Der Einfluss von Vitamin D 3 auf endotheliale Reparaturprozesse im Zusammenhang mit der Präeklampsie

Aus der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe der Medizinischen Hochschule Hannover

Der Einfluss von Vitamin D₃ auf endotheliale Reparaturprozesse im Zusammenhang mit der

Präeklampsie

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

Vorgelegt von Sarah Haß aus Kiel

Hannover 2013

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 09.10.2014.

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover.

Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum Betreuerin der Arbeit: PD Dr. med. Frauke von Versen-Höynck Referent : Prof. Dr. med. Daniel Sedding

Korreferent: Prof. Dr. med. Florian Limbourg

Tag der mündlichen Prüfung: 09.10.2014

Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. med. Hermann Haller Prof. Dr.med. vet. Klaus Otto Prof. Dr. med. Martin Sauer

Abkürzungsverzeichnis

ACE = Angiotensin-konvertierendes Enzym AP-1 = Transkriptionsfaktor-Aktivator-Protein 1 ASS = Acetylsalicylsäure

bFGF = elementarer Fibroblasten-Wachstumsfaktor BMI = Körper-Masse-Index

CAMP = Cathelicidin antimikrobielles Peptid CD = Cluster der Differenzierung

cDNA = komplementäre Desoxribonukleinsäure CO = Kohlenmonoxid

CO₂ = Kohlendioxid

CSF = Kolonie-stimulierender Faktor Ct = Schwellenwert-Zyklus

CTG = Kardiotokographie

DEPC = Diethylpyrocarbonat

DGGG = Deutsche Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe DMSO = Dimethylsulfoxid

DNA = Desoxribonukleinsäure

dNTP = Desoxyribonukleosidtriphosphat

ECs = Endothelzellen

ECFCs = endotheliale Kolonie-formierende Zellen

EDHF = Endothel-abhängiger hyperpolarisierender Faktor EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure

EGF = epidermaler Wachstumsfaktor EGM = Endothelzell-Wachstumsmedium

eNOS = endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase EtOH = Ethanol

FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung FGF = Fibroblasten Wachstumsfaktor FITC = Fluoresceinisothiocyanat FKS = fetales Kälberserum Flk-1 = fetale Leber-Kinase 1 FSC = Vorwärtsstreulicht

GOT = Glutamat-Oxalacetat-Transaminase GPT = Glutamat-Pyruvat-Transaminase GTC = Guanidinisothiocyanat

hCG = humanes Choriongonadotropin

HELLP = Hämolyse, Erhöhung der Leberenzyme, Thrombozytopenie HIF=Hypoxie-induzierter Faktor

HMEC-1 = humane mikrovaskuläre Endothelzellen hPL = humanes plazentares Laktogen

hPMVEC=humane pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen HUVECs = humane endotheliale venöse Endothelzellen

IE = internationale Einheit IFN = Interferon

IGF-1= Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 1

IgG = Immunglobulin der Klasse G IL = Interleukin

ISSHP = Internationale Gesellschaft für Hypertension in der Schwangerschaft IUGR = intrauterine Wachstumsrestriktion

JNK = c-Jun N-terminale Kinase KDR = Kinasedomäne-Rezeptor

LDH = Laktatdehydrogenase

MAP-Kinase = mitogenaktivierte Proteinkinase MHH = Medizinische Hochschule Hannover MMPs = Matrix-Metalloproteasen

mRNA = Boten-Ribonukleinsäure

NAD = Nikotinamidadenindinukleotid

NADH = Nikotinamidadenindinukleotid, reduzierte Form NO = Stickstoffmonoxid

NRP-1 = Neuropilin 1 NRP-2 = Neuropilin 2 NS = Nabelschnur

O₂ = Sauerstoff OD = optische Dichte

PA SMC = glatte Muskelzelle aus der Pulmonalarterie PBS = Phosphat-gepufferte Salzlösung

PCR = Polymerase-Kettenreaktion

PDGF = Thrombozyten-abhängiger Wachstumsfaktor PE = Präeklampsie

PFA = Paraformaldehyd PGE2 = Prostaglandin E2 PGL=Prostaglandin

pH= Stärke des Wasserstoffs (in der lateinischen Sprache: potentia hydrogenii) PlGF = plazentaler Wachstumsfaktor

PMA = Phorbolmyristylacetat Primer R = Primer rückwärts Primer V = Primer vorwärts PTH = Parathormon

R = Rezeptor

RNA = Ribonukleinsäure RNase = Ribonuklease RPE = R-Phycoerythrin

rRNA = ribosomale Ribonukleinsäure RT = Reverse Transkription

RT-PCR = Echtzeit Polymerase-Kettenreaktion

sEng = lösliches Endoglin

sFlt1 = lösliche fms-ähnliche Tyrosinkinase 1 sRNA = lösliche Ribonukleinsäure

SSC = Seitwärtsstreulicht SSW = Schwangerschaftswoche

TBE = Tris, Borsäure, EDTA

TGF = transformierender Wachstumsfaktor Th1-Zellen = T-Helferzellen vom Typ 1 Th2-Zellen = T-Helferzellen vom Typ 2

TIMPs = Gewebeinhibitoren der Matrix-Metalloproteasen TNFα= Tumornekrosefaktor α

UtMVEC = uterine mikrovaskuläre Endothelzellen UV = ultraviolett

VDR = Vitamin D Rezeptor

VEGF = vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor VSMCs = vaskuläre glatte Muskelzellen

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Einleitung

 Aufbau und Funktion der Plazenta Seite 4-5

2. Präeklampsie

 Defintion und Symptomatik Seite 5-6

 Epidemiologie Seite 6-7

 Ätiologie Seite 7-9

 Prävention und Therapie Seite 10-11

3. Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF)

 Gliederung, Wirkmechanismus und Wirkung Seite 11-12

 VEGF und die Pathogenese von Erkrankungen Seite 12-14 4. Endothelzellen (ECs)

 Differenzierung und Aufgaben der ECs Seite 14-15 5. Vitamin D

 Vitamin D Stoffwechsel Seite 16

 Wirkung und Funktion von Vitamin D Seite 16-18

 Vitamin D in physiologischer und präeklamptischer Seite 18-20 Schwangerschaft

6. Fragestellung Seite 21

Material und Methoden

1. Chemikalien und Materialien Seite 22-24

2. Geräte Seite 25

3. Software Seite 26

4. Auswahl der Probandinnen Seite 26-27

5. Materialgewinnung

 Einwilligung Seite 28

 Messungen der 25(OH) Vitamin D Serumkonzentrationen Seite 28-29

 Isolation der humanen umbilikalen venösen

Endothelzellen (HUVECs) Seite 29-30

6. Zellkultur Seite 31-32

7. Mykoplasmentest Seite 33

8. Charakterisierung der HUVECs mittels Durchflusszytometrie Seite 33-34

9. Matrigel-Angiogenese-Assay Seite 34-36

10. Proliferationsversuch Seite 36-37

11. Migrationsversuch Seite 37-38

12. Laktatdehydrogenase (LDH)-Assay Seite 39

13. Ribonukleinsäure (RNA)-Isolation Seite 40

14. RNA-Konzentrationsmessung Seite 41-42

15. komplementäre Desoxyribonukleinsäure (cDNA)-Synthese Seite 42-43 16. Echtzeit Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Quantifizierung

der VEGF-Genexpression Seite 43-45

17. Statistische Auswertung Seite 46

Ergebnisse

 Vergleich der in vitro Angiogenese von HUVECs aus

gesunden und präeklamptischen Schwangerschaften Seite 52-54

 In vitro Angiogenese von HUVECs aus gesunden Schwangerschaften unter 1,25(OH)₂ Vitamin D₃

Behandlung Seite 55-56

 In vitro Angiogenese von HUVECs aus präeklamptischen Schwangerschaften unter 1,25(OH)₂ Vitamin D₃

Behandlung Seite 57-58

4. Proliferationsversuch

 Vergleich der Proliferation von HUVECs aus gesunden und

präeklamptischen Schwangerschaften Seite 59-61

 Proliferation von HUVECs aus gesunden Schwangerschaften

unter 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Behandlung Seite 61-63

 Proliferation von HUVECs aus präeklamptischen

Schwangerschaften unter 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Behandlung Seite 63-65

5. Migrationsversuch

 Vergleich der Migration von HUVECs aus gesunden und

präeklamptischen Schwangerschaften Seite 66-68

 Migration von HUVECs aus gesunden Schwangerschaften

unter 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Behandlung Seite 68-71

 Migration von HUVECs aus präeklamptischen

Schwangerschaften unter 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Behandlung Seite 72-74

6. LDH-Assay Seite 74-75

7. RT-PCR zur Quantifizierung der VEGF-Genexpression

 Vergleich der VEGF-Genexpression der HUVECs aus

gesunden und präeklamptischen Schwangerschaften Seite 76-77

 VEGF-Genexpression von HUVECs aus gesunden Schwangerschaften unter 1,25(OH)₂ Vitamin D₃

Behandlung Seite 77-78

 VEGF-Genexpression von HUVECs aus präeklamptischen Schwangerschaften unter 1,25(OH)₂ Vitamin D₃

Behandlung Seite 78-79

Diskussion

1. Hintergrund der Arbeit Seite 80

2. Messungen der 25(OH) Vitamin D Serumkonzentrationen Seite 81

3. Reinheit der Zellen Seite 82

4. In vitro Angiogenese Seite 82-84

5. Proliferation Seite 84-86

6. Migration Seite 86-88

7. VEGF-Genexpression Seite 88-89

8. PE vs. Hypoxie Seite 89-91

9. Unterschiedliche Wirkung von Vitamin D auf die

angiogenetischen Eigenschaften von ECs, abhängig vom Differenzierungsgrad, der Abstammung und der Lokalisation

der ECs Seite 91-95

Zusammenfassung und Ausblick

Referenzen

Lebenslauf

Erklärung nach §2 Abs. 2 Nr. 6 und 7 PromO

Danksagung

1

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 Aufbau einer Plazenta Seite 5

Abbildung 2 Morphologische Veränderungen der Spiralarterien in physiologischer und präeklamptischer Schwangerschaft

Seite 8

Abbildung 3 Auswirkung einer VEGF-A- und VEGF-Rezeptor-Insuffizienz auf die Angiogenese und Vaskulogenese

Seite 13

Abbildung 4 Querschnitt einer Nabelschnur Seite 29

Abbildung 5 Präparierte Nabelschnur während der Inkubation Seite 30

Abbildung 6 HUVECs Tag 1 nach der Isolation Seite 32

Abbildung 7 HUVECs Tag 5 nach der Isolation Seite 32

Abbildung 8 Tubulibildung im Matrigel-Angiogenese-Assay Seite 36 Abbildung 9 Migration der HUVECs im Scratch-Wound-Assay Seite 38 Abbildung 10

Abbildung 11

RNA-Auftrennung im Agarosegel 25 (OH) Vitamin D Messung

Seite 42 Seite 48 Abbildung 12 Detektion des FSC und SSC einer gesunden Kontroll-Patientin

mittels Durchflusszytometrie

Seite 50

Abbildung 13 CD 90- und CD 31-Detektion von HUVECs einer gesunden Kontroll-Patientin

Seite 51

Abbildung 14 In vitro Angiogenese gesund (n=10) vs. PE (n=8) Seite 53 Abbildung 15 In vitro Angiogenese einer gesunden Kontroll-Patientin vs.

einer PE-Patientin

Seite 54

Abbildung 16 In vitro Angiogenese gesunde Patientinnen (n=10) Seite 55 Abbildung 17 In vitro Angiogenese einer gesunden Kontroll-Patientin Seite 56 Abbildung 18 In vitro Angiogenese Präeklampsie-Patientinnen (n=8) Seite 57 Abbildung 19 In vitro Angiogenese einer PE-Patientin Seite 58 Abbildung 20 Proliferation gesund (n=8) vs. PE (n=8) während drei

Behandlungstagen

Seite 60

Abbildung 21 Proliferation gesund (n=8) vs. PE (n=8) insgesamt Seite 61

2

Abbildung 22 Proliferation gesunde Patientinnen (n=8) während drei Behandlungstagen

Seite 62

Abbildung 23 Proliferation gesunde Patientinnen (n=8) insgesamt Seite 63 Abbildung 24 Proliferation Präeklampsie-Patientinnen (n=8) während drei

Behandlungstagen

Seite 64

Abbildung 25 Proliferation Präeklampsie-Patientinnen (n=8) insgesamt Seite 65 Abbildung 26 Migration gesund (n=11) vs. PE (n=8) Seite 66 Abbildung 27 Migrationsversuch von HUVECs einer gesunden Patientin vs.

einer Präeklampsie-Patientin

Seite 67-68

Abbildung 28 Migration gesunde Patientinnen (n=11) Seite 69 Abbildung 29 Migrationsversuch von HUVECs einer gesunden Patientin Seite 70-71 Abbildung 30 Migration Präeklampsie-Patientinnen (n=8) Seite 72 Abbildung 31 Migrationsversuch von HUVECs einer Präeklampsie-Patientin Seite 73-74

Abbildung 32 Laktatdehydrogenase-Assay (n=3) Seite 75

Abbildung 33 VEGF-Genexpression gesund (n=6) vs. PE (n=8) Seite 77 Abbildung 34 VEGF-Genexpression gesunde Patientinnen (n=6) Seite 78 Abbildung 35 VEGF-Genexpression Präeklampsie-Patientinnen (n=6) Seite 79

3

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Verwendete Chemikalien und Materialien Teil 1 Seite 22 Tabelle 2 Verwendete Chemikalien und Materialien Teil 2 Seite 23 Tabelle 3 Verwendete Chemikalien und Materialien Teil 3 Seite 24

Tabelle 4 Verwendete Geräte Seite 25

Tabelle 5 Verwendete Software Seite 26

Tabelle 6 Schwangerschaftsbefunde und Laborbefunde der Studien- Probandinnen

Seite 27

Tabelle 7 Pipettierschema: RT-PCR Master Mix Seite 43

Tabelle 8 Pipettierschema: cDNA Master Mix Seite 44

Einleitung

4

1. Einleitung

1.1 Plazenta

1.1.1 Aufbau und Funktion der Plazenta

Die Plazenta besteht aus einem mütterlichen und einem fetalen Anteil. Der mütterliche Anteil wird durch die Deziduaplatte und der fetale Anteil von der Chorionplatte begrenzt. Zwischen diesen beiden Platten befinden sich die intervillösen Räume. Die intervillösen Räume werden über 80-100 Spiralarterien mit sauerstoffreichem maternalen Blut gefüllt. Über zwei Nabelarterien wird das sauerstoffarme Blut des Feten in Zotten in die intervillösen Räumen transportiert, wo das fetale Blut durch Diffusion mit Sauerstoff (O₂) angereichert und von Kohlendioxid (CO₂) und Kohlenmonoxid (CO) gereinigt wird. Über die Nabelvene fließt das sauerstoffreiche Blut zum Feten zurück.

Das mütterliche Blut aus den intervillösen Räumen kehrt über venöse Öffnungen in der Deziduaplatte in den maternalen Kreislauf zurück.

Auf diese Weise wird der Austausch von Gasen und Stoffwechselprodukten, eine der bedeutendsten Funktionen der Plazenta, gewährleistet ¹.

Die menschliche Plazenta ist reich an angiogenetischen Substanzen, welche eine wichtige Rolle bei der Regulation der plazentaren Gefäßbildung spielen. Angiogenetische Prozesse werden durch Wachstumsfaktoren (elementarer Fibroblasten-Wachstumsfaktor [bFGF], vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor [VEGF], plazentaler Wachstumsfaktor [PlGF] und dem Tumornekrose Faktor α [TNF α]) initiiert ², welche die Gefäßpermeabilität steigern, die Proteolyse der extrazellulären Matrix stimulieren und die Proliferation der Endothelzellen (ECs) fördern. Weitere Regulatoren der Angiogenese sind andere Zytokine, Hormone, Hypoxie, Hypoglykämie, Scherstress, Komponenten der extrazellulären Matrix (Laminin, Fibronektin, Integrine), Matrix-Metalloproteasen [MMPs] sowie andere Proteasen, Fibrin und inflamatorische Zellen ³.

Einleitung

5

Aufbau einer Plazenta

Abbildung 1: Dargestellt ist der Querschnitt durch eine Plazenta ⁴. Die Beschriftung wurde modifiziert.

1.2 Präeklampsie (PE)

1.2.1 Definition und Symptomatik der PE

Die PE ist eine schwangerschaftspezifische Erkrankung und wird nach den Leitlinien der Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe (DGGG) und in Anlehnung an die Kriterien der Internationalen Gesellschaft für Hypertension in der Schwangerschaft (ISSHP) definiert als neu aufgetretene Hypertonie mit Blutdruckwerten ≥ 140/90 mmHg und einer Proteinurie ≥ 300 mg im 24 h-Urin nach der abgeschlossenen 20. Schwangerschaftswoche (SSW). Eine Proteinurie muss allerdings zur Diagnosestellung „PE“ nicht zwingend vorhanden sein. Es kann alternativ neben dem Hypertonus auch eines der folgenden Symptome auftreten:fetale Wachstumsrestriktion, Beteiligung der Leber- oder Nierenfunktion, neurologische Symptome oder hämatologische Störungen ^5,6.

Einleitung

6

Eine generalisierte endotheliale Dysfunktion im mütterlichen Kreislauf ist die Ursache für die umfassende klinische Symptomatik. Als Marker für die endotheliale Dysfunktion zeigt sich u.a. eine 5- 6 fach erhöhte Konzentration an zirkulierenden ECs, welche mit dem Ausmaß des Endothelschadens korreliert ⁷.

Die Hypertension wird über einen gesteigerten Sympathikotonus ⁸, Veränderungen in der Produktion von VEGF ⁹ und seinem löslichen Rezeptor, der löslichen fms-ähnlichen Tyrosinkinase 1 (sFlt1) ¹⁰, eine erhöhte Konzentration an Autoantikörpern gegen den Angiotensin 1-Rezeptor ¹¹, erhöhte Spiegel an Vasokonstriktoren wie Thromboxan ¹², Endothelin ¹³ und Prostaglandin 2α ¹⁴ und verminderten Konzentrationen an Vasodilatatoren wie Prostazyklin ¹⁴ und Stickstoffmonoxid (NO) ¹⁵ vermittelt .

Die Proteinurie entsteht durch eine Schädigung der Basalmembran der Nierenglomeruli. Die erhöhte endotheliale Permeabilität führt zu Ödemen. Durch die Verletzung des Endothels kann es zur Gerinnungsaktivierung mit intravasalen Thrombosen und im Extremfall zur disseminierten intravasalen Gerinnung kommen. Auch das Endothel der Leber und des Gehirns kann geschädigt werden, woraus schwere Verlaufsformen wie das HELLP- Syndrom oder die Eklampsie resultieren.

Dabei treten bei der Eklampsie zusätzlich tonisch-klonische Krampfanfälle ohne anderweitiges Korrelat auf. Das HELLP Syndrom ist definiert als Trias aus Hämolyse, pathologisch erhöhten Leberenzymen und einer Thrombozytopenie mit einer Thrombozytenzahl < 100.000/µl (low platelet count) ^5,16.

1.2.2 Epidemiologie der PE

Die PE tritt bei 2-8 % aller Schwangeren auf ^16-18. Sie ist eine Erkrankung, die viele Organe betrifft und eine Hauptursache für maternale und fetale Morbidität und Mortalität ^16-18. Sie führt weltweit zu ca.

50.000 mütterlichen Todesfällen pro Jahr ¹⁹. 10-15 % der maternalen Mortalität ist assoziiert mit den Erkrankungen PE und Eklampsie ^16,18.

Die PE hat nicht nur Auswirkungen auf Mutter und Fetus während der betroffenen Schwangerschaft, sondern auch auf deren Gesundheit im weiteren Leben. Frauen, die eine PE durchgemacht haben, haben im weiteren Leben ein erhöhtes Risiko eine koronare Herzkrankheit, einen arteriellen Hypertonus sowie Herzinfarkte und Schlaganfälle zu entwickeln ²⁰. Im Vergleich zu Frauen mit unkomplizierten Schwangerschaften ist ihre Lebenserwartung reduziert ²¹. Ähnlich sieht es bei den

Einleitung

7

Kindern aus präeklamptischen Schwangerschaften aus. Sie haben ebenfalls ein erhöhtes Risiko eine koronare Herzkrankheit, einen Schlaganfall oder ein metabolisches Syndrom zu entwickeln ^16,22-24.

1.2.3 Ätiologie der PE

Die Ätiologie der PE ist bisher noch nicht vollständig geklärt. Es bestehen verschiedene Theorien zur Entstehung dieses multifaktoriellen Krankheitsbildes. Die derzeit akzeptierteste Hypothese beinhaltet ein 2-Stadien-Model der Erkrankung ²⁵. Im Stadium 1 der Erkrankung wird eine verminderte plazentare Perfusion als Hauptgrund der pathophysiologischen Veränderungen angesehen. Diese führt über verschiedene andere Vorgänge bei einigen, jedoch nicht bei allen, Frauen zum Stadium 2 der Erkrankung, dem multisystemischen Syndrom der PE.

Als erwiesen gilt, dass Defekte in der frühen Plazentation die Ursache für eine verminderte plazentare Perfusion sind. Es kommt zur fehlerhaften Trophoblasteninvasion und zu einem inadequaten Remodelling der maternalen Spiralarterien ²⁶.

Während der normalen Schwangerschaft migrieren die villösen Zytotrophoblasten in das Myometrium und die Spiralarterien verlieren ihr Endothel und die meisten ihrer Muskelfasern.

Daraus resultieren ein erniedrigter Gefäßwiderstand und eine geringere Sensitivität auf vasoaktive Substanzen ^27,28. Bei der PE findet dieser Umbau bei ½ bis ⅔ der Gefäße des Myometriums nicht statt

27,29

. In diesen Fällen wandern weniger Trophoblasten ein und gelangen nicht tief genug ins Myometrium, so dass die Dilatation der Spiralarterien vermindert ist (siehe Abbildung 2).

Einleitung

8

Morphologische Veränderungen der Spiralarterien in physiologischer und präeklamptischer Schwangerschaft

Abbildung 2: Dargestellt sind die morphologischen Veränderungen der Spiralarterien in einem Uterus einer präeklamptischen Schwangerschaft (mittleres Bild) im Vergleich zu einer gesunden Schwangerschaft (rechtes Bild). Die Trophoblasten wandern in dem Uterus einer späteren präeklamptischen Schwangerschaft nicht in die tieferen Schichten des Myometriums, woraus eine reduzierte Dilatation der Spiralarterien resultiert ^7,30.

Das führt zu einem erhöhten arteriellen Widerstand und zu einer erhöhten Sensitivität auf vasoaktive Substanzen. Dadurch können u.a. durch Vasokonstriktion eine Ischämie und vasoaktiver Stress auf die Plazenta wirken. Dopplersonographisch lässt sich der erhöhte Widerstand in den mütterlichen

Einleitung

9

Arteriae uterinae nachweisen ^27,29 und imponiert typischerweise als Inzisur (Notch) ⁷. Der daraus resultierende verminderte Sauerstoffgehalt führt zur gesteigerten Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies und zu oxidativem Stress in der Plazenta. Dadurch werden verschiedene pathophysiologische Veränderungen eingeleitet, die u.a. zur Ausschwemmung von plazentaren Mikropartikeln (Zellmaterial durch Trophoblastenaktivierung, Apoptose und Nekrose) in die mütterliche Zirkulation führen. Sie sind bei Patientinnen mit PE vermehrt nachweisbar. In vitro Studien gehen davon aus, dass Mikropartikel an der maternalen endothelialen Dysfunktion beteiligt sind, indem sie Monozyten im peripheren Blut aktivieren, so dass diese pro-inflammatorische Zytokine wie Interleukin (IL)-8, IL-6 und IL-1β sezernieren ^27,31. Diesbezüglich hat eine Studie herausgefunden, dass das Serum von PE-Patientinnen die Endothelpermeabilität anderer Probandinnen steigert. Dieser Effekt ist nach der Entbindung nicht mehr zu beobachten ³². Das bekräftigt die These, dass plazentare Faktoren an der Entstehung der endothelialen Dysfunktion beteiligt sind.

Die endotheliale Dysfunktion sorgt für eine vaskuläre Hyperpermeabilität, Thrombophilie und Hypertension (siehe Einleitung 1.2.1).

Nicht alle Frauen mit verminderter plazentarer Perfusion entwickeln eine PE. Man geht davon aus, dass maternale Faktoren dazu führen, dass nur bestimmte Frauen an diesem Syndrom erkranken.

Derzeit bekannte Risikofaktoren für die PE sind ^5,33,34:

 familiäre Belastung

 Diabetes mellitus Typ 1

 chronische Hypertonie

 chronische Nierenerkrankungen

 PE in vorherigen Schwangerschaften, PE in der Familie

 Antiphospholipid-Antikörper-Syndrom

 Körper-Masse-Index (BMI) > 35

 Alter > 40

 Erstparität

 Autoimmunerkrankungen, Systemischer Lupus Erythematodes

 bilaterales Notching der Arteriae uterinae

 Mehrlingsschwangerschaften

 Kardiovaskuläre Erkrankungen in der Familie

 das Leben in größerer Höhenlage

Einleitung

10 1.2.4 Prävention und Therapie der PE

Die Dopplersonographie kann diagnostisch wichtige Hinweise für die spätere Entwicklung einer PE liefern. Bei einem pathologischen beidseitigen Dopplernsonogramm der Ateriae uterinae mit Notch oder einer reduzierten diastolischen Blutströmung, besteht ein Risiko von ca. 60 % im weiteren Verlauf der Schwangerschaft eine PE zu entwickeln ^5,35-37.

Die Einnahme von Acetylsalicylsäure (ASS) ist bislang die einzige Möglichkeit der PE präventiv vorzubeugen. Dabei wird Risikoschwangeren empfohlen ab der frühen Schwangerschaft täglich 75- 150 mg ASS einzunehmen ^5,38.

Eine manifeste PE sollte primär stationär behandelt werden ³⁹, damit eine adäquate klinische Verlaufskontrolle gewährleistet ist. Darunter fallen die Überwachung klinischer Symptome, die regelmäßige Blutdruckmessung, Urin- und Blutlaborkontrollen, Gewichtskontrollen, regelmäßige Diagnostik mittels Dopplersonographie, Kardiotokografie (CTG) und Fetometrie ⁵. Antihypertensiva sollten erst bei anhaltenden Blutdruckwerten von ≥ 170 mmHg systolisch und ≥ 110 mmHg diastolisch gegeben werden. Dabei steht die Vermeidung von maternalen cerebro-/vaskulären Komplikationen im Vordergrund ^5,40-44.

Zielwerte sind Blutdruckwerte von 140-155 mmHg systolisch und 90-105 mmHg diastolisch ⁴⁵. In der Schwangerschaft ist Alpha-Methyldopa das Antihypertensivum der Wahl. Alternativ können Dihydralazin oder ß1 selektive β-Blocker und Nifedipin ab dem zweiten Trimenon eingesetzt werden

5. Bei zentralnervösen Symptomen wird zur Eklampsie-Prophylaxe intravenös Magnesiumsulfat verabreicht ^5,42-44.

Die Entbindung stellt derzeit immer noch die einzige kurative Therapie der PE dar ⁵. Eine Notsectio sollte bei schwerer PE eingeleitet werden, wenn die Patientin eine Eklampsie, eine therapierefraktäre schwere Hypertonie, Nierenversagen, ein akutes Lungenödem, eine disseminierte intravasale Gerinnung, persistierende schwere Oberbauchschmerzen oder schwere zentral-nervöse Symptome entwickelt ⁴¹.

Des Weiteren sollte schnellstmöglich entbunden werden, sobald eine schwere Wachstumsretardierung des Feten (< 5. Perzentile) mit pathologischem Dopplerbefund vorliegt ^5,46,47. In der Wissenschaft wird intensiv nach einer therapeutischen Möglichkeit gesucht, die Schwangerschaft bei dem Vorhandensein einer PE möglichst lange zu erhalten. Thadhani et al.

führten eine Pilotstudie durch, in der Frauen mit PE in der frühen Schwangerschaft mittels Dextran-

Einleitung

11

Sulfat-Cellulose-Apharese behandelt wurden. Die Therapie baut auf die These auf, dass sFlt1, eine Variante des VEGF Rezeptors 1, eine Rolle bei der Entstehung der PE spielt. Dabei wird davon ausgegangen, dass die sFlt1-Level im Blut der Schwangeren bei PE erhöht sind und dass diese erhöhten Konzentrationen an zirkulierendem sFlt1 für eine vermehrte Bindung von VEGF sorgt. Im experimentellen Modell wurde durch eine Erhöhung des sFlt1-Levels ein präeklamptischer Phänotyp induziert. In der Pilotstudie von Thadhani et al. konnten durch die Dextran- Sulfat-Cellulose-Apharese die sFlt1-Level gesenkt und somit der Blutdruck der Probandinnen stabilisiert und die Proteinurie reduziert werden. Es bleibt abzuwarten, ob die Apherese in Zukunft eine Therapie der PE darstellt. Es ist diesbezüglich noch weitere Forschungsarbeit notwendig, da die Pilotstudie nur mit wenigen Probandinnen durchgeführt wurde und nur Schwangere mit PE in der frühen Schwangerschaft mit Feten ohne Wachstumsretardierung eingeschlossen hat. Des Weiteren ist die Apharese nicht spezifisch für die Reduzierung von sFlt1. Es ist durchaus möglich, dass auch andere Moleküle entfernt werden, die bei der PE eine Rolle spielen ⁴⁸.

1.3 VEGF

1.3.1 Gliederung, Wirkmechanismus und Wirkung von VEGF

Die VEGF-Familie besteht aus verschiedenen Vertretern. Zu ihr gehören VEGF-A, PlGF, VEGF-B, VEGF- C, VEGF-D und ihre Rezeptoren (R) VEGFR-1 (Flt1), VEGFR-2 (Kinasedomäne-Rezeptor [KDR] oder fetale Leber-Kinase 1 [Flk-1]), VEGFR-3 und die Korezeptoren Neuropilin 1 (NRP-1) sowie Neuropilin 2 (NRP-2) ⁴⁹.

In der humanen Plazenta werden VEGF-A, PlGF und die Rezeptoren VEGFR-1 sowie VEGFR-2 exprimiert ^50,51, VEGF induziert das Wachstum der EC ⁵² und erhöht die vaskuläre Permeabilität ⁵³. Durch alternatives Splicing gibt es in humanen Zelllinien sechs verschiedene VEGF-A-Isoformen (VEGF-A-121,145, 165,183,189,206) ⁴⁹. VEGF-A stimuliert verschiedene Zelltypen. EC haben jedoch hochaffine Bindungsstellen für VEGF-A auf ihrer Oberfläche ⁵⁴ und exprimieren diese schon früh während der EC-Differenzierung, so dass man davon ausgeht, dass EC die Zielzellen der VEGF- Wirkung sind ^52,55,56. Es gibt zwei hochaffine VEGF-A-Rezeptoren, den KDR und den Flt1-Rezeptor ^57-59. Sie bestehen aus einer extrazellularen Domäne (bestehend aus 7 Immunglobulin-ähnlichen Untereinheiten), einer Transmembranregion und einer intrazellulären Domäne (Tyrosinkinase) ^52,57-63. Durch alternatives Splicing entsteht eine lösliche Form des Flt1-Rezeptors, der sFlt1. Dieser lösliche Rezeptor bindet an VEGF und inhibiert dadurch seine Wirkung ^52,64,65. Der KDR spielt eine Rolle bei

Einleitung

12

der Vaskulogenese und Angiogenese und stimuliert die Proliferation und Differenzierung von ECs

52,59,63,66,67

. Er wird auf proliferierenden und nicht proliferierenden Zellen exprimiert, was vermuten lässt, dass er eine Rolle für das Überleben der ECs spielt ^52,68. Der Flt1-Rezeptor scheint keine Auswirkungen auf die Proliferation und Differenzierung von ECs zu haben ^67,69,70 und spielt vor allem eine Rolle bei der Zellmigration und der Organisation von Blutgefäßen ⁷¹.

Die VEGF-Genexpression wird durch den Sauerstoffpartialdruck (Hypoxie induziert die VEGF- Genexpression) ^72-75 und über Zytokine wie z.B. den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ^76,77, die transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF) α und β ^76,78-80, IL-1α und β ^81,82, Prostaglandin E2 (PGE2) ⁸², IL-6 ⁸³, den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) ⁸⁴ und das humane Choriongonadotropin (hCG) reguliert ^52,85.

1.3.2 VEGF und die Pathogenese von Erkrankungen

VEGF nimmt eine bedeutende Rolle in der Angiogenese ein. In verschiedenen Versuchen hat man die Auswirkungen einer VEGF-A-Inaktivierung, sowie der Inaktivierung der VEGF-A-Rezeptoren Flt1 und KDR untersucht. Eine Inaktivierung eines VEGF-A-Allels war dabei assoziiert mit einer Inhibierung der EC-Differenzierung und einer insuffizienten Angiogenese und Vaskulogenese und waren mit einer erhöhten embryonalen Letalität verbunden ^86,87. Ähnliche Ergebnisse wurden bei VEGF-Rezeptor- insuffizienten Embryos gefunden. Eine KDR-Rezeptor-Insuffizienz resultierte in einer Inhibition der EC-Differenzierung mit einer fehlerhaften Gefäßbildung ⁶⁶. Im Gegensatz dazu war die Differenzierung der ECs bei einer Flt1-Insuffizienz nicht beeinträchtigt. Die Gefäßbildung war dennoch insuffizient ⁷⁰ (siehe Abbildung 3).

Einleitung

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Auswirkung einer VEGF-A- und VEGF-Rezeptor-Insuffizienz auf die Angiogenese und Vaskulogenese

Abbildung 3: Die Abbildung zeigt die Auswirkungen einer VEGF-A- oder VEGF-Rezeptor Insuffizienz auf die Angiogenese und Vaskulogenese ⁶⁹, modifiziert.

Nachdem sich im Tiermodell ein positiver Effekt von VEGF auf den myokardialen Blutfluss bei chronischer Myokardischämie gezeigt hat ^88-90, wurde experimentell versucht, VEGF als Therapeutikum bei myokardialen Erkrankungen einzusetzen. Dabei wurden eine Minderung der Symptomatik und eine Verbesserung der myokardialen Perfusion erreicht, jedoch wurden die Erfolge durch eine Hypotension limitiert ^91,92.

Während der normalen Schwangerschaft steigt die Konzentration an zirkulierendem VEGF im mütterlichen Kreislauf an. Dieser Anstieg bleibt bei präeklamptischen Schwangerschaften aus ^93-95. Dabei ist jedoch nicht die Gesamt-Konzentration an VEGF reduziert ^96,97, sondern lediglich die Menge

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an freiem zirkulierenden VEGF. Das ist darauf zurückzuführen, dass bei PE-Patientinnen erhöhte Level an sFlt1 vorhanden sind ^93-95,98.

sFlt1 bindet das freie VEGF, welches somit nicht mehr für die Bindung an die Oberflächenrezeptoren zur Verfügung steht ^27,99. Das Ausmaß des sFlt1-Level-Anstiegs korreliert mit der Schwere der Erkrankung ¹⁰⁰. In Tierversuchen konnte durch eine Überexpression von sFlt1 bzw. durch die Reduktion an VEGF eine Hypertonie und Proteinurie ausgelöst werden ^101,102, und auch bei Krebspatienten, die mit VEGF-Antagonisten behandelt wurden, sind Nebenwirkungen wie Hypertonie und Proteinurie aufgetreten ^103,104.

1.4 Endothelzellen

1.4.1 Differenzierung und Aufgaben der ECs

Durch den Einfluss von VEGF und bFGF differenzieren sich die pluripotenten Hämangioblasten zu den ECs 1,66,105,106

. Die ECs kleiden die Blutgefäße von innen aus. Diese Zellschicht wird Endothel genannt.

Das Endothel trennt den Intravasalraum vom Extravasalraum und kontrolliert den Transport von Molekülen ¹⁰⁷.

Die Permeabilität des Endothels wird über die Zonula occludens, über die sogenannten „tight junctions“, geregelt. Die Permeabilität ist dabei von der Lokalisation des Gefäßes im Körper abhängig, z.B. besteht eine dichte Barriere in Gehirn, Herz, Lunge, Skelettmuskulatur, exokrinen Drüsen, Haut, Fettgewebe und Thymus und eine lockere Barriere in der Leber und in den Nierenglomeruli. Bei Veränderungen der Endothelpermeabilität kann es zu gravierenden Störungen des betroffenen Organs kommen ^108-110.

ECs besitzen neben der Barrierefunktion weitere Aufgaben wie die Sekretion vasoaktiver Substanzen.

Dabei haben NO, der Endothel-abhängige hyperpolarisierende Faktor (EDHF) und Prostaglandin 2 (PGl2) eine vasodilatatorische und Endothelin, Angiotensin 2 und das Angiotensin-konvertierende Enzym (ACE) eine vasokonstriktorische Wirkung ^108,109.

Des Weiteren spielen ECs eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Blutgefäßen. Dabei gibt es zum einen die Angiogenese und zum anderen die Vaskulogenese. Angiogenese ist die Entstehung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden Blutgefäßen ¹¹¹. Dabei unterscheidet man die sprießende Angiogenese von der aufsplittenden Angiogenese. Die sprießende Angiogenese setzt sich dabei

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zusammen aus der enzymatischen Zersetzung der Basalmembran, der EC-Proliferation, der EC- Migration, der EC-Tubuli-Bildung, der Gefäßfusionierung, der Gefäßverästelung und der Perizytenstabilisierung ¹¹¹. Das Aussprossen neuer Blutgefäße wird durch eine Hypoxie stimuliert.

Parenchymzellen reagieren mit der Sekretion von VEGF-A auf den hypoxischen Stimulus. Die ECs sind dafür zuständig enzymatisch den Weg durch die extrazelluläre Matrix zu bahnen. Andere ECs folgen diesen Zellen, proliferieren und fusionieren zum neuen Gefäß ^112-117. Bei der aufsplittenden Angiogenese entstehen neue Gefäße durch Spaltung eines bereits existierenden Gefäßes. Dabei ist lediglich die Neuformatierung der ECs und keine Proliferation oder Migration der ECs nötig. Diese Form der Angiogenese findet z.B. in Lunge, Koroidea, Drüsengewebe, intestinaler Mukosa, Niere, Ovar, Uterus, Skelettmuskel, Herz und Gehirn statt ^118,119. Die Vaskulogenese ist die Neuentstehung von Gefäßen aus endothelialen Vorläuferzellen, welche durch Botenstoffe wie VEGF-A angelockt werden. Diese ist z.B. bei der Wundheilung, Tumorgefäßentwicklung und vor allem bei der Embryogenese von Bedeutung ¹²⁰.

Das Endothel spielt auch eine Rolle in der Blutgerinnung. Es wirkt prothrombotisch und antifibrinolytisch indem es den Gerinnungsfaktor V und den von-Willebrand-Faktor synthetisiert, die Gerinnungsfaktoren Xa und XII aktiviert und Inhibitoren der Plasminogenaktivatoren sezerniert. Das Endothel wirkt aber auch antithrombotisch durch die Synthese und Sekretion von Heparanproteglykan, Thrombomodulin, Nexin, Plasminogenaktivatoren, Prostazyklin, 13- Hydroxylinolensäure und NO 108,109,121

.

Des Weiteren bilden die Endothelien Matrixkomponenten wie Kollagen IV, Proteoglykane sowie Laminin und spielen durch die Sekretion von IL-1, IL-6, IL-8, Adhäsionsmolekülen und Histokompatibilitätsantigenen eine Rolle bei der Regulation des Immunsystems 108,109,122-125.

Das Endothel wirkt sich außerdem auf das Zellwachstum aus, indem es wachstumsstimulierende (Thrombozyten-abhängiger Wachstumsfaktor [PDGF], Kolonie-stimulierender Faktor [CSF], Fibroblasten Wachstumsfaktor [FGF]) und wachstumshemmende Faktoren (Heparin, transformierender Wachstumsfaktor β [TGF-β]) bildet ¹⁰⁸.

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1.5 Vitamin D

1.5.1 Vitamin D Stoffwechsel

Vitamin D ist ein Prohormon, welches über die Nahrung aufgenommen oder unter Ultraviolett (UV)- Einstrahlung in der Haut synthetisiert wird. Das Prohormon wird an ein Vitamin D bindendes Globulin gebunden und zur Leber transportiert. Dort wird es von der 25-Hydroxylase zu 25(OH) Vitamin D hydroxyliert. Dieses ist die zirkulierende Form des Vitamin D ¹²⁶. Man misst die Konzentration an zirkulierendem 25 (OH) Vitamin D, um den Vitamin D Status zu beurteilen ^127,128. Bei einem 25(OH) Vitamin D Serumspiegel von ≥ 30 ng/ml spricht man von einem ausreichenden Vitamin D Status. Ein Vitamin D Mangel ist bei einem 25(OH) Vitamin D Serumspiegel von ≤ 20 ng/ml vorhanden. Bei Werten zwischen 21 und 29 ng/ml liegt eine Vitamin D Insuffizienz vor ¹²⁹.

25(OH) Vitamin D wird in der Niere von der 1γ-Hydroxylase zu 1,25(OH)₂ Vitamin D oder von der 24- Hydroxylase zu 24,25(OH)₂ Vitamin D umgewandelt ¹²⁶. 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ ist die biologisch aktive Form des Vitamin D. Die Wirkung von Vitamin D wird über einen nukleären und einen Membran- gebundenen Rezeptor reguliert ¹³⁰.

1.5.2 Wirkung und Funktion von Vitamin D

Die wohl bekannteste Aufgabe von Vitamin D ist die Regulierung des Calcium-Phosphat- Stoffwechsels. 1,25 (OH)₂ Vitamin D₃ stimuliert die intestinale und renale Calcium- und Phosphat- Absorption. Des Weiteren stimuliert es die Osteoblasten zum Knochenaufbau und zur Kalzifizierung der Knochen ¹³¹. Bei einem Vitamin D Mangel kommt es zu einem reduzierten Calcium-Spiegel.

Dieses führt zu einer gesteigerten Sekretion des Parathormons (PTH). PTH sorgt wiederum für eine gesteigerte Absorption von Calcium über Darm und Nieren und für eine gesteigerte Ausscheidung von Phosphat über die Nieren sowie für eine vermehrte Freisetzung von Calcium und Phosphat aus dem Knochen 126,131,132

. Durch diesen Mechanismus kann es bei einem Vitamin D Mangel zum Krankheitsbild der Rachitis 131,133,134 bei Kindern bzw. der Osteomalazie 131,132,134 bei Erwachsenen kommen.

Des Weiteren hat Vitamin D eine Wirkung auf den Glukosestoffwechsel, indem es die ß-Zellen des Pankreas zur Insulinsekretion und damit die Aufnahme von Glukose in die Zellen stimuliert und die Glukosekonzentration im Blut senkt ^135-138. Demnach ist ein Vitamin D Mangel mit der Entstehung eines Diabetes mellitus vom Typ 1 ¹³⁹ und Typ 2 ¹⁴⁰ sowie mit der Entstehung des Gestationsdiabetes

141 korreliert.

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Zusätzlich moduliert Vitamin D die Differenzierung, das Wachstum und die Apoptose von Zellen.

Dabei hat 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ einen antiproliferativen Effekt auf viele Zelltypen wie z.B. auf Kolonepithelzellen ¹⁴², Lobulusalveolarzellen der Brustdrüsen ¹⁴³, Schilddrüsenzellen ^144,145 und Keratinozyten ^146,147. Aus diesem Grund werden Vitamin D Präparate erfolgreich zur Therapie von Psoriasis ^146,148 und der Schilddrüsenhyperplasie eingesetzt ^144,145. Der antiproliferative Effekt wird durch unterschiedliche Mechanismen erreicht. Eine bedeutende Rolle spielt zum einen die Inhibition des Zellzyklus. Dabei werden die Zellen durch Vitamin D gehindert, aus der G1 Phase in die S Phase zu gelangen ^149-153. Zum anderen stimuliert Vitamin D die Apoptose von Zellen ^153,154 wie z. B. die Apoptose von Kolonkrebszellen ¹⁵⁵ und Retinoblastomzellen ¹⁵⁶. Aus diesem Grund werden 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ krebspräventive Eigenschaften zugesprochen. Ein Vitamin D Mangel wird mit der Entstehung von Brust- ¹⁵⁷, Prostata- ^158,159 sowie Kolonkarzinom ^157,160 in Zusammenhang gebracht ¹³².

Vitamin D hat eine Wirkung auf die Differenzierung vieler Zelltypen ¹⁵³. Bei Vitamin D knock-out Mäusen hat man eine anormale epidermale Differenzierung gefunden ¹⁶¹ und Studien haben eine Stimulation der Differenzierung von Keratinozyten durch Vitamin D erzielt ¹⁴⁶. Des Weiteren stimuliert 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ die Differenzierung von Leukämiezellen zu Monozyten bzw.

Makrophagen ¹⁶².

Es gibt aber auch Zelltypen, die durch 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ zum Wachstum stimuliert werden, wie z.B. vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) ¹⁶³, humane Osteoblasten ¹⁶⁴ und endotheliale Kolonie- formierende Zellen (ECFCs) ¹⁶⁵.

1,25(OH)₂ Vitamin D₃ wird ebenfalls ein Effekt auf das Immunsystem zugesprochen ¹⁵³. Dabei hat Vitamin D Wirkungen auf das erworbene Immunsystem ¹³⁸, indem aktivierte T- und B-Lymphozyten sowie Monozyten über Rezeptoren auf 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ reagieren ¹⁶⁶. Dabei inhibiert 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ die Immunglobulin G (IgG)-Produktion, Proliferation und Differenzierung von B- Lymphozyten und inhibiert die Proliferation von T-Lymphozyten und T-Helferzellen vom Typ 1 (Th1)

167-170. Dabei verändert Vitamin D auch die Zytokinausschüttung ¹³⁸. Die Sezernierung von Interferon γ (IFN γ), IL-2 und TNF α wird inhibiert (sezerniert von Th1-Zellen) und die Sezernierung von IL-4,-5,-6,- 9,-10 und -13 (sezerniert von Th2-Zellen) 167,171,172

stimuliert. Vitamin D beeinflusst zusätzlich das angeborene Immunsystem ¹³⁸, indem es die Wirkung von antimikrobiellen Peptiden wie Cathelicidin antimikrobielles Peptid (CAMP) ^173-176 stimuliert.

Ein 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Mangel soll mit der Entstehung von Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose ¹⁷⁷ und Diabetes mellitus vom Typ 1 132,178,179

assoziiert sein. Vitamin D wird im Tiermodell

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erfolgreich gegen rheumatoide Artritis, Diabetes mellitus vom Typ 1, allergische Enzephalitis, Systemischen Lupus Erythematodes und inflammatorische Darmerkrankungen ^138,180 eingesetzt, und es wird die therapeutische Anwendung an Menschen erprobt ^181,182.

Vitamin D fungiert als negativer Regulator des Renin-Angiotensin-Systems ¹⁸³. Ist diese negative Regulation bei einem Vitamin D Mangel vermindert, so kann es zu kardiovaskulären Erkrankungen wie der Hypertonie, Herzinfarkt oder Schlaganfall kommen. Umgekehrt hat eine Vitamin D Substitution von Hypertonikern zu einer Senkung der Blutdruckwerte geführt ¹⁸⁴.

1.5.3 Vitamin D in physiologischer und präeklamptischer Schwangerschaft

25(OH) Vitamin D gelangt vom mütterlichen Kreislauf über die Plazenta in den fetalen Kreislauf ¹⁸⁵. Dabei beträgt die Konzentration an 25(OH) Vitamin D in der Nabelschnur 68-108 % der maternalen 25(OH) Vitamin D Konzentration ^185-191.

Auch bei den 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Konzentrationen im maternalen vs. fetalen Serum gibt es in der Wissenschaft unterschiedliche Ergebnisse. Studien haben herausgefunden, dass 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ die Plazenta passiert ^192,193. Die meisten Studien haben im Nabelschnurblut niedrigere Konzentrationen an 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ als im maternalen Blut gefunden 189,194,195

. Es gibt aber auch Studien, die höhere Konzentrationen an 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ im Nabelschnurblut im Vergleich zum maternalen Blut gefunden haben ^196,197. Die differierenden Ergebnisse könnten aus der variablen Produktion an 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ durch die maternalen und fetalen Nieren sowie von der Plazenta resultieren ¹²⁶.

Während der Schwangerschaft ist die maternale Serumkonzentration von 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ ab dem ersten Trimenon erhöht ¹⁹⁸, was auf die Synthese von 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ von den Deziduazellen der Plazenta zurückzuführen ist ^199,200. Die lokale Produktion von Vitamin D in der Plazenta, seine starken immunmodulatorischen Effekte und die Regulation von Genen, die für die Implantation wichtig sind, lassen eine Rolle für Vitamin D₃ in der Pathophysiologie der PE vermuten.

Der Vitamin D Mangel wird weltweit zunehmend als Gesundheitsproblem verstanden und kommt in 20-84 % aller Schwangerschaften vor ^127,201, abhängig von der Hautfarbe, der Exposition gegenüber Sonnenlicht und den Ernährungsgewohnheiten. Da die Aufnahme über herkömmliche

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Nahrungsmittel nicht genügt, um eine ausreichende Zufuhr zu gewährleisten, empfiehlt die Deutsche Gesellschaft für Ernährung die zusätzliche tägliche Aufnahme von 800 IE für Erwachsene und insbesondere Schwangere ²⁰². Ob diese Menge genügt, um auch den vermehrten Bedarf in der Schwangerschaft zu decken, wird kontrovers diskutiert. Epidemiologische Studien zeigen eine deutliche Assoziation zwischen niedrigen Vitamin D3 Serumspiegeln und dem Auftreten einer PE und deuten auf einen Vitamin D₃ Mangel als unabhängigen Risikofaktor für das Auftreten einer PE hin

203,204

. Schwangere mit Vitamin D Mangel (< 37,5 nmol/l) haben ein bis zu 5-fach erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer PE ²⁰³. Vitamin D3 ist besonders niedrig bei früh in der Schwangerschaft auftretender PE mit für das Gestationsalter zu kleinen Kindern ²⁰⁵. Mit steigenden 25(OH) Vitamin D Serumspiegeln sinkt demzufolge das Risiko für die Entwicklung des Syndroms. So führt ein Anstieg um 10 nmol/l zu einer Reduktion des Risikos um ca. 38 % ²⁰⁴. Neben dem 25(OH)₂ Vitamin D Serumspiegel ist auch ein erniedrigter 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Level mit der PE assoziiert ^206,207, was auf eine erniedrigte 1α-Hydroxylase Expression und Aktivität in den Plazenten der Betroffenen zurückzuführen ist 135,208-211

.

Im ersten Trimenon und in der Schwangerschaftsmitte war der Vitamin D Status der Schwangeren positiv mit dem Verhältnis aus pro-angiogenen zu anti-angiogenen Faktoren (PlGF/sFlt1 x lösliches Endoglin [sEng]) korreliert ^204,212.

Verschiedene Studien konnten durch eine Vitamin D Substitution eine Reduktion des PE Risikos zeigen ^213-215. Hier finden vor allem zwei kürzlich veröffentlichte randomisierte kontrollierte Studien Beachtung, die durch eine Substitution von 4.000 IE täglich eine Reduktion von bis zu 30 % zeigen konnten ^216,217.

Es gibt Studien, die für einen bedeutenden Effekt von 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ in der Plazenta sprechen

138. 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ beeinflusst die Differenzierung von Endometriumzellen zu Deziduazellen ²⁰⁹,

218 und spielt eine große Rolle bei der Implantation des Embryos in die Gebärmutterschleimhaut

218,219. Des Weiteren reguliert 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ die Synthese von für die Schwangerschaft wichtigen Hormonen und beeinflusst die antimikrobielle und antiinflammatorische Antwort von Trophoblasten 138,220-224

sowie die autokrine und parakrine Immunmodulation während der Schwangerschaft ²²⁵. Th1-Zytokine sorgen für eine negative maternale Reaktion auf die Implantation des Embryos und den Fetus, wohingegen Th2-Zellen wichtig für die Erhaltung der Schwangerschaft ist ^226,227. Vitamin D inhibiert die Wirkung von Th2-Zellen und verstärkt die Wirkung von Th1-Zellen, was sich protektiv auf die Schwangerschaft auswirkt ^171,227.

Einleitung

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In einer Studie wurde durch 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ eine Reduktion der TNFα- und IL-6-Expression in plazentaren Trophoblasten von PE-Patientinnen erzielt. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ eine bedeutende Rolle in immunologischen Reaktionen einnimmt und dass eine Verbindung zwischen der Wirkung von 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ und der PE besteht ²²⁸.

Vitamin D und sein Rezeptor sind an der Regulation der Hormonsezernierung von hCG und humanem plazentaren Laktogen (hPL), Estradiol und Progesteron durch die Plazenta involviert ^220-222. Diese Hormone sind für den Erhalt der Schwangerschaft unentbehrlich ¹³⁸.

Arbeiten aus der Arbeitsgruppe Molekulare Perinatologie an der Frauenklinik der Medizinischen Hochschule Hannover haben die Wirkung von 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ auf die Proliferation, Angiogenese und VEGF-Genexpression von endothelialen Vorläuferzellen untersucht und einen positiven Effekt von 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ auf die Angiogenese und Proliferation der ECFCs gefunden.

Es konnte gezeigt werden, dass der proangiogenetische Effekt von Vitamin D über eine gesteigerte VEGF-Genexpression vermittelt wird ¹⁶⁵.

Ein anderer interessanter Aspekt ist, dass 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ die Proliferation von VSMCs stimuliert. Dieses Phänomen entsteht wahrscheinlich dadurch, dass 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ die VEGF- Genexpression steigert. Inhibiert man VEGF, so bleibt der Proliferationseffekt aus ¹⁶³. Die Forschungsgruppe um A. Cardus hat diesen Mechanismus genauer untersucht. Sie haben herausgefunden, dass 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ über einen Vitamin D Rezeptor (VDR) an ein Vitamin D abhängiges Element im VEGF-Promotor bindet und somit die Expression von VEGF steigert ²²⁹.

Alles in allem könnte der niedrige Vitamin D Spiegel als Risikofaktor für die Entstehung einer PE im Zusammenhang mit einer reduzierten VEGF-Genexpression stehen. Alle genannten Aspekte legen nahe, dass bei der PE ein Endothelschaden vorliegt. Interessant ist in diesem Zusammenhang zum einen, dass ECs VDRs besitzen, und zum anderen dazu in der Lage sind, 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ zu synthetisieren ^230,231.

Einleitung

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1.6 Fragestellung

Nachdem gezeigt werden konnte, dass Vitamin D eine positive und durch VEGF vermittelte Wirkung auf das Verhalten von endothelialen Vorläuferzellen hat, war das Ziel dieser Arbeit die Untersuchung der Wirkung von Vitamin D auf EC höherer Differenzierung. Dazu sollten die Effekte von 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ auf die angiogenetischen Eigenschaften von HUVECs, die aus Nabelschnüren normaler und präeklamptischer Schwangerschaften isoliert wurden, untersucht werden. Hierzu sollten Versuche mit folgenden experimentellen Methoden durchgeführt werden:

 Matrigel-Angiogenese-Assay

 Migrations-Assay

 Proliferations-Assay

 VEGF-Genexpression mittels RT-PCR

Die Ergebnisse sollten anschließend statistisch ausgewertet und vergleichend gegenüber gestellt werden.

Material und Methoden

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2. Material und Methoden

2.1 Chemikalien und Materialien

Verwendete Chemikalien und Materialien Teil 1

Tabelle 1: In der Tabelle sind die verwendeten Chemikalien und Materialien sowie die Herstellerfirmen dargestellt.

Material und Methoden

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Verwendete Chemikalien und Materialien Teil 2

Tabelle 2: In der Tabelle sind die verwendeten Chemikalien und Materialien sowie die Herstellerfirmen dargestellt.

Material und Methoden

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Verwendete Chemikalien und Materialien Teil 3

Tabelle 3: In der Tabelle sind die verwendeten Chemikalien und Materialien sowie die Herstellerfirmen dargestellt.

Material und Methoden

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2.2 Geräte

Verwendete Geräte

Tabelle 4: In der Tabelle sind die verwendeten Geräte sowie die Herstellerfirmen dargestellt.

Material und Methoden

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2.3 Software

Verwendete Software

Tabelle 5: In der Tabelle sind die verwendete Software sowie die Herstellerfirmen dargestellt.

2.4 Auswahl der Probandinnen

In die Studie wurden PE-Patientinnen sowie gesunde Kontroll-Probandinnen eingeschlossen.

Die PE wurde definiert als:

 Neu aufgetretene Hypertonie mit Blutdruckwerten > 140 mmHg systolisch und ≥ 90 mmHg diastolisch

und

 Proteinurie von ≥ 0,3 g im 24 h-Urin zwischen der 20. Schwangerschaftswoche und der sechsten Woche nach der Entbindung und/oder

 Erhöhten Leberwerten und/oder

 Thrombozytopenie ⁵

Material und Methoden

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Von allen eingeschlossenen Probandinnen wurden folgende Parameter erhoben: Alter, BMI, Blutdruck, Gestationsalter bei Entbindung, Ergebnisse der Urinuntersuchungen (Protein im Urin) und der Blutuntersuchungen der Mutter vor der Geburt (Thrombozyten, Glutamat-Oxalacetat- Transaminase (GOT), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Kreatinin) sowie das Geburtsgewicht und die Geburtsgewichtsperzentile des Neugeborenen (Tabelle 6). Dabei wurden die Kontroll- Personen bezüglich des Gestationsalters mit der PE-Gruppe abgeglichen.

Als Ausschlusskriterien galten: regelmäßige Medikamenteneinnahme, vorbestehende akute und chronische Erkrankungen, vorbestehende kardiovaskuläre Risikofaktoren wie Diabetes mellitus, Hypertonus, Nikotinkonsum während der Schwangerschaft sowie Mehrlingsschwangerschaften.

Die Laborbefunde, Dopplersonographiebefunde und Schwangerschaftsdaten wurden im Kreißsaal und während des Aufenthalts der Schwangeren auf der Mutter-Kind-Station (Station 82) der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) erhoben. Die Daten wurden anamnestisch sowie aus den Mutterpässen und den Patientenakten der Mütter gewonnen.

Schwangerschaftsbefunde und Laborbefunde der Studien-Probandinnen

Tabelle 6:Dargestellt sind dieSchwangerschaftsmerkmale der Studien-Probandinnen

Material und Methoden

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2.5 Materialgewinnung

Für die Studie wurden folgende Materialien benötigt:

 Einwilligung aller Schwangeren nach entsprechender Aufklärung

 Serum der Mütter beider Untersuchungsgruppen, gewonnen aus Venenblut

 Serum der Feten beider Untersuchungsgruppen, gewonnen aus Venen- und Arterienblut

 Nabelschnur der Schwangeren beider Untersuchungsgruppen

2.5.1 Einwilligung

Die Probandinnen wurden vor Studienteilnahme über den Ablauf der Studie, die Materialgewinnung und das Ziel der Studie aufgeklärt und willigten schriftlich ein, an der Studie teilzunehmen. Ein entsprechendes Ethikvotum der Ethikkommission der MHH zur Durchführung der Untersuchung lag vor.

2.5.2 Messungen der 25(OH) Vitamin D Serumkonzentrationen

Aus dem Kreißsaal der MHH wurde für die Studie vor der Geburt ein Serumröhrchen mit Blut der Schwangeren abgenommen. Unmittelbar nach der Geburt wurde ein Serumröhrchen mit Nabelschnurblut (Mischblut aus Nabelschnurarterien und –Vene) gewonnen. Dieses Blut wurde bei 1400 rpm zentrifugiert und der Überstand (das Serum) wurde bis zur 25(OH) Vitamin D Bestimmung in 1,5 ml Eppendorfgefäßen bei - 80 °C eingefroren.

Die Messungen der 25(OH) Vitamin D Konzentrationen der Seren wurden von Frau Radtke aus dem Labor der Gastroenterologie und Endokrinologie der MHH durchgeführt. Dabei wurde der ADVIA Centaur Vitamin D Total Test von der Firma SIEMENS verwendet. Bei dem Verfahren handelt es sich um einen kompetitiven Immunoassay. Dabei kommen ein kovalent an paramagnetische Partikel gebundener monoklonaler Anti-Flourescein-Antikörper der Maus, ein mit Acridiniumester markierter monoklonaler Anti-25(OH) Vitamin D Antikörper der Maus und ein mit Fluorescein markiertes Vitamin D Analogon zum Einsatz. Das Lichtsignal wird als relative Lichteinheit gemessen und ist

Material und Methoden

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umgekehrt proportional zur 25(OH) Vitamin D Konzentration in den Seren (Herstellerangaben der Firma SIEMENS, Deutschland).

2.5.3 Isolation der HUVECs

Die Isolation der Primärzellen aus Nabelschnüren erfolgte auf der Basis eines Protokolls von E.A. Jaffe

232, welches noch weiter modifiziert wurde.

Die Nabelschnur wurde bis zum Isolieren der Zellen kühl (bei 4 °C) gelagert und der Zeitraum zwischen der Entbindung und der Isolation betrug nicht länger als drei bis vier Tage.

Die HUVECs wurden unter sterilen Bedingungen unter einer Werkbank isoliert. Der Nabelschnurpuffer wurde bei Raumtemperatur verwendet und zunächst mit einer Pinzettenspitze Kollagenase (gelagert bei 4 °C) angereichert und dann mit einem sterilen Filter filtriert. Im nächsten Schritt wurden beide Enden der Nabelschnur mit einem sterilen Skalpell glatt abgeschnitten, so dass zwei kleinlumige Arterien und eine großlumige Vene zu sehen waren (Abbildung 4).

Querschnitt einer Nabelschnur

Abbildung 4: Querschnitt einer Nabelschnur mit zwei kleinlumigen Nabelschnurarterien und einer großlumigen Nabelschnurvene.

Material und Methoden

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Die Knopfkanülen wurden an beiden Enden in die Vene eingeführt und mit Kabelbindern fixiert.

Nachdem die Vene über die Knopfkanülen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) (37 °C) ausgespült worden ist, wurde sie an einem Ende mit einer 20 ml Spritze verschlossen und über das andere Ende prall mit Kollagenase gefüllt (Abbildung 5).

Präparierte Nabelschnur während der Inkubation

Abbildung 5: Mit Kollagenase gefüllte Nabelschnur während der Inkubation.

Anschließend wurde die Nabelschnur mit der Kollagenase für 25 min. bei 37 °C inkubiert. Nach Ablaufen der Inkubationszeit hatten sich die Endothelzellen von der Gefäßwand gelöst. Die Flüssigkeit wurde nun aus der Nabelschnur in ein 15 ml Röhrchen ausgestrichen und bei 800 rcf zentrifugiert.

Der Überstand wurde verworfen, das Zellpellet in 10 ml EC-Wachstumsmedium mit 2,44%

Supplements (Wachstumsfaktoren), 8% fetales Kälberserum (FKS) und 1,2% Penicillin/Streptomycin (EGM1) resuspendiert und in eine T75-Zellkulturflasche überführt. Am nächsten Tag erfolgte ein Mediumwechsel. Anschließend wurde dieser alle drei bis vier Tage durchgeführt.

Material und Methoden

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2.6 Zellkultur

Die HUVECs wurden bei 37 °C und 5 % C0₂ in T75-Zellkulturflaschen kultiviert, bis sie konfluent gewachsen waren. Anschließend wurden sie mittels Trypsin abgelöst und in Dimethylsulfoxid (DMSO) und EGM1 im Verhältnis eins zu zehn zunächst in einer Propanolbox bei – 80 °C (bis zum Abschluss des Mykoplasmentests) und anschließend in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Zur Vorbereitung auf die Versuche wurden HUVECs in EGM1 kultiviert. Die Versuche sind anschließend mit Endothelial Growth Medium mit Zusatz von 0,6% Supplements, 0,1% FKS und 1,2%

Penicillin/Streptomycin (EGM2) durchgeführt worden. HUVECs benötigen zum Überleben Zusätze zum regulären Kulturmedium, wie Wachstumsfaktoren und FKS. Die verwendeten Konzentrationen wurden so gering wie möglich gewählt, um mögliche Vitamin D Effekte nicht zu maskieren.

Alle Versuche sind mit HUVECs der Passage zwei bis sechs durchgeführt worden.

Die HUVECs wurden vor den Versuchen jeweils in T75-Zellkulturflaschen kultiviert (Abbildung 6 und 7) und nach Erreichen der Konfluenz in die für die Versuche vorgesehenen Petrischalen oder Zellkulturplatten ausgesät. Hierzu wurden die Zellen mittels Trypsin vom Flaschenboden abgelöst, mit Trypanblau angefärbt und in einer Neubauerzählkammer die Anzahl der Zellen gezählt.

Material und Methoden

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HUVECs am Tag 1 nach der Isolation

Abbildung 6:HUVECs am ersten Tag nach der Isolation (linkes Bild 100fache Vergrößerung, rechtes Bild 400fache Vergrößerung).

HUVECs fünf Tage nach der Isolation

Abbildung 7:HUVECs am fünften Tag nach der Isolation (100fache Vergrößerung).

Material und Methoden

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2.7 Mykoplasmentest

Die Studie wurde mit Primärzellen durchgeführt. Primärkulturen werden häufig von Erregern kontaminiert. Mykoplasmen gehören dabei zu den häufigen Übeltätern, die auch Veränderungen der Zelleigenschaften hervorrufen können. Aus diesem Grund wurden alle isolierten Zellen vor Versuchsbeginn auf die Kontamination mit Mykoplasmen getestet.

Von jeder verwendeten Zelllinie wurden 0,5 bis 1 Mio. Zellen für einen Mykoplasmentest in Stickstoff schockgefroren und bei – 20 °C gelagert.

Der Mykoplasmentest wurde von Dr. Natalia Bogdanova aus der Arbeitsgruppe Molekulare Gynäkologie unter der Leitung von Prof. Dr. rer. nat. Dörk-Bousset (Labor der Frauenklinik der MHH), im Rahmen der im Labor der Frauenklinik üblichen Routinetestung, durchgeführt. Der Mykoplasmentest basierte auf einer „nested“ PCR und anschließender Agarosegel-Elektrophorese. Es wurden 30 Mykoplasmenspezies getestet, die am häufigsten Zellkulturen kontaminieren. Um eine hohe Spezifität der PCR zu erreichen, wurden die Proben dreimal getestet.

2.8 Charakterisierung der HUVECs mittels Durchflusszytometrie

Diese Versuche wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Biochemie und Tumorbiologie unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. rer nat. Ralf Hass (Forschungslabor der Frauenklinik der MHH) durchgeführt.

Für die Durchflusszytometrie-Analyse wurden 1 Mio. Zellen in 1 ml PBS suspendiert. Um die Zellen zu fixieren, wurde anschließend tröpfchenweise eisgekühltes 96 %iges Ethanol (EtOH) hinzugegeben.

Die fixierten Zellen wurden dann bis zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS-Analyse) bei 4 °C gelagert.

Die HUVECs wurden mittels Durchflusszytometrie und mit einem Phycoerythrin-markierten Antikörper auf das Oberflächenmolekül Cluster der Differenzierung (CD) 90 und mit einem Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markierten Antikörper auf das Oberflächenmolekül CD31 untersucht.

Als Negativkontrolle diente ein R- Phycoerythrin (RPE)-markierter IgG1-Antikörper.

Die FACS-Analyse wurde mit leichter Modifikation nach dem Protokoll des Herstellers „Dako Cytomation Denmark A/S“ durchgeführt.

Material und Methoden

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Zunächst wurden die in EtOH fixierten HUVECs für 6 min. bei 320 xg zentrifugiert und der Überstand verworfen. Um unspezifische Bindungen zu verhindern, wurde jeweils 1 ml 2 % FKS in PBS hinzugefügt und bei 4 °C für 20 min. inkubiert. Als Nächstes erfolgte eine erneute Zentrifugation für 6 min. bei 320 xg mit Verwerfen des Überstandes. Anschließend wurden die Proben auf jeweils zwei FACS-Röhrchen aufgeteilt. In das erste FACS-Röhrchen wurden 5 µl des CD31-FITC-Antikörpers und 20 µl des CD90-Phycoerythrin-Antikörpers (Volumen wie vom Hersteller angegeben) hinzupipettiert und für 30 min. bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Als Negativkontrolle wurden die Proben in dem zweiten FACS-Röhrchen mit 5 µl Maus- IgG1-RPE-konjugiert versetzt und ebenfalls bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Als Letztes wurden die Proben zweimal mit 1 ml PBS gewaschen, für 6 min. bei 320 xg zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Proben wurden anschließend in 1 ml PBS aufgenommen und im Galaxy Durchflusszytometer mit der Partec FlowMax Software analysiert.

2.9 Matrigel-Angiogenese-Assay

Der Matrigel-Angiogenese-Assay eignet sich, um die in vitro Angiogenese Kapazität von Zellen zu quantifizieren.

Zellvorbehandlung: Es wurden 20.000 - 100.000 HUVECs in 2 ml EGM1 suspendiert und in jeweils vier Wells einer 6-Well-Platte ausgesät. Am nächsten Tag erfolgte ein Mediumwechsel. Sobald die HUVECs bis zu 70 % konfluent gewachsen waren, wurden die Zellen für 24 h mit dem jeweiligen Behandlungsmedium inkubiert.

Es wurde die Wirkung von 0,1 nM 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ und die Wirkung von 10 nM 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ im Vergleich zu dem dazugehörigen Kontrollmedium untersucht. Hierzu wurde die entsprechende 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Konzentration dem Zellkulturmedium (EGM2) zugegeben. Da 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ als lipophile Substanz in EtOH gelöst verwendet wurde, wurde dieses in jeweils äquivalenter Konzentration dem Kontroll-Medium zugegeben. Aus diesem Grund gibt es für beide 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Konzentrationen jeweils eine Kontrolle. Die Kontrolle der 0,1 nM 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Behandlung wird als Kontrolle 1 und die Kontrolle der 10 nM 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Behandlung als Kontrolle 2 bezeichnet.