Untersuchungen zur Bedeutung der induzierbaren Cyclooxygenase für die Atherogenese bei Cholesterin-gefütterten Kaninchen

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Untersuchungen zur Bedeutung der induzierbaren Cyclooxygenase für die Atherogenese bei

Cholesterin-gefütterten Kaninchen

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae – ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Marion Wurr

aus Heessen

Hannover 2013

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Kleintiere, Tierärztliche Hochschule Hannover)

Univ.-Prof. Dr. Dirk O. Stichtenoth (Institut für Klinische Pharmakologie, Medizinische Hochschule Hannover)

1. Gutachter: Prof. Dr. Ingo Nolte

2. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann

Tag der mündlichen Prüfung: 24.04.2013

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Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis

1 Einleitung 9

2 Literaturübersicht 11

2.1 Pathogenese der Atherosklerose 11

2.2 Prostaglandine, Cyclooxygenase und NSAR 14

2.2.1 Prostaglandine 2.2.2 Cyclooxygenase 2.2.3 NSAR

2.2.4 Selektive und hochselektive COX-2-Hemmung 2.2.5 NSAR-Klassifikation nach COX-Selektivität 2.2.6 NSAR und Atherosklerose

2.3 Isoprostane 20

2.3.1 Biologische Aktionen von Isoprostanen

2.4 DHEA und Atherogenese 24

2.5 Stickstoffmonoxid 25

3 Ziele der Studie 27

4 Material und Methoden 28

4.1 Versuchstiere und Induktion der Atherogenese 28 4.1.1 Versuchstiere

4.1.2 Haltung und Fütterung

4.2 Versuchskollektive und Studienablauf 30

4.2.1 Arbeitsprogramm für das Versuchskollektiv: gesunde Kontrolle 4.2.2 Arbeitsprogramm für das Versuchskollektiv: Cholesterinkontrolle 4.2.3 Arbeitsprogramm für das Versuchskollektiv: DHEA

4.2.4 Arbeitsprogramm für das Versuchskollektiv: Celecoxib

4.3 Verwendete Medikamente: Celecoxib und DHEA 33 4.3.1 Celecoxib

4.3.2 DHEA

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4.4.2 Sammlung von 24h-Urin

4.4.3 Perorale Applikation der angewandten Präparate 4.4.4 Blutentnahme

4.4.5 Tötung der Tiere und Präparation der Aorta

4.5 Bestimmung von Kreatinin im 24h-Urin 38

4.6 Messung der Prostanoide Urin mittels Gaschromatographie/Tandem- 38 Massenspektrometrie (GC/MS-MS)

4.6.1 Messung von 2,3-dn-6-keto-PGF1α und 2,3-dn-TxB2 39 4.6.1.1 Probenvorbereitung und Trennung der dinor-Metabolite

4.6.1.2 Weitere Aufarbeitung und Derivatisierung des 2,3-dn-6-keto-PGF 1α

4.6.1.3 Weitere Aufarbeitung und Derivatisierung des 2,3-dn-TxB2

4.6.1.4 Messung der dinor-Metabolite mittels GC/MS-MS

4.6.2 Messung von PGE2 und PGE-M 42 4.6.2.1 Probenvorbereitung und Trennung von PGE2 und PGE-M

4.6.2.2 Messung

4.6.3 Bestimmung von 8-iso-PGF^2α 44 4.6.3.1 Probenvorbereitung

4.6.3.2 Messung

4.7 Bestimmung von Nitrat und Nitrit im Urin 47

4.7.1 Probenvorbereitung 4.7.2 Messung mittels GC/MS

4.8 Messung von Triglyceriden und Gesamtcholesterin im Plasma 48

4.9 Messung der Plättchenaggregation im Plasma 49

4.10 Messung des Anteils von Plaques an der Gesamtoberfläche der Aorta 49

4.11 Statistische Analyse 50

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5.1 Physiologische Parameter 51 5.1.1 Körpergewicht

5.1.2 Futter

5.2 Kreatinin 51

5.3 Prostanoide 54

5.3.1 8-iso-PGF2a

5.3.2 2,3-dn-6-keto-PGF1a 5.3.3 2,3-dn-TXB2

5.3.4 PGE2 5.3.5 PGE-M

5.4 Nitrat und Nitrit im 24h-Urin 59

5.4.1 Nitrat 5.4.2 Nitrit

5.5 Triglyceride und Gesamtcholesterin im Plasma 59 5.5.1 Cholesterin

5.5.2 Triglyceride

5.6 Plättchenaggregation 63

5.7 Plaques-Planimetrie 64

5.8 Synapsis der Ergebnisse 65

6 Diskussion 69

7 Zusammenfassung 71

Conclusion 74

8 Referenzen 76

9 Anhang 84

9.1 Medikamente, chemische Substanzen und Lösungen 9.2 Material und Ausrüstung

9.3 Experimentelle Diäten

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Abb. Abbildung Abs. Absatz

ADP Adenosindiphosphat

BSTFA NO-bis-Trimethylsilyl-trifluoracetamid COX Cyclooxygenase

bzw beziehungsweise

d Tag

DHEA Dehydroepiandrostenon

EDRF endothelium-derived relaxing factor et al. und andere

eV Elektronenvolt

Fa. Firma

GC Gaschromatographie

GC/MS/MS Gaschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie ggr. geringgradig

h Stunde

HDL high density lipoprotein

HPLC high-performance liquid chromatography ID

i.v. intravenös

KG Körpergewicht

LDL low density lipoprotein

MCP-1 monocyte-derived chemotactic protein 1 MDGF macrophage-derived growth factor MEZ mitteleuropäische Zeit

ml Milliliter

mg Milligramm

min Minute

µA Mikroampére

mM mikromolar

MO

MS Massenspektrometrie

n Anzahl

NO Stickstoffmonoxid

NSAR nicht-steroidale Antirheumatika

PDGF plättchen-assoziierter Wachstumsfaktor (platelet-derived growth factor)

PG Prostaglandin

PGE-M Prostaglandin E – majory urine metabolite p.o. per os

PPP plättchenarmes Plasma (platelet poor plasma) PRP plättchenreiches Plasma (platelet rich plasma) SD Standardeviation

SPF spezifisch pathogenfrei s.S. siehe Seite

Tab. Tabelle TGL Triglyceride

TX Thromboxan

u.a. unter anderem

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Abb. 1: Gewichtsentwicklung 52

Abb. 2: Futteraufnahme 53

Abb. 3: zeitlicher Verlauf der Werte von 8-iso-PGF2a bezogen auf Kreatinin im 24h-Urin 54 Abb. 4: zeitlicher Verlauf der Werte von 2,3-dn-6keto-PGF1a bezogen auf Kreatinin 55

im 24h-Urin Abb. 5: zeitlicher Verlauf der Werte von 2,3-dn-TXB2 bezogen auf Kreatinin im 24h-Urin 56 Abb. 6: zeitlicher Verlauf der PGE2-Werte bezogen auf Kreatinin im 24h-Urin 57

Abb. 7: zeitlicher Verlauf der PGE-M-Werte bezogen auf Kreatinin im 24h-Urin 58

Abb. 8: zeitlicher Verlauf der Nitratwerte bezogen auf Kreatinin im 24h-Urin 59

Abb. 9: zeitlicher Verlauf der Nitritwerte bezogen auf Kreatinin im 24h-Urin 60

Abb. 10: zeitlicher Verlauf der Gesamtcholesterinwerte im Plasma 62

Abb. 11: zeitlicher Verlauf der Triglycerid-Werte im Plasma 63

Abb. 12: ADP-induzierte (2 mM ADP) Thrombozytenaggregation im Zeitverlauf 64

Abb. 13: ADP-induzierte (4mM ADP) Thrombozytenaggregation im Zeitverlauf 64

Abb. 14: ADP-induzierte (10 mM ADP) Thrombozytenaggregation im Zeitverlauf 65

0, 4, 8 und 12 Wochen Abb. 15: ADP-induzierte (20 mM ADP) Thrombozytenaggregation im Zeitverlauf 65

Abb. 16: Vergleich der planimetrisch gemessenen Plaques zwischen den vier Kollektiven 66

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Tab. 1: Biologische Rolle der konstitutiven und induzierbaren Cyclooxygenase 16 Tab. 2: NSAR-Klassifikation nach COX-Isoenzymselektivität 19

Tab. 3: Gesamtübersicht über den Studienablauf 31

Tab. 4: Arbeitsprogramm des Versuchskollektives gesunde Kontrolle 30 Tab. 5: Arbeitsprogramm des Versuchskollektives Cholesterinkontrolle 30 Tab. 6: Arbeitsprogramm des Versuchskollektives DHEA 31 Tab. 7: Arbeitsprogramm des Versuchskollektives Celecoxib 31

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1 Einleitung

Die Atherosklerose (griechisch: `atheroma` = Grützbeutel; sklero, hart) ist beim Menschen die häufigste Erkrankung des mittleren und höheren Lebensalters und das Herz- und

Kreislaufversagen als deren Folge die häufigste Todesursache (Lehnert, 1991). Laut WHO- Definition ist die Atherosklerose eine variable Kombination von Veränderungen der Intima, bestehend aus herdförmigen Ansammlungen von Fettsubstanzen, komplexen Kohlenhydraten, Blut und Blutbestandteilen, Bindegewebe und Calciumablagerungen, verbunden mit Verän- derungen der Arterienmedia.

Wenn es gelänge, diese Krankheit zu verhindern, würde die durchschnittliche Lebenser- wartung um 11 Jahre steigen. Als Risikofaktoren für die Atherosklerose gelten in erster Linie hohe Cholesterinspiegel, daneben Übergewicht, Hypertonie, Diabetes und Gicht

(Lehnert, 1991).

Nach derzeitigem Stand der Wissenschaft werden die Risikofaktoren für die Atherosklerose (bsp. durch Einstellung einer Hypertonie, Cholesterinsenkung) vorbeugend beeinflusst und bei vorliegender Atherosklerose die Prophylaxe mit Thrombozyten-Aggregationshemmern wie Acetylsalicysäure durchgeführt. Stetig werden neue Möglichkeiten gesucht. Neue An- sätze sind die Behandlung mit NSAR (nicht-steroidalen Antirheumatika) der neueren Gene- ration sowie mit dem Steroidhormon DHEA (Dehydroepiandrosteron) (Crea et al., 1997;

Khaw et al., 1996). Unter der Medikation mit dem Steroidhormon DHEA konnte im Tier- modell eine signifikante Reduktion der Plaquegröße (bis zu 50 % gegenüber der Kontroll- gruppe) nachgewiesen werden (Gordon et al., 1988).

Nicht-steroidale Antirheumatika (NSAR) bewirken im Atherosklerosemodell beim Kaninchen eine signifikante Senkung der Atheroskleroserate (Sun et al., 1993; Lehnert, 1991). Als möglicher anti-atherosklerotischer Wirkmechanismus der NSAR wird die Hemmung der proinflammatorischen Prostanoidsynthese in der Gefäßwand diskutiert

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(Bailey et al., 1979). Das Schlüsselenzym für die Synthese von Prostaglandinen ist die Cyclooxygenase (COX) (Stichtenoth et al., 1998). Dabei werden seit 1990 (Fu et al., 1990) ein konstitutives (COX-1) und ein induzierbares (COX-2) Isoenzym der Cyclooxygenase unterschieden. “Die COX-1 ist für die physiologische Prostanoid-Synthese verantwortlich“

(Stichtenoth et al., 1998). Die COX-2 jedoch wird “erst unter dem Einfluß von Zytokinen oder Endotoxin exprimiert, so dass sie sich vor allem in entzündlich verändertem Gewebe findet“ (Stichtenoth et al., 1998). Die verschiedenen NSAR weisen Unterschiede in ihrer Isoenzymselektivität auf. Neuere NSAR haben eine höhere COX-2-Selektivität.

Hochselektive COX-2-Inhibitoren wie Celecoxib können neben ihrem „klassischen“

Indikationsgebiet, den rheumatischen Erkrankungen, eine Bedeutung für die Prophylaxe der Atherosklerose besitzen, wofür herkömmliche NSAR wegen ihrer Toxizität (Magenulcus, Magenperforation und gastrointestinale Blutung) nicht geeignet sind (Bazan et al., 1998).

Dieses mögliche Anwendungsgebiet ist wegen der Diskussion um das kardiovaskuläre Risiko der hochselektiven COX-2-Inhibitoren in Vergessenheit geraten. Nach dem derzeitigen Stand der Wissenschaft besitzen jedoch alle NSAR ein solches Risiko, als gemeinsamer

Mechanismus wird die NaCl / Wasserretention als typische unerwünschte Wirkung der NASR diskutiert (Rader, 2007). Demgegenüber stehen therapeutisch erwünschte Effekte der NSAR wie die Hemmung der Entzündungsaktivität im atheromatösen Plaque und antioxidative Wirkungen mit konsekutiver Verbesserung der Verfügbarkeit von Stickstoffmonoxid, dessen Mangel die Ursache der endothelialen Dysfunktion bei der Atherosklerose ist (Stichtenoth, 1997).

Ziel der Studie war daher zu untersuchen, welche Bedeutung sowohl die COX-2 und die von diesem Enzym gebildeten Prostanoide, als auch die wahrscheinlich COX-unabhängigen Isoprostane für die Atherosklerose besitzen.

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2 Literaturübersicht

2.1 Pathogenese der Atherosklerose

Die Atherosklerose ist ein komplexer, multifaktorieller Prozeß, welcher verschiedene Zell- typen und zahlreiche Systeme beeinflusst. Die folgenden zellulären Prozesse sind an der Pathogenese atherosklerotischer Läsionen beteiligt.

1. Den Endothelzellen kommt bei der Entstehung der atherosklerotischen Plaques eine Schlüsselrolle zu. Verschiedene Ursachen wie Hypertonie, Hypercholesterinämie, Diabetes Mellitus, Zirkulation von Immmunkomplexen, virale Infektionen (z.B. Herpesviren) oder chemische Irritationen führen zu einer Verletzung und damit zu einer Dysfunktion des Gefäßes (Badminon et al., 1993 ; Libby, 1997 ; Jackson, 1997).

Es ist erwiesen, dass sich die normale vaskuläre Freigabe von Vasodilatatoren und -kontraktoren (Stickstoffmonoxid NO und Endothelin-1) als Antwort auf zirkulierende Agonisten ändern kann und damit den lokalen, luminalen Querschnitt verringern, das Endothel verändern und die lokalen Interaktionen zwischen zirkulierenden Zellen und dem Endothel steigern kann (Lüscher et al., 1993). Ist das Endothel einmal beschädigt, haften sich Plättchen an, aggregieren und setzen viele vasoaktive Faktoren frei - einschließlich des Plättchen-assozierten Wachstumsfaktors (platelet-derived growth factor / PDGF), welcher die Zellproliferation stimuliert (Ross, 1993) und Thromboxan A2, welches Vasokonstriktion und weitere Plättchenaggregation hervorruft (Hollenberg, 1991; Pill et al., 1990).

2. Rekrutierung und Akkumulation von Monocyten / Makrophagen und Lipiden in der Arterienwand:

Das Anhaften von Monocyten an das Endothel ist eine der am frühesten zu beobachtenden Abnormalitäten der Gefäßwand bei hypercholesterinämischen Tieren (Ross, 1993). Parallel dazu erscheint eine verminderte Relaxation, welche durch EDRF vermittelt wird (Cohen et

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al., 1988 ; Selke et al., 1990). Durch das Fehlen von NO kommt es zur endothelialen Dys- funktion. Von Monocyten hergeleitete Makrophagen wandern aktiv in die Intima, ingestieren Lipide und produzieren eine Reihe von Zytokinen und Wachstums- faktoren. Diese Stoffe führen zu einer Einwanderung und Proliferation von Gefäß-Muskelzellen und stehen im Verdacht, lokale Nekrosen zu verursachen (Falk, 1996).

3. Modifikation und Ablagerung von Lipiden:

Klinische und experimentelle Studien haben erwiesen, dass die Lipide, die sich in atherosklerotischen Läsionen anreichern, sich vor allem vom Plasma-LDL herleiten (Goldstein and Brown, 1977; Steinberg et al., 1989), welches entweder acetyliert oder konjugiert (Steinberg et al.,1989) mit Malondialdehyd, einem Aldehyd-Produkt der Lipidperoxidation von Endo- thelzellen, glatten Muskelzellen oder Makrophagen, vorkommt (Cathcart et al., 1985; Haber- land et al., 1990 ; Morel et al., 1984 ; Naito et al. 1985). Das oxidativ modifizierte LDL wird schnell von Makrophagen-Rezeptoren aufgenommen (Goldstein et al., 1979). Oxidiertes LDL (oxLDL) ist stark cytotoxisch (Witztum and Steinberg, 1991). Einmal in der Gefäßwand gebildet, kann oxLDL das Endothel direkt verletzen. Aufgrund ihrer radikalischen Entstehung werden die Isoprostane als In-vivo-Marker für diesen oxidativen Streß diskutiert (Lipsky et al., 1997; Roberts et al., 1995). Isoprostane, wie bsp. 8-iso-PGF2α, sind Prostaglandin- ähnliche Substanzen, die in vivo aus Arachidonsäure durch freie Radikal-katalysierte Peroxidation entstehen (Morrow et al., 1991; Roberts et al., 1997 ; Morrow et al., 1997).

Unter den Isoprostanen ist 8-iso-PGF2α das biologisch potenteste und quantitativ

bedeutsamste (Morrow et al., 1994). Eine Erhöhung der In-vivo-Bildung von Isoprostanen ist bei einer Reihe von Krankheitsbildern wie dem hepatorenalem Syndrom (Morrow et

al., 1993), koronaren Herzerkrankungen (Delanty et al., 1997), Diabetes Mellitus (Gopaul et al., 1995) und Atherosklerose (Practico et al., 1996) beobachtet worden.

Das oxidierte LDL verursacht funktionelle Veränderungen in den Endothelzellen, welche die

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Penetration von zirkulierenden Monocyten und die Aufnahme von LDL in den subendothelialen Raum begünstigen. Dieses beschleunigt die Bildung von "fatty streaks“, eine An- sammlung lipidspeichernder Schaumzellen (Steinberg et al.,1989). Diese frühe Form eines atherosklerotischen Plaques kann sich noch zurückbilden, entwickelt sich bei einem Fort- schreiten des Prozesses jedoch zu einem Atherom weiter. LDL ist chemotaktisch und induziert die Synthese von Monozyten-chemotaktischem Protein-1 (MCP-1) durch Endothel- zellen und glatte Muskelzellen (Cushing et al., 1990). Makrophagen können einen mitogenen Faktor - ähnlich dem PDGF- den Makrophagen-assoziierten Wachsstumsfaktor (MDGF) bilden, welcher eine Rolle in der Proliferation der glatten Muskelzellen und der Neovaskula- risation von Plaques spielt (Prieto et al., 1988, Shimokado et al., 1985).

4. Beim Fortschreiten des atherosklerotischen Prozesses kommt es sekundär zu einer Migration der glatten Muskelzellen aus der Media zur Intima und Proliferation von Bindegewebe mit dem Resultat der Formation einer subendothelialen fibromuskulären Kappe, welche die Integrität des Arterienlumens in einem erheblichen Maß beschädigen kann und zu einem Verlust der natürlichen Dehnbarkeit der Gefäße führt (Falk, 1996; Steinberg, 1997).

5. Die Nekrose von Bindegewebe an der Plaque-Basis führt zu der Bildung eines weichen, verformbaren atheromatösen Pools. Wenn dieser in Relation zu der fibromuskulären Kappe massiv ist, kommt es durch den Thrombus zum Gefäßverschleiß und es kann ein Plaque-Bruch auftreten. Durch die gebildeten Thromben kommt es zu Gefäßverschlüssen und thrombembolischen Komplikationen (Falk, 1996).

Große Forschungsmühen wurden zur Klärung dieser Pathogenese-Mechanismen aufgewendet, wie auch im Bereich der Suppression und Regression von atherosklerotischen Läsionen. Als Konsequenz wurden verschiedene Substanzen wie Anti-Oxidantien, Lipidsenker, L-Arginin,

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Calcium-Antagonisten und bereits einige NSAR auf ihre mögliche Bedeutung bei der Inhi- bition des atherosklerotischen Prozesses untersucht (Bippi et al.,1990; Bode-Böger et al.

1997 ; Leese et al., 2000; Phivtong-ngam et al., 1998; Stichtenoth et al., 1996).

2.2 Prostaglandine, Cyclooxygenase und nichtsteroidale Antirheumatika

2.2.1 Prostaglandine

Prostaglandine sind wichtige Mediatoren der Entzündung und werden aus Arachidonsäure synthetisiert. Arachidonsäure ist für die Prostaglandinproduktion nicht in freier Form ver- fügbar. Aus diesem Grund ist als initialer Schritt der Prostaglandinsynthese die Freisetzung von Arachidonsäure durch die Phospholipase erforderlich (Vane, 1998). Im Anschluß katalysiert das bifunktionale Enzym Cyclooxygenase die Oxidation von Arachidonsäure zu dem cyclischen Endoperoxid PGG2, und eine Peroxidase reduziert die C15-Hydroperoxid- Verbindung zu Hydroxyl-PGH2. Ausgehend von PGH2 werden die verschiedenen Prostanoide (Prostaglandine, Thromboxan und Prostacyclin) in verschiedenen Zellen auf charakteris- tischen Wegen synthetisiert (Frölich, 1997).

PGE2, Prostacyclin und Thromboxan A2 sind biologisch aktive Arachidonsäuremetaboliten.

Die primären Prostanoide werden katabolisiert via Oxidation und Reduktion zu 15-oxo-13,14- dihydro-Prostanoiden. Diese Metabolite sind im Plasma mäßig stabil und haben eine nur geringe biologische Aktivität. Sie werden durch b-Oxidation zu dinor- und tetranor-Meta- boliten degradiert, welche via w-Oxidation weiter transfomiert werden zu w-Carboxyl-Meta- boliten (Fauler et al., 1994). PGE-M, 2,3-dinor-6-oxo-PGF1a und 2,3-dinor-TxB2 sind die Hauptmetaboliten von PGF2, Prostacyclin und Thromboxan im Urin beim Menschen und anderen Säugetieren (Fauler et al., 1994). Die Messung dieser Metabolite im Urin mittels Gas- chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (GC/MS-MS) ermöglicht die Erfassung des

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Prostanoid-Stoffwechsels in vivo (Tsikas et al., 2000).

2.2.2 Cyclooxygenase:

“Seit 1990 werden, allgemein anerkannt, ein konstitutives und ein induzierbares Isoenzym der Cycylooxygenase unterschieden: Die konstitutive Cyclooxygenase (COX-1) ist für die physiologische Prostanoidsynthese verantwortlich und liegt in fast allen Zelltypen ständig vor;

die gebildeten Prostanoide, hauptsächlich Prostaglanin E2(PGE2), Thromboxan A2 (TxBA2) und Prostacyclin (PGI2), sind wichtige Mediatoren für die gastrointestinale Schleimhaut- pro- tektion, die Nierenfunktion, die Plättchenfunktion und die Blutflussregulation. Im Unter- schied zu COX-1 wird das induzierbare Isoenzym der Cyclooxygenase (COX-2) vorwiegend unter Einfluss von proinflammatorischen Cytokinen (Tumornekrosefaktor α, Interleukin 1), Wachstumsfaktoren, Endotoxin oder Mitogenen exprimiert, so dass sich diese Enzyme hauptsächlich in entzündlich verändertem Gewebe und Entzündungszellen finden. Die nach- folgend synthetisierten Prostanoide spielen eine wichtige Rolle für das weitere ent- zündliche Geschehen“ (Stichtenoth et al., 1998). Die COX-2 wird jedoch auch konstitutiv exprimiert, wie abweichend von der initialen Annahme eines rein proinflammatorischen, induzierbaren Enzyms festgestellt wurde (Stichtenoth et al., 1999). Den derzeitigen Wissensstand zur biologischen Bedeutung der COX-Isoenzyme und der von diesen produzierten Prostanoiden gibt Tabelle 1 wieder.

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Tabelle 1: Biologische Bedeutung der von konstitutiver bzw. induzierbarer Cycloxygenase produzierten Prostanoide (Stichtenoth und Frölich, 2001):

Konstitutive Cycloxygenase / COX-1 Induzierbare Cycloxygenase / COX-2

Homöostase Entzündung

Mukosaprotektion im Gastrointestinaltrakt Extravasation

Nierenfunktion Schmerz

Plättchenaggregation Fieber

Blutflussregulation Proliferation

Lungenfunktion

ZNS Homöostase

Nierenfunktion und Nierenreifung

(Entzündung) ZNS

Knochenstoffwechsel Blutflussregulation Lungenfunktion Heilungsvorgänge Ulkusheilung

Adaptation bei vaskulärer Schädigung Reproduktion

2.2.3 Nichtsteroidale Antirheumatika

NSAR üben ihre antiinflammatorischen, analgetischen und antipyretischen Wirkungen durch die Hemmung der Prostanoidsynthese aus. Die typischen Nebenwirkungen der NSAR sind ebenfalls durch diesen Wirkmechanismus, die Hemmung der Cyclooxy- genase, bedingt: gastrointestinale Ulzera und deren Komplikationen, Nierenfunktions- störungen und Nierenversagen, Hemmung der Plättchenaggregation, NSAR-induziertes Asthma und NSAR-typische Medikamenteninteraktionen wie der Wirkungsverlust von Antihypertonika und Hemmung der Lithiumausscheidung (Stichtenoth, 2001). Mit Entwicklung selektiver COX-2-Inhibitoren sollten die NSAR-typischen Nebenwirkungen vermieden werden. Da NSAR zu den am häufigsten eingenommenen Medikamenten beim Menschen gehören, ist die epidemiologische Bedeutung sehr groß: So sind 80 % aller tödlichen Ulkuskomplikationen, 3 % aller akuten und bis zu 30 % aller Fälle von

chronischem Nierenversagen NSAR-induziert (Armstrong, 1987; Stichtenoth, 1998 und

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2001). Insgesamt sterben in den USA jährlich ca. 16500 Menschen durch NSAR, ebensoviel wie an der Immunschwächekrankheit AIDS (Singh, 1998).

2.2.4 Selektive und hochselektive COX-2-Hemmstoffe

“Grundlage für die Entwicklung selektiver und hochselektiver COX-2-Inhibitoren ist eine genaue Charakterisierung der COX-Isoenzyme. Die für die COX-1 und COX-2 kodierenden Gene sind beim Menschen auf Chromosom 9 bzw. 11 lokalisiert und weisen eine Länge von 22 bzw. 8 Kilobasenpaaren auf. Die Aminosäuresequenzen der COX-Isoenzyme, welche beide ein Molekulargewicht von etwa 70 kDa haben, sind nur zu 60% homolog, doch weisen die für die Peroxidase- und Cyclooxygenaseaktivität verantwortlichen Regionen eine große Ähnlichkeit auf. Zwischen den Säugetierspezies bestehen Sequenzhomologien von mehr als 80%.“ (Stichtenoth et al., 1998). “Beide COX-Isoenzyme sind Homodimere mit je zwei unterschiedlichen aktiven Stellen an der katalytischen Einheit: die Peroxidase-aktive Stelle, die mit einem Häm-Cofaktor verbunden ist, und die COX-aktive Stelle. Vier Helices bilden einen hydrophoben Kanal, an dessen Ende die katalytischen Zentren liegen und durch den das Substrat Arachidonsäure an die COX-Bindungsstelle gelangen muss“ (Heinzl, 1999). An den Bindungsstellen gibt es geringe Unterschiede zwischen COX-1 und COX-2. Der Kanal der COX-2 ist weiter und weist eine Seitentasche auf (Vane, 1998). So war es möglich spezifsche COX-2-Inhibitoren zu entwickeln.

Die pharmakologische Strategie der selektiven COX-2-Hemmung geht von der Hypothese aus, dass bei möglichst zielgerichteter Hemmung der COX-2-vermittelten proinflammatorischen Prostanoidsynthese bei voller therapeutischer Wirksamkeit, keine der typischen NSAR-Nebenwirkungen zu erwarten sind, da die COX-1-abhängige Prostanoidsynthese unbeeinflusst bleibt (Vane, 1998 und 1994; Stichtenoth et.al. 1998). Stichtenoth und Frölich (2001) sehen diese Hypothese als größtenteils bestätigt an.

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2.2.5 NSAR-Klassifikation nach COX-Selektivität:

Ordnet man NSAR gemäß ihrer COX-Isoenzym-Selektivität, resultiert eine Klassifikation, welche im Unterschied zur Einteilung nach chemischer Struktur eine Vorhersage der Wirkungen erlaubt (Frölich, 1997). Dabei geben insbesondere die Gesamtkörper- Thromboxanproduktion, die Plättchenaggregation und –thromboxansynthese genaue

Auskunft, ob und in welchem Maße die COX-1 durch eine Substanz gehemmt wird (Frölich, 1997). Letztlich gibt dabei nur die Überprüfung am Patienten eine Bestätigung der

experimentell ermittelten COX-2-Selektivität (Stichtenoth, 2001).

Das älteste NSAR, die Salizylsäure, ist in vivo beim Menschen zwar ein selektiver COX-2- Inhibitor, während In-vitro-Daten auf eine etwa gleiche, schache Hemmung der COX- Isoenzyme hinweisen (Stichtenoth, 1998). Salizylsäure hat allerdings eine starke topische, nicht durch COX-Inhibition vermittelte Schleimhauttoxizität. Lokal gut verträglich ist die Disalizylsäure, welche im Körper wieder zu Salizylsäure hydrolisiert wird (Stichtenoth, 1998). Meloxicam ist der erste in der Humanmedizin intensiv untersuchte und als solcher zugelassener COX-2-Inhibitor (Stichtenoth, 2001).

In Deutschland derzeit für den Menschen zugelassene spezifische COX-2-Hemmstoffe sind u.a: Celecoxib (CelebrexÒ), Parecoxib (Dynastat®) und Etoricoxib (Arcoxia®).

In der Tiermedizin zugelassene selektive COX-2-Hemmer sind u.a. Meloxicam (Metacam®, zugelassen für Hund, Katze, Rind und Pferd), Cimicoxib (Cimalgex®, zugelassen für Hunde), und Firocoxib (Previcox®, zugelassen für Hunde). Außerdem kommen in der Tiermedizin auch häufig nicht-selektive COX-Hemmstoffe wie zum Beispiel das Carprofen (Rimadyl®, zugelassen für Hunde) zum Einsatz, welches eine etwa gleichstarke Hemmung der COX-1 wie der COX-2 aufweist.

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Tabelle 2: NSAR-Klassifikation nach COX- Isoenzym-Selektivität (Frölich, 1997):

NSAR-Klasse Beispielsubstanzen Anmerkungen Spezifische (hochselektive)

COX-1-Inhibitoren

Experimentelle Substanzen (niedrig dosierte

Azetylsalicylsäure)

Hochselektive Hemmnung der Plättchen-COX-1

Nicht-spezifische (unselektive) COX-Inhibitoren

Die meisten herkömmlichen NSAR

Typische NSAR- Nebenwirkungen Präferenz für COX-1 Azetylsalizylsäure,

Indometacin, Piroxicam

Hohes Risiko für

gastrointestinale und renale Nebenwirkungen. Starke Hemmung der

Plättchenaggregation Etwa gleiche Inhibition

von COX-1/-2

Diclofenac, Ibuprofen Typische NSAR- Nebenwirkungen, aber akzeptables Nutzen-Risiko- Verhältnis

Präferentielle (selektive) COX-2-Inhibitoren

Disalizylsäure, Meloxicam Weniger typische NSAR- Nebenwirkungen

Spezifische (hochselektive) COX-2-Inhibitoren

Celecoxib, Etoricoxib, Parecoxib

Minimale gastrointestinale Toxizität, keine Hemmung der Plättchenaggregation

Die selektiven und hochselektiven COX-2-Hemmer zeigen dabei keine größere Wirksamkeit als die herkömmlichen NSAR, nur die typischen NSAR-Nebenwirkungen sind geringer.

Zu beachten ist dabei, dass auch die COX-2 physiologische Regulationsaufgaben wahrnimmt.

Sie lässt sich beim Menschen und anderen Säugetieren auch in nicht-entzündetem Gewebe, besonders der Niere und dem ZNS, in bedeutsamen Mengen nachweisen. Die von der COX-2 dort synthetisierten Prostanoide sind nachweislich an der Organfunktion beteiligt (Vane, 1998). In verschiedenen Tiermodellen wurde gezeigt, dass die COX-2 eine wichtige Rolle bei der Heilung spielt. Dagegen ist sie im gesunden Gastrointestinaltrakt bei intakter Mukosa ohne Bedeutung (Crofford et al,. 2000; Reuter et al., 1996).

Erwähnt werden soll hier noch, dass auch die Existenz einer COX-3 diskutiert wird (Vane , 1998), da die analgetische Wirksamkeit von NSAR bei Abwesenheit von Entzündung und COX-2-Expression nur durch die Inhibition der COX-1 oder eben eines weiteren Isoenzyms, einer COX-3, erklärt werden kann. Über die klassischen NSAR-Indikationen hinaus zeichnen

(20)

sich für die hochselektiven COX-2-Inhibitoren einige neue Anwendungsgebiete ab, bei denen wegen des negativen Nutzen-Risiko-Verhältnisses der Einsatz herkömmlicher NSAR nicht möglich ist. Zu solchen Indikationsgebieten gehören: Kolonadenome bzw. -karzinome, Morbus Alzheimer, zerebrale Ischämie und nicht zuletzt die Atherosklerose (Stichtenoth et al., 1998).

2.2.6 NSAR und Atherosklerose:

“Die Bedeutung von entzündlichen Prozessen für die Progression der Atherosklerose ist größer“ als zunächst bekannt. “Insbesondere aktivierte Monocyten/Makrophagen in den oberflächlichen Schichten der atheromatösen Plaques scheinen die Plaqueruptur, die häufigste Ursache für das Auftreten einer instabilen Angina pectoris und eines

Myokardinfarktes, zu fördern. Bei Patienten mit instabiler Angina pectoris lässt sich eine erhöhte, acetylsäureresistente Thromboxansynthese nachweisen, was zusammen mit den vorgenannten Befunden eine COX-2-Expression in Monocyten oder ortsständigen

Bindegewebszellen wahrscheinlich macht. COX-unselektive NSAR wirken in Tiermodellen der Atherosklerose unabhängig von der Thrombocytenaggregationshemmung

antiartheromatös“ (Stichtenoth et al., 1998).

2.3 Isoprostane (Roberts und Morrow, 1996)

Isoprostane sind eine einheitliche Reihe von Prostaglandin-artigen Verbindungen, welche unabhängig vom Cyclooxygenaseenzym mittels Katalysierung durch freie Radikale durch Peroxidation von veresterter Arachidonsäure in vivo gebildet werden (Morrow et al., 1990).

Freie Radikale sind Atome oder Moleküle, die durch ein ungepaartes Elektron auf dem äußersten Orbital gekennzeichnet sind und entstehen als Zwischenprodukte des Stoffwechsels oder durch exogene Einflüsse. Isoprostane sind spezifische Produkte der Lipidperoxidation

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(Morrow et al., 1992). In vitrowurde dieser Prozeß, der nicht enzymatischen Autooxidation von Fettsäuren in Prostaglandin-ähnliche Verbindungen, vor über 30 Jahren erstmals

beschrieben (Nugteren , 1967). In vivo wurden die Isoprostane im Jahre 1990 von Morrow und Roberts erstmals nachgewiesen. Bis dahin galt die enzyminduzierte Metabolisierung der Arachidonsäure in die klinisch sehr relevanten Substanzen Thromboxan A2, Prostacyclin, Prostaglandin, Leukotriene und den plättchenaktivierenden Faktor als alleiniger Reaktions- weg der Arachidonsäure (Pryor et al., 1976). Arachidonsäure (all-cis-5,8,11,14-Eicosatetraen- säure) kommt nur in geringen Mengen frei vor. Der größte Teil ist in die Phospholipide der Zellmembran eingebaut. Auf Reize der verschiedensten Art, insbesondere nach zellschä- digenden Noxen, wird sie durch Aktivierung von Phospholipase A2 freigesetzt und an- schließend durch verschiedene Enzyme in die entsprechenden Mediatorsubstanzen umge- wandelt (Roberts et al., 1995). Bei diesen handelt es sich um stark wirksame Entzündungs- mediatoren (Tsikas et al., 1998). Der Angriff von freien Radikalen bewirkt an der phospho- lipidgebundenen Arachidonsäure eine Abspaltung von Wasserstoff, was zur Bildung von drei Radikalen der Arachidonsäure führt. Durch den nachfolgenden Angriff mittels O2 entstehen vier oxidierte Radikale der Arachidonsäure (Morrow et al., 1992 und 1995). Durch eine spontane Bildung eines Cyklopentanringes in der Kohlenwasserstoffkette und einer weiteren Addition von O2entstehen hieraus PGG2-ähnliche Verbindungen. Die Reduktion dieser PGG2-ähnlichen Verbindungen führt wiederum zu der Bildung von PGH 2-ähnlichen Verbindungen. Der Mechanismus der Bildung führt also in Abhängigkeit von der Lokalisation des Angriffes der freien Radikale zu vier Regioisomeren, die sich in der Lokalisation des Peroxyl-Radikal-Derivates der Arachidonsäure unterscheiden. Da jedes Regioisomer theoretisch acht racemische Diasteromere aufweist, gibt es potentiell vierund- sechzig Verbindungen. Alle diese Verbindungen beinhalten den F-Typ-Prostanring und sind isomerisch zu PGF2a, welches über den Cyclooxygenaseweg entsteht. Deshalb werden diese

(22)

Verbindungen als F2-Isoprostane bezeichnet (Morrow et al., 1995). In sehr geringen Mengen können die F2-Isoprostane auch Cyclooxygenase-abhängig entstehen. Die F2-Isoprostane entstehen aus Arachidonsäure noch während diese mit Phospholipiden der Membran verestert ist. Die nachfolgende Freisetzung in die freie Form findet erst durch den Angriff der

Phospholipase statt (Morrow, 1992). Von den vier Regioisomeren der F2-Isoprostane hat 8- iso-PGF2a eine besondere Bedeutung als ein Indikator des oxidativen Stresses erlangt (Tsikas et al., 1998). Untersuchungen zeigten, dass für die Analyse von Isoprostanen einige

Bedingungen (bsp. Lagerung der Proben bei -20°C) erfüllt sein müssen (Tsikas et al., 1997 und 1998). Gemessen werden diese Verbindungen mittels GC/MS/MS nach Morrow und Roberts 1990 (siehe unter Material und Methoden). Die Messung von Isoprostanen in Urin und Plasma wird als Index für die Lipidoxidation und den oxidativen Streß in vivo

vorgenommen. Dies ist wichtig für die Erforschung der Rolle von freien Radikalen in der Pathogenese menschlicher Erkrankungen (Tsikas et al. 1998).

Die Sensivität der Massenspektrometrie ermöglicht die Messung der F2-Isoprostane.

Die Fähigkeit F2-Isoprostane zu quantifizieren eröffnet viele, neue Wege für die

Erforschung der Rolle von freien Radikalen in der Pathophysiologie vieler Erkrankungen und ist ein wertvolles Werkzeug zur Erforschung der klinischen Pharmakologie von Anti-

oxidantien, welche bei Erkrankungen eingesetzt werden, bei denen freie Radikale eine pathologische Rolle spielen (bsp. Atherosklerose, Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und der normale Alterungsprozeß) (Tsikas et al., 1998). Man fand heraus, daß hochdosiert applizierte Antioxidantien die Bildung von F2-Isoprostanen zu 25 bis 55% inhibieren (Bode- Böger et al., 1998).

Somit kann die Messung von Isoprostanen benutzt werden, um die pharmakodynamischen Effekte von Antioxidantien bei der Inhibierung der freien Radikale in vivo zu definieren.

(23)

Biologische Aktionen von Isoprostanen:

Da die Isoprostane isomerisch zu den von der Cyclooxygenase gebildeten Prostaglandinen sind, welche hohe biologische Aktivität zeigen, war es von großem Interesse, ob die Isoprostane nur Marker der Lipidperoxidation sind oder auch selbst biologische Aktivität aufweisen, bzw. in welcher Stärke sie als Mediatoren der oxidativen Schädigung teilhaben.

8-iso-PGF2a ist einer der hochpotentesten renalen Vasokonstriktoren, die bis jetzt

identifiziert wurden. Es senkt die glomeruläre Filtrationsrate und den renalen Blutfluß um 40-45%. Anscheinend existiert aber kein Effekt auf den systemischen Blutdruck (Morrow et al., 1990). Des Weiteren ist 8-iso-PGF2a ein potenter Vasokonstriktor der Pulmonalarterien (Banerjee et al., 1992). Außerdem induziert dieses Isoprostan die Mitogenese in den glatten Muskelzellen der Gefäße und fördert die Freisetzung von Endothelin-1 aus den

Entdothelzellen der Aorta (Kang et al., 1993). 8-iso-PGE2 ist ebenfalls ein potenter renaler Vasokonstriktor (Takahashi 1992). Beide Isoprostane sind potente Antagonisten

der Thromboxan-Rezeptor-induzierten Plättchenaggregation. Insgesamt hat 8-iso-PGF2a einen direkt fördernden Einfluß auf die Entstehung und das Fortschreiten des atherosklerotischen Prozesses. Entscheidend für die biologischen Aktionen scheint die Stereochemie der

Seitenketten und nicht die Ringstruktur zu sein (Bode-Böger 1998).

Ratten, denen CCL4 oder das Herbizid Diquat gegeben wurde, um Radikal bedingte Schäden zu verursachen, wiesen mehr als 200fach höhere Messwerte der F2-Isoprostane auf als die entsprechenden Kontrollratten (Morrow, 1990). In allen menschlichen und tierischen

Geweben und Flüssigkeiten sind auch im normalen Zustand messbare Werte der Isoprostane nachweisbar, was daraufhin deutet, dass in allen Organismen in geringen Mengen

Lipidperoxidationen stattfinden, welche durch Antioxidantien in ihrer Ausprägung abschwächbar sind. So wurde in einer Gruppe von Probanden unter einer hochdosierten Kombination von Antioxidantien (4 g/d Vitamin C, 3200 IU/d Vitamin E und 300 mg/d b-

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Karotin), über einen Zeitraum von zwei Wochen, die Bildung von mit Plasmalipiden

veresterten 8-iso-PGF2a um 25-55% verringert (Roberts, 1997). Somit können die Isoprostane als Indexparameter der Lipidperoxidation und des oxidativen Stresses angesehen werden (Tsikas et al., 1998).

2.4 DHEA und Atherogenese

Die Nebennierenrinden des Menschen und einiger Primaten produzieren große Mengen des Steroids DHEA und dessen Sulfat-Ester. DHEA und sein im Blut in großen Mengen zirkulierendes Sulfat sind die mit Abstand führenden Steroidhormone im Hinblick auf die Synthese- und Sekretionsleistung der Nebennierenrinde (Baulieu, 1996). Mit zunehmendem Alter sinkt der DHEA-Plasmaspiegel signifikant ab. Eine schwedische Studie (Janson et al., 1998) zeigte, dass niedrige Serum-DHEA-Spiegel mit einem erhöhten Risiko für

einen plötzlichen Herztod assoziiert sind. In der Altersgruppe über 50 Jahre korrelieren hohe DHEA-Sulfat-Serumkonzentrationen mit einer reduzierten kardiovaskulären Mortalität (Barret-Connor et al. 1986). In Kaninchenmodellen wurde gezeigt, dass orale DHEA- Applikation coronare Atherosklerose und die `fatty streak`-Formation inhibieren kann. So fanden Gordon et al. (1988) eine Reduktion der atherosklerotischen Plaquesgröße unter DHEA-Gabe um 50 % gegenüber der Kontrollgruppe. Dabei korrelierte die Plaquesgröße negativ mit den DHEA-Serumkonzentrationen (Gordon et al., 1988).

Herrington (1988) führte ebenfalls Studien durch, welche eine signifikante inverse Relation zwischen den Plasmaspiegeln von DHEA/DHEAS und der angiographisch erfaßten Coronar- erkrankung zeigten. Tiermodelle zeigten, dass DHEA-Supplementierung die Entwicklung der Atherosklerose verhindern bzw. mindern kann. Mitchell untersuchte 49 männliche Patienten nach Myocardinfarkt und fand signifikant niedrigere DHEA-Plasmaspiegel im Vergleich zur Kontrollgruppe (Mitchell et al., 1994). Der Mechanismus der DHEA-Wirkung ist weiterhin unklar: einerseits inhibiert DHEA die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase und

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damit den Pentosephosphatweg, was einen Effekt auf die Entstehung der Atherosklerose ausüben könnte (Gordon et al., 1988). Zusätzlich wird eine Beeinflussung der Plättchen- aggregation und eine Verminderung der Produktion freier Radikale diskutiert (Khaw et al., 1996). Morales et al. (1994) fanden in einer Studie einen signifikanten Anstieg von IGF-1 bei gesunden Probanden nach DHEA-Gabe. Vorstellbar wäre eine günstige Beeinflussung der endothelialen NO-Synthese über IGF-1-Stimulation (Böger et al., 1996).

2.5 Stickstoffmonoxid

“NO wird aus L-Arginin durch die NO-Synthase gebildet, von der 2 konstitutive und 1 induzierbare unterschieden werden“ (Stichtenoth 1997). Die 2 konstitutiven NO-Synthasen haben homöostatische Regulationsaufgaben für Blutfluß, Plättchenfunktion und die Signalüber- tragung im Nervensystem. Im Gegensatz dazu wird die Expression der induzierbaren NO- Synthase durch Endotoxin und Zytokine (Tumornekrosefaktor-α, Interferon-Gamma, Inter- leukin-1 und -2 induziert. Im Rahmen der Entzündungsreaktion exprimieren Monozyten/

Makrophagen mit Einflussnahme proinflammatorischer Zytokine NO-Synthase (Stichtenoth 1997). “NO besitzt abhängig von Konzentration und Herkunft sowohl pro- als auch anti- inflammatorische Wirkungen“ (Stichtenoth 1997). Hinweise auf eine NO-abhängige oxidative Schädigung ergaben sich in Form von erhöhten Nitrotyrosinkonzentrationen in Serum und Synovia bei Patienten, welche an chronischer Polyarthritis erkrankt waren, nicht so aber bei gesunden Probanden (Kaur, 1994). Nitrotyrosin stellt dabei als Peroxinitrit des Tyrosins, welches durch Reaktion von NO mit Superoxidradikalen entsteht, einen Index- parameter für die NO-abhängige oxidative Schädigung dar (Stichtenoth, 1997). “Auch bei entzündlichen Darmerkrankungen ist NO als proinflammatorischer Mediator an der Patho- genese beteiligt“ (Stichtenoth, 1997). Somit ergibt sich die Möglichkeit der antiinflammatorischen Therapie durch gezielte Hemmung der gesteigerten NO-Synthese bei chronisch entzündlichen nicht erregerbedingten Erkrankungen (Stichtenoth, 1997). Bode-Böger et al.

(26)

(1997) beschrieben die antiatherosklerotische NO-Wirkung. „Intaktes Endothel produziert NO, welches vasodilatierend wirkt und die Aggregation und Adhäsion von Thrombozyten und Monozyten hemmt. Bei Patienten mit Atherosklerose ist die endothelvermittelte Vasodilata- tion (abgeschwächte NO-Synthese) gemindert (Bode-Böger, 1997).

(27)

3. Ziele der Studie

Ziel der Studie war zu untersuchen, welche Bedeutung sowohl die COX-2 und die von diesem Enzym gebildeten Prostanoide, als auch die wahrscheinlich COX-unabhängigen Isoprostane für die Atherosklerose besitzen. Zu diesem Zweck wurden die Effekte des selektiven COX-2- Inhibitors Celecoxib auf die Atherosklerose und Prostanoidproduktion bei cholesterin- gefütterten Kaninchen ermittelt und mit einer unbehandelten Kontrollgruppe und einer mit DHEA- behandelten Gruppe verglichen.

(28)

4.

Material und Methoden

Medikamente, Chemikalien, Lösungen, Materialien und Ausrüstungen, welche in den Experimenten Verwendung fanden, sind im Anhang aufgelistet.

4.1 Versuchstiere und Induktion der Atherosklerose

Die Tierversuche für diese Dissertation wurden gemäß §8 Abs.1 des Tierschutzgesetzes in der Fassung vom 25.05.1998 durch die Bezirksregierung Hannover (Dr. Coenen) für das

Versuchsvorhaben genehmigt: Aktenzeichen 509c-42502-98/91 vom 6.8.1998.

48 männliche Kaninchen der Rasse Weiße Neuseeländer mit einem Gewicht von 1,76 bis 2,68 kg bei Versuchsbeginn wurden in die Studie aufgenommen. Vor Versuchsbeginn erhielten die Tiere 14 Tage Zeit zur Adaptation an die Umweltbedingungen (Raum, Käfig, Lichtregime, Luftfeuchte, Wasser, Tagesablauf).

Die Atherosklerose wurde durch die Fütterung einer Cholesterin-Diät induziert. Über vier Wochen erhielten die Tiere Futter, welches 1% Cholesterin enthielt. In den folgenden acht Wochen wurde Futter mit einem Cholesteringehalt von 0,5 % gefüttert. Alle Tiere, die eine Cholesterindiät erhielten, wurden in die statistische Auswertung der Studie einbezogen.

4.1.1 Versuchstiere

Es wurden ausschließlich männliche Kaninchen der Rasse Weiße Neuseeländer aus Zuchten von Charles River (Frankreich) in die Studie aufgenommen. Tiere gleichen Geschlechtes und gleicher Rasse wurden gewählt, um Einflussfaktoren aus diesen Parametern auszuschließen.

Die vier Kollektive bestanden aus jeweils 12 Tieren und besaßen zum Zeitpunkt der Para- metererhebung eine durchschnittliches Gewicht von 2,94 kg.

4.1.2 Haltung und Fütterung

Die Tiere wurden unter SPF(spezifisch pathogen-frei)-Bedingungen hinter Barrieren in

(29)

Räumen mit ausschließlicher Kunstbeleuchtung in Einzelkäfigen gehalten. Es wurden Sicherheitsmaßnahmen wie das Tragen Mundschutz, Kopfhauben, Überschuhen, speziellen Kitteln und eingeschränkter Personenzugang eingehalten.

Die Tiere erhielten täglich 200g Futter. Dieses übersteigt die Futtermenge, welche die Tiere bei Ad-libitum-Fütterung aufnehmen, deutlich. So konnte die wöchentliche Menge Futter, welche die Tiere aufnahmen durch Wiegen der nicht-gefressenen Reste bei gleichzeitiger Sicherstellung einer ad-libitum-Fütterung bestimmt werden.

Die Umweltparameter waren standardisiert und stellten sich wie folgt dar:

Raumtemperatur: 20±2 °C Luftfeuchtigkeit: 40-60 %

Lichtphasen: 12 Stunden Helligkeit (7.00 bis 19.00 Uhr MEZ) Käfige: Drahtkäfige (54x58cm) mit perforiertem Bodenblech Einstreu: Keine

Fütterung: Alleindiät in pelletierter, autoklavierter Form ad libitum (Sniff K-H)

Alleindiät mit 1 % Cholesterin in pelletierter, autoklavierter Form ad libitum (Altromin 2023 Laborherstellung mit 1 % Cholesterin)

Alleindiät mit 0,5% Cholesterin in pelletierter, autoklavierter Form ad libitum(Altromin 2023 Laborherstellung mit 0,5 % Cholesterin)

Tränke: steriles Leitungswasser aus Nippeltränken ad libitum

4.2 Versuchskollektive und Studienablauf

Das Fütterungsregime und das Management der Probenentnahmen lehnen sich an die Studien von Bode-Böger et al. und jene von Gordon et al. aus dem Jahre 1998 an. Der Untersuchungs- periode ging eine jeweils 14-tägige Adaptationsperiode voraus. Im Rahmen dieser Studie wurden folgende Kaninchenkollektive zu jeweils 12 Tieren untersucht:

Bei der ersten Gruppe handelt es sich um die gesunde Kontrollgruppe. Diese Tiere erhielten keine Cholesterindiät sondern nur ein Standardfutter ad libitum. Die Tiere 1-8 wurden 12 Wochen untersucht - die Tiere 9-12 nur 4 Wochen. In den Wochen 0, 4, 8 und 12 (Tiere 9-12 nur einschließlich Woche 4) wurden Blutentnahmen vorgenommen. Außerdem erfolgte in den Wochen 0, 2, 4, 6, 8, 10 und 12 (Tiere 9-12 nur einschließlich Woche 4) die Sammlung von 24-h-Urin. Nach Ablauf der 4 bzw. 12 Wochen dauernden Untersuchungs-

(30)

periode wurden die Tiere euthanasiert. Im Anschluß wurden die Tiere seziert und die Aorta freipräpariert und zum Fotografieren entnommen.

Das zweite Versuchskollektiv bildete die Cholesterinkontrollgruppe. Die Tiere erhielten eine Cholesterindiät (siehe 6.1.1.1). Diese unterscheidet sich zum Standardfutter nur durch den Cholesteringehalt von 0,5 bzw. 1 %. Die Tiere 1-8 wurden über 12 Wochen untersucht, die Tiere 9-12 nur über vier Wochen. Wiederum wurde in den Wochen 0, 4 und bei Tier 1-8 auch in den Wochen 8 und 12 eine Blutentnahme vorgenommen. Die Sammlung von 24-h-Urin fand in den Wochen 0, 2, 4, 6, 8, 10 und 12 (bei Tier 9-12 bis einschließlich Woche 4) statt.

Die Tiere 9-12 wurden nach vier, die Tiere 1-8 nach 12 Wochen euthanasiert und seziert.

Wieder wurde die Aorta herauspräpariert.

Ein weiteres Versuchskollektiv, die DHEA-Gruppe, wurde 12 Wochen untersucht. Die Tiere erhielten Cholesterindiät und zusätzlich ab Woche 4 täglich 10mg DHEA pro Tier oral.

Blutentnahmen wurden in den Wochen 0, 4, 8 und 12 vorgenommen. 24-h-Urin wurde in den Wochen 0, 2, 4, 6, 8 und 12 gesammelt. Nach 12 Wochen wurden die Tiere euthanasiert und seziert. Die Aorta wurde entnommen.

Mit einem letztem Versuchskollektiv wurde analog zur DHEA-Gruppe verfahren. Nur erhielten diese Tiere 10mg Celecoxib (Celebrex® der Firma Searle, USA) pro Tier und Tag per os anstelle des DHEA. Die Dosis des Celecoxib wurde mittels Berechnung über das metabolische Körpergewicht nach Löscher et al. (1994) errechnet.

(31)

Tabelle 3: Gesamtübersicht über den Studienablauf Gruppe

Name

Bezeichnung Diät Woche 1-4

Diät

Woche 5-12 Gesunde

Kontrolle (Tier1-4)

Kontrolle 4 Wochen normales Kaninchenfutter ---

Gesunde Kontrolle (Tier 5-12)

Kontrolle 12 Wochen normales Kaninchenfutter normales Kaninchenfutter

Cholesterin- gruppe (Tier 1-4)

Cholesterin-Diät 4 Wochen

1 %-Cholesterin Basisdiät ---

Cholesterin- gruppe (Tier 5-12)

Cholesterin-Diät 12 Wochen

1 %-Cholesterin Basisdiät 0,5 %-Cholesterindiät

DHEA- Gruppe (Tier 1-12)

DHEA-Gruppe 1 %-Cholesterin Basisdiät 0,5 %-Cholesterindiät + 10 mg/d/Tier DHEA Celecoxib-

Gruppe (Tier 1-12)

Celecoxib 1 %-Cholesterin Basisdiät 0,5 %-Cholesterindiät +10 mg/d/Tier Celecoxib

4.2.1 Tabelle 4: Arbeitsprogramm für das Versuchskollektiv: gesunde Kontrollegruppe Versuchswoche Arbeitsprogramm

0 Blutentnahme

Sammlung von 24h-Urin

2 Sammlung von 24h-Urin

4 Blutentnahme

Sammlung von 24h-Urin Tötung und Sektion Tier 9-12

8 Blutentnahme

12 Blutentnahme

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4.2.2 Tabelle 5: Arbeitsprogramm für das Vesuchskollektiv: Cholesterinkontrollgruppe Versuchswoche Arbeitsprogramm

0 Blutentnahme

Beginn der Fütterung der Cholesterindiät (1 %ig)

4 Blutentnahme

Umstellung der Fütterung: Cholesterindiät (0,5 %ig)

8 Blutentnahme

12 Blutentnahme

4.2.3 Tabelle 6: Arbeitsprogramm für das Versuchskollektiv: DHEA - Gruppe Versuchswoche Arbeitsprogramm

0 Blutentnahme

4 Blutentnahme

Umstellung der Fütterung: Cholesterindiät (0,5 %ig) Beginn der DHEA-Therapie

8 Blutentnahme

12 Blutentnahme

Sammlung von 24h-Urin Tötung und Sektion (Tier 1-12)

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4.2.4 Tabelle 7: Arbeitsprogramm für das Versuchskollektiv: Celecoxibgruppe Versuchswoche Arbeitsprogramm

0 Blutentnahme

4 Blutentnahme

Umstellung der Fütterung: Cholesterindiät (0,5 %ig) Beginn der Celecoxib-Therapie

8 Blutentnahme

12 Blutentnahme

Sammlung von 24h-Urin Tötung und Sektion (Tier 1-12)

4.3 Angewandte Medikamente: Celecoxib und DHEA 4.3.1 Celecoxib

Celecoxib ist ein Diaryl-substituiertes Pyrazol-Derivat (Penning 1997). Nach oraler Gabe sind maximale Plasmaspiegel nach etwa drei Stunden erreicht. Fettreiche Nahrung verzögert die Absorption, erhöht aber die Bioverfügbarkeit um etwa 40%. Die Plasmaproteinbindung ist mit 97% relativ hoch. Die Substanz wird in der Leber vor allem über das Cytochrom-P450- System metabolisiert, die Metaboliten sind inaktiv. Weniger als 3% der Substanz werden unverändert ausgeschieden. Unveränderte Substanz und Metaboliten werden zu 27% über die Nieren, zu 57% über die Fäzes ausgeschieden. Die Halbwertszeit beträgt nach Einnahme auf leeren Magen etwa 11 Stunden (Stichtenoth et al., 1998). Heinzl beschrieb 1999 folgende Interaktionen: Bei gleichzeitiger Applikation von Celecoxib mit Antazida, in Form von Magnesium-Aluminium-Präparaten, nimmt die maximale Plasmakonzentration um etwa 37%

ab. NSAR können die blutdrucksenkende Wirkung von ACE-Hemmern verringern, dies sollte auch bei der Gabe von Celecoxib bedacht werden. Celecoxib kann mit niedrig dosierter Acetylsalicylsäure gleichzeitig gegeben werden, allerdings kann es bei dieser Kombination

(34)

zu vermehrten gastrointestinalen Störungen kommen. Gleichzeitige Gabe von

Fluconazol hemmt den Metabolismus von Celecoxib, wodurch es zu einem Anstieg der Celecoxib-Plasmakonzentration kommt. NSAR können die natriuretische Wirkung von Furosemid und Thiazid-Diuretika verringern, dies sollte auch bei der Gabe von Celecoxib bedacht werden. Bei gleichzeitger Gabe von Celecoxib und dem Antikoagulans Warfarin wurden vermehrt Blutungen beobachtet. Wie eine Untersuchung an gesunden Probanden zeigt, weist Celecoxib eine hervorragende gastrointestinale Verträglichkeit auf (Stichtenoth et al 1998). Eine Thrombocytenaggregationshemmung durch Celecoxib fehlt. Auch in der Behandlung postoperativer entzündlicher Schmerzzustände zeigte sich Celecoxib effektiv (Stichtenoth et al.,1998). Als häufigste Nebenwirkungen wurden Dyspepsie und

Oberbauchbeschwerden beobachtet. Knöchelödeme traten vergleichsweise ähnlich häufig wie bei anderen NSAR auf (Heinzl, 1999).

4.3.2 DHEA

Die Nebennierenrinde des Menschen und einiger Primaten produzieren große Mengen des Steroids DHEA und dessen Sulfat-Ester. Mit zunehmendem Alter nimmt der DHEA- Plasmaspiegel signifikant ab (Barret-Connor et al., 1986). Die physiologische Rolle von DHEA beim Menschen ist noch unklar. Bei Medikation von durchschnittlichen älteren Männern und Frauen mit DHEA wird beschrieben, dass es zu einer Zunahme der Knochendichte, der Muskelkraft, des Wohlbefindens und des Insulin-abhängigen

Wachstumsfactors I (IGF-I) kommt. Aus Studien mit DHEA-Ersatztherapie bei Frauen mit Nebenniereninsuffizienz resultierte eine signifikante Verbesserung des Wohlbefindens (Arlt et al.,1999).

Nebenwirkungen traten auch bei längeren Studien wenig und auch nur transient auf. So kam es bei einigen Frauen aufgrund der androgenen Wirkung von DHEA zu trockener Haut und Verlust von Achsel- und Schamhaaren (Arlt et al., 1999). Die charakteristische Abnahme der

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DHEA-Konzentrationen mit zunehmendem Alter führte zu der Spekulation, dass das Alter ein DHEA-Mangelsyndrom darstelle und DHEA-Gabe den Alterungsprozeß verlangsamen könne (Hinson et al., 1999). Die größte Menge des DHEA im Blut ist sulfatiert. Bei verschiedenen Erkrankungen wurde eine signifikant verminderte DHEA-Konzentration festgestellt. Zu den untersuchten Erkrankungen gehören verschiedene Krebsarten, entzündliche Erkrankungen, Typ II Diabetes mellitus und kardiovaskuläre Erkrankungen (Hinson et al., 1999). Es wurde postuliert, dass ein erniedrigter Plasma-DHEA-Spiegel mit einem größeren Risiko von Herzerkrankungen assoziiert ist - unabhängig von anderen Risikofaktoren (Feldmann, 1998).

Eine schwedische Studie (Jansson et al., 1998) zeigte, dass niedrige Serum-DHEA-Spiegel mit einem erhöhten Risiko für einen plötzlichen Herztod assoziiert sind.

Die Urin- und Blut-Spiegel von DHEA und DHEAS fallen dramatisch mit zunehmenden Alter ab - parallel zu der altersassozierten Zunahme der Atherosklerose (Hinson et al., 1999).

Gewebekulturen, Tiermodelle und epidemiologische Studien führten zu der Annahme, dass DHEA die Atherosklerose durch seine antiproliferativen Effekte verhindern kann. In Kaninchenmodellen wurde gezeigt, dass orale DHEA-Applikation coronare Atherosklerose und die `fatty streak`-Formation inhibieren kann (Gordon et al., 1988). Eine signifikante inverse Relation zwischen den Plasmaspiegeln von DHEA/DHEAS und der angiographisch erfaßten Coronar-Erkrankung konnte nachgewiesen werden (Herrington, 1988). Diese Daten unterstützten die Hypothese, dass DHEA eine Rolle in der Pathogenese der coronaren Herzerkrankung spielen könnte. DHEA ist ein potentes antiproliferatives Agens. Niedrige Spiegel von DHEAS gehen der Entwicklung von klinischen Manifestationen von kardio- vaskulären Erkrankungen voraus (Mitchell et al., 1994). Tiermodelle zeigten, dass DHEA- Supplementierung die Entwicklung der Atherosklerose verhindern bzw. mindern kann (Gordon et al. 1988; Ebeling et al., 1994).

(36)

4.4 Tierexperimentelle Techniken 4.4.1 Erhebung physiologischer Parameter

Zur Ermittlung des Körpergewichtes wurden die Tiere wöchentlich gewogen. Ebenfalls wöchentlich wurde die aufgenommene Futtermenge bestimmt. Dies erfolgte durch Wiegen des Futterrestes nach einer täglichen Fütterung von 200 g Futter. So war eine ad libitum Fütterung bei gleichzeitiger Kontrolle der gefressenen Futtermenge möglich.

4.4.2 Sammlung von 24-h- Urin

Es wurde zu Untersuchungsbeginn und dann 14-tägig 24-h-Urin gesammelt. Die

Urinsammlung erfolgte in den gewohnten Käfigen. Eine Akklimatisation war deshalb nicht erforderlich. Unter den Käfigen wurde in 2 Ebenen ein Fiberglasnetz zur Abtrennung des Kotes und eine 0,5 mm - dicke Folie mit Hilfe von Kreppklebeband befestigt. Der

gesammelte Urin wurde bei -20°C bis zur Bestimmung der Laborparameter tiefgefroren.

4.4.3 Perorale Applikation der angewandten Präparate

Die Medikamente wurden den Tieren in gelöster Form verabreicht. DHEA lag in

pulverisierter Form vor. Es wurde 1 g Pulver mit 50 ml Wasser (Ampuwa®) vermengt und dann die Suspension als Einzeltierdosen (0,5 ml) in Einmalspritzen aufgezogen. Celecoxib lag in Form von Kapseln (Celebrex®) vor. Diese wurden geöffnet und der Inhalt mit Wasser (Ampuwa®) vermengt (Inhalt von 10 Kapseln auf 50 ml Wasser). Anschließend wurden aus der Suspension Einzeltierdosen wie oben angefertigt. Das Vermengen geschah in einer Fantaschale unter Verwendung eines Pistills. Zur Eingabe wurden 2 ml-Einwegspritzen der Firma Braun (Melsungen) verwendet. Zur Applikation wurden die Tiere mit der einen Hand an Rücken und Kopf fixiert, während mit der anderen Hand die Spritze vorsichtig in das Maul ein- geführt wurde. Das Medikament wurde im kaudalen Maulbereich appliziert. Um zu gewähr- leisten, dass die Tiere das Medikament auch abschlucken, wurde die erforderliche Dosis in nur

(37)

0,5 ml sterilem Wasser gelöst. Bei diesem geringen Volumen schluckten die Tiere das Medi- kament ohne Gegenwehr problemlos ab.

4.4.4 Blutentnahme

Aufgrund des labortechnisch erforderlichen Blutvolumens von 6 ml war nur die Punktion der zentralen Ohrarterie praktikabel. Venös hätte nicht ausreichend Blut gewonnen werden können. Blutentnahmen wurden zu Beginn des Untersuchungszeitraums und dann in

vierwöchigem Abstand vorgenommen. Für die Plättchenaggregation wurden ca. 2,5 ml Blut in Citratröhrchen (Firma Sarstedt, Deutschland) entnommen. Für die Bestimmung der übrigen Parameter wurden ca. 2,5 ml Blut in EDTA-Röhrchen (Firma Sarstedt, Deutschland)

entnommen. Letztere wurden bei 1500g über 10 min zur Plasmagewinnung zentrifugiert. Das Plasma wurde bis zur Messung der Parameter bei -20°C eingefroren.

4.4.5 Tötung der Tiere und Präparation der Aorta

Die Tiere wurden zunächst mit Ketamin i.m. (25 mg/kg KGW, Ketamin 10% von der WDT) praemediziert und dann mit Eutha 77® der Firma Essex (Überdosis von Pentobarbital ca.

800-1600 mg pro Tier) via Ohrrandvene euthanasiert. Nach Befeuchtung der Tiere mit

Leitungswasser (verhindert die Störung durch das Fell) wurde das Abdomen entlang der Linea alba eröffnet. Nach Überprüfung der physiologischen Lage der Organe wurden Leber, Milz und Magen-Darm-Trakt mit anhaftender Bauchspeicheldrüse entnommen. Nach Eröffnung des Thorax wurde die linke Lungenhälfte entfernt. Dann konnte die Aorta als Ganzes entnommen werden. Anschließend wurde die Aorta von anhaftendem Fett- und Bindegewebe befreit und längs eröffnet. Dabei wurden die Gefäße mehrmals mit physiologischer Kochsalzlösung gespült. Nun konnte die Innenseite der Aorta auf das Vorhandensein von Atherosklerose- Plaques untersucht werden. Dazu wurden die Gefäße fotografiert. Anschließend wurden die Aorten in Formalin eingelegt und so gelagert.

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4.5 Bestimmung von Kreatinin im 24h-Urin (Validierung nach Beckmann et al., 1994) Die Kreatininkonzentration des 24-h-Urins wurde spektrophotometrisch über die alkalische Pikrinsäurereaktion mit einem automatischen Analysegerät bestimmt. Die Methode beruht auf der photometrischen Jaffe´-Reaktion, wobei die Geschwindigkeit des Extinktions- anstieges bei 520 nm aufgrund der Bildung eines alkalischen Kreatininpikratkomplexes gemessen wird. Hierfür wurde ein handelsüblicher Kreatinin-Reagenz-Satz zum Gebrauch am

`Beckman-Creatinin-Analyser 2´ (Beckman, Galway, Ireland) benutzt. Die bei –20°C- tiefgefrorenen Urinproben wurden bei 4°C aufgetaut und sofort zur weiteren Analyse aufgearbeitet. Das Reagenz wurde gemischt mit Pikrinsäurelösung (0,5 M Prikrinsäure) und alkalischem Puffer (0,188 M Natriumhydroxid gepuffert mit Natriumborat und Natrium- phosphat). Kreatinin reagiert mit Pikrinsäure, und bei Anwesenheit von Hydroxylionen im Reagenz entsteht ein rot gefärbter Komplex, der bei 520 nm gemessen werden kann. Die Konzentration von Kreatinin in der Probe ist direkt proportional zu der Rate der

Komplexbildung. Zur Bestimmung der Kreatininkonzentration wurden in dieser Studie 25µl verdünnter Urin (1:20) mit dem Reagenz in eine Reaktionszelle injiziert. Kreatinin wurde gemessen in µM.

Sämtliche im Urin gemessenen Parameter wurden anschließend auf Kreatinin bezogen, um einen Einfluss des Urinvolumens auf die Werte auszuschließen.

4.6 Bestimmung der Prostaglandine und Isoprostane mittels Gaschromatographie / Tandem - Massenspektrometrie (GC-MS/MS) (Tsikas et al. 1998)

Die valide Methode zur Messung der F2-Isoprostane ist die `Gaschromatographie-Tandem- Massenspektrometrie` (GC-MS/MS) mit chemischer Ionisation und Messung negativer Ionen,

‚negative ion chemical ionization’ (NICI). Sie ist hoch sensitiv und dazu sehr genau.

Allerdings ist die Methode sehr arbeits-intensiv. (Validierung nach Tsikas et al., 1998)

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4.6.1 Bestimmung von 2,3,-dn-6-keto-PGF1α und 2,3-dn-TXB2 (Tsikas et al., 2000) im 24-h-Urin

4.6.1.1 Probenvorbereitung und Trennung der dinor-Metabolite

Nach Auftauen der Urinproben bei 4 °C wurden diese bei 5 min bei 1500 g zentrifugiert.

2,5 ml-Aliquots wurden mit je 2,5 ng tetradeutero-2,3-dn-6-keto-PGF^1α (d4-2,3-dn-6-keto- PGF1α) und tetradeutero-2,3-dn-TXB2 (d4-2,3-dn-TXB2) versetzt. Nach Zugabe von 250 µl 30 %iger Bariumchloridlösung wurden die Proben 2 min gerüttelt und anschließend 5 min bei 1500 g zentrifugiert. Die abgenommenen Überstände ließ man 30 min bei 4 °C ruhen. Vor der Festphasenextraktion wurden die Proben mit 5 M Ameisensäure auf einen ph-Wert von 3 angesäuert.

Die Festphasenextraktion (SPE, englisch solid phase extraction) erfolgte mit Chromabond LV-C18ec (15 ml, 500 mg endcapped Octadecylsilica) von Macherey-Nagel . Die

SPE-Kartuschen wurden nacheinander mit 10 ml Methanol und 5 ml 0,05 M Ameisensäure gewaschen und trocken gesaugt. Die Elution der dinor-Metabolite erfolgte mit 4 ml

Ethylacetat (ca. 1 Tropfen/sec).

Zur Trennung der dinor-Metabolite wurden die Eluate zweimal mit je 2 ml Boratpuffer pH 8 für je 1 min ausgeschüttelt. Das 2,3-dn-6-keto-PGF^1α verblieb im Ethylacetat und das 2,3-dn- TXB2 fand sich im Boratpuffer.

4.6.1.2 Weitere Aufarbeitung und Derivatisierung des 2,3-dn-6-keto-PGF 1α

Die Ethylacetatphase wurde zur Trockene eingeengt. Die Rückstände wurden mit

50 µl Pyridin und 1ml Boratpuffer aufgenommen und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Inkubationslösungen wurden mit je 5 ml Ethylacetat für 1 min ausgeschüttelt und die Überstände wurden verworfen. Der Boratpuffer wurde mit 20 µl 5 M Ameisensäure auf ph ≤ 3,5 angesäuert, wobei sich das Lacton des 2,3-dn-6-keto-PGF1α bildete. Das Lacton wurde durch Ausschütteln mit 5 ml Ethylacetat für 1 min extrahiert. Die Überstände wurden

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zunächst in 10 ml PPN-Röhrchen auf ca. 1 ml eingeengt, in silanisierte Autosampler- Fläschchen überführt und dann zur Trockene eingeengt.

Die anschließende Lactonspaltung erfolgte mit einer Mischung aus Wasser/Pyridin/

Triethylamin (10/10/1, v/v/v). Dazu wurden die Rückstände mit 40 µl dieser Mischung für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach erneuter Einengung zur Trockene erfolgte die Veresterung mit Pentafluorbenzylbromid (PFB-Br). Dazu wurden die Rückstände für eine Stunde mit einer Mischung aus 100 µl Acetonitril, 10 µl Methanol, 10 µl PFB-Br (30 %ig in Acetonitril) und 10 µl N-Ethyl- diisopropylamin bei 30 °C erwärmt.

Die Lösungen aus der Veresterung wurden zur Trockene eingeengt. Zur anschließenden Methoximierung wurden die Proben mit 100 µl einer gesättigten (in Pyridin) Lösung von Methoxylamin-Hydrochlorid für eine Stunde bei 60 °C inkubiert.

Nachdem die Proben abgekühlt waren, wurden jeweils 200 µl Wasser dazugegeben. Die Lösungen wurden zweimal mit je 500 µl Diethylether für eine Minute extrahiert. Die Überstände wurden in silanisierte konische-Autosampler-Fläschchen überführt und zur Trockene eingeengt.

Zur Silyilierung wurden die Proben mit 50 µl BSTFA (NO-bis-Trimethylsilyl-triluoracetamid, ein Silylierungsreagenz) für eine Stunde bei 60 °C erhitzt. Die Proben waren jetzt fertig für die GC/MS-MS-Messung.

4.6.1.3 Weitere Aufarbeitung und Derivatisierung von 2,3-dn-TxB 2

Die – wie unter 4.6.1.1 beschrieben – gewonnene Boratphase wurde mit 20 µl Ameisensäure auf pH ≤ 3,5 angesäuert und zweimal mit je 2 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte wurden zunächst in einem PPN-Röhrchen und dann in einem silanisierten Autosampler-Fläschchen zur Trockene eingeengt. Danach erfolgte die Methoximierung wie unter 4.6.1.2 für das 2,3-dn-6-keto-PGF^1αbeschrieben. Die Reaktionslösung wurde eingeengt

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und der Rückstand in 1 ml 5 M Ammoniumacetatlösung pH 5 aufgenommen.

Aus dieser Lösung wurde das 2,3-dn-TxB2 mit einer weiteren SPE extrahiert. Die dazu verwendete Bond Elut PBA-Kartusche (Phenylboronsäure, 1 ml, 100 mg) der Firma Varian wurde nacheinander mit 4 ml Methanol und 4 ml 0,1 M Salzsäure (1/1, v/v) und

2 ml einer Lösung aus Methanol/ 0,2 M Ammoniumsulfat (1/1, v/v) gespült. Die Elution erfolgte mit 4 ml einer Lösung aus Methanol/ 0,1 Natronlauge (1/1, v/v). Die Eluate wurden mit je 16 ml bidestilliertem Wasser verdünnt und mit 500 µl 5 M Ameisensäure auf pH < 4 angesäuert. Es folgte eine weitere SPE mit einer C18- Kartusche wie unter 3.4.1.1

beschrieben. Die so gewonnenen Eluate wurden eingeengt und nacheinander die PFB- Veresterung und Silysierung wie unter 4.6.1.2 für das 2,3-dn-6-keto-PGF 1α beschrieben durchgeführt.

4.6.1.4 Messung der dinor-Metabolite mittels Gaschromatographie /

Tandem- Massenspektrometrie (GC/MS-MS) nach Tsikas et al. (1998)

Die quantitative Bestimmung der dinor-Metabolite, wie auch die des PGE 2, PGE-MUM und des 8-iso-PGF^2α erfolgte mit dem ´Triple stage Quadrupol Massenspektrometer TSQ 7000´

(ThermoQuest, Austin, Texas, USA), das direkt mit dem Gaschromatographen ´Trace 2000´

(Thermoquest) gekoppelt war. Die Probenaufgabe (1µl) erfolgte mittels Autosampler (AS2000, ThermoQuest). Zur gaschromatographischen Trennung wurde eine Optima-17- Kapillarsäule (30 m x 0,25 mm; 0,25 µm Filmdicke) von Macherey-Nagel eingesetzt.

Als Trägergas wurde Helium mit einem konstanten Druck von 70 kPa verwendet.

Die Injektortemperatur betrug 280 °C und die des Interfaces 290 °C. Folgendes Ofen-

Temperaturprogramm wurde genutzt: 2 min bei 70 °C, Erhöhung der Temperatur auf 250 °C mit 25°C/min, gefolgt von einer Temperaturerhöhung von 2 °C/min auf 280 °C und einer weiteren Temperaturerhöhung von 4 °C/min auf 320 °C, die für weitere 4 min gehalten wurden. Durch die Methoximierung entstehen je eine syn- und eine anti-Form der Derivate

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der dinor-Metabolite und ihrer deuterierten Standards, wobei die verwendete Trennsäule aber nur die entsprechenden syn- und anti-Formen des 2,3-dn-6-keto-PGF1αund des d4-dn-6-keto- PGF^1α auftrennen kann. Daraus ergaben sich bei dem obigen Temperaturprogramm folgende Retentionszeiten: 20,10 min und 20,48 min für das 2,3-dn-6-keto-PGF1α und 20,02 min und 20,40 min für das d4-2,3-dn-6-keto-PGF^1α.Unter den gegebenen Bedingungen betrugen die Retentionszeiten 18,46 min für das 2,3-dn-TxB2 und 18,40 min für das d4-2,3-dn-TxB2. Für die quantitative massenspektrometrische Bestimmung der Prostaglandine und Isoprostane wurde der MS/MS-Modus unter NICI-Bedingungen (Messung negativer Ionen bei chemischer Ionisation) gewählt. Als Trägergas diente Methan unter einem Druck von 65 Pa. Argon wurde als Kollisionsgas mit einem Druck von 0,15 Pa eingesetzt. Die Kollisionennergie betrug 25 eV bei einer Bestimmung des 2,3-dn-6-keto-PGF^1α und 20 eV bei der Bestimung des 2,3-dn-TxB2. Die Elektronenenergie betrug 200 eV und der Eletronenstrom 300µA. Die Temperatur der Ionenquelle lag bei 180 °C.

Die quantitativen Bestimmungen erfolgten im `selected reaction monitoring` (SRM)-Modus.

Dazu wurden die Produktionen m/z 240 (M-PFB-3xTMSOH)‾ für das endogene 2,3-dn-6- keto-PGF1α sowie das endogene dn-TxB2 und m/z 244 für die d4-Standards gemessen, die aus den Mutterionen (M-PFB)- m/z 586 bzw. 590 hervorgingen. Die gefundenen Konzentrationen der dinor-Metabolite gemessen in pg/ml wurden auf den jeweiligen Urin-Kreatininwert

korrigiert (nmol/mol Kreatinin).

4.6.2 Messung von PGE2 und PGE-M ( Fauler et al., 1994) im 24-h-Urin 4.6.2.1 Probenvorbereitung und Trennung von PGE 2 und PGE-M

Die Urinproben wurden analog zur unter 4.6.1.1 beschriebenen Methode für die dinor- Metabolite vorbereitet und mit den internen Standards versetzt. Als interne Standards wurden in diesem Fall 5 ng tetradeutero-PGE2 (d4-PGE2) und 10 ng [1,16-18O2]- PGE-M

eingesetzt. Nach Ansäuern der Proben mit 5 M Ameisensäure wurden die Proben der SPE wie