁺ Zellen, sondern CD11c/CD40-doppelpositive Zellen im drainierenden Lymphknoten mittels FACS untersuchten. Durch Versuche an CCR7-Knockout-Mäusen konnte bestätigt werden, dass DC, die aus der Dermis und Epidermis in den regionären Lymphknoten migrieren, CD11c/CD40 doppelpositiv sind (Ohl et al., 2004;

Ruedl et al., 2000). Topisch verabreichtes Diflorason-Diacetat (0,05 %) führte, vergleichbar zu Cilomilast, Rapamycin und Tacrolimus (Publikation [6]), zu einer signifikanten Abnahme der Ohrschwellung und der CD11c/CD40 doppelpositiven DC im regionären Lymphknoten.

Das Gewicht und vor allem die Zellzahl des regionären Lymphknotens fielen nach Diflorason-Diacetat Behandlung weit unter Kontrollwerte. In Publikation [7] diskutierten wir, dass diese massive Abnahme der Zellzahl ein proapoptotischer Effekt von Diflorason-Diacetat sein kann. Bisher sind solche apoptotischen Effekte von Corticoiden, beispielsweise auf Langerhans-Zellen in der Epidermis topisch behandelter Haut, beschrieben worden (Hoetzenecker et al., 2004), nicht aber für den drainierenden Lymphknoten topisch behandelter Haut. Daher wurde eine orientierende Studie an DNCB-sensibilisierten Mäusen durchgeführt. Die Mäuse wurden nach dem in Publikation [3] beschriebenen Schema mit DNCB sensibilisiert. Analog zu Publikation [7] wurden die Ohren von je drei Mäusen neun und eine Stunde vor Challenge mit 20 µl Vehikel, Diflorason-Diacetat (0,05 % topisch) oder Cilomilast (3 % topisch) behandelt. 24 Stunden nach Challenge wurden die Mäuse getötet, die drainierenden Lymphknoten entnommen und die Zellen vereinzelt. Die Lymphknotenzellen wurden mit Annexin V und Propidiumiodid gefärbt und der prozentuale Anteil apoptotischer/nekrotischer Zellen mittels FACS-Analyse bestimmt. Der Anteil Annexin V/Propidiumiodid-doppelpositiver Zellen nimmt nach Behandlung mit Diflorason-Diacetat deutlich zu (Abb. 8b). Ein leichter Anstieg doppelpositiver Zellen ist auch nach Cilomilast-Behandlung zu sehen (Abb. 8c).

a)

A p o p t o s e

Apoptose/Nekrose

N e k r o s e

b)

c)

Auch Homey et al. (1997) diskutierten einen möglichen proapoptotischen Effekt auf die Zellen des drainierenden Lymphknotens durch topisch verabreichtes Mometason oder Dexamethason in der Induktionsphase der allergischen Kontaktdermatitis, ohne jedoch entsprechende Messungen durchzuführen (Homey et al., 1997). Es ist in diesem Zusammenhang interessant, dass eine Reduktion der Langerhans-Zelldichte in der Epidermis diflorasonbehandelter Mäuse 24 Stunden nach Challenge noch nicht zu beobachten ist (Publikation [7]). Dies deutet darauf hin, dass die Apoptose im regionalen Lymphknoten früher induziert wird als in den Langerhans-Zellen der Epidermis. Tatsächlich wird auch von Araki et al. (1999) eine Abnahme der Langerhans-Zelldichte erst 48 Stunden nach Applikation eines Corticoids gemessen, während nach 24 Stunden die Dichte, vergleichbar zu unseren Ergebnissen, der unbehandelter Kontrollen entspricht (Araki et al., 1999). Der Apoptosenachweis in Langerhans-Zellen wird in der Studie von Hoetzenecker et al. (2004) sogar erst 72 Stunden nach Corticoidapplikation durchgeführt.

Abb. 8: Bestimmung apoptotisch-nekrotischer Zellen im regionären Lymphknoten nach Behandlung mit

DiflorasonDiacetat oder Cilomilast DNCB -sensibilisierter Mäuse. Neun und eine Stunde vor

Challenge wurden die Mausohren von je drei Mäusen mit 20 µl Vehikel (a), 20 µl Diflorason-Diacetat (0,05%) (b) oder 20 µl Cilomilast (3%) (c) behandelt. 24 Stunden nach Challenge wurden die Zellen des drainierenden Lymphknotens mit Annexin V/Propidiumiodid gefärbt.

Diflorason-Diacetat führte zu einer deutlichen Zunahme apoptotisch-nekrotischer Zellen (Quadrant C2) im drainierenden Lymphknoten. Genaue Methode der Sensibilisierung und Behandlung siehe Publikation [3].

Ob der leichte Anstieg apoptotischer/nekrotischer Zellen in cilomilastbehandelten Mäusen eine klinische Relevanz hat, muss in weiterführenden Studien untersucht werden. Der Einfluss auf Lymphknotengewicht und Zellzahl deutet nicht auf eine massive Apoptoseinduktion hin (Publikation [6]). Allerdings ist eine Induktion von Apoptose beispielsweise für eosinophile Granulozyten durch PDE4-Inhibitoren beschrieben (Wang et al., 2005). PDE4-Inhibitoren induzieren auch in (leukämischen) B- und T-Zellen Apoptose (Ogawa et al., 2002; Tiwari et al., 2005), so dass der moderate Anstieg apoptotischer Zellen in lymphatischem Gewebe durchaus erklärbar ist. Hervorzuheben ist bei diesen Studien die Kombination aus Glucocorticoidwirkung und PDE4-Inhibition. In beiden zuletzt zitierten Studien wird ein additiver Effekt auf die Apoptoseinduktion bei gleichzeitiger Gabe von Glucocorticoiden und