D
ie Anzahl der Artikel, bei denen der Begriff Microarray im Titel oder Abstract vorkommt, ist seit der ersten Publikation zur Anwendung von Microarrays zur Messung von Gen- expressionsstärke im Jahre 1995 (27) ex- ponentiell gestiegen (Grafik 1). Die Be- sonderheit der Microarray-Technik liegt in ihrer Eigenschaft, dass bis zu mehrere zehntausend Gene einer Probe gleich- zeitig auf die Stärke ihrer Expression (Genaktivität) untersucht werden kön- nen. Als Proben können biologische Materialien von Viren, Bakterien, Pflan- zen, Tieren oder Menschen verwendet werden. Microarrays sind ein Werkzeug, mit dem die Suche nach geeigneten Kandidatengenen für eine Hypothese stark beschleunigt wird. Diese Kan- didatengene können dann in weiter- führenden Untersuchungen (so genann- te „Downstream-Analysen“) überprüft werden.In Microarray-Studien ist die An- wendung und Fortentwicklung von Algorithmen und Methoden aus der
Informatik (Bioinformatik), insbeson- dere bei der Datenerfassung und der Vernetzung der Ergebnisse, sowie die Implementierung und Erweite- rung statistischer Methoden (Biome- trie) vor allem in der Auswertung un- abdingbar.
Ziele von Microarray- Untersuchungen
Obwohl die Anwendung der Microar- ray-Technologie sehr vielseitig ist, las- sen sich die Ziele der Auswertungen aus statistisch methodischer Sicht in der biomedizinischen Forschung grob in folgende drei Bereiche einteilen, wobei es im Rahmen der Analyse einer Micro- array-Studie auch zur Anwendung von Methoden aus mehreren Bereichen kommen kann:
>Untersuchung auf Unterschiede in der Expression zwischen Proben aus verschiedenen Gruppen/Populationen,
>Clusteranalyse von Genen/Proben zur Entdeckung von Gruppen oder Strukturen („unsupervised learning“),
>Klassifikation von Krankheitsen- titäten („supervised learning“).
Bei der Untersuchung auf Unter- schiede in der Expression zwischen verschiedenen Gruppen sind zwei un- terschiedliche Fragestellungen hervor- zuheben. Zum einen interessiert der Vergleich zwischen Tumorgewebe und Normalgewebe bei einem Patienten, zum anderen der Vergleich der Expres- sionsstärke im Gewebe von Patienten gegenüber gesunden Kontrollen. Ziel ist dabei die Entdeckung von geneti- schen Ursachen insbesondere für kom- plexe Krankheiten, die dann zu An- satzpunkten für (kausale) Therapien führen können (17). Auch der Ver- gleich von unbehandelten Zellkultu- ren mit solchen, die bestrahlt oder mit einem Medikament behandelt wurden, stellt ein mögliches Untersuchungsde- sign dar. Hieraus erhofft man sich eine Verbesserung oder Differenzierung für Therapien.
In der Clusteranalyse wird nach Gen- gruppen oder Subgruppen in Proben ge- sucht, die ähnliche Expressionsmuster zeigen (14, 32). Eine Anwendung ist zum Beispiel die Differenzierung neuer Tu- morsubtypen oder die Aufdeckung von Gengruppen, deren Expression zusam- menhängt (1, 24, 30).
cDNA-Microarrays –
Strategien zur Bewältigung der Datenflut
Zusammenfassung
Die Zahl von Artikeln zu Untersuchungen mit Beteiligung von Microarray-Techniken nimmt derzeit stark zu. Mit Microarrays kann die Gen- expression (Genaktivität) vieler Gene gleich- zeitig bestimmt werden. Die Genexpression entspricht dabei der Menge an mRNA, die in einer Zelle vorhanden ist; die mRNA ist ein Sur- rogat für die Genaktivität in einer Zelle. Damit können beispielsweise Unterschiede in der Expression verschiedener Gene zwischen Tu- morgewebe und Normalgewebe untersucht werden. Potenziell sind so Aussagen über den Beitrag der Gene zur Tumorentstehung mög- lich. Ein weiteres Anwendungsbeispiel ist die bessere Klassifikation von Tumoren. In diesem Artikel wird aus biometrischer Sicht darge- stellt, welche Aussagen anhand von Micro-
array-Untersuchungen derzeit getroffen wer- den können und was bei der Planung, Durch- führung, Auswertung und Interpretation der Ergebnisse beachtet werden sollte.
