Effekte von PDE4-Inhibitoren in Modellen allergischer Hauterkrankungen

Die PDE4-Inhibitoren Cilomilast und AWD 12-281 wurden zuerst topisch im Modell der allergischen Kontaktdermatitis, ausgelöst durch das Hapten Toluendiisocyanat (TDI), getestet [1]. TDI ist ein respiratory chemical allergen. Das heißt, dass TDI nicht nur ein Kontaktallergen ist, sondern auch atemwegssensibilisierende Eigenschaften besitzt (Scheerens et al. 1999). Kontaktallergene, die auch atemwegssensibilisierend wirken (z.B. FITC, TMA, TDI), zeichnen sich durch eine präferenzielle Th2-Antwort aus. Eine kürzlich publizierte Studie bringt diesen Umstand damit in Zusammenhang, dass Langerhans-Zellen unterschiedlich schnell zum drainierenden Lymphknoten wandern (Cumberbatch et al., 2005).

In der ersten Studie wurden die PDE4-Inhibitoren präventiv verabreicht, d.h. vor der Challenge mit TDI. Die Ohrschwellung wurde als Messparameter für die Entzündung 4, 8 und 16 Stunden nach Challenge gemessen. Auch die Entnahme von Gewebeproben für die histologische Untersuchung und zur Cytokinbestimmung erfolgte zu den genannten Zeiten.

Der Fokus richtete sich bei dieser Studie somit vor allem auf frühe entzündliche Prozesse und deren Beeinflussung durch AWD 12-281 und Cilomilast. Zusätzlich wurden Ohrdickenbestimmungen auch 24 und 48 h nach Challenge durchgeführt, wobei die Entzündungsreaktion relativ moderat war. Beide PDE4-Inhibitoren hemmten die durch TDI provozierte Entzündung signifikant. Dies zeigte sich zum einen in einer reduzierten Ohrschwellung, aber auch in der histologischen Auswertung und bei der Bestimmung von IL-1β im Hauthomogenat [1]. Auch wenn die IL-4-Konzentration signifikant reduziert werden konnte, so war die Induktion in diesem Versuchsaufbau eher marginal. Die insgesamt recht schwache Reaktion auf TDI hatte 2 Ursachen: Erstens ist das Kontaktallergiegeschehen erst nach 24 Stunden voll ausgeprägt, mit den frühen Messungen hat man den Höhepunkt der Reaktion somit noch nicht erfasst. Zweitens sind die Tiere in dieser Studie noch nicht nach einem standardisierten Schema sensibilisiert worden, da eine Sensibilisierung nach Angaben von Gad et al. (1986) über Wochen anhält. Unsere Erfahrungen aber zeigten, dass die entzündliche Reaktion, erneut provoziert zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Sensibilisierung, in der Stärke der Ausprägung stark variieren kann. Um diese Variation zu mindern, wurde in den folgenden Arbeiten ein starres Sensibilisierungs- und Challengeregime

verwendet. Es zeigte sich, dass dies zu einer robusten Reaktion in der Vehikelkontrolle führt [1-4; 6-7]. Um den optimalen Zeitpunkt der Probenahme zu bestimmen, wurde in einem nicht publizierten Vorversuch ein Zeitprofil erstellt, bei dem Proben von jeweils 2 Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach TDI-Challenge entnommen wurden. Abbildung 4 zeigt die Zeitabhängigkeit der Cytokinkonzentration von IL-1β, IL-4, IL-10 und MIP-2. Es wird ersichtlich, dass die Kinetik nicht einheitlich verläuft, aber 24 Stunden nach Challenge alle Cytokine deutlich erhöht sind. Aus diesem Vorversuch wurde geschlossen, dass der geeignetste Zeitpunkt für die Probennahme (Cytokinbestimmung, histologische Untersuchung) 24 Stunden nach Challenge ist.

Abb. 4: Zeitabhängigkeit der Bildung von IL-1β, IL-4, IL-10 und MIP-2 in Mausohren eine bis 48 Stunden nach TDI-Challenge. Mittelwert aus je 2 TDI-behandelten Mäusen pro Zeitpunkt (schwarze Balken), im Vergleich zu 2 unbehandelten Mäusen (graue Balken).

In der zweiten Studie wurden AWD 12-281 und Cilomilast systemisch und topisch eingesetzt. Eine topische Applikation erfolgte zusätzlich auch therapeutisch, d.h. eine Stunde nach Challenge, als schon deutliche Entzündungssymptome vorlagen (Publikation [2]).

Verglichen mit der topischen Applikation sind AWD 12-281 und Cilomilast bei systemischer Verabreichung (i.p. und oral) erheblich schwächer wirksam. Während nach oraler Gabe keine Suppression der Ohrschwellung durch AWD 12-281 zu induzieren war, hemmte Cilomilast die Ohrschwellung signifikant. Dies erklärt sich durch die hohe orale Bioverfügbarkeit von Cilomilast (Giembycz, 2001), während AWD 12-281 zu weniger als 3 % bioverfügbar ist (Kuss et al., 2003).

Die topische Applikation führte, präventiv verabreicht, wieder zu einer signifikanten Inhibition der Ohrschwellung durch Cilomilast (3 %) und AWD 12-281 (1 %). Das sehr stark wirksame Dermatocorticoid (Klasse III) Diflorason-Diacetat (0.05 %) war nur unwesentlich stärker wirksam als die PDE4-Inhibitoren. Bei der therapeutischen Intervention war neben Diflorason-Diacetat nur AWD 12-281 in der Lage, die Entzündung signifikant zu beeinflussen. Cilomilast hatte selbst in Konzentrationen von bis zu 10 % keinen signifikanten antiinflammatorischen Einfluss, wenn es auf bereits entzündetes Gewebe verabreicht wurde.

Es muss jedoch einschränkend hinzugefügt werden, dass die IC50 des PDE4-Inhibitors AWD 12-281 etwa 10fach niedriger liegt als die von Cilomilast (9 nmol/l zu 95 nmol/l).

Eine Langzeitbehandlung mit TDI führt zeitabhängig zu einer Erhöhung von TDI-spezifischem IgE (Scheerens et al., 1999). Daher wurden Mäuse über 120 Tage wiederholt im Abstand von je 10 Tagen mit TDI abdominal sensibilisiert. Eine stärkere Frühreaktion (1 Stunde nach TDI-Challenge) kann Ausdruck einer IgE-mediierten Sofortreaktion sein. 3 % AWD 12-281, topisch verabreicht 1 h nach Challenge, hemmt die Ohrschwellung nahezu vollständig, was durch histologische Untersuchungen bestätigt wird. Vergleichbar zu Diflorason-Diacetat sind weder Entzündungszellen noch Plasmaextravasationen zu erkennen, während vehikelbehandelte Ohren nach TDI-Challenge durch Mikroabszesse und massive Ödembildung gekennzeichnet sind (Abb. 5).

Abbildung 5: Histologischer Querschnitt von Mausohren. Effekt von topisch appliziertem AWD 12-281 (b) auf die TDI induzierte Ohrschwellung. Im Vergleich zu vehikelbehandelten Kontrollmäusen (a), inhibiert AWD 12-281 (3 %), auch wenn es eine Stunde nach TDI Challenge verabreicht wird, die Entzündungsreaktion nahezu vollständig (Probennahme 24 Stunden nach Challenge, Messbalken: 100 µm, Material und Methoden in Publikation [2]).

