Abbildung 6:HUVECs am ersten Tag nach der Isolation (linkes Bild 100fache Vergrößerung, rechtes Bild 400fache Vergrößerung).
HUVECs fünf Tage nach der Isolation
Abbildung 7:HUVECs am fünften Tag nach der Isolation (100fache Vergrößerung).
Material und Methoden
33
2.7 Mykoplasmentest
Die Studie wurde mit Primärzellen durchgeführt. Primärkulturen werden häufig von Erregern kontaminiert. Mykoplasmen gehören dabei zu den häufigen Übeltätern, die auch Veränderungen der Zelleigenschaften hervorrufen können. Aus diesem Grund wurden alle isolierten Zellen vor Versuchsbeginn auf die Kontamination mit Mykoplasmen getestet.
Von jeder verwendeten Zelllinie wurden 0,5 bis 1 Mio. Zellen für einen Mykoplasmentest in Stickstoff schockgefroren und bei – 20 °C gelagert.
Der Mykoplasmentest wurde von Dr. Natalia Bogdanova aus der Arbeitsgruppe Molekulare Gynäkologie unter der Leitung von Prof. Dr. rer. nat. Dörk-Bousset (Labor der Frauenklinik der MHH), im Rahmen der im Labor der Frauenklinik üblichen Routinetestung, durchgeführt. Der Mykoplasmentest basierte auf einer „nested“ PCR und anschließender Agarosegel-Elektrophorese. Es wurden 30 Mykoplasmenspezies getestet, die am häufigsten Zellkulturen kontaminieren. Um eine hohe Spezifität der PCR zu erreichen, wurden die Proben dreimal getestet.
2.8 Charakterisierung der HUVECs mittels Durchflusszytometrie
Diese Versuche wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Biochemie und Tumorbiologie unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. rer nat. Ralf Hass (Forschungslabor der Frauenklinik der MHH) durchgeführt.
Für die Durchflusszytometrie-Analyse wurden 1 Mio. Zellen in 1 ml PBS suspendiert. Um die Zellen zu fixieren, wurde anschließend tröpfchenweise eisgekühltes 96 %iges Ethanol (EtOH) hinzugegeben.
Die fixierten Zellen wurden dann bis zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS-Analyse) bei 4 °C gelagert.
Die HUVECs wurden mittels Durchflusszytometrie und mit einem Phycoerythrin-markierten Antikörper auf das Oberflächenmolekül Cluster der Differenzierung (CD) 90 und mit einem Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markierten Antikörper auf das Oberflächenmolekül CD31 untersucht.
Als Negativkontrolle diente ein R- Phycoerythrin (RPE)-markierter IgG1-Antikörper.
Die FACS-Analyse wurde mit leichter Modifikation nach dem Protokoll des Herstellers „Dako Cytomation Denmark A/S“ durchgeführt.
Material und Methoden
34
Zunächst wurden die in EtOH fixierten HUVECs für 6 min. bei 320 xg zentrifugiert und der Überstand verworfen. Um unspezifische Bindungen zu verhindern, wurde jeweils 1 ml 2 % FKS in PBS hinzugefügt und bei 4 °C für 20 min. inkubiert. Als Nächstes erfolgte eine erneute Zentrifugation für 6 min. bei 320 xg mit Verwerfen des Überstandes. Anschließend wurden die Proben auf jeweils zwei FACS-Röhrchen aufgeteilt. In das erste FACS-Röhrchen wurden 5 µl des CD31-FITC-Antikörpers und 20 µl des CD90-Phycoerythrin-Antikörpers (Volumen wie vom Hersteller angegeben) hinzupipettiert und für 30 min. bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Als Negativkontrolle wurden die Proben in dem zweiten FACS-Röhrchen mit 5 µl Maus- IgG1-RPE-konjugiert versetzt und ebenfalls bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Als Letztes wurden die Proben zweimal mit 1 ml PBS gewaschen, für 6 min. bei 320 xg zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Proben wurden anschließend in 1 ml PBS aufgenommen und im Galaxy Durchflusszytometer mit der Partec FlowMax Software analysiert.
2.9 Matrigel-Angiogenese-Assay
Der Matrigel-Angiogenese-Assay eignet sich, um die in vitro Angiogenese Kapazität von Zellen zu quantifizieren.
Zellvorbehandlung: Es wurden 20.000 - 100.000 HUVECs in 2 ml EGM1 suspendiert und in jeweils vier Wells einer 6-Well-Platte ausgesät. Am nächsten Tag erfolgte ein Mediumwechsel. Sobald die HUVECs bis zu 70 % konfluent gewachsen waren, wurden die Zellen für 24 h mit dem jeweiligen Behandlungsmedium inkubiert.
Es wurde die Wirkung von 0,1 nM 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ und die Wirkung von 10 nM 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ im Vergleich zu dem dazugehörigen Kontrollmedium untersucht. Hierzu wurde die entsprechende 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Konzentration dem Zellkulturmedium (EGM2) zugegeben. Da 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ als lipophile Substanz in EtOH gelöst verwendet wurde, wurde dieses in jeweils äquivalenter Konzentration dem Kontroll-Medium zugegeben. Aus diesem Grund gibt es für beide 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Konzentrationen jeweils eine Kontrolle. Die Kontrolle der 0,1 nM 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Behandlung wird als Kontrolle 1 und die Kontrolle der 10 nM 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Behandlung als Kontrolle 2 bezeichnet.
Material und Methoden
35
Matrigelvorbereitungen: Eine 96-Well-Platte, 200 µl-Pipettenspitzen und das Matrigel (zuvor gelagert bei -20°C) wurden über Nacht bei 4 °C und am Versuchstag vor Versuchsbeginn 1 h auf Eis gelagert.
Versuchsdurchführung: Für jede Versuchskonzentration wurden drei Wells der 96-Well-Platte mit 30 µl Matrigel luftblasenfrei befüllt und für 10 min. bei Raumtemperatur und weitere 40 min. bei 37 °C ausgehärtet. Die vorbehandelten HUVECs wurden mit Trypsin gelöst, mit Trypanblau gefärbt und in der Neubauerzählkammer gezählt.
Für den Matrigel-Angiogenese-Versuch wurden 8.000 Zellen/Well der 96-Well-Platte in 150 µl Behandlungsmedium ausgesät.
Nach sechs Stunden Inkubation bei 37 °C wurde jedes Well mit dem Mikroskop LEICA DMI 6000 B fotografiert.
Versuchsauswertung: Die im Matrigel ausgebildeten Tubuli wurden nach dem Fotografieren mittels Wacom Tablet und Image-J-Programm quantifiziert.
Aus den nachgezeichneten Tubuli (Abbildung 8) wurde mittels Image J Programm die Gesamtlänge aller Tubuli pro Well errechnet. Aus den drei Gesamt-Tubuli-Längen/Well pro Versuchsgruppe wurde der Mittelwert ermittelt. Die Auswertung erfolgte jeweils durch zwei voneinander unabhängige Auswerter. Aus diesen Ergebnissen wurde erneut der Mittelwert der Gesamt-Tubuli-Längen pro verwendete Versuchskonzentration errechnet.
Beim Vergleich der Tubulibildung der HUVECs der PE-Patientinnen im Vergleich zur Tubulibildung der HUVECs der Kontroll-Patientinnen, wurden die Mittelwerte der Tubulilänge der Patientinnen-Gruppen einander als Rohdaten im Säulendiagramm gegenübergestellt. Von diesen Rohdaten wurde die Standardabweichung berechnet. Anschließend wurde die Signifikanz der Unterschiede der Rohdaten beider Gruppen mit dem unpaarigen zweiseitigen t-Test analysiert.
Beim Vergleich der Ergebnisse unter 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Behandlung mit den Ergebnissen der Kontrolle wurden die Ergebnisse unter 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Behandlung als Vielfaches der Kontrolle dargestellt. Dabei wurde der Mittelwert der Rohdaten der Tubulibildung der HUVECs jeder Patientin unter 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Behandlung durch den jeweiligen Mittelwert der Rohdaten der Tubulibildung nach Inkubation im dazugehörigen Kontrollmedium dividiert. Somit war die Tubulibildung nach Inkubation im Kontrollmedium gleich 1 und die Tubulibildung unter 1,25(OH)₂ Vitamin D₃ Behandlung war ein Vielfaches der Kontrolle. Diese Daten dienten der Berechnung der
Material und Methoden
36
Standardabweichung. Die Signifikanz der Unterschiede der beiden Gruppen wurde anschließend anhand der Rohdaten mit dem paarigen zweiseitigen t-Test berechnet.
Die Berechnung der Ergebnisse und die Darstellung im Säulendiagramm erfolgten in allen Versuchen nach dem gleichen Schema.