Schlüsselwörter: molekulare Medizin, Micro- array, Klassifikation, Krebsentstehung, multi- ples Testen
Summary
cDNA-Microarrays – Strategies for Coping Abundant Data
The number of articles in scientific literature concerning microarrays increases steadily. With microarrays gene expression levels (gene activity) can be determined for a large number of genes simultaneously. The gene expression
corresponds to the amount of mRNA present in the cell and is used as a surrogate for the de- gree of gene activity in the cell. The com- parison of differential expression between tumourous and normal tissue is an example for the application of this technique. As a result of this investigation it may be possible to determine the potential contribution of one or more genes to tumour development. Another example is the classification of tumour sub- types. This article discusses what kind of results can be achieved with microarray experiments so far and what has to be considered when planning, performing and interpreting such experiments from a biostatistician´s viewpoint.
Key words: molecular medicine, microarray, classification, development of cancer, multi- ple testing
Institut für Medizinische Biometrie, Epidemiologie und Informatik (Leiterin: Prof. Dr. rer. nat. Maria Blettner), Jo- hannes Gutenberg-Universität, Mainz
Anja Victor Stefanie J. Klug Maria Blettner
In der Klassifikation ver- schiedener Krankheitsentitä- ten liegt eine der für die Kli- nik viel versprechenden Mög- lichkeiten der Genexpressi- onsanalyse. Die Klassifikation verschiedener Tumorsubty- pen kann die Diagnose ver- bessern und damit die Wahl und den Erfolg der Therapie.
Mit Microarrays könnten gleichzeitig Tausende Gene untersucht und damit das Ver- ständnis der molekularen Un- terschiede zwischen Tumor- subtypen verbessert werden.
In einer Studie wurde bei- spielsweise nach Genexpres- sionsprofilen geforscht, die im Voraus einen Hinweis auf den
Erfolg einer Chemotherapie mit Doce- taxel bei Brustkrebspatientinnen geben könnten (9).
Eine andere Anwendung ist die Be- stimmung eines Sets von Genen, an- hand deren Expressionsprofil Patien- tinnen mit Brustkrebs in Hoch- und- Niedrig-Risikogruppen eingeteilt und entsprechend dieser Einteilung thera- piert werden könnten (35). Als Beispie- le für die Einsatzmöglichkeiten von Microarrays aus dem Bereich der Bak- terien, die aus medizinischer Sicht inter- essant sind, seien die genaue Klassifizie- rung (7, 20) und Identifikation von neu- en Bakterienstämmen genannt (4).
Beim Patienten kann eine Infektion so- mit schneller identifiziert und gezielt behandelt werden (15, 36). Clusterana- lyse und Klassifikation sind nicht immer klar trennbar. Auch bei Untersuchun- gen zur Klassifikation können Cluster- analysen als einer der Analyseschritte verwendet werden (16, 23).
Molekularbiologische Technik
Grafik 2 stellt schematisch den Ablauf eines cDNA-Microarray-Experiments dar, bei dem mRNA aus einem Tumor mit mRNA aus den Zellen einer gesun- den Kontrolle verglichen wird. DNA- Fragmente der interessierenden Gene werden mit der Polymerase-Kettenre- aktion (PCR) amplifiziert und auf der Oberfläche des Microarray-Chips, meist handelt es sich hierbei um einen
einfachen Glasobjektträger, aufgetra- gen. Die so entstandenen Spots, die je- weils unterschiedliche Genfragmente enthalten, werden anschließend fixiert.
Auch Gendoubletten, Negativ- und Po- sitivkontrollen sollten nach Möglich- keit auf einem cDNA-Microarray ent- halten sein. Microarray-Chips können gekauft oder selbst hergestellt werden.
Die zu untersuchende mRNA des in- teressierenden Ausgangsmaterials wird isoliert und mithilfe des Enzyms re- verse Transkriptase wird cDNA („com- plementary DNA“) neu synthetisiert.
Dabei werden in die neue cDNA Nu- kleotide mit fluoreszierenden Farbstof- fen inkorporiert. So werden aus ver- schiedenen Ausgangsmaterialien, hier im Beispiel von Tumor und Kontrolle (Grafik 2), verschieden fluoreszieren- de Farbstoffe eingebaut, die bei unter- schiedlicher Wellenlänge zum Beispiel rot oder grün leuchten. Die entstandene cDNA aus den zu untersuchenden Aus- gangsmaterialen wird gemischt und zur Hybridisierung auf die einzelnen Spots des Microarrays aufgetragen. Anschlie- ßend wird der Microarray gewaschen, um ungebundene cDNA zu entfernen.
Zur Quantifizierung der Genexpres- sion wird die Fluoreszenzintensität der einzelnen Spots auf dem Microarray mit einem Laser, meist ein konfokales Lasermikroskop, ermittelt (gescannt).
Hierbei wird jeweils mit den unterschied- lichen Wellenlängen gemessen, die für die Fluoreszenzreaktion der verwende- ten Farbstoffe nötig sind.
In dem Beispiel würde die cDNA, die aus der Tumor-mRNA synthetisiert wur- de, rot leuchten, wenn diese hauptsäch- lich hybridisiert wäre. Gebundene cDNA der Kontrolle würde als grüner Spot er- kennbar sein, ein gelber Spot bedeutet, dass beide cDNAs in gleicher Men- ge hybridisiert sind, wohingegen ein schwarzer Spot indiziert, dass keine der beiden cDNAs gebunden hat (Grafik 3).
Von der Farbe und der Intensität der Fluoreszenz kann die relative Expressi- onsaktivität der auf dem Microarray fi- xierten Genfragmente der beiden Pro- ben abgeschätzt werden.
Zur vertieften Darstellung der Metho- dik und zusätzlich der zugrunde liegen- den Molekularbiologie wird auf folgende Texte verwiesen (21, 28) (www.ebi.ac.uk/
microarray/biology_intro.html).
Weitere Anwendungsbereiche der Microarray-Technik, auf die nicht einge- gangen wird, umfassen Oligonukleoti- de-Microarrays (www.affymetrics.com) sowie Protein- und Antikörper-Arrays (18).
Planung und Auswertung von Microarray-Experimenten
Ziel der Planung und Auswertung aus biometrischer Sicht ist es (Grafik 4):
>bei der Planung das für die Fra- gestellung optimale Design zu wählen und die nötige Fallzahl abzuschätzen,
>die anfallenden Datenmengen zu reduzieren und systematische Fehler in den Daten zu beheben, sodass eine sinnvolle Auswertung möglich ist,
>den Vergleich zwischen den Grup- pen oder die Klassifikation oder andere statistische Verfahren der Fragestellung entsprechend auszuwählen und durch- zuführen,
>die Ergebnisse zu interpretieren und auf eventuelle Limitationen hinzu- weisen.
Design des Versuchs
Bei Verwendung von Microarrays gibt es kein standardisiertes Design. Das Vorgehen muss in Abhängigkeit von der Fragestellung auch im Hinblick auf die Durchführbarkeit und Auswer- tung ausgewählt werden (39). Eine Ergebnisse einer Literatursuche in Pubmed (Medline) mit
dem Begriff „Microarray*“ als Suchwort ab 1995 (Stand 3. 2. 2004)
Grafik 1
Möglichkeit besteht darin, pro Array jeweils nur eine Probe auszuwerten, so ergeben sich mit jedem Chip Inten- sitätswerte für eine Probe. Häufig ver- wendet werden auch komparative De- signs, bei denen zwei verschiedene Proben mit unterschiedlichen Fluo- reszenzfarbstoffen markiert und an- schließend auf demselben Chip hybri- disiert werden (Grafik 3). Man be- trachtet dann das Intensitätsverhältnis zweier Proben zueinander. Möchte man zwei Gruppen mit einem kompa- rativen Design vergleichen, gibt es die Möglichkeit eines „common referen- ce“-Designs, das heißt, alle Proben werden gegen dieselbe Kontrolle ver- glichen. Dies kann zum Beispiel eine aus allen Kontrollen gepoolte cDNA- Probe sein. Der Vergleich zwischen den zwei Gruppen erfolgt indirekt über die Quotienten jeweils zur glei- chen Kontrolle. Beim direkten Design wird je eine Probe einer Gruppe mit einer Probe der anderen Gruppe auf einem Glasobjektträger hybridisiert.
In vielen Fällen ergibt dieser direkte Vergleich eine geringere Varianz (39).
Beim paarweisen Vergleich von mehr als zwei Gruppen werden bei einer di- rekten Gegenüberstellung jedoch schnell sehr viele Vergleiche erforder- lich. Sollen mehr als zwei Gruppen verglichen werden, ist häufig ein De- sign unter Verwendung indirekter Ver- gleiche von der Durchführbarkeit her zu empfehlen. Die Art der Vergleiche, sowie die Anzahl und Art der Replika- tionen sollte vor Beginn des Experi- ments in Absprache mit einem Biome- triker festgelegt werden (19, 39).
In diesem Artikel beziehen sich die Autorinnen in der Regel auf die kom- parative Form der Microarray-Versu- che.
Datenvorbereitung und Bioinformatik
Bei der Auswertung der Ergebnisse von Microarray-Versuchen ergeben sich zahlreiche Probleme, mit deren Lösung sich die Bioinformatik und die Biometrie beschäftigt. Es werden enor- me Datenmassen generiert, für die geeignete Speicherungs- und Darstel- lungsmöglichkeiten gefunden werden
müssen. Die bunt leuchtenden Micro- arrays müssen in Intensitätswerte (Zah- len) umgewandelt und hieraus müssen Aussagen gewonnen werden.
Schon die Bildanalyse ist ein um- fangreiches Aufgabenfeld für die In- formatik. Die sich ergebenden Fluo- reszenzen müssen gemessen und zu Intensitäten verarbeitet werden. Die Entscheidung, was Hintergrundhellig- keit und was Intensität der Probe ist, wird von verschiedener Scannersoft- ware unterschiedlich gehandhabt. Aus den vielen Bildpunkten je Spot muss eine zusammenfassende Maßzahl der Helligkeitspixel gebildet werden. In der Regel wird der Mittelwert aller dem Hintergrund zugeordneten Pixel und aller der Probe zugeordneten Pi- xel gebildet. Anschließend wird für den Intensitätswert der Hintergrund- mittelwert vom Probenmittelwert ab- gezogen. Um annähernd normal ver- teilte Werte zu erhalten, wird zumeist mit logarithmierten Intensitäten gear-
beitet. Bei komparativen Experimen- ten, bei denen die Proben mit unter- schiedlichen Farbstoffen (zum Bei- spiel Cy5 und Cy3, rot und grün) mar- kiert wurden, wird die Differenz die- ser zwei logarithmierten Werte gebil- det, das logRatio (hierbei stehen Cy5 und Cy3 für den Intensitätswert von Cy5 beziehungsweise Cy3). Dieser Wert wird für die weitere Analyse ver- wendet.
Fehlerquellen und Normalisierung
Experimente mit Microarrays ent- halten zahlreiche potenzielle Fehler- quellen. Bereits die Präparation der zellulären mRNA ist ein kritischer Schritt der Untersuchung, da diese zum Beispiel degradieren kann, oder Fehler beim Markieren der mRNA mit den fluoreszierenden Nukleotiden auftreten können (21). Dadurch könn- Herstellung eines cDNA-Microarrays (modifiziert nach [13] mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group, www.nature.com/ng).
Grafik 2
te es sein, dass das Versuchsergebnis nicht die In-vivo-Situation widerspie- gelt. Weitere Fehlerquellen können bei der Herstellung des Chips im eige- nen Labor, der Hybridisierung oder beim Scannen des Arrays auftreten.
Vor der Datenprozessierung und Auswertung muss eine gründliche Un- tersuchung auf mögliche Fehler oder systematische Einflüsse beim Ver- suchsablauf erfolgen (33). Fehlerhafte Ergebnisse müssen von der Analyse ausgeschlossen werden, systematische Fehler, die ein Ergebnis ver-
zerren können, versucht man mit der Normalisierung zu korrigieren. Normalisierung könnte man auch mit dem Begriff Skalierung umschrei- ben. Die erhaltenen Inten- sitäten sind keine absoluten Werte, die für dieselben Pro- ben bei jedem Versuch gleich sind. Vielmehr ist die Höhe der Intensität von zahlrei- chen äußeren Faktoren des Versuchs abhängig. Eine Möglichkeit der Normalisie- rung besteht darin, auf dem Array Gene, die für ständig benötigte Gene in der Zelle kodieren (Housekeeping- Gene), mitzuhybridisieren, die dann als Nullkontrolle dienen. Nach Beendigung des Versuchs wird die mittle- re Intensität dieser Nullkon-
trollen ermittelt und von allen ande- ren Werten subtrahiert (3, 29). Die Verwendung von Housekeeping-Ge- nen weist einige Probleme auf. So ist nicht immer sicher, dass es sich bei den verwendeten Genabschnitten wirklich um Nullkontrollen handelt. Außerdem ist ihre Zahl in Relation zur Gesamt- heit der Gene auf dem Array meist zu klein. Dadurch kann es zu einer fehler- haften Skalierung kommen. Eine Al- ternative besteht darin, die Intensitä- ten aller Gene zur Normalisierung zu nutzen. Dabei wird davon ausgegan- gen, dass die meisten Gene für die Fra- gestellung nicht wichtig sind. Bei die- sem Ansatz wird die mittlere oder me- diane Intensität aller Gene von jedem einzelnen Wert subtrahiert. Eine fei- nere Anpassung, die die Möglichkeit, dass die Einflüsse unterschiedlich für
verschiedene Intensitätshöhen sind, berücksichtigt, ist die Verwendung ro- buster lokaler Regression (38). Da nicht immer davon ausgegangen wer- den kann, dass die Mehrheit der Gene auf dem Array keine differenzielle Ex- pression zeigt, gibt es weitere Vor- schläge zur Wahl der zur Normalisie- rung herangezogenen Kontrollen. Bei- spielsweise kann die Auswahl einer Untermenge aller Gene, „rank invari- ant selection“ (26), hierfür verwen- det werden. Eine weitere Möglichkeit
bietet die Zugabe künstlicher Trans- kripte, deren Verhalten definiert ist.
Erst die entsprechend vorbereiteten (logarithmierten Quotienten der) In- tensitätswerte verwendet man schließ- lich als „wahres“ Signal in der statisti- schen Auswertung. Im Folgenden wer- den mit „fold change“ diese qualitäts- kontrollierten, normalisierten Quoti- enten bezeichnet.
Wie die Ausführungen zeigen, exi- stiert für die Datenvorbereitung der Microarray-Technik noch kein ausge- reiftes, standardisiertes Vorgehen. Für fast jeden Analyseschritt gibt es ver- schiedene Vorgehensmöglichkeiten.
Es ist daher schwierig, die Qualität der Ergebnisse zu beurteilen und Resulta- te verschiedener Studien miteinander zu vergleichen. Um dieses Problem anzugehen, wurde eine Arbeitsgruppe
„Microarray Gene Expression Data Society“ (mged) gegründet. Diese Ar- beitsgruppe hat einen Leitfaden „mini- mum information about a microarray experiment“ (MIAME) herausgege- ben, der bei Veröffentlichungen eine Beurteilung der Qualität ermöglichen soll (6). Zeitschriften wie Nature, Cell und Lancet haben angekündigt, diese Standards einzuhalten.
Das EBI (European Bioinformatics Institute) hat ebenso wie das NCBI (National Center for Biotechnology Information) eine Datenbank, in der Daten aus Microarray-Experimenten gespeichert sind, (ähnlich der EMBL- Datenbank für DNA-Sequenzdaten) eingerichtet. Diese Datenbanken hei- ßen ArrayExpress (www.ebi.ac.uk/
arrayexpress) und Gene Expression Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).
Statistische Auswertung
Die Herausforderung in der statisti- schen Analyse besteht in der hohen Zahl von Genabschnitten mit gemes- sener Expression im Vergleich zur meist geringen Anzahl untersuchter Proben, das heißt, es werden viele Merkmale, aber nur wenige Beobach- tungseinheiten erhoben.
Beim Vergleich von Gruppen (bei- spielsweise zwischen Tumor- und Nor- malgewebe) bezüglich der Genexpres- sionsstärke wird häufig nur die Größe der „fold change“ betrachtet (ein Wert von zum Beispiel > 3 wird dabei als re- levant bezeichnet). Eine Entscheidung anhand dieses Kriteriums ist häufig fehlerhaft, weil dabei nicht beachtet wird, dass es mit höheren Intensitäts- werten auch zu höheren Varianzen kommt.
Stattdessen ist die Verwendung sta- tistischer Tests auf Unterschiede (zum Beispiel t-Test), besonders wenn mehr als eine explorative Aussage er- wünscht ist, notwendig. Jedoch kann es aufgrund der vielen untersuchten Abschnitte und der somit hohen Zahl durchgeführter Tests zu vielen falsch- positiven (fälschlich signifikanten) Er- gebnissen kommen. Eine Beachtung dieses Problems (multiples Testen) ist notwendig (11, 12). Man kann sich dafür entscheiden, die Wahrscheinlich- cDNA-Microarrays, das Bild wurde freundlicherweise von
Dr. Susanne Kneitz, Interdisziplinäres Zentrum für klini- sche Forschung, Würzburg, zur Verfügung gestellt.
Grafik 3
keit, mindestens ein falschpo- sitives Ereignis zu erhalten, zu kontrollieren („familywise er- ror rate“, FWER). Hier wur- den Verfahren von Westfall und Young entwickelt (37), die auf die Microarray-Analy- se übertragbar sind (12).
Die Kontrolle der FWER ist ein sehr striktes Fehler- kriterium und mit dem Nach- teil einer geringen Power, wahre Unterschiede zu ent- decken, behaftet. Eine weni- ger strikte Definition zugun- sten einer höheren Power ist in vielen Studien wünschens- wert, weil es sich bei Micro- array-Studien in erster Linie um explorative Studien han- delt, deren Ergebnisse in wei- teren Analysen überprüft werden. Deshalb bietet sich die Kontrolle der „false dis- covery rate“ (FDR) an (5, 11, 34). Die FDR ist der erwartete Anteil fälschlich abgelehnter Hypothesen an allen abgelehnten Hypothe- sen (Tabelle) (5). Ihre Kon- trolle hat den Vorteil einer in den meisten Situationen hö- heren Power, jedoch können mehr falschpositive Ergebnis- se auftreten.
Die Clusteranalyse dient dazu, große Mengen an In- formation zusammenzufassen und kondensiert zu präsen- tieren. Es wird versucht, zu- vor unbekannte Gruppen von Genen anhand ähnlicher Ex- pressionsstärke oder Grup-
pen von Proben anhand ähnlicher Expressionsprofile zusammenzufassen (zu „clustern“). Man kann sich das ver- einfacht als Unterscheidung von Punkt- wolken vorstellen. Bei der Clusterana- lyse handelt es sich vor allem um ein Verfahren zur Deskription, statistische Testverfahren werden hier in einem an- deren Sinn angewandt.
Die explorative Natur dieses Verfah- rens zeigt sich auch dadurch, dass die Ergebnisse (Cluster) stark von den gewählten Eigenschaften der Cluster- Analyse abhängen. So ist die Wahl des Abstandsmaßes (was ist „ähnlich“)
oder die Wahl des Clusterverfahrens ausschlaggebend für die resultierende Gruppierung (Cluster). Beim hierarchi- schen Clustering zum Beispiel werden zunächst die zwei nächsten Elemente zu einem Cluster zusammengefasst, an- schließend wird dieser Cluster wieder mit anderen Elementen oder Clustern weiter zusammengefasst, sodass ein ge- schachteltes System von Clustern ent- steht. Demgegenüber wird die Anzahl der Cluster beim k-means-Verfahren vorher festgelegt, anschließend werden die Gene/Proben „optimal“ zugeteilt.
Eine Zusammenstellung von Cluster-
verfahren für Microarray-Anwendun- gen bietet Quackenbush (25).
Alle genannten Analysen können auch als Vorstufen für die Klassifika- tion verwendet werden. Klassifikation ist die Zuordnung von Proben zu bekannten Gruppen anhand ihrer Expressionsprofile. Man versucht da- bei, eine minimale Gruppe von Genen zu identifizieren, anhand derer man bekannte Populationen mit ausrei- chender Sicherheit unterscheiden kann.
Eine Zusammenstellung und einen Vergleich der in diesem Zusammen- hang gebräuchlichen statistischen Verfahren wie Diskriminanzanalyse,
„nearest neighbor classifiers“, „classi- fication and regression trees“, sowie
„bagging and boosting“ sind bei Du- doit, Fridlyand und Speed (10) zu finden. Ein weiteres statistisches Ver- fahren, das in diesem Zusammenhang verwendet werden kann, sind „support vector machines“ (8).
Neben der Auswertung sollte auch die Vorbereitung der Daten für die endgültige Analyse von einem Biome- triker vorgenommen werden. Heute werden viele Programmpakete ange- boten, die diese Vorbereitungsschritte wie zum Teil auch schon die Analyse- schritte nach Aussagen der Hersteller implementiert haben. Hierbei handelt es sich aber oftmals um eine Black- box deren Dokumentation und vor allem deren Anpassbarkeit an die Situation der Daten häufig unzurei- chend ist. Die Autorinnen raten da- her davon ab, solche Programme unkritisch zu verwenden. Man sollte alle Schritte von den Rohdaten bis zur Aussage unter wissenschaftlicher Betreuung durch einen Biometriker durchführen, der auch schon in die Planung vor Beginn des Versuchs ein- gebunden sein sollte.
Für das frei verfügbare Statistiksoft- ware-Paket R (ähnlich S-Plus, www.
cran.r-project.org) hat eine Gruppe von Biometrikern eine Plattform ein- gerichtet, die kostenfrei zugängliche Programme mit Dokumentation zur Datenvorbereitung und Auswertung von Microarray-Daten zur Verfügung stellt (www.bioconductor.org).
Zum erweiterten Studium sei auf entsprechende Bücher (2, 22, 31) ver- wiesen.
Schema des Ablaufs einer Studie mit selbst erstelltem Microarray (gelb: Beteiligung Bioinformatiker, rot: Be- teiligung Biometriker, orange: Beteiligung von Biometri- ker und Bioinformatiker)
Grafik 4
Fazit
Microarrays lassen die gleichzeitige Un- tersuchung der Expression zahlreicher Genabschnitte zu. Hierdurch wird das molekulare Verständnis von Krankheiten verbessert und ermöglicht, Therapieop- tionen zu finden oder zu optimieren. Mit der Generierung vieler Ergebnisse steigt allerdings gleichzeitig das Risiko vieler falschpositiver Resultate.Außerdem han- delt es sich bei Messung der mRNA nur um einen Surrogatparameter für die Ak- tivität eines Gens. Ferner ist aufgrund der verwendeten Technik eine hohe Fehler- anfälligkeit gegeben; dies muss bei der Auswertung adäquat berücksichtigt wer- den. Microarray-Studien haben somit noch explorativen Charakter; zur Verifi- zierung ihrer Ergebnisse sollten Bestäti- gungsversuche mit anderen Methoden wie zum Beispiel mittels „real time“-PCR durchgeführt werden. Derzeit gibt es noch keine einheitlich verwendeten Stan- dards, anhand derer die Ergebnisse von Microarray-Studien beurteilt werden können. Die Microarray-Methode besitzt jedoch ein enormes Entwicklungspoten- zial, das in der Erforschung von Ursachen und Therapien komplexer Krankheiten zu Erfolgen führen kann.
Die Autorinnen erklären, dass kein Interessenkonflikt im Sinne der Richtlinien des International Committee of Me- dical Journal Editors besteht.
Manuskript eingereicht: 1. 3. 2004, revidierte Fassung angenommen: 13. 7. 2004
❚Zitierweise dieses Beitrags:
Dtsch Arztebl 2005; 102: A 355–360 [Heft 6]
Veranschaulichung der „false discovery rate“ nach (5)
nicht abgelehnte abgelehnte Summe
Hypothesen Hypothesen
wahre Hypothesen T V M0
falsche Hypothesen U S M1
Summe M-R R M
Die jeweilige Hypothese lautete: „Es besteht kein Unterschied“.
R sind alle aufgrund des statistischen Tests abgelehnten Hypothesen.
V ist die Anzahl der fälschlich abgelehnten Hypothesen, der Fälle, in denen in Wahrheit kein Unterschied besteht, aber aufgrund des Tests fälschlich ein Unterschied postuliert wird.
V/R ist somit der Anteil der fälschlich abgelehnten Hypothesen an allen abgelehnten Hypothesen.
Berichtigung
In dem Beitrag „Spätinterruptio und Fetozid – das Kieler Modell“
von Kaisenberg und Koautoren in Heft 3 vom 21. Januar 2005 ist auf Seite A 135 ein Fehler aufgetre- ten. Statt „1. Avitaler Fetus, Totge- burt mit einem Gewicht von mehr als 500 g: Es wird kein Totenschein ausgestellt [. . .]“ muss es richtig lauten: 1.Avitaler Fetus,Totgeburt mit einem Gewicht von weniger als 500 g: Es wird kein Totenschein ausgestellt [. . .].“
AUSGEWÄHLT UND KOMMENTIERT VON H. SCHOTT AUSGEWÄHLT UND KOMMENTIERT VON H. SCHOTT
MEDIZINGESCHICHTE(N))
Homöopathie Simile-Prinzip
Zitat: „Jedes wirksame Arzneimittel erregt im menschlichen Körper eine Art von eigner Krankheit, eine desto eigenthümlichere, ausgezeichnetere und heftigere Krankheit, je wirksamer die Arznei ist. Man ahme der Natur nach, welche zuweilen eine chronische Krankheit durch eine andre hinzu- kommende heilt, und wende in der zu heilenden (vorzüglich chronischen) Krankheit dasjenige Arzneimittel an, welches eine andre, möglichst ähnli- che, künstliche Krankheit zu erregen im Stande ist, und jene wird geheilt werden; Simila similibus.“
Samuel Hahnemann: Versuch über ein neues Princip zur Auffindung der Heilkräfte der Arzneisubstanzen, nebst einigen Blicken auf die bisherigen. (Erstveröffentli- chung in Hufelands Journal der praktischen Arzneikun- de, 2. Band, 3. Stück, 1796.) Aus: Der sympathetische Arzt.Texte zur Medizin im 18. Jahrhundert. Herausgege- ben von Heinz Schott. München 1998, Seite 248. – Hah- nemann (1755–1843) formulierte an dieser Stelle zum ersten Mal den Grundsatz der Homöopathie, die er spä- ter mit seinem Hauptwerk „Organon der rationellen Heilkunde“ (1810) begründete, nämlich das Ähnlichkeits- prinzip: Similia similibus curentur (Ähnliches möge durch Ähnliches geheilt werden).
Pest
Biblischer Bericht
Zitat:„Aber die Hand des Herrn lag schwer auf den Leuten von Asdod und verstörte sie und schlug sie mit Beulen [òphâlîm], Asdod und sein Gebiet. [...]
Da schaffte man die Lade des Gottes Israels dorthin [nach Gath]. Als man sie aber hingeschafft hatte, da brachte die Hand des Herrn über die Stadt ei- ne sehr grosse Bestürzung; er schlug die Leute der Stadt vom Kleinsten bis zum Größten, sodass an ihnen Beulen ausbrachen.
[...] Da sandten sie die Lade nach Ekron.Als aber die Lade Gottes nach Ekron kam, schrien die Leute von Ekron: [...] Schicket die Lade des Gottes Israels wieder fort, dass sie heimkehre und nicht uns und unser Volk töte!“
„Pest der Philister“, 1060 v. Chr. (1. Sam 5, 6ff.). Aus:
Zürcher Bibel, Zürich 1955, Seite 306 f. – Vermutlich handelte es sich um die Beulenpest. Schon den Göt- tern in Ägypten und Babylonien wurde die Aussen- dung von Seuchen (zur Bestrafung der Menschen) unterstellt, aber auch die Macht, diese zu heilen.
Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf das Literatur- verzeichnis, das beim Verfasser erhältlich oder im Internet unter www.aerzteblatt.de/lit0605 abrufbar ist.
Anschrift für die Verfasserinnen:
Prof. Dr. rer. nat. Maria Blettner
Institut für Medizinische Biometrie, Epidemiologie und Informatik
Klinikum der Universität Mainz Obere Zahlbacher Straße 69, 55131 Mainz E-Mail: blettner@imbei.uni-mainz.de
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Literaturverzeichnis Heft 6/2005:
cDNA-Microarrays –
Strategien zur Bewältigung der Datenflut
Anja Victor Stefanie J. Klug Maria Blettner