In dieser Studie wurden zusätzlich IL-4, IL-6 und MIP-2 im Hauthomogenat gemessen. IL-4 ist ein typisches Th2-Cytokin, während IL-6, ähnlich wie IL-1β, ein pleiotropes, proinflammatorisches Cytokin darstellt. MIP-2, ein murines Analogon zu IL-8, ist ein wichtiger chemotaktischer Faktor für neutrophile Granulozyten, die im histologischen Bild deutlich dominieren (s. Abb. 5 und Publikation [3]). Alle drei Cytokine sind in TDI-behandelten Mausohren massiv induziert. Sowohl Cilomilast (3 %) als auch AWD 12-281 (3 %) und Diflorason-Diacetat (0,05 %) können die Cytokinkonzentrationen signifikant hemmen. Die massive Inhibition des chemotaktischen Faktors MIP-2 (zusammen mit der Reduktion von KC, das ebenfalls ein chemotaktischer Faktor für Neutrophile ist [4]) erklärt das fast vollständige Fehlen von Neutrophilen in PDE4-Inhibitor-behandelten Mäusen (Abb 5, und Publikation [1-3]). Mit Hilfe antikörpergekoppelter beads (Bioplex^ Technologie) war es uns zusätzlich möglich, insgesamt 17 Cytokine und Chemokine in kleinsten Probenvolumina simultan zu messen. Dabei zeigte sich, dass AWD 12-281 (3 %) die Konzentrationen nahezu aller in der Haut durch TDI induzierten Cytokine und Chemokine signifikant hemmen konnte.

AWD 12-281 reduzierte die Konzentration von 1β, 2, 3, 4, 5, 6, 10, IL-17, TNFα, IFNγ, GMCSF, G-CSF, KC, MIP-1α und RANTES (Publikation [4]). Die Reduktion der IL-12-Konzentration war zwar nicht signifikant, aber es konnte zuvor gezeigt werden, dass IL-12 auch keine zentrale Rolle im TDI-Modell spielt und sich somit auch die grundsätzlich niedrigen Werte erklären (Publikation [3]). Für nahezu alle von uns untersuchten Cytokine und Chemokine ist bekannt, dass sie bei Menschen mit AD eine Rolle spielen. So war IL-1β in der Haut von Atopikern nach einer epicutanen Applikation eines Hausstaubmilbenantigens erhöht (Junghans et al., 1998). In Monozyten von Atopikern fanden sich jedoch nach In-vitro-Stimulation erniedrigte IL-1β Werte (Jakob et al., 1995). T-Zellen, isoliert aus der Haut von AD-Patienten, produzierten nach Stimulation IL-2, unabhängig davon, ob die AD allergischen oder nicht-allergischen Ursprungs war (Akdis et al., 1999). Im Serum von AD-Patienten hingegen war IL-2 tendenziell erniedrigt und korrelierte signifikant invers mit Serum-IgE-Spiegeln (Yoshizawa et al., 2002). IL-3, IL-4 und IL-5 wurden von T-Zellen in allergisch entzündeter Haut sezerniert (Dubois et al., 1994). In Hautbioptaten von akut entzündeten Läsionen fand sich eine erhöhte Expression von IL-4 und IL-13, bei chronischen Läsionen nahm diese Expression zu Gunsten von IL-5, IL-12 und IFNγ ab (Hamid et al., 1994; Hamid et al., 1996). T-Zellen von AD-Patienten sezernierten spontan signifikant höhere Gehalte von IL-6 im Vergleich zu gesunden Probanden (Toshitani et al., 1993). Auch Monozyten (PBMC) von Kindern mit schwerer AD zeigten spontan eine im Vergleich zu gesunden Kindern erhöhte IL-6-, TNFα- und IL-8-Sekretion. Wurden

Monozyten (PBMC) von AD-Patienten mit Keratinozyten co-kultiviert, zeigte sich in den Überständen eine im Vergleich zur Kontrolle (Co-kultivierung mit PBMC gesunder Probanden) erhöhte IL-6- und IL-8-Konzentration (Neuber et al., 1995). Eine im Vergleich zu gesunden Kontrollen erhöhte IL-8-Expression wurde auch auf mRNA-Ebene in Blutmonozyten (PBMC) von AD-Patienten gefunden (Hatano et al., 1999). Im Plasma von AD-Patienten fanden sich im Gegensatz zu gesunden Kontrollen deutlich erhöhte Konzentrationen von IL-8 (Kimata und Lindley, 1994). In der Maushaut wurden statt IL-8 die funktionell homologen Chemokine KC und MIP-2 gemessen (Publikation [2, 4]). Auch die Expression von IL-10 zeigte sich in der Haut von AD-Patienten deutlich erhöht (Howell et al., 2005). Allerdings scheinen die Serum-Gehalte an IL-10 bei AD-Patienten nicht erhöht zu sein (Yoshizawa et al., 2002). Zu IL-17 liegen nur wenige Untersuchungen vor. Es zeigte sich aber gerade in akut entzündlichen Läsionen eine erhöhte Expression von IL-17 in der Haut von AD-Patienten (Toda et al., 2003). Die Expression der mRNA war, wie auch die spontane Sekretion des Chemokins MIP-1α, in Monozyten von AD-Patienten signifikant erhöht (Hatano et al., 1999; Kaburagi et al., 2001). Im Plasma von AD-Patienten zeigte sich hingegen keine signifikante Erhöhung von MIP-1α (Kaburagi et al., 2001). Das typische Th1-Cytokin IFNγ wurde auf mRNA-Ebene in läsionaler Haut von AD-Patienten immer gemeinsam mit einer erhöhten Expression von IL-4 gefunden (Grewe et al., 1994).

Allergenspezifische T-Zellen, die aus der Dermis von chronischen Hautläsionen isoliert wurden, zeigten zu über 70 % eine vermehrte Expression und Sekretion von IFNγ (Werfel et al., 1996). Die Expression von GM-CSF war in Epidermis und Dermis von AD-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden deutlich erhöht (Pastore et al., 1997). Wurden Keratinozyten aus atopischen Ekzemen gewonnen und kultiviert, sezernierten sie entweder spontan oder stimuliert im Vergleich zu Kontrollkeratinozyten erheblich höhere Gehalte an GM-CSF. Die Autoren konnten zusätzlich einen funktionellen Zusammenhang zwischen erhöhten GM-CSF-Gehalten und Aktivierung dendritischer Zellen darstellen (Pastore et al., 1997). Im Umkehrschluss könnte die in der Maushaut gemessene Reduktion der GM-CSF-Konzentration teilweise die Inhibition der DC-Aktivierung erklären (s.u.), die wir nach Behandlung mit dem PDE4-Inhibitor Cilomilast beobachtet haben (Publikation [6]). Auf die Expression von RANTES wird im Folgenden noch näher eingegangen (Publikation [3]).

Zur Charakterisierung der Cytokin- und Chemokinexpression in der Haut von Hunden mit AD ist die Datenlage zwar eingeschränkt, doch wurden auch in der Haut atopischer Hunde erhöhte mRNA-Expressionen von IL-4, IFNγ, TNFα und IL-2 gemessen. Für IL-10, IL-6 und

al., 2002b). In einer weiteren Studie konnten erhöhte mRNA-Expressionen von IL-4 und IL-5 in der Haut atopischer Hunde gemessen werden. IFNγ wurde in chronisch entzündeten Hautläsionen vermehrt gefunden (Olivry et al., 1999).

Es wird sowohl für den Hund als auch für den Menschen ersichtlich, dass gerade bei der Chronifizierung der AD eine erhöhte Aktivität von Th1- und Th2-Zellen vorliegt (Grewe et al., 1998; Olivry et al., 1999), so dass ein geeignetes Therapeutikum möglichst breit auf Th1- und Th-2-Cytokine wirken sollte. Dass AWD 12-281 sowohl Th1- als auch Th2-Cytokine signifikant inhibieren kann, konnte auch in vitro an stimulierten humanen Blutmonozyten demonstriert werden. Die IC50s lagen je nach Cytokin zwischen 30 und 190 nmol/l (Publikation [4]).

Die hohen IL-4-Gehalte und die in der Literatur beschriebenen erhöhten IgE-Spiegel in TDI-sensibilisierten Mäusen (Scheerens et al., 1999) geben klare Hinweise, dass TDI eine präferenzielle Th2-Antwort induziert. Da aber die AD bei Mensch und Hund, gerade in ihrem chronischen Verlauf, auch durch ein Th1-mediiertes Entzündungsgeschehen geprägt ist (Grewe et al., 1998; Nuttall et al., 2002b), haben wir Cilomilast in einem weiteren, präferentiellen Th1-Entzündungsmodell, ausgelöst durch das reine Kontaktallergen Dinitrochlorbenzen (DNCB), getestet⁴. Die Th1-Dominanz, die DNCB schon per se besitzt (Ban und Hettich, 2001; Dearman et al., 1996), wurde durch eine intradermale Gabe von komplettem Freund´schem Adjuvanz weiter verstärkt (Publikation [3]). Zur Kontrolle der Th1/Th2-Polarisierung wurden im Hauthomogenat die Konzentrationen von IL-4 und dem Th1-Cytokin IL-12(p70) gemessen. Während TDI-behandelte Mäuse einen signifikanten Anstieg von IL-4 zeigten, aber nur marginal erhöhte IL-12-Werte aufwiesen, war das Bild in DNCB-behandelten Mäusen genau umgekehrt. Da die allergische Kontaktdermatitis eine T-Zell-vermittelte Entzündungsreaktion ist, wurden zum einen der Influx von CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen in den beiden Allergiemodellen untersucht, zum anderen wurden die T-Zell-relevanten Chemokine TARC (Vestergaard et al., 2000), RANTES (Schall et al., 1990) und CTACK (Morales et al., 1999) im Hauthomogenat gemessen und immunhistologisch dargestellt. In beiden Modellen war der Influx von CD4⁺ T-Zellen etwa gleich stark ausgeprägt. Jedoch wurden in der Haut DNCB-behandelter Tiere erheblich höhere Gehalte an CD8⁺ T-Zellen festgestellt. Beide Kontaktallergien sind jedoch durch eine extrem hohe Anzahl GR-1⁺ Zellen (neutrophile Granulozyten) gekennzeichnet. Während sowohl TARC

4 AWD 12-281 stand uns für weitere Untersuchungen nicht mehr zur Verfügung, denn es wurde zu diesem Zeitpunkt an GlaxoSmithKline verkauft (dort nun unter der Nummer GSK 842470 in der klinischen Phase für die Behandlung der AD des Menschen). Doch in Publikation [4] sind auch Daten publiziert, die in unserer Arbeitsgruppe generiert worden sind.

(CCL-17) als auch RANTES (CCL-5) in beiden Allergiemodellen deutlich induziert wurden, hatte keines der beiden Haptene einen Einfluss auf die CTACK-Konzentration (CCL-27) in behandelter Maushaut (ELISA wie auch Immunhistologie). Da aber eine CTACK-Induktion durch das dem DNCB verwandte Hapten Dinitrofluorobenzen (DNFB) beschrieben war (Homey et al., 2002), sind zusätzliche Versuche durchgeführt worden (mehrfache Challenge derselben Hautstelle, was zu extremer Exazerbation der Entzündung führte, sowie Probennahme bereits 2, 4, 8, 16 Stunden nach Challenge). Alle Bemühungen, eine Induktion von CTACK nachzuweisen, schlugen jedoch fehl. Auffallend waren aber die hohen Basalwerte von CTACK, die dafür sprechen, das CTACK für die Homöostase der T-Zellmigration (steady state trafficking) wahrscheinlich wichtig ist. Diese Schlussfolgerung wird durch andere Untersuchungen bestätigt (Soler et al., 2003).

Cilomilast konnte im TDI-Modell die Ohrschwellung erneut signifikant hemmen. Im DNCB-Modell war die Wirkung jedoch deutlich schwächer, während Diflorason-Diacetat die Entzündung in beiden Modellen vollständig inhibierte, was durch die histologische Auswertung bestätigt werden konnte. Korrespondierend zur Entzündungshemmung war auch der Einfluss von Cilomilast auf die Chemokine RANTES und TARC nur im TDI-Modell nennenswert. Eine Hemmung dieser beiden Chemokine ist auch im Hinblick auf die Behandlung der AD relevant, da erhöhte Plasmakonzentrationen beider Chemokine bei AD-Patienten gemessen werden (Homey et al., 2006). Während Diflorason-Diacetat die RANTES-Konzentration in beiden Modellen signifikant senkte und die TARC-Konzentration auch im DNCB-Modell, haben wir im TDI-Modell eine massive Induktion von TARC durch Diflorason-Diacetat sowohl in der Immunhistologie als auch mittels ELISA gemessen. Dieser überraschende Befund konnte in einem Wiederholungsexperiment mit der gleichen, massiven Induktion von TARC durch Diflorason-Diacetat im TDI-Modell bestätigt werden. Eine Diflorason-Diacetat-Behandlung führte andererseits zu einer Reduktion weiterer Chemokine und Cytokine z.T. auf Basallevel (Publikationen [2 und 3]), und auch histologisch war in beiden Entzündungsmodellen nahezu kein Zellinflux zu sehen, woraus zu schließen ist, dass diese Induktion von TARC durch Diflorason-Diacetat funktionell offensichtlich keine entscheidende Rolle spielt. Weil CTACK, wie bereits erwähnt, durch die verwendeten Haptene nicht induziert werden konnte, zeigte sich erwartungsgemäß auch keine Beeinflussung durch Cilomilast oder Diflorason-Diacetat.

Da die beschriebenen Studien eine klare Wirkung von PDE4-Inhibitoren auf ein allergisches Entzündungsgeschehen zeigten, wurden für AWD 12-281 weitergehende Untersuchungen

durchgeführt (Publikationen [2 und 4]). Da AWD 12-281 im TDI-Allergiemodell sowohl präventiv als auch therapeutisch sehr wirksam war, wurden erste orientierende Hautpenetrationsstudien mit ¹⁴C-markiertem AWD 12-281 an Maushaut durchgeführt.

Innerhalb von 6 Stunden penetrierten etwa 0,1 - 0,2 % der applizierten Substanz die Haut (Publikation [2]). Die Hornschicht stellt die erste und größte Barriere für topisch applizierte Stoffe dar. Da sich die Hornschicht der Maus von der des Menschen schon durch die Dicke unterscheidet (Maus etwa 8-10 µm gegenüber 18-20 µm beim Menschen), sind weitere Untersuchungen am Meerschweinchen durchgeführt worden, da sowohl die Hornhautdicke (18,6 ± 1,2 µm) als auch die Resorptionseigenschaften eher den Verhältnissen beim Menschen gleichen. Es gab aus Resorptionsversuchen auch klare Hinweise, dass das Meerschweinchen im Gegensatz zu Maus und Ratte im Hautpenetrationsverhalten dem Menschen näher kommt (Priborsky und Muhlbachova, 1990). Es war zudem wünschenswert, das starke antientzündliche Potential von PDE4-Inhibitoren an der Haut auch an einer weiteren Tierspezies zu zeigen. Zu diesem Zweck wurden Meerschweinchen intradermal mit Ovalbumin (OVA) sensibilisiert. 14 Tage nach der ersten Sensibilisierung wurde durch erneute Provokation mit OVA der Sensibilisierungsstatus erhoben. Nur sicher sensibilisierte Meerschweinchen wurden für den eine Woche später durchgeführten Hauptversuch herangezogen. Die Tiere erhielten AWD 12-281 an vier aufeinander folgenden Tagen, entweder in einer W/O-Salbenemulsion oder in DMSO-Aceton (1/9) gelöst. Fünf Tage nach der letzten Behandlung wurden die Meerschweinchen erneut intradermal mit OVA behandelt (Challenge). Rötung und Schwellung wurden nach 60 Minuten erfasst (diese Versuche fanden bei Elbion in Radebeul statt). AWD 12-281 zeigte dosisabhängig sowohl in DMSO/Aceton als auch in einer W/O-Salbenemulsion eine fast an Diflorason-Diacetat heranreichende Hemmwirkung bezüglich des OVA-induzierten Ödems und der Rötung (Publikation [4]). Der ausgeprägteste Effekt wurde mit einer 5 %igen W/O-Emulsion erreicht. Somit ist auch für eine andere Spezies und in einem proteininduzierten Allergiemodell eine deutliche antiallergische/antiinflammatorische Wirkung gezeigt worden.

Neben den bereits skizzierten In-vivo-Studien wurden auch In-vitro-Untersuchungen an kultivierten Zellen (dendritische Zellen, T-Zellen, Keratinozyten) zur näheren Charakterisierung und zum weiteren Verständnis der PDE4-inhibitorischen Wirkungen durchgeführt.

3.2 Pharmakologische Beeinflussung caniner, muriner und humaner