Vergleichende Untersuchungen zur dermalen Penetration und Permeation
in Diffusionszellen
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Silke Riedel (geb. Franzbach) aus Gronau
Hannover 2003
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H.C. Krebs
Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2003
in Dankbarkeit gewidmet
2.1 Aufbau und Funktion der Haut 2
2.1.1 Epidermis 2
2.1.2 Dermis 5
2.1.3 Hypodermis 7
2.1.4 Hautanhangsgebilde 7
2.1.5 Gefäßsystem der Haut 8
2.2 Transdermale Penetration, Permeation und Resorption 9
2.2.1 Barrierefunktion der Haut 9
2.2.2 Penetration in die Haut und Pharmakokinetik topisch applizierter Substanzen 12
2.2.3 Penetrationsbeeinflussung 19
2.3 Modelle zur Untersuchung der transkutanen Penetration und Permeation 22
2.3.1 In-vivo-Modelle 22
2.3.2 In-vitro-Modelle 23
2.3.2.1 Diffusionszellen 23
2.3.2.2 Saarbrücker Penetrationsmodell 26
2.3.2.3 Zellkulturen und künstliche Haut 29
2.3.2.4 Perfusionsmodelle 30
2.4 Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison als Testsubstanzen der
transdermalen Penetration und Permeation 32
3 MATERIAL UND METHODEN 35
3.1 Versuchsmaterial 35
3.2 Verwendete Testsubstanzen 37
3.2.1 Benzoesäure 37
3.2.2 Hydrocortison 37
3.2.3 Testosteron 38
3.3 Diffusionszellen 38
3.5.1 Enzymimmunoassay 40 3.5.2 Bestimmung von Benzoesäure mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
(HPLC) 41
3.6 Statistische Auswertung 43
4 ERGEBNISSE 44
4.1 Benzoesäurepenetration und -permeation 44
4.1.1 Rattenhaut 44
4.1.2 Hundehaut 45
4.1.3 Pferdehaut 46
4.1.4 Schweinehaut 46
4.1.5 Rinderhaut 49
4.2 Hydrocortisonpenetration und -permeation 51
4.2.1 Rattenhaut 51
4.2.2 Hundehaut 52
4.2.3 Pferdehaut 53
4.2.4 Schweinehaut 54
4.2.5 Rinderhaut 55
4.3 Testosteronpenetration und -permeation 57
4.3.1 Rattenhaut 57
4.3.2 Hundehaut 58
4.3.3 Pferdehaut 59
4.3.4 Schweinehaut 60
4.3.5 Rinderhaut 61
5 DISKUSSION 63
5.1 Vergleich der Hautlokalisationen innerhalb der Tierarten 63
5.1.1 Benzoesäurepermeation 63
5.1.2 Hydrocortisonpermeation 64
5.2.2 Hydrocortisonpermeation 69
5.2.3 Testosteronpermeation 70
5.3 Vergleich der Testsubstanzen Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison 73
5.4 Schlußfolgerung 76
6 ZUSAMMENFASSUNG 77
7 SUMMARY 79
8 LITERATURVERZEICHNIS 81
9 ANHANGSTABELLEN 99
Abb. Abbildung
cm Zentimeter
cm² Quadratzentimeter
ELISA enzyme-linked immuno sorbent assay
g Gramm
°C Grad Celsius
h Stunde
HPLC high performance liquid chromatography
i.v. intravenös
l Liter
ln Logarithmus
m männlich
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
n Anzahl der Versuche
ng Nanogramm
s. siehe
S. Seite
Tab. Tabelle
V. Vena
w weiblich
1 Einleitung
Die Entwicklung von Arzneimitteln zur topischen Anwendung bei Mensch und Tier macht es erforderlich, die dermale Penetration, Permeation und Resorption verschiedener Wirkstoffe an Modellen zu untersuchen. Hier bieten In-vitro-Modelle den Vorteil, daß die resorbierte Wirkstoffmenge direkt bestimmt und, wenn notwendig, auch mit toxischen Konzentrationen gearbeitet werden kann. Im Gegensatz zu In-vitro-Modellen werden In-vivo-Untersuchungen durch ethische Aspekte limitiert. Ferner erschweren die Verteilung eines resorbierten Stoffes im Organismus sowie dessen mögliche Metabolisierung (Leber) die Interpretation von Ergebnissen aus In-vivo-Versuchen. In-vitro-Untersuchungen werden an menschlicher und tierischer Haut und an sogenannten Hautäquivalenten („künstliche Haut“) durchgeführt.
Hinsichtlich der Barriereeigenschaften der Haut bestehen offensichtlich ausgeprägte speziesspezifische Unterschiede, die die Übertragbarkeit von Ergebnissen im Einzelfall erheblich einschränken können. So ist im Vergleich zur menschlichen Haut die Barriereeigenschaft der Haut von Labortieren (z.B. Ratte, Maus) sehr viel geringer (MARZULLI et al. 1969; BARTEK et al. 1972). Weiter ist zu berücksichtigen, daß die Hautpermeabilität bei allen Spezies in Abhängigkeit von der Körperregion variiert (FELDMANN und MAIBACH 1967; BRONAUGH 1985; BEHL et al. 1985).
Die zugängliche Literatur weist eine große Anzahl von In-vivo- und In-vitro-Untersuchungen auf, in denen die kutane Pharmakokinetik untersucht wird. Für In-vitro-Penetrationsstudien werden oft Diffusionszellen eingesetzt, die die Messung der passiven Diffusion einer topisch applizierten Substanz durch die Haut ermöglichen. Ein Vergleich der Ergebnisse vorliegender Studien zur dermalen Penetration, Permation und Resorption gestaltet sich aufgrund nicht einheitlicher Versuchsbedingungen, Hautlokalisationen sowie Unterschieden der Spezies recht schwierig bzw. unmöglich.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, tierartliche und regionale Unterschiede in einer vergleichenden Untersuchung der transdermalen Penetration und Permeation unter identischen Bedingungen darzustellen. In den Versuchen soll die Haut von Schweinen, Hunden, Rindern, Pferden und Ratten untersucht werden. Für die Darstellung regionaler Unterschiede werden die Lokalisationen seitliche Brustwand, Rücken, Bauch und Euter (Rind) gewählt. Die vielfach in vorliegenden Studien eingesetzten Testsubstanzen Benzoesäure, Testosteron und Hydrocortison sollen aufgrund ihrer unterschiedlichen Pharmakokinetik in der vorliegenden Arbeit Verwendung finden.
2 Literaturübersicht
2.1 Aufbau und Funktion der Haut
Die Haut stellt als äußere Körperbedeckung sowohl eine schützende Grenzfläche als auch eine breite Kontaktfläche zur Außenwelt dar. Sie ist in erster Linie ein Schutzorgan gegenüber mechanischen, thermischen, chemischen und biologischen Einflüssen (LIEBICH et al. 1999).
Die Körpertemperatur und der Wasserhaushalt werden u.a. über Hautdrüsen und -blutgefäße reguliert; weiter fungiert die Haut als Sinnesorgan, welches zur Wahrnehmung von mechanischen, thermischen und Schmerzreizen dient (LEONHARDT 1990). Die Dicke und Festigkeit der Haut ist abhängig von Tierart, Rasse, Alter und Körpergegend. Im Allgemeinen ist die Haut des Rückens dicker als die Bauchhaut, mechanisch stark beanspruchte Hautstellen sind dicker als geschützt liegende (HABERMEHL 1984). An behaarten Körperstellen ist die Hautdicke geringer als in haarlosen und haararmen Regionen (LIEBICH et al. 1999).
2.1.1 Epidermis
Die Epidermis (Oberhaut) ist ein mehrschichtiges, verhornendes Plattenepithel, welche als äußerste Grenzschicht der Haut eine undurchlässige Hornschicht trägt (FRITSCH 1998). Die Epidermisdicke der behaarten Haut ist stark variabel. In Tab. 1 ist die Epidermisdicke für den Menschen und für verschiedene Tierarten angegeben.
Spezies vitale Epidermis
(ohne Stratum corneum)
Gesamtdicke der Epidermis (inklusive Stratum corneum)
Mensch 75-150 (ODLAND 1983)
Ratte 10-30 (UHR 1984) ~ 32 (BRONAUGH et al. 1982b)
Hund 12-45 (SCHWARZ u. MEYER 1994) 10-45 (CREED 1958)
Pferd 25-45 (MEYER 2002) 30-90 (TALUKDAR et al. 1972)
Schwein 34-47 (m) (MEYER 1986) 41-57 (w)
70-140 (MEYER u. NEURAND 1975)
Rind ~ 32 (MEYER 2001) 40-60 (GOLDSBERRY u. CALHOUN 1958)
Rindereuter 50-80 (SEEGERS 2003) 60-200 (LUDEWIG et al. 1996)
Tab. 1: Epidermisdicke der behaarten Haut bei verschiedenen Spezies (Angaben in µm)
In den folgenden Abbildungen (Abb. 1-6) ist die Epidermis (Bauchhaut) der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Tierarten histologisch dargestellt.
50 µm
Abb. 1-6: Epidermis (Bauchhaut) von Ratte (1), Hund (2), Pferd (3), Schwein (4), Rind (5) sowie von Euterhaut (6)
1
6 5
4 3
2
Die Keratinozyten machen mit etwa 90 % den Hauptanteil der Epidermis aus, daneben enthält die Epidermis Langerhans-Zellen, Lymphozyten, Melanozyten und Merkelzellen. Die Epidermis besteht aus vier Schichten, die jeweils durch ihre Morphologie und Funktion charakterisiert sind (FRITSCH 1998). Abbildung 7 zeigt den schematischen Aufbau der Epidermis.
Abb. 7: Schematischer Aufbau der Epidermis (nach FRITSCH 1998)
Das Stratum basale besteht aus einer Lage zylindrisch aufgebauter Zellen, die durch Hemidesmosomen mit einer Basalmembran verbunden sind (RICHTER und LINSS 1998).
Hier beginnt die Erneuerung der Keratinozyten aus den Stammzellen durch Mitose, wobei Zellgewinn im Gleichgewicht mit Zellverlust steht (FRITSCH 1998).
Das Stratum spinosum ist durch größere, polygonale Keratinozyten charakterisiert. Trotz deutlicher Interzellularspalten sind die Zellen durch stachelförmige Fortsätze über Desmosomen miteinander verbunden (LEONHARDT 1990). Eine Besonderheit des Stratum spinosum sind die sog. „Odland bodies“, Zellorganellen, die Lipide und Enzyme enthalten.
In der aus 2–5 Zelllagen bestehenden Stachelzellschicht geht die Fähigkeit zur Zellteilung mit dem Eintritt der terminalen Differenzierung verloren. Nur unter besonderen Umständen (z.B.
Stratum corneum Stratum granulosum
Stratum spinosum
Stratum basale Desmosom
Keratohyalin- granula
Hemidesmosom
Basallamina Odland
bodies
Wundheilung) finden vereinzelt noch Mitosen statt. Das Stratum basale und das Stratum spinosum werden daher auch als Stratum germinativum zusammengefaßt (FRITSCH 1998).
Mit dem Übergang in das Stratum granulosum flachen die durch basophile Keratohyalin- granula charakterisierten Keratinozyten ab. Dehydratation tritt ein, Zellkerne und –organellen gehen verloren. Durch Exozytose der Odland bodies wird im Interzellularraum die Bildung einer wenig permeablen Kittsubstanz induziert, wodurch die Zellen starr fixiert werden (FRITSCH 1998).
Das Stratum corneum ist das Endprodukt der keratinisierten Epidermis, die sich etwa im Zeitraum von 1-2 Wochen erneuert. Die Anzahl der Zellschichten im Stratum corneum ist recht variabel. Die Hornschicht besteht jedoch zumeist aus ca. 10 bis 20 Zellschichten voll keratinisierter Korneozyten. Diese verhornten Zellen sind überwiegend aus Keratinfilamenten aufgebaut und werden von einer dicht vernetzten, äußerst stabilen Hülle von Proteinen und Lipiden, dem „cornified envelope“ umgeben. Entsprechend einem „Ziegelstein-Mörtel“- Modell ist die Hornschicht im wesentlichen aus den Korneozyten und der interkorneozytären, lamellären Lipidschicht aufgebaut (ELIAS 1983) (siehe 2.2.1).
In den tieferen Schichten des Stratum corneum erschwert ein enger Interzellularraum die transepitheliale Stoffpassage, oberflächlich lösen sich die Zellen aus dem Epithelverband und schilfern ab. Die Schichtdicke ist neben Geschlecht, Alter und Körperregion von der Intensität der mechanischen Beanspruchung und der Abschilferungsrate der Haut abhängig (LIEBICH et al. 1999).
Die Hornschicht ist für Wasser und wasserlösliche Substanzen fast undurchlässig, sie ist in ihrer Gesamtheit Träger der Barrierefunktion. Eine hohe Widerstandsfähigkeit besteht gegen physikalische und chemische Noxen, relativ empfindlich reagiert sie dagegen auf organische Lösungsmittel und Detergenzien (FRITSCH 1998) (siehe 2.2.3).
2.1.2 Dermis
Die Dermis (Lederhaut) ist der zwischen der Unterhaut und Epidermis gelegene bindegewebige Anteil der Körperdecke. Vom Grad ihrer Ausbildung wird die Dicke der Haut bestimmt, so hat z.B. unter Haussäugetieren das Schaf die dünnste und das Rind die dickste Lederhaut. Im Allgemeinen ist die Dicke der Dermis auch vom Alter der Tiere und von der Körpergegend abhängig (HABERMEHL 1984).
Die Dermis erfüllt komplexe biologische Aufgaben, wie Ernährung der Epidermis und Bereitstellung von Abwehrzellen. Sie ist zudem für die mechanische Festigkeit der Haut verantwortlich. Es lassen sich zwei Schichten unterscheiden: ein dünnes, zell- und gefäßreiches, subepidermales Stratum papillare und ein dickes, faserreiches Stratum reticulare (SMOLLE 1998).
Das Stratum papillare ist über die Basalmembran mit der Epidermis verbunden. Es ist aus feinmaschigen kollagenen und elastischen Fasern aufgebaut und enthält reichlich ungeformte Grundsubstanz, die für das Wasserbindungsvermögen und damit für den Hautturgor maßgeblich ist. Die Austauschfläche und die Haftung werden durch die regional unterschiedlich starke Ausbildung von Papillarkörpern - fingerförmigen, papillenartigen Verzahnungen von Epidermis und Dermis - bestimmt (RICHTER und LINSS 1998). Die Versorgung, insbesondere die des Stratum germinativum der Epidermis, erfolgt über haarnadelförmige Kapillarschlingen (die auch zur Regulierung der Körpertemperatur beitragen), die gemeinsam mit nervösen Endapparaten in die Papillarkörper hineinreichen.
Vorzugsweise befinden sich in dieser Schicht Haare, Talg- und Schweißdrüsen als Abkömmlinge der Epidermis (LIEBICH et al. 1999). Außerdem charakterisieren freie Entzündungszellen (Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen, Granulozyten) das Stratum papillare als relevant für die Abwehr (SALT = skin associated lymphoepithelial tissue) (RICHTER und LINSS 1998). Beim Pferd ist der Papillarkörper der Körperhaut nur schwach entwickelt bzw. kann fehlen (MEYER et al. 1978a).
Das Stratum reticulare stellt ein Netz aus gröberen kollagenen und elastischen Fasern dar, das mechanisch hoch belastbar ist (RICHTER und LINSS 1998). Diese Schicht ist relativ arm an Zellen und Gefäßen, vorzugsweise kleinere Arterien und Venen zu und von den oberflächlichen Hautschichten passieren diese Bindegewebslagen (LIEBICH et al. 1999). Das Pferd besitzt als spezielle Bildung eine zusätzliche Schicht der Dermis aus feinen kollagenen Fasern, in die feine elastische und retikuläre Fasern eingewoben sind. Hier handelt es sich um den sog. „Roßspiegel“; diese Schicht ruft einen leichten Glanz der Haut hervor. Diese Struktur überzieht die Kruppe und den Rücken bis zu den Tubera coxae sowie die dorsale Hälfte des Thorax (MEYER et al. 1978a).
2.1.3 Hypodermis
Die Hypodermis, die auch als Tela subcutanea, Subcutis oder Unterhaut bezeichnet wird, besteht aus lockerem Bindegewebe, elastischen Fasern (Stratum fibrosum) und Fettgewebe (Stratum adiposum). Sie stellt das Bindeglied zwischen der Dermis und den innenliegenden Faszien, Muskeln oder Knochen dar und ermöglicht so die Verschieblichkeit der Haut (ECKERT 1992). Die Fetteinlagerungen dienen als Energiereserven und als Kälteschutz und an manchen Stellen auch einer mechanischen Polsterung (z.B. Sohlenballen) (LIEBICH et al.
1999). Die wärmeisolierende Eigenschaft ist abhängig vom Grad der Ausprägung des Stratum adiposum. Dieses ist beim Rind und Pferd nur spärlich, beim Hund und Schwein hingegen deutlich ausgeprägt (MEYER et al. 1978a). Die Unterhaut des Rindereuters hebt sich von der Dermis nur undeutlich ab. Auffällig ist hier das Fehlen von Adipozyten (LUDEWIG et al.
1996).
2.1.4 Hautanhangsgebilde
Die Hautdrüsen und deren Modifikationen sind embryonal als Abkömmlinge der Epidermis anzusehen, sie ragen jedoch größtenteils in die Dermis hinein. Bei den Haussäugetieren unterscheidet man die holokrin sezernierenden Talgdrüsen von den apokrin sezernierenden Schweiß- und Duftdrüsen, deren Sekrete die Haut mit einem dünnen Fett- und Säuremantel bedecken (LIEBICH et al. 1999). Ekkrine „echte Schweißdrüsen“ wie beim Menschen kommen bei unseren Haussäugern nicht vor.
Die apokrinen Schweißdrüsen (Gll. sudoriferae) gehen aus dem Epithel der Haaranlage hervor und geben ihr Sekret in die Haarbälge ab; sie können sekundär auch von den Haarbälgen frei werden (HABERMEHL 1984). Sie haben nur beim Rind und besonders beim Pferd durch Feuchtigkeits- bzw. Wärmeabgabe in Form erhöhter Schweißsekretion eine Bedeutung für die Thermoregulation. Bei den Karnivoren sowie bei Schaf, Ziege und Schwein produzieren die Drüsen individualspezifische Duftstoffe und Substanzen zur Haut- und Haarpflege (MEYER et al. 1978b).
Die Talgdrüsen (Gll. sebaceae) liegen verhältnismäßig oberflächlich, sie sind kranzförmig um die Haarbälge herum angeordnet (Haarbalgdrüsen) (HABERMEHL 1984). Der holokrin sezernierte lipidreiche Talg (Sebum) gelangt über weite Ausführungsgänge in den Haarbalg;
auf der Epidermis entsteht ein dünner Fettfilm, der die Durchlässigkeit für Wasser und wäßrige Flüssigkeiten vermindert und das Stratum corneum und die Oberfläche der Haare geschmeidig hält (LIEBICH et al. 1999).
Die Haare sind aus Epithelzellen der Epidermis entstandene, biegsame und zugfeste Hornfäden, die mit ihren Wurzeln schräg in die Dermis eingelassen sind (HABERMEHL 1984). Haare bieten einen Schutz gegen mechanische und thermische Umwelteinflüsse, weiter wird durch eine dichte Behaarung und starke Pigmentierung UV-Strahlung abgeschirmt (MONTAGNA 1967; BANKS 1993).
Durch die sensible Innervation des Haarbalges kommt dem Haar eine bedeutende Funktion als Sinnesorgan zu. Alle Säugetiere außer dem Menschen verfügen über Sinushaare, die im Gesicht mit Ästen des Nervus trigeminus in Verbindung stehen (MONTAGNA 1967).
Am Haar kann ein proximaler Teil, die Haarwurzel mit ihrem Haarbulbus, von einem distalen Teil, dem Haarschaft, unterschieden werden, der mit der Haarspitze die Epidermis überragt.
Funktionell läßt die Epidermis-Trias, bestehend aus Haar, Talg- und Schweißdrüsen nach LIEBICH et al. (1999) ein gemeinsames Haarorgan entstehen.
2.1.5 Gefäßsystem der Haut
Die Haut beinhaltet ein tiefes (fasziales), ein oberflächliches (kutanes) und ein subepitheliales Gefäßnetz. Über Arteriolen entsteht eine Verbindung zwischen dem tiefen und oberflächlichen Netz, dessen Gefäße schließlich in einen subepithelialen Venenplexus münden. Arteriovenöse Anastomosen ermöglichen eine Wärmeregulation in der Lederhaut.
Aus dem kutanen Gefäßnetz entspringen Kapillargefäße, die als haarnadelartige Kapillarschlingen in die Papillarkörper des Stratum papillare ziehen und von dort über Diffusion die Epidermis versorgen. Der Rückfluß erfolgt über Kapillaren, Venolen und Venen, die in der Hypodermis Anschluß an größere Venennetze finden (LIEBICH et al.
1999).
2.2 Transdermale Penetration, Permeation und Resorption
2.2.1 Barrierefunktion der Haut
Das intakte Stratum corneum stellt mit seiner lipidreichen Interzellularsubstanz die wichtigste Permeabilitätsbarriere der Haut dar. Die Lipide der Hornschicht sind lebensnotwendig, da sie vor einer Dehydratation schützen; ohne sie würde der Wasserverlust um das 2500fache, bei Fehlen der Hornschicht um das 4millionenfache zunehmen (LANDMANN 1988). Die Folge einer großflächigen Eliminierung dieser Hautbarriere wäre eine kurzfristig sich entwickelnde hochgradige Exsikkation mit maximaler Erhöhung des Hämatokritwertes (STÜTTGEN 1990).
Die Barrierefunktion der Hornschicht läßt sich durch ein Zweikompartimentenmodell (sog.
„brick and mortar model“) (siehe 2.1.1) beschreiben. Demnach sind die ziegelsteinähnlich geschichteten Korneozyten in einem interzellulären Lipidmörtel eingebettet, welcher sich vorwiegend aus Ceramiden (ca. 40 %), freien Fettsäuren (ca. 25 %), Cholesterol (ca. 25 %), Anteilen von Cholesterolsulfat (ca. 6 %) und Triglyceriden zusammensetzt (ELIAS 1983).
Die Lipide der Hornschicht sind als multiple Bilayer ausgebildet und machen 10 – 30 % des gesamten Hornschichtvolumens aus (ELIAS und LEVENTHAL 1979). Im Gegensatz zu anderen Biomembranen, die hauptsächlich aus Phospholipiden aufgebaut sind, enthält die Lipidbarriere der Hornschicht sehr wenige Phospholipide (LAMPE et al. 1983). Im Vergleich zu anderen Biomembranen ist die Permeabilität des Stratum corneum außergewöhnlich gering. Nach POTTS und FRANCOEUR (1991) liegt die Erklärung hierfür in der besonderen Morphologie des Stratum corneum mit ihren großen Permeationswegen durch die Interzellularräume, die wesentlich zur Effektivität der Hornschichtbarriere beiträgt.
Bereits BURR und BURR (1929) stellen im Tierversuch fest, daß sich durch eine Diät, die arm an essentiellen Fettsäuren ist, eine Permeabilitätsstörung der Barriere erreichen läßt. Die Lipide, die für die kutane Hautbarriere verantwortlich sind, entstammen dem Stoffwechsel der Epidermis (FEINGOLD et al. 1982, 1983). Einen direkten Beweis dafür, daß die kutane Cholesterolsynthese für die Erhaltung der Barrierefunktion notwendig ist, liefern FEINGOLD et al. (1990) in Versuchen an Mäusen. Ihre Untersuchungsergebnisse zeigen, daß nach einer Störung der Permeabilitätsbarriere durch Lipidextraktion die Wiederherstellung der Barriereeigenschaften durch topische Applikation von Lovastatin gehemmt wird. Lovastatin
ist ein kompetitiver Hemmer der HMG CoA-Reduktase, das die Cholesterolsynthese regulierende Enzym. Cholesterol gehört neben Sphingolipiden und essentiellen Fettsäuren zu den Bestandteilen der Lipiddoppelschichten des Stratum corneum, die für die Aufrechterhaltung der epidermalen Barrierefunktion verantwortlich sind (HOLLERAN et al.
1991).
WERTZ et al. (1987) zeigen mittels Elektronenmikroskopie, daß die interzellulären Lipidlamellen in der gesamten Hornschicht lokalisiert sind. Im Stratum corneum als morphologisch heterogener Membran sind die interzellulären Lipide der äußeren Zelllagen lockerer gepackt als die der inneren (PELLETT et al. 1997). Untersuchungen von BLANK (1952, 1953) über die Wasserdurchlässigkeit der Hornschicht nach Abrissen derselben mittels eines adhäsiven Klebebandes (z.B. Tesa-Film) zeigen, daß für die Barrierefunktion vor allem die unterste Schicht des Stratum corneum verantwortlich ist. Mit der Tesa-Film- Abrißmethode werden durch den Klebstoff die Lamellen des Stratum corneum mehr oder weniger schichtweise abgetragen. PELLETT et al. (1997) bestätigen diese Ergebnisse durch spektroskopische Untersuchungen. Ihre Resultate bekräftigen, daß sich die morphologischen Unterschiede zwischen den inneren und äußeren Schichten des Stratum corneum in Permeabilitätsunterschieden ausdrücken.
Der Wassergehalt der Hornschicht nimmt von innen nach außen ab (TAGAMI et al. 1980). Er ist mit maximal 20 % sehr viel niedriger als der Wassergehalt in der lebenden Epidermis, in der er mit 60 - 80 % relativ konstant ist (WARNER et al. 1988). Dieser deutliche Unterschied ist in der lipidreichen Zusammensetzung der interkorneozytären Substanz begründet.
Hautanhangsgebilde unterbrechen die Kontinuität der Hornschicht. Die für die Hornschicht charakteristische Barrierefunktion geht in den tieferen Abschnitten der Haarfollikel verloren.
Diese Regionen sind aufgrund des ihres lipophilen Charakters (Talg) für die Aufnahme lipophiler Substanzen prädestiniert, während in den oberen Abschnitten die Aufnahme wasserlöslicher Stoffe im Vordergrund steht (STÜTTGEN 1990).
FELDMANN und MAIBACH (1965) untersuchen die dermale Resorptionsrate von 14C- markiertem Hydrocortison über einen Zeitraum von zehn Tagen durch normale und geschädigte Haut im Vergleich zur i.v. Applikation anhand der Nierenausscheidung. Die Resorptionsrate durch normale und durch Tesa-Film-Abrisse geschädigte Haut liegt zwischen 0,1 und 1 % der lokal aufgetragenen Hydrocortisonmenge. Hingegen stellen sie fest,
daß die Resorptionsrate bei intradermaler Injektion nahezu 100 % beträgt. Da hierbei das Stratum corneum umgangen wird, kommt es hier zu keiner Depotbildung. Im Gegensatz dazu wird der Wirkstoff bei intakter Haut über einen längeren Zeitraum kontinuierlich abgegeben.
Bei mit Tesa-Film-Abrissen vorgeschädigter Haut fehlt ebenfalls die Depotbildung; die Resorptionsrate ist im Vergleich zu normaler Haut signifikant erhöht. Unter okklusiven Bedingungen wird im Vergleich zu normaler Haut die zehnfache Hydrocortisonmenge resorbiert, was bedeutet, daß die hydratisierte Hornschicht für Hydrocortison durchgängiger ist als die durch Tesa-Film-Abrisse vorgeschädigte Haut. Unter Anwendung eines Okklusionsverbandes wird durch Abdeckung der Haut ihr Feuchtigkeitsgehalt, jedoch besonders der der Hornschicht, erhöht.
Das Stratum corneum ist mit seiner lipidreichen Interzellularsubstanz die wichtigste Diffusionsbarriere bei der dermalen Resorption (MARZULLI 1962; ELIAS 1983;
STÜTTGEN 1990). Die darunterliegende, avaskuläre lebende Epidermis ist eher eine hydrophile Matrix. Voraussetzungen für eine transdermale Diffusion sind sowohl lipophile als auch hydrophile Eigenschaften penetrierender Moleküle. Im Allgemeinen ist der Diffusionswiderstand der Hornschicht für polare Lösungen im Vergleich zur lebenden Epidermis und Dermis groß. Für lipophilere Substanzen hingegen ist er geringer. Dennoch ist die Hornschicht die mengenbegrenzende Barriere, da die lipophilen Moleküle sich in ihr anreichern und nur langsam und zu einem geringen Anteil in die wässrige lebende Epidermis übertreten. Die Dermis ist schließlich mit einem wässrigen Gel vergleichbar, dessen Struktur aus Kollagenfasern und Elastin besteht. Aufgrund der dermalen Vaskularisation werden bis hierher vorgedrungene Moleküle letztlich abtransportiert (POTTS et al. 1992). Unter der Annahme, daß das Stratum corneum, die lebende Epidermis und die Dermis als aufeinanderfolgende Membranen fungieren, resultiert die Barrierefunktion der Haut aus der Summe der individuellen Barriereeigenschaften (POTTS et al. 1992).
Für den Prozeß des Wirkstofftransportes in und durch die Haut stellt eine intakte Hornschicht die Hauptbarriere dar. Neben dieser Funktion fungiert die Hornschicht auch als Reservoir für topisch applizierte Substanzen. Die Barrierefunktion der Hornschicht nimmt von außen nach innen zu und im gleichen Umfang nimmt ihre Reservoirfunktion ab (ZESCH et al. 1973).
Zahlreiche topisch applizierte Substanzen sind in der Hornschicht nur schwer löslich, woraus ein eingeschränktes Diffusionsvermögen resultiert. Es kommt zu einer Anreicherung der
Stoffe in den oberen Hornlagen, aus welchen sie, den Gesetzen der Fick´schen Diffusion gehorchend, in die tieferen Epidermislagen diffundieren (SCHAEFER et al. 1978a, b).
2.2.2 Penetration in die Haut und Pharmakokinetik topisch applizierter Substanzen
Nach STÜTTGEN und SCHAEFER (1974) versteht man unter der Penetration das Eindringen einer Substanz in und durch die Hornschicht. Permeation kann als Ausdruck einer Durchwanderung der Haut aufgefasst werden. Unter einer Adsorption ist der physikalisch- chemische Vorgang oberflächlicher Bindung und Haftung zu verstehen. Sie ist abhängig von der Affinität der Hornschicht zum extern zugeführten Stoff. Resorption ist schließlich die Aufnahme in Blut- und/oder Lymphgefäße. In Abb. 8 sind Penetration, Permeation und Resorption graphisch dargestellt.
Abb. 8: Substanzaufnahme durch die Haut (nach STÜTTGEN und SCHAEFER 1974)
Einfache Penetrationsversuche an exzidierter Säugetierhaut zeigen, daß der perkutane Flux direkt proportional zum Konzentrationsgradienten ist (BLANK und SCHEUPLEIN 1969). Es wird daraus geschlossen, daß der Transport durch die Haut vorwiegend durch passive Diffusion erfolgt (POTTS et al. 1992). Für die Penetration von Substanzen durch das Stratum corneum gelten prinzipiell die physikalischen Gesetze der Membrandiffusion. Aktive Transportvorgänge spielen bei der Aufnahme durch die Haut praktisch keine Rolle (SCHEUPLEIN 1978a; SCHAEFER et al. 1982; BARRY 1983). Nach dem Auftragen eines Wirkstoffes besteht initial ein großes Konzentrationsgefälle von der galenischen Formulierung zum Stratum corneum. Für den Diffusionsvorgang gelten somit die Gesetz- mäßigkeiten des 1. Fick´schen Gesetzes:
Penetration Permeation Resorption
Gefäß Epidermis Hornschicht
Dermis
m= D* F/d (c1-c2)
m = Diffusionsstrom d = Schichtdicke
D = Proportionalitätsfaktor c1-c2 = Konzentrationsgefälle F = Fläche
Gelangt ein in ein Vehikel inkorporiertes Pharmakon mit einer Membranoberfläche in Kontakt, kommt es nach einer zeitlichen Verzögerung während der Anreicherung der Substanz in der Membran allmählich zu einem Gleichgewichtszustand des transmembranären Flusses. Dieser bleibt so lange bestehen, wie einerseits auf der Membranoberfläche ein genügend großer Pharmakonvorrat gegeben und andererseits ein kontinuierlicher Substanzabstrom gewährleistet ist (MERK und BICKERS 1992).
Geschwindigkeitsbestimmend für die dermale Resorption eines Stoffes sind seine chemisch- physikalischen Eigenschaften. Hierzu zählen Löslichkeit, Polarität, Affinität zum Vehikel und Struktur- sowie Molekülgröße (STÜTTGEN 1972).
Ein einfaches Modell, um die Pharmakokinetik der dermalen Penetration und Permeation topisch applizierter Substanzen zu beschreiben, stellen GUY und HADGRAFT (1983) auf (Abb. 9). Danach sind die zwei geschwindigkeitsbestimmenden Schritte für die Pharmako- kinetik eines dermal applizierten Wirkstoffes erstens der Übertritt aus der Grundlage in die Hornschicht und zweitens die Permeation aus der Hornschicht in das lebende Gewebe. Eine für jeden Stoff charakteristische Konstante k beschreibt die Geschwindigkeit des Wirkstoffübertrittes zwischen den jeweiligen Kompartimenten.
Abb. 9: Schematische Darstellung der Wirkstoffaufnahme aus einer galenischen Formulierung in die Haut (nach GUY und HADGRAFT 1984)
k1 – k4 = Geschwindigkeitskonstanten
k1 k2
k3
k4
galenische Formulierung
Stratum corneum
Blut bzw.
Rezeptor- flüssigkeit
Direkt nach Applikation eines Pharmakons auf die Haut besteht ein großes Konzentrationsgefälle von der galenischen Formulierung zum Stratum corneum. Der Wirkstoff gelangt durch passive Diffusion in die Hornschicht. Die Diffusion erfolgt hauptsächlich vom Stratum corneum in das Blutgefäßsystem und stoffabhängig meist nur in geringem Maße vom Blutgefäßsystem in die Hornschicht zurück. Die Kenntnis der Geschwindigkeitskonstanten erlaubt eine Abschätzung des pharmakokinetischen Verhaltens einer Testsubstanz (siehe 2.4).
Nach dem strukturellen Aufbau der Haut sind verschiedene Möglichkeiten für den dermalen Stofftransport gegeben. Der transepidermale Transport kann entsprechend der Zweikompartiment-Struktur der Hornschicht interzellulär und transzellulär erfolgen (Abb.
10). Der letztere Weg setzt voraus, daß die Substanz die Zellmembran und die Lipidschicht durchqueren kann (KARZEL und LIEDTKE 1989).
Abb. 10: Transportwege durch das Stratum corneum (nach ELIAS 1981)
Die Penetration über die Haarfollikel und Talgdrüsen und/oder die ekkrinen Schweißdrüsen wird als „Shunt“-Weg bezeichnet (STÜTTGEN et al. 1986). SCHEUPLEIN (1967) geht davon aus, daß dieser Weg vornehmlich zu Beginn eines Diffusionvorgangs Bedeutung hat.
Auch ILLEL und SCHAEFER (1988) messen diesem Transportweg vor allem initial Bedeutung bei. Das Erreichen eines Gleichgewichtzustandes zwischen den
Geschwindigkeitskonstanten von außen nach innen und denen von innen nach außen resultiert aus einem Ausgleich dieser beiden Penetrationswege (STÜTTGEN und SCHAEFER 1974).
HUEBER et al. (1993) liefern in einem In-vitro-Resorptionsvergleich von vier unterschiedlich lipophilen Steroiden an Humanhaut Beweise dafür, daß die Permeation durch normale Haut signifikant größer ist als durch Narbenhaut, also Haut ohne Haarfollikel und Talgdrüsen.
Aufgrund des geringen Oberflächenanteils von 0,1 – 1 % scheint der transfollikuläre Transport jedoch insgesamt von untergeordneter Bedeutung zu sein. ILLEL und SCHAEFER (1988) gewinnen drüsenlose Haut, indem sie die Rückenhaut narkotisierter Ratten eine Minute mit 60 °C heißem Wasser behandeln, danach wird die Epidermis entfernt. Nach abgeschlossener Wundheilung nach drei bis vier Monaten ist die neugebildete Epidermis drüsenfrei. Die Untersuchungsergebnisse an drüsenloser Haut zeigen, daß der transfollikuläre Weg hauptsächlich bei polaren Stoffen eine Rolle spielt. Für lipophile Pharmaka ist dieser Weg weniger bedeutsam (ILLEL und SCHAEFER 1988).
Wie bereits erwähnt, ist das Stratum corneum als eigentliche Barriere für den Durchtritt eines Stoffes durch die Haut zu sehen. Es gelangt zunächst nur ein kleiner Teil der aufgetragenen Substanz in die tiefen Lagen der Haut. Stoffabhängig verbleibt ein beachtenswerter Teil im Stratum corneum. Aus diesem kann die Substanz schließlich, dem Konzentrationsgefälle folgend, in die tieferen Hautschichten eindringen. Die übereinander liegenden Zelllagen bilden ein System von aufeinanderfolgenden lipophilen und hydrophilen Schichten, in welchen die Diffusion eines Stoffes, den Gesetzen der Fick´schen Diffusion gehorchend, nach innen hin zunehmend erschwert bzw. verlangsamt wird (SCHAEFER et al. 1982; DUPUIS et al. 1984). Unterhalb der Hornschicht ist die Penetration durch die lockeren Zellanordnungen im Stratum spinosum und Stratum basale entsprechend erleichtert (NEURAND und MEYER 1987). Das Eindringen in die Epidermis allein ist jedoch nicht gleichbedeutend mit einer Aufnahme durch den Gesamtorganismus. Da sich die Epidermis stetig von unten her regeneriert, können Substanzen, die hier länger verweilen, mit den Zellen wieder eliminiert werden (ZESCH und SCHAEFER 1976). Nach dem Durchdringen des Stratum papillare der Dermis können aufgetragene Substanzen in die Blut- und Lymphbahnen gelangen; sie können jedoch schon in der Haut metabolisiert werden, da auch in der Haut eine große Anzahl von Enzymen mit metabolischer Aktivität vorhanden sind (STÜTTGEN und SCHAEFER 1974).
Qualitativ sind die Enzyme solchen in anderen Organgeweben gleich, die quantitative
Umwandlungsrate der Arzneimittel ist in der Haut im Vergleich zur Leber allerdings deutlich geringer. Bei systemischer Applikation spielt die Haut bei der Metabolisierung von Arzneimitteln daher nur eine untergeordnete Rolle. Auf der anderen Seite ist die Metabolisierung in der Haut nach topischer Applikation von entscheidender Bedeutung.
KAPPUS (1989) zeigt auf, daß die Metabolisierungsrate stoffabhängig erhöht oder erniedrigt ist, woraus eine verminderte bzw. gesteigerte Bioverfügbarkeit resultiert. Ferner weist er darauf hin, daß neben der Umwandlung zu exkretionsfähigen Verbindungen die enzymatische Metabolisierung auch zu einer kovalenten Bindung an das Gewebe führen und in Toxizität, Mutagenität und Kanzerogenität enden kann (BICKERS und KAPPUS 1980; BICKERS 1983).
Die Faktoren, welche auf die perkutane Penetration und Resorption Einfluß nehmen, sind vielfältig. Nach STÜTTGEN und SCHAEFER (1974) vergrößert sich die Permeationsrate mit steigender Löslichkeit der angebotenen Substanz im Stratum corneum entsprechend den Gesetzen der Diffusion.
Hydrophile Stoffe diffundieren nach topischer Applikation nur in begrenztem Umfang in die Hornschicht, da durch die Lipidmembran nur ungeladene lipophile Substanzen diffundieren.
Auch höhermolekulare Stoffe zeigen in der Regel eine geringere perkutane Penetration. Die Lipophilie des Arzneistoffes spielt somit für die Diffusion durch die Hornschicht eine entscheidende Rolle (SCHAEFER et al. 1982). Moleküle mit sowohl polaren als auch apolaren Eigenschaften penetrieren in der Regel recht gut durch die Hornschicht (KOCH 1985). Außerordentlich gering ist die Penetration von Elektrolyten durch das Stratum corneum (SCHEUPLEIN 1978b). Soweit diese stattfindet, dürfte sie in erster Linie interzellulär erfolgen, da die Zellmembranen nach MIDDLETON (1969) für Elektrolyte undurchlässig sind.
Abgesehen von hochmolekularen Substanzen spielt die Molekülgröße für die Penetration und Permeation durch die Haut eine eher untergeordnete Rolle. Festzustellen ist, daß bei allen Molekülen, die die Haut gut durchwandern, eine Beziehung zwischen Molekülgröße und Permeabilitätsgeschwindigkeit nicht zu belegen ist (STÜTTGEN und SCHAEFER 1974).
Untersuchungen von FELDMANN und MAIBACH (1970) zeigen, daß chemisch verwandte Verbindungen große Resorptionsunterschiede aufweisen können. So ist die Resorptionsrate
für Benzoesäure wesentlich höher als für Hippursäure, dem Glycinkonjugat dieser Verbindung.
Aufgrund der speziesabhängigen Unterschiede der Morphologie der Haut muß die Beurteilung der Penetrationsfähigkeit einzelner Substanzen für jede Spezies gesondert betrachtet werden. Beim Menschen scheint die Barrierefunktion des Stratum corneum recht stark ausgebildet zu sein (BARTEK et al. 1972). Dem Menschen am ähnlichsten reagieren nach BARTEK et al. (1972) unter den Tieren Schweine, haarlose Mäuse und einzelne Affenarten. Meerschweinchen, Hunde, Ratten und Kaninchen zeigen eine deutlich schwächere Barrierefunktion (siehe auch Tab. 3, S. 27). PRÍBORSKÝ und MÜHLBACHOVÁ (1990) ermitteln dagegen annähernd gleiche Resorptionsraten bei Menschen und Meerschweinchen, während sie bei Ratten deutlich höhere Resorptionsraten ermitteln. MARZULLI et al. (1969) sowie BRONAUGH et al. (1982a) führen die Permeabilitätsunterschiede der Arten auf die Zahl der Haare und Drüsen sowie die abweichende Stärke und Zusammensetzung des Stratum corneum zurück.
Von erheblicher Bedeutung sind die großen Permeationsunterschiede in den verschiedenen Körperregionen. In In-vitro-Untersuchungen an Rattenhaut zeigt BRONAUGH (1985), daß die dünnere Abdominalhaut permeabler für Wasser, Harnstoff und Kortison ist als die dickere Rückenhaut. Mit In-vitro-Untersuchungen an haarloser Mäusehaut bestätigen BEHL et al.
(1985) einen Zusammenhang zwischen Hautdicke und regionalen Permeationsunterschieden.
CHAMBIN et al. (1996) testen verschiedene Estradiolformulierungen in vitro an Schweinehaut von unterschiedlichen Körperregionen. Auch in ihren Untersuchungen hat die Hautdicke Einfluß auf die Fluxrate, die perkutane Penetration durch dünnere Haut ist gesteigert.
FELDMANN und MAIBACH (1967) zeigen unter Verwendung von radioaktiv markiertem Hydrocortison (Messung im Urin nach topischer Applikation), daß die resorbierte Substanz- menge an Kopfhaut, Achselhöhle, Stirn und Kieferwinkel besonders hoch ist. Mit der 42 fachen resorbierten Substanzmenge bezogen auf die Unterarmhaut (=1) ist die Resorptionsrate am Skrotum am größten (Tab. 2).
Tab. 2: Urinausscheidung von 14C-Hydrocortison nach externer Applikation bezogen auf die Haut am Unterarm (=1) (FELDMANN und MAIBACH 1967)
Unterarm (ventral) 1,00
Fußsohle 0,14
Fußknöchel (lateral) 0,42
Handfläche 0,83
Unterarm (dorsal) 1,10
Rücken 1,70
Kopfhaut 3,50
Achselhöhle 3,60
Stirn 6,00
Kieferwinkel 13,00
Skrotum 42,00
Nicht nur die Körperregion, sondern auch das Hautalter hat Einfluß auf die perkutane Penetration und Resorption. Neonatale Haut ist im Allgemeinen deutlich permeabler. Ursache hierfür ist der im Vergleich zum Erwachsenen höhere Wassergehalt und der verringerte Lipidgehalt der Hornschicht (POULSEN 1972). Mit zunehmendem Alter weist die Haut Veränderungen wie erhöhte Trockenheit auf, welche auf der verminderten transepidermalen Wasserabgabe beruht, die durch die Verhärtung der gealterten Epidermis bedingt ist (RAAB 1990b). Die Verringerung des Lipidgehaltes - den Fettfilm auf der Haut betreffend - geht auf eine eingeschränkte Funktion der Talgdrüsen zurück (STRAUSS et al. 1986). ROSKOS et al.
(1986) untersuchen die renale Elimination von Testosteron, Östradiol, Hydrocortison und Benzoesäure nach topischer Anwendung bei 18-35-jährigen und 65-75-jährigen Probanden.
Für das lipophile Testosteron und Östradiol resultiert bei beiden Gruppen kein Eliminationsunterschied, wohl aber für das weniger lipophile Hydrocortison und für Benzoesäure, deren Elimination bei den älteren Probanden reduziert ist. Dieses deutet auf eine geringere Resorptionsrate von weniger lipophilen Substanzen bei älteren Menschen hin.
2.2.3 Penetrationsbeeinflussung
Eine intakte Funktion und Struktur der Haut garantiert einen größtmöglichen Schutz gegenüber externen Substanzen. So ist für viele Substanzen bekannt, daß sie auch nach längerer Einwirkungszeit in sehr hohem Prozentsatz wieder von der Hautoberfläche eliminiert werden können. Das ist zunächst von den Eigenschaften der betreffenden Substanz selbst abhängig, andererseits vom Zustand der Zusammensetzung des Hautoberflächenfilms. Als Folge verschiedener struktureller Veränderungen der Hornschicht ist eine Beschleunigung der Penetration topisch applizierter Arzneistoffe bzw. Schadstoffe nachweisbar. Von Bedeutung sind nach WOHLRAB (2001b) besonders folgende Veränderungen:
- Entfettung der Haut
- Entfernung der oberflächlichen Hornlagen - Störung der lamellären Struktur des Horns
- Erhöhung der Hydratation der Hornschicht (z.B. bei Okklusion) - erhöhte Transpiration
- Sonnenlichtexposition - erhöhte Hautdurchblutung
Organische Lösungsmittel führen aufgrund der Lipidentfernung zu gesteigerter Permeabilität der Hornschicht. Am meisten wird der transepidermale Wasserverlust durch ein Gemisch aus Chloroform und Methanol gesteigert (GRICE 1980). HARADEA et al. (1992) machen deutlich, daß die Entfernung der mehr polaren Lipide durch Chloroform-Methanol-Extraktion vor allem zu einer Penetrationsverbesserung lipophiler Wirkstoffe führt. IMOKAWA und HATTORI (1985) zeigen, daß eine Entfettung der Hornschicht mit einem Aceton-Ether- Gemisch zu einem Verschwinden der lamellären Lipidstrukturen und zu einer Abnahme des gebundenen Wassers führt. Je länger die Acetonbehandlung anhält, umso ausgeprägter ist die Exsikkation. IMOKAWA et al. (1986) stellen fest, daß der Hautzustand nach Lipidextraktion reversibel ist. Durch Auftragen von Lipiden, insbesondere Ceramiden und Glykolipiden, kommt es wieder zu einer Zunahme des Wasserbindungsvermögens. KIETZMANN und BLUME (1997) vergleichen am Modell des isoliert perfundierten Rindereuters die Resorption von Betamethasondipropionat durch unbehandelte Euterhaut und durch mit Aceton
vorgeschädigte Euterhaut. Ihre Ergebnisse zeigen, daß Aceton die Hornschicht für den Wirkstoff durchlässiger macht.
DOWNING et al. (1993) untersuchen die Beeinflussung der Hornschichtbarriere durch Tenside. Sie zeigen, daß es zu einer Einlagerung der Tenside in das Stratum corneum kommt.
Sie stellen fest, daß die Hornschichtpermeabilität allein durch die Einlagerung von Tensiden erhöht werden kann, ohne daß die Hornschichtbarriere zerstört wird. Trotzdem kann es darüber hinaus bei starker Tensideinwirkung zu einer Schädigung der Barrierefunktion durch Herausemulgieren von Lipiden kommen (DOWNING et al. 1993).
Bei Verlust der Hornschicht gibt es keine wesentliche Barriere mehr für eindringende Agenzien. Experimentell läßt sich diese Situation, die bei Verbrennungen und teilweise auch bei Ekzemen vorliegt, durch Entfernen der Hornschicht mittels der Tesa®-Film-Abrißmethode simulieren (GLOOR 1982). Die Menge des Stratum corneum, die pro Abriss entfernt wird, ist nicht linear proportional zur Anzahl der Abrisse (TSAI et al. 1991). SCHALLA et al. (1980) zeigen für Kortikosteroide, daß durch die Tesa®-Film-Abrißmethode die Wirkstoffpenetration verstärkt wird.
Aus der klinischen Praxis ist die Penetrationssteigerung durch Okklusivverbände bekannt (GLOOR 1982). Diese führen zu einem Wärme- und Feuchtigkeitsstau mit nachfolgender Hydratation, Quellung und Auflockerung der Hornschichten. Die Penetration topischer Arzneistoffe läßt sich dadurch wirkstoffabhängig deutlich steigern (AUBÖCK 1992). Einige Autoren stellen jedoch fest, daß die Penetration von hydrophilen und einigen lipophilen Substanzen, insbesondere Methanol, Ethanol (BEHL et al. 1980) und Hydrocortison (BUCKS et al. 1988) nicht oder nur in geringem Maße durch Hydratation und Okklusion beeinflußt wird. Obwohl es unter Okklusionsbedingungen zu einer Hydratation der Hornschicht kommt, unterstützen Untersuchungen von TREFFEL et al. (1992) die Ansicht, daß eine Okklusion nicht notwendigerweise die perkutane Resorption von Substanzen steigert.
Die perkutane Penetration topisch applizierter Substanzen ist weiterhin temperaturabhängig.
BLANK et al. (1967), GOLDEN et al. (1987) sowie EMILSON et al. (1993) zeigen in In- vitro-Versuchen, daß die perkutane Penetration mit steigender Temperatur ansteigt. Durch die Temperaturerhöhung wird die Fluidität der Lipiddoppelschichten der Hornschicht erhöht. Die Bilayer sind so weniger dicht gepackt, und die entstandene Minderung der Barriere führt zu gesteigerter Penetration (CLARYS et al. 1996). Die Temperatur kann die Stoffresorption
direkt über die Diffusionsrate, aber auch indirekt über die Durchblutung beeinflussen (KARZEL und LIEDTKE 1989). So beeinflussen Kortikosteroide ihr eigenes pharmako- kinetisches Profil, da sie durch ihren vasokonstriktorischen Effekt einen negativen Einfluß auf den Blutstrom ausüben (GIBSON 1990).
Um ein möglichst großes Konzentrationsgefälle von der galenischen Formulierung zum Stratum corneum zu erreichen, können nach DAVIS und HADGRAFT (1991) übersättigte Lösungen, wie z.B. Mikroemulsionen verwendet werden. Diese legen einen weiteren Mechanismus dar, die perkutane Penetration zu verbessern. WATKINSON et al. (1996) zeigen an einem synthetischen Membranmodell, daß unter konstanten Bedingungen der Flux durch die Membran sein Maximum erreicht, wenn die äußere Membranschicht gesättigt ist.
Das trifft zu, wenn das Vehikel ebenfalls mit dem Wirkstoff gesättigt ist.
Eine große Anzahl von Substanzen ist bekannt, die für unterschiedliche topisch applizierte Substanzen als Penetrationsförderer wirksam sind. Diese Eigenschaft wird vielfach für die Verbesserung der therapeutischen Effektivität galenischer Zubereitungen genutzt (WOHLRAB 2001a). Penetrationsförderer erhöhen durch Veränderung der Hautstruktur die Hautpermeabilität, ohne irreversible Schäden hervorzurufen. Dabei haben sie in der angewandten Konzentration in der Regel keine eigenen pharmakologischen Eigenschaften (RITSCHEL und SPROCKEL 1988). Lange bekannt ist beispielsweise die penetrationsfördernde Eigenschaft des Dimethylsulfoxid (DMSO). Die Wirkung ist mit der Fähigkeit zu erklären, die Durchlässigkeit der Barriere zu vergrößern. Dabei kommt es zu einer Reaktion mit den polaren Gruppen der Membran und zu einer Lockerung der Bindungsenergie, gefolgt von Strukturänderungen, die letztlich zu neuen Wegen durch das Gewebe führen (SCHAEFER et al. 1982; BARRY 1987). Auch Stoffe wie Harnstoff und Salicylsäure finden aufgrund ihrer keratolytischen Eigenschaft Einsatz als Penetrationsförderer. Die Anwendung von Harnstoff bewirkt ebenso wie eine Okklusionsbehandlung einen Anstieg des interzellulären freien Wassergehaltes (GLOOR 1982). 5 - 10 %ige Harnstoffpräparate bewirken in Gegenwart von Wasser eine Auflösung der Interzellularbrücken und damit eine Lösung der Korneozytenhaftung (WOHLRAB 1996). In Untersuchungen zur Salicylsäurewirkung auf die Haut zeigen HUBER und CHRISTOPHERS (1977), daß durch die topische Applikation von Salicylsäure die Haftfähigkeit der Hornzellen
untereinander gemindert und in den tieferen Hornschichtlagen das Verbundsystem der Hornzellen gelockert wird.
2.3 Modelle zur Untersuchung der transkutanen Penetration und Permeation
Für Untersuchungen der perkutanen Pharmakokinetik stehen derzeit eine Vielzahl von In- vivo- und In-vitro-Methoden zur Verfügung (SCHAEFER und HENSBY 1990). Die Untersuchungen werden zumeist an menschlicher und tierischer Haut und an sogenannten Hautäquivalenten („künstliche Haut“) durchgeführt (WESTER und MAIBACH 1985;
SCHAEFER-KORTING 1996).
2.3.1 In-vivo-Modelle
In-vivo-Untersuchungen am Menschen werden nach RIVIERE et al. (1986) durch ethische Fakten limitiert. Weiter können In-vivo-Methoden wegen toxikologischer Gefährdung oder aus Gründen des Strahlenschutzes (radioaktiv markierte Substanzen) nur sehr begrenzt am Menschen angewendet werden (GLOOR 1982). Dagegen bieten sich sowohl in vivo als auch ex vivo viele Möglichkeiten im Tierversuch an. Untersuchungen an Tieren haben das Ziel, die perkutane Resorption beim Menschen vorhersagen zu können. Zur Messung der perkutanen Permeation von Substanzen und deren anschließender Resorption kann nach Applikation einer Substanz auf die Haut im Blut und Urin des Versuchstieres die Menge der resorbierten bzw. ausgeschiedenen Substanz in Abhängigkeit von der Kontaktdauer gemessen werden.
Auch die Bestimmung der Verteilung der Substanz in verschiedenen Organen ist möglich (WOHLRAB 2001b). Allerdings ergibt sich bei der Auswahl eines Tiermodells die Problematik der Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die Verhältnisse beim Menschen. So ist die Barrierefunktion der Hornschicht von Labortieren (z.B. Meerschweinchen, Maus, Ratte) im Vergleich zur menschlichen Haut deutlich geringer (HOWES et al. 1996). Nach WESTER und MAIBACH (1985) ist die perkutane Resorption beim Affen und Schwein in den meisten Fällen mit der des Menschen am ehesten vergleichbar bzw. nahezu identisch.
Die Messung der Resorption hydrophober Substanzen gestaltet sich in vivo oft schwierig, da die resorbierten hydrophoben Substanzen sich in das Körperfett verteilen und nur sehr langsam ausgeschieden werden. Aus diesem Grund wären Messungen über Monate
notwendig, da es möglich ist, daß nach einer Woche nur ein geringer Prozentsatz der absorbierten Menge ausgeschieden wurde (BRONAUGH und COLLIER 1991b).
In-vivo-Untersuchungen schließen die Wirkungen des Organismus auf die resorbierte Substanz, wie Metabolisierung, Verteilung und Exkretion mit ein, so daß die Penetrationsrate nur indirekt ermittelt wird. Weiterhin ist es mit In-vivo-Modellen nicht möglich, exakte qualitative und quantitative Aussagen über den Hautmetabolismus zu machen (BRONAUGH et al. 1982b).
2.3.2 In-vitro-Modelle
In Anbetracht der Nachteile von In-vivo-Methoden ergeben sich für In-vitro-Modelle weitere Vorteile in einer Einsparung von Tierversuchen und in der Möglichkeit, auch mit toxischen Dosen arbeiten zu können (WESTER und MAIBACH 1985). Bei den In-vitro-Methoden unterscheidet man zwischen Modellen mit nicht perfundierter und perfundierter Haut. Zu den erstgenannten gehören Diffusionszellen und Zellkulturen. Die Perfusionsmodelle sind unter 2.3.2.3 aufgeführt.
2.3.2.1 Diffusionszellen
Die Anwendung von Diffusionszellen basiert auf der Annahme, daß die Barriereeigenschaften der Hornschicht von exzidierter Haut mit In-vivo-Verhältnissen identisch sind, eine Annahme, die durch viele Untersuchungen gestützt wird. Nach BRONAUGH und MAIBACH (1985) behält die Haut auch nach Exzision vom Körper ihre Barriereeigenschaften, da das Stratum corneum als nicht mehr vitales Gewebe die wichtigste Penetrationsbarriere für Substanzen darstellt. Vitale Haut ist nach BRONAUGH und MAIBACH (1985) weiterhin keine Voraussetzung für Penetrationsversuche, weil die Penetration ein passiver Diffusionsprozeß ist. Die Barriereeigenschaften der Haut können normalerweise nach Gewinnung der Haut vom Körper und geeigneter Lagerung (-20 °C) bis zu drei Monaten erhalten bleiben (HARRISON et al. 1984). Unter standardisierten Bedingungen gewonnene Haut von verschiedenen Tierspezies ist im Gegensatz zu Humanhaut leicht erhältlich. Letztere steht nur in begrenztem Umfang bei Operationen oder post mortem zur Verfügung. PFLUCKER et al. (1997) untersuchen morphologische Veränderungen und die dermale Permeation in vitro an exzidierter Schweinehaut nach Lagerung unter verschiedenen Bedingungen im Vergleich zu
frischer Haut. Sie finden nach topischer Applikation verschiedener Substanzen keine Änderungen in den Penetrationseigenschaften der Haut. Das gebräuchlichste In-vitro-Modell zum Studium des dermalen Wirkstofftransportes ist die Diffusionszelle nach Franz (FRANZ 1975) (Abb. 11) bzw. davon abgeleitete Modifikationen.
Abb. 11: Schematische Darstellung des Aufbaus sog. „Franz-Zellen“ (nach FRANZ 1975)
Die „Franz-Zelle“ besteht aus einer doppelwandigen, temperierbaren Glaskammer zur Aufnahme der Rezeptorflüssigkeit. Auf dieses Gerät wird entweder das vom subkutanen Fett befreite Hautstück oder nur die Epidermis gelegt und durch einen Glasring und eine Metallklammer so fixiert, daß es mit der dermalen Seite in Kontakt zum Rezeptormedium gelangt. Die epidermale Seite der Haut wird in die trockene bzw. kontrolliert hydratisierte Umgebung gerichtet eingesetzt. Als Diffusionsbarriere können auch synthetische Materialien benutzt werden (NACHT und YEUNG 1985). Da das wässrige dermale Gewebe wasserlösliche Substanzen leicht diffundieren lässt, stellt es nur eine minimale Beeinflussung für die Penetration der applizierten Substanzen dar. Hydrophobe Substanzen hingegen diffundieren nur sehr langsam durch die Dermis, weshalb im Vergleich zu In-vivo- Untersuchungen die Resorption lipophiler Substanzen langsamer erscheint (BRONAUGH und COLLIER 1991).
Probe-
entnahmerohr Hautpräparat
Abdeckung
Dichtungsring
Temperatur- mantel
Zufluß
Abfluß Magnetrührer
Eine auf das Stratum corneum aufgetragene Substanz diffundiert, den Gesetzen der Fick´schen Diffusion folgend, durch die Schichten der Haut und kann anschließend in der Rezeptorflüssigkeit nachgewiesen werden. Die gewählte Rezeptorflüssigkeit darf das Ausmaß der Penetration der Testsubstanz nicht begrenzen, d.h. die Substanz muß im Rezeptormedium vollständig löslich sein. Die Konzentration der Testsubstanz im Rezeptormedium muß während der Versuchsdauer gering bleiben, um eine signifikante Rückdiffusion zu vermeiden.
Es muß weiterhin beachtet werden, daß die Barriereeigenschaften der Haut, sowie die physikalisch-chemischen Eigenschaften der zu untersuchenden Substanz und die Analytik nicht nachteilig durch die Rezeptorflüssigkeit verändert werden (HOWES et al. 1996). Bei längerandauernden Experimenten ist nach COLLIER und BRONAUGH (1991) eine Antibiotikazugabe zur Rezeptorflüssigkeit erforderlich.
Eine besondere Modifikation der Diffusionszelle ist die Durchflußdiffusionszelle („flow- through“-Diffusionszelle). Sie wurde entwickelt, um die Probennahme zu automatisieren.
Weiter läßt sich hier die Problematik der Rückdiffusion von Stoffen aus der Rezeptorflüssigkeit in die Haut, die unter Verwendung der Diffusionszelle eintreten kann, vermeiden. Diese Durchflußdiffusionszellen entsprechen eher der In-vivo-Situation, da durch den ständigen Austausch der Rezeptorflüssigkeit die penetrierende Substanz durch die Mikrozirkulation aus der Haut entfernt wird. Im Vergleich zu statischen Diffusionszellen stimmen die Penetrationsprofile und die penetrierenden Mengen von Wasser, Kortison und Benzoesäure überein (BRONAUGH und STEWART 1985). Im Gegensatz dazu stellen WESTER und MAIBACH (1985) signifikante Unterschiede zwischen statischen und „flow through“-Diffusionszellen fest. Sie untersuchen die Penetration des Desinfektionsmittels Triclocarban in die menschliche Bauchhaut. Die Penetration im statischen System beträgt 0,1
%, im Durchflußsystem 6,0 % der applizierten Dosis. Die geringe Penetrationsrate wird durch die schlechte Löslichkeit des Triclocarban in der Rezeptorflüssigkeit erklärt, weshalb diese Substanz in der Haut verbleibt. Die Löslichkeit im „flow-through“-System ist durch das höhere Volumen größer, weshalb dieser Zustand eher dem kontinuierlichen Blutfluß in vivo entspricht. Die perkutane Resorption von Triclocarban in vivo beträgt etwa 7 %. Um die Resorption vorherzusagen, eignet sich in diesem Fall das „flow-through“-System besser (WESTER und MAIBACH 1985).
Bei der Verwendung von Diffusionszellen ist zu beachten, daß Enzyme aus der Dermis in die Rezeptorflüssigkeit übertreten können, so daß penetrierte Substanzen möglicherweise erst in der Rezeptorflüssigkeit metabolisiert werden (BUNDGAARD et al. 1983). DECARVALHO et al. (1996) zeigen, daß auch eine Diffusion des Wassers aus der Rezeptorkammer in die Donatorkammer möglich ist, was die Penetration einer Testsubstanz beeinflussen kann.
2.3.2.2 Saarbrücker Penetrationsmodell
Das sog. Saarbrücker Penetrationsmodell (SB-M) wurde auf der Basis von exzidierter Humanhaut entwickelt. Es können die Arzneistoffkonzentrationsverläufe in den einzelnen Hautschichten ermittelt werden. Im Gegensatz zur „Franzzelle“, die für die Wirkstoffpermeation durch die Haut entwickelt wurde, dient das SB-M der Untersuchung der Wirkstoffpenetration in die Haut.
Am SB-M werden die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Wirkstoffpenetration in die verschiedenen Hautschichten untersucht, wobei die Haut selbst als Akzeptor für die zu penetrierende Substanz fungiert. Eine Hydratation der Haut wird vermieden und damit auch mögliche Veränderungen der Hauteigenschaften, die bei Verwendung der „Franzzelle“ durch die Rezeptorflüssigkeit entstehen können. Jedoch stellt die Inkubationszeit hier in Abhängigkeit von der verwendeten Substanz einen limitierenden Faktor dar, da die Voraussetzungen für das Eindringen der Substanz über die gesamte Versuchsdauer erhalten werden müssen.
Für den Versuchsablauf wird ein Hautstück zusammen mit einem mit Ringerlösung getränkten Papierfilter in die Aushöhlung eines Teflonblocks gebracht. Die Arzneimittel- zubereitung mit der zu penetrierenden Substanz befindet sich in der Aushöhlung eines Gegenstückes, welches ebenfalls aus Teflon besteht. Dieses Gegenstück wird auf die Oberfläche der Haut aufgelegt und mit Schrauben fixiert. Um einen transepidermalen Wasserverlust zu vermeiden, wird die Lücke zwischen den beiden Teflonstücken mit Plastibase versiegelt. Die gesamte Apparatur wird in in einer Plastikbox in einem 32 °C warmen Wasserbad über unterschiedlich lange Zeit inkubiert.
Zur Bestimmung der Verteilung der Substanz in den verschiedenen Hautschichttiefen wird das Hautstück im Anschluß an den Versuch mit zwei verschiedenen Methoden segmentiert:
mit der Tesa-Film-Abrißmethode wird das Stratum corneum Schicht für Schicht abgetragen.
Die „lebende“ Epidermis wird mit dem Gefriermikrotom parallel zur Hautoberfläche in definierten Schichtdicken abgetragen. Durch anschließende Extraktion der zu untersuchenden Substanz aus den Hautschnitten und Bestimmung der Konzentrationen mittels HPLC kann die Verteilung in den Hautschichten errechnet werden (WAGNER et al. 2000).
WAGNER et al. (2000) vergleichen das SB-M mit der etablierten „Franzzelle“ und In-vivo- Daten, wobei sowohl für das SB-M als auch für die „Franzzelle“ für den Arzneistoff Flufenaminsäure eine gute In-vitro-/ In-vivo-Korrelation gefunden wird. Außerdem stellen sie fest, daß die starke Hydratation der Haut bei Verwendung der „Franzzelle“ insbesonders den Arzneistoffkonzentrationsverlauf in den tieferen Hautschichten stark beeinflußt.
Zur Bestimmung der In-vitro-Permeabilitätseigenschaften der Haut gibt es zahlreiche Untersuchungen. Tabelle 3 faßt in absteigender Reihenfolge in vitro bestimmte Hautpermeabilitäten bei verschiedenen Spezies zusammen.
TREGEAR (1966) MARZULLI et al. (1969) McCREESH (1965) Hautpermeabilität
Kaninchen Maus Kaninchen
Ratte Meerschweinchen Ratte
Meerschweinchen Ziege Meerschweinchen
Mensch Kaninchen Katze
Pferd Ziege
Katze Affe
Hund Hund
Affe Schwein
Schwein Mensch Schimpanse
Tab. 3: In vitro-Hautpermeabilität bei verschiedenen Spezies in absteigender Reihenfolge (nach TREGEAR 1966; MARZULLI et al. 1969; McCREESH 1965)
Schweinehaut ist nach DICK et al. (1997) für Voraussagen bezüglich der Permeabilität durch die Haut des Menschen sehr gut geeignet. Rattenhaut stellt ebenfalls ein geeignetes Modell
+++++
+
für menschliche Haut dar, wenn die applizierte Substanz hydrophiler Natur ist, führt aber grundsätzlich zu einer Überschätzung der penetrierten Menge bei lipophilen Substanzen.
BRONAUGH (1985) kann auch in vitro an Rattenhaut regionale Unterschiede feststellen. Die dünnere Abdominalhaut ist für Wasser, Kortison und Harnstoff permeabler als die dickere Rückenhaut. BEHL et al. (1985) dagegen zeigen in Versuchen an haarlosen Mäusen, daß hier die Rückenhaut dünner und gleichzeitig permeabler als die Bauchhaut ist.
Im Hinblick auf die Darstellung der Penetration, also dem Weg durch die Hornschicht und Anreicherung in der Epidermis, kann zwischen In-vivo- und In-vitro-Versuchen kein prinzipieller Unterschied festgestellt werden. Wesentliche Abweichungen ergeben sich jedoch, sobald die Kutis mit ihren Gefäßsystemen in die Penetrationsuntersuchungen einbezogen wird. Da der Transport durch die Gefäße und die davon abhängige Gleichgewichtseinstellung in vitro nicht mehr möglich ist, sofern die Haut nicht perfundiert ist, sind solche Ergebnisse auf In-vivo-Verhältnisse schlecht übertragbar (STÜTTGEN und SCHAEFER 1974).
Nach KLIGMANN (1983) ist die Auswertbarkeit der In-vitro-Ergebnisse leichter, da bei diesen Untersuchungen nur die Haut erfasst wird. Er ist daher der Ansicht, daß In-vitro- Ergebnisse valider sind als In-vivo-Daten, und daß bei bestehenden Unterschieden die In-vivo- Ergebnisse fragwürdiger sind.
BRONAUGH et al. (1982b) untersuchen die Resorption von Benzoesäure, Acetylsalicylsäure, Harnstoff und Coffein durch Rattenhaut. Sie vergleichen die erzielten In-vivo- und In-vitro- Ergebnisse und stellen fest, daß sich sowohl qualitativ als auch quantitativ eine gute Übereinstimmung zeigt. Andere Autoren stellen ebenfalls zwischen In-vivo- und In-vitro- Untersuchungen gute Übereinstimmungen fest (AINSWORTH 1960; SEKURA und SKALA 1972; CREASY et al. 1978).
2.3.2.3 Zellkulturen und künstliche Haut
Da zu Untersuchungen zur Hautphysiologie und -pathophysiologie frisch exzidierte gesunde Humanhaut nicht immer in ausreichend großer Menge zur Verfügung steht und Ergebnisse aus Resorptionsstudien am Tier nur begrenzt auf den Menschen übertragbar sind, stehen als Ersatzverfahren u.a. kultivierte Hautzellen und rekonstruierte Epidermis bzw. künstliche Haut zur Verfügung (SCHAEFER-KORTING 1996).
Zellkulturen werden heute in großem Umfang zur Testung von Pharmaka eingesetzt. Hierbei werden Zellen von Epidermis und Korium in künstlichen Nährmedien vermehrt. Kultiviert man Keratinozyten in Gegenwart physiologischer Kalziumionenkonzentration, d.h. in einem kalziumreichen Nährmedium, gelingt es, einen Differenzierungsprozeß in Gang zu setzen, aus dem mehrschichtige (2-5 Zelllagen) Präparate hervorgehen. In kalziumarmen Nährmedien wird dagegen nur eine Zelllage ausgebildet (SCHAEFER-KORTING 1996).
Schon DUBERTRET (1990) verwendet ein Hautäquivalent zur Untersuchung dermo- epidermaler Wechselwirkungen, indem er menschliche Fibroblasten mit Kollagen Typ I und III mischt. Die Kollagenfasern werden durch die Fibroblasten zusammengezogen. Diese dreidimensionale Kultur wird anschließend mit Keratinozyten bedeckt.
Für die Herstellung „künstlicher Haut“ werden Keratinozyten beispielsweise auf mesenchymalem Gewebe (isoliertes Korium oder in Kollagen eingebettete Fibroblasten) gezüchtet und durch Inkubation an der Luft-Medium-Grenze zur Verhornung gebracht. Diese
„Ersatzhaut“ weist allerdings eine geringere Barrierefunktion als gesunde Humanhaut auf.
Während die verstärkte Durchlässigkeit tierischer Haut auf die Vielzahl von Haarfollikeln (Shuntweg der Penetration) zurückgeführt wird, ist sie bei der Kunsthaut auf eine den physiologischen Bedingungen nicht entsprechende Ausbildung des Stratum corneum zurückzuführen. Epidermale Lipide (Ceramide) entstehen in geringerer Konzentration, werden unzureichend sezerniert und zudem nicht gemäß der Beschreibung unter 2.2.1 arrangiert. Die in vitro kultivierten Keratinozyten haben jedoch das Potential zur normalen Ausreifung keinesfalls verloren. Nach Transplantation von „Kunsthaut“ in Nacktmäuse resultiert nämlich eine Normalisierung der Barrierefunktion (SCHAEFER-KORTING 1996).
Es liegen verschiedene Permeabilitätsstudien und Untersuchungen zur Barrierefunktion von künstlicher Haut vor (RÉGNIER et al. 1992; DOUCET et al. 1997). LOTTE et al. (1997) zeigen, daß die Penetrationskinetik von Wasser, Benzoesäure, Coffein und Hydrocortison an
rekonstruierter Epidermis deutlich unterschieden werden kann. In dieser Reihenfolge nehmen die Penetrationsraten der genannten Stoffe ab. Dieses entspricht auch der Reihenfolge der Permeabilität durch Humanhaut, wobei die mit rekonstruierter Epidermis erzielten absoluten Werte jedoch wesentlich höher liegen.
SCHMOOK et al. (2001) vergleichen die Penetrationseigenschaften von Menschen-, Ratten- und Schweinehaut mit kommerziell erhältlichen Hautäquivalenten. Sie kommen zu dem Ergebnis, daß die momentan angebotenen Kunsthautmodelle (z.B. Graftskin®, Skinethik®, Skin²®, Episkin®) nicht ohne Einschränkung für In-vitro-Penetrationsstudien einsetzbar sind.
2.3.2.4 Perfusionsmodelle
Nach HOWES et al. (1996) ist die Verwendung perfundierter Haut aus physiologischer Sicht wünschenswert, da die Versuchsanordnung in Diffusionszellen nur Aussagen zur dermalen Penetration, jedoch nicht zur Resorption topisch applizierter Substanzen erlaubt (KIETZMANN und LÖSCHER 1993). In-vitro-Verfahren, die die In-vivo-Situation am ehesten widerspiegeln, stellen Perfusionsmodelle dar (BEHRENDT et al. 1989). Es gibt jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Modellen, die als aussagekräftig angesehen werden.
Für Routineuntersuchungen der perkutanen Absorption werden sie aufgrund ihres höheren technischen Aufwandes und der begrenzten Lebensfähigkeit der perfundierten Organe seltener genutzt (HOWES et al. 1996). Wie bereits beschrieben, ist zu beachten, daß die dermale Penetration und Resorption regional erheblich variiert (FELDMANN und MAIBACH 1969). Diese Tatsache schränkt die Übertragbarkeit von Ergebnissen generell auf Zieltierarten bzw. auf den Menschen ein (SCHAEFER et al. 1987).
Eine etablierte Versuchsanordnung stellt das isoliert perfundierte Kaninchenohr dar, welche erstmals von PISSEMSKI (1914) im Rahmen physiologischer Untersuchungen beschrieben wird. Später werden verschiedene Modifikationen dieser Methode für Untersuchungen zur Resorption und zum Hautmetabolismus topisch applizierter Substanzen entwickelt (EKERDT et al. 1985; KELLNER et al. 1986; BEHRENDT und KAMPFFMEYER 1987, 1989; BAST und KAMPFFMEYER 1994), jedoch ist die Übertragbarkeit der am Kaninchenohr gemessenen Resorptionsrate auf andere Tierarten oder den Menschen nur mit Einschränkungen möglich (PERSHING und KRUEGER 1987).
