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Hundegenomik am Beispiel von MLPH und MDR1 sowie Kandidatengenen für die dilatative Kardiomyopahtie

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Aus dem Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Hundegenomik am Beispiel von MLPH und MDR1 sowie

Kandidatengenen für die dilatative Kardiomyopathie

Habilitationsschrift zur Erlangung der VENIA LEGENDI

an der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Dr. rer. nat. Ute Elisabeth Philipp

Hannover 2009

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Tag der nichtöffentlichen wissenschaftlichen Aussprache

7. Juli 2009

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Inhaltsverzeichnis 3

Abkürzungsverzeichnis 4

Verzeichnis der Veröffentlichungen, die Bestandteil der Habilitationsschrift sind 6

1 Einleitung 7

1.1 Stand der Genomanalyse beim Hund 7

1.2 Kartierung des Hundegenoms 8

1.3 Methodische Ansätze zur Identifikation von Genen 10

2 Farbpigmente bei Säugetieren 12

2.1 Farbdilution bei Mensch und Maus 15

2.2 Der Dilutionsgenort beim Hund und mögliche Assoziationen zu Erkrankungen 19 2.3 Zusammenfassung der Ergebnisse der molekulargenetischen Untersuchungen

am caninen Farbdilutionsgenort 20

2.4 Eigene Beiträge zur molekulargenetischen Aufklärung des Farbdilutionsgenorts

bei Hunden 21

2.5 Diskussion 24

3 Dilatative Kardiomyopathie 29

3.1 Dilatative Kardiomyopathie beim Menschen 29

3.2 Dilatative Kardiomyopathie beim Hund 31

3.3 Zusammenfassung der Ergebnisse zur Untersuchung von Kandidatengenen, die an der Ausprägung einer DCM beim Irischen Wolfshund beteiligt sein könnten 33 3.4 Eigene Beiträge zur DCM beim Irischen Wolfshund 33

3.5 Diskussion 36

4 Untersuchungen am caninen MDR1 Gen 41

4.1 Funktion des MDR1 P-Glykoproteins 41

4.2 MDR1 Polymorphismen beim Menschen 41

4.3 Der MDR1 Polymorphismus beim Hund 43

4.4 Ziel der Untersuchungen am caninen MDR1 beim Elo 43 4.5 Eigener Beitrag zur Untersuchung von MDR1 Polymorphismen beim Hund 44

4.6 Diskussion 46

5 Studienübergreifende Diskussion 48

6 Ausblick 50

7 Zusammenfassung 51

8 Literaturnachweis 53

9 Danksagung 65

10 Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Arbeiten 66

11 Anhang 68

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Abkürzungsverzeichnis

ABD Actin-Bindungsdomäne

ACTC1 α-Actin, cardiac muscle (Herzmuskel) α-MSH Melanozyten stimulierendes Hormon APC Adenomatous Polyposis coli Gen ASIP Agouti-Signal Protein

BHFD Black Hair Follicular Dysplasia

bp Basenpaar

cAMP cyclo-Adenosinmonophosphat CDA Color Dilute Alopecia

CDB103 β-Defensin 103

cDNA copy DNA

CFA Canis lupus familiaris Autosom

CHRM2 muscarinischer Acetylcholinrezeptor M2

cM centiMorgan

CSRP3 Cystein- und glycinreiches Protein 3 CTNNA3 α-Catenin 3

D, d Allele am Dilutionsgenort

DES Desmin

DCM dilatative Kardiomyopathie (dilated cardiomyopathy) DHI Dihydroxyindol

DHICA Dihydroxyindol-Carboxylsäure DNA Desoxyribonukleinsäure DOPA Dihydroxyphenylalanin δ-SCGD δ-Sarcoglycan

FISH Fluoreszenz in-situ Hybridisierung GS Griscelli Syndrom

GTP Guanosintriphosphat HSA Homo sapiens Autosom IW Irischer Wolfshund kb Kilobasen (1000 Basen)

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MATP Membran assoziiertes Transporter Protein Gen Mb Megabasen (eine Million Basen)

MBD Myosin-Bindungsdomäne MC1R Melanocortinrezeptor 1

MDR1 Multidrug Resistance Gene (Multidrug Resistenz Gen)

miRNA microRNA

MITF Microphthalmia-associated transcription factor (Mikrophthalmie assoziierter Transkriptionsfaktor)

MLPH: Melanophilin

mRNA messenger RNA (Boten-RNA) MT Microtubuli

MYH7 β-Myosin, heavy polypeptide 7, cardiac muscle (schwere Polypeptidkette des kar- di alen β-Myosins)

MYO5A Myosin VA

NCBI National Center for Biotechnology Information (USA) PDLIM3 PDZ- und Lim-Domäne 3 Gen

PLN Phospholamban

RAB27A Ras related Protein 27A RBD Rab-Bindungsdomäne RNA Ribonukleinsäure

SCARB1 Scavenger Rezeptor, Klasse B, Typ 1

SNP Single Nucleotide Polymorphism (Einzelbasenaustausch) snRNA small nuclear RNA (kleine nukleäre RNA)

SILV Silver-Genort

STS Marker sequence tagged site Marker TAZ Tafazzin

TCAP Titin-cap Gen oder Telethonin TMOD1 Tropomodulin 1

TYR Tyrosinase

TYRP Tyrosinase Related Protein

UCSC University of California, Santa Cruz UTR untranslatierte Region

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Verzeichnis der Veröffentlichungen (veröffentlicht bzw. eingereicht), die Bestandteil der Habilitationsschrift sind:

1. Philipp U, Quignon P, Scott A, Rak S, Andre C, Breen M, Leeb T. Assignment of the ca- nine myosin Va gene (MYO5A) to chromosome 30q14 by fluorescence in situ hybridiza- tion and radiation hybrid mapping. Cytogenet Genome Res. 2003; 101: 92C.

2. Philipp U, Scott A, Quignon P, Andre C, Breen M, Leeb T. Assignment of the RAB27A gene to canine chromosome 30q15.1 by fluorescence in situ hybridization and radiation hybrid mapping. Cytogenet Genome Res. 2003; 101: 92E.

3. Philipp U, Quignon P, Scott A, Andre C, Breen M, Leeb T. Chromosomal assignment of the canine melanophilin gene (MLPH): A candidate gene for coat color dilution in Pin- schers. J Hered. 2005; 96: 774-776.

4. Philipp U, Hamann H, Mecklenburg L, Nishino S, Mignot E, Günzel-Apel AR, Schmutz SM, Leeb T. Polymorphisms within the canine MLPH gene are associated with dilute coat color in dogs. BMC Genet. 2005; 6: 34.

5. Drögemüller C, Philipp U, Haase B, Günzel-Apel AR, Leeb T. A noncoding melanophilin gene (MLPH) SNP at the splice donor of exon 1 represents a candidate causal mutation for coat color dilution in dogs. J Hered. 2007; 98: 468-473.

6. Philipp U, Broschk C, Vollmar A, Distl O. Evaluation of tafazzin as candidate for dilated cardiomyopathy in Irish wolfhounds. J Hered. 2007; 98: 506-509.

7. Philipp U, Vollmar A, Distl O. Evaluation of six candidate genes for dilated cardiomyo- pathy (DCM) in Irish wolfhounds. Anim Genet. 2008; 39: 88-89.

8. Philipp U, Vollmar A, Distl O. Evaluation of the Titin-cap Gene (TCAP) as candidate for dilated cardiomyopathy in Irish wolfhounds. Animal Biotechnol. 2008; 19: 231-236.

9. Philipp U, Fecht S, Wöhlke A, Distl O. A sex-dependent functional polymorphism in the canine multidrug-resistance (MDR1) gene. submitted

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1 Einleitung

1.1 Stand der Genomanalyse beim Hund

Der Haushund (Canis lupus familiaris) gehört zu den Säugetieren, deren Genom nahezu kom- plett sequenziert wurde. Nach dem humanen Genom (Venter et al. 2001) und den Genomen von Ratte und Maus (Waterston et al. 2002, Gibbs et al. 2004) folgte bereits das Hundegenomprojekt.

Für das Projekt des Instituts für Genom Forschung (TIGR) wurde die DNA eines männlichen Pudels mit 1,5-facher Genomabdeckung sequenziert (Kirkness et al. 2003), während das Hunde- genomprojekt vom Broad Institute die DNA der Boxerhündin Tasha analysierte. Die Rasse Bo- xer wurde ausgesucht, da eine Voruntersuchung ergeben hatte, dass Boxer aufgrund der hohen Inzucht eine geringere genetische Varianz aufweisen als andere Hunderassen. Das Genom inge- züchteter Tiere ist leichter zu sequenzieren. Zur Assemblierung des Hundegenoms mit seinen insgesamt 38 Autosomen und dem X Chromosom standen Einzelsequenzen mit einer durch- schnittlichen 7,6-fachen Abdeckung des Genoms zur Verfügung (Lindblad-Toh et al. 2005). Das Hundegenom besteht aus rund 2.500 Mb. Davon konnten 2.400 Mb aus 39.804.928 Einzelse- quenzen, die in der Datenbank des NCBI Trace-Archives hinterlegt sind, assembliert werden.

Die Einzelsequenzen wurden zunächst zu 3315 Contigs (zusammenhängende DNA-Bereiche, die aus überlappenden Einzelsequenzen zusammengesetzt werden konnten) zusammengefasst, die anschließend zu den 39 Chromosomen assembliert wurden. Für künftige genetische Studien und die weitere Entwicklung der Hundegenomik bildet die Hundegenomsequenz eine wichtige Grundlage. Hunde haben das Interesse der Genetiker geweckt, da sie große Unterschiede bezüg- lich Morphologie, Verhalten und Erkrankungen aufweisen. Dadurch sind sie zu einem Modellor- ganismus für genetische Studien geworden. Während zwischen einzelnen Rassen erhebliche Un- terschiede in phänotypischen Merkmalen bestehen, weisen Hunde innerhalb einer Rasse eine ge- ringere Varianz auf. Diese Besonderheit macht insbesondere reinrassige Hunde für genetische Analysen wertvoll und sollte die Identifizierung kausaler Gene erleichtern.

Die vollständige Sequenzierung verschiedener Säugetiergenome soll genomische Analysen er- leichtern. Viele biologische Fragestellungen können zudem einfacher beantwortet werden, wenn man sich nicht nur auf ein Genom beschränkt, sondern die Sequenz weiterer Genome mit be- rücksichtigt und die Möglichkeiten der vergleichenden Genomik nutzt. Mittlerweile liegen von vielen weiteren Säugetieren assemblierte Genomsequenