Abbildung 9: Auf diesen Fotos ist exemplarisch die Migration der HUVECs einer gesunden Schwangeren (Probandin 14, Passage 3) unter dem Kontrollmedium 2 dargestellt. Das linke Foto zeigt die freigekratzte Fläche zum Zeitpunkt Null und auf dem rechten Foto ist das gleiche Well nach 18 h Inkubationszeit bei 37 °C und 5 % CO₂ abgebildet. Pro Versuch wurden für jedes Behandlungsmedium Duplikate angelegt. Die freie Fläche wurde in allen Fotos nachgezeichnet (siehe schwarze Markierung in den Fotos), und es wurde der Mittelwert der freien Fläche berechnet. Die nachgemessene freie Fläche zum Zeitpunkt 0 wurde als 100 % bzw. als 1 festgesetzt. Nach 18 h hat sich die freie Fläche durch Migration der Zellen verkleinert (rechtes Foto). Die durch Migration geschlossene Fläche berechnete sich wie folgt:
1. 1 = durch Migration geschlossene Fläche + durch Migration nicht geschlossenen Fläche
2. Durch Migration nicht geschlossene Fläche in Prozent = (1/freie Fläche T0 * freie Fläche T18)*100
3. Durch Migration geschlossene Fläche in Prozent = (1-(1/freien Fläche T0 * freie Fläche T18))*100
Material und Methoden
39
2.12 LDH-Assay
Der auf den Nachweis der LDH basierende Assay (In Vitro Toxikologie Assay Kit: Tox-7-1 Kit, Sigma Aldrich GmbH, Deutschland) wurde angewendet, um eine signifikante Zelltoxizität der verwendeten Behandlungsmedien und damit einen möglichen negativen Effekt auf das Zellverhalten auszuschließen.
Die Versuchsüberstände des Migrationsversuches und den dazugehörigen 100 % Kontrollen wurden hierfür eingesetzt. Die 100 % Kontrollen wurden parallel zum Migrationsversuch durch Aussäen einer äquivalenten Zellzahl und Gewinnung des Mediums sowie Trypsinierung der Zellen nach Erreichen der Konfluenz und 18-stündiger Inkubation in EGM1 gewonnen.
Die Versuchsüberstände, die 100 % Kontrollen und der in vitro Toxikologie Assay Kit wurden auf Eis aufgetaut. Der Kit beinhaltet LDH Assay Substrat (bei – 20 °C gelagert), Kofaktor (bei – 20 °C gelagert) und Farbstofflösung (bei - 4°C gelagert), welche wie vom Hersteller vorgegeben im gleichen Verhältnis miteinander den Master Mix bilden.
Die Zytoplasmamembran der HUVECs aus den 100 % Kontrollproben wurde durch starkes Resuspendieren zerstört, so dass die LDH freigesetzt wurde. Anschließend wurden jeweils 50 µl der Mediumüberstände bzw. 50 µl der resuspendierten 100 % Kontrollen in Duplikaten in eine 96-Well-Platte pipettiert. Als Leerwert wurden zwei Wells mit 50 µl EGM2 angelegt. In jedes der Wells wurden zuletzt 50 µl Master Mix pipettiert.
Nach 20 - 30 min. lichtgeschützter Inkubation wurde die Enzymreaktion durch Senken des pH-Wertes mittels 0,1 % Salzsäure gestoppt. In dieser Zeit katalysierte die durch das Resuspendieren frei gewordene LDH die Reduktion von Nikotinamidadenindinukleotid (NAD+) zum reduzierten Nikotinamidadenindinukleotid (NADH), welches benötigt wird, um Tetrazolium zu Formazan umzusetzen. Dadurch kommt es zu einem Farbumschlag der Proben, welcher vom Photometer Original Multiscan EX bei 492 nm detektiert wurde.
Die Intensität des Farbumschlages der Versuchsüberstände wurde mit der Intensität des Farbumschlages der 100 % Kontrollproben ins Verhältnis gesetzt und somit der prozentuale Anteil an toten Zellen berechnet.
Material und Methoden
40
2.13 RNA Isolation
Um RNA isolieren zu können, wurden die HUVECs zunächst in vier Petrischalen (100 x 20 mm) ausgesät. Sobald die Zellen zu 70 % konfluent gewachsen waren, erfolgte ein Mediumwechsel. Das EGM1 wurde verworfen, die Zellen mit PBS gewaschen und in jede Petrischale wurde eines der Behandlungsmedien (siehe Material und Methoden 2.9) pipettiert. Die Inkubationszeit betrug 24 h bei 37 °C.
Die RNA-Isolation erfolgte nach dem Protokoll von Chomczynski et al. 233, welches von unserer Arbeitsgruppe geringfügig modifiziert wurde. Alle Arbeitsschritte fanden auf Eis statt. Das Medium wurde nach der Inkubationszeit von 24 h verworfen und die Zellen mit gekühltem PBS gewaschen.
Anschließend wurde jeweils 1 ml kaltes PBS in die Petrischalen pipettiert, der Zellrasen mit einem Zellschaber abgekratzt, in Ribonuklease (RNase)-freie Eppendorfgefäße (mit Diethylpyrocarbonat [DEPC] gereinigt) pipettiert und bei 4000 rpm für 5 min. bei 4 °C zentrifugiert. Die Überstände wurden abpipettiert und die Zellpellets in 1 ml Total RNA Isolations Reagenz(Guanidiniumthiocyanat [GTC] und Phenol) resuspendiert.
Nach Zugabe von 200 µl Chloroform wurden die Eppendorfgefäße gut geschüttelt, für 10 min. auf Eis inkubiert und für 15 min. bei 12,000 rpm und 4 °C zentrifugiert.
Die obere wässrige Phase, in der sich die RNA befand, wurde in neue RNase-freie Eppendorfgefäße überführt und erneut Chloroform im Verhältnis 1:1 hinzu pipettiert. Die Eppendorfgefäße wurden gut geschüttelt und für 10 min. auf Eis inkubiert, bevor sie dann für 10 min. bei 12,000 rpm und 4 °C zentrifugiert wurden. Nach Überführung der Überstande in neue RNase freie Eppendorfgefäße und Versetzen mit Isopropanol im Verhältnis zwei zu drei wurde nach gutem Durchmischen und einer zehnminütigen Inkubation auf Eis für 15 min., bei 12,000 rpm und 4 °C zentrifugiert.
Anschließend wurden die Überstände verworfen und die Pellets mit 75 % Uvasol gewaschen. Dafür wurde zu jedem Pellet 500 µl 75 % Uvasol pipettiert, leicht geschüttelt und für 5 min. bei 12,000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Die RNA enthaltenden Pellets wurden nun mit jeweils 25 µl DEPC-Wasser verdünnt.
Material und Methoden
41
2.14 RNA-Konzentrationsmessung
Zunächst wurden jeweils 2 µl der verdünnten RNA mit 98 µl DEPC-Wasser versetzt. Diese 100 µl wurden dann in ein Photometer pipettiert. Das Photometer misst die optische Dichte (OD) der RNA bei einer Wellenlänge von 260 nm (OD₂₆₀), das ist das Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren. Die optische Dichte von eins bei einer Wellenlänge von 260 nm, entspricht dabei einer RNA-Konzentration von 40 µg/ml. Aus dieser Information lässt sich folgende Formel herleiten, mit der die RNA-Konzentration der Proben berechnet werden kann:
RNA-Konzentration (µg/ml) = OD₂₆₀ x 40 µg/ml x Verdünnungsfaktor.
Des Weiteren kann die Reinheit der isolierten RNA bestimmt werden. Dazu wird zum einen der Quotient zwischen OD bei dem Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren (OD₂₆₀) und der OD bei dem Absorptionsmaximum von Proteinen (OD₂₈₀) gebildet. Liegt dieser Quotient bei ≥ 1,8, ist die RNA rein. Ist der Quotient signifikant kleiner, ist die RNA durch Proteine kontaminiert. Zum anderen wird der Quotient aus OD₂₆₀ und OD₂₃₀ bestimmt. Dieser prüft die Verunreinigung der RNA durch Polysaccharide, Phenol oder ähnliches. Beträgt dieser Wert ≤ 1, so ist die RNA, z.B. bei der Isolation durch Phenol, verunreinigt worden 234-236.
Um eine Denaturierung der DNA auszuschließen, wurden jeweils 2 µl RNA mit 2 µl Auftragspuffer versetzt und in das Gel aus 1 % Agarose pipettiert, welches sich in einer mit 1x TBE-Puffer (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, Borsäure und Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]) gefüllten Pufferkammer befand. Anschließend wurde für 20 min. eine Spannung von 100 V angelegt.
Nukleinsäuren sind aufgrund ihrer Phosphatgruppen negativ geladen und wandern somit zur Anode (Pluspol). Die RNA wird ihrer Größe nach aufgetrennt. Dabei wandern kleinere Fragmente schneller als größere Fragmente.
Der Auftragspuffer enthielt Bromphenolblau und diente der Anfärbung der RNA. Auf diese Weise konnte man sehen, wie weit die RNA in der angelegten Spannung gewandert ist und somit bestimmen wie lang die Spannung angelegt werden muss. Dem Agarosegel wurde GelRed beigefügt (1 µl Gel/ml Agarosegel). GelRed ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der zwischen den Basen der RNA interkaliert. Auf diese Weise wird die Fluoreszenz unter UV-Licht verstärkt und die RNA sichtbar. Bei intakter RNA wurden unter UV-Licht zwei Banden sichtbar, die 28S und 18S- ribosomale RNA (rRNA) Bande (siehe Abbildung 10) 236,237.
Material und Methoden
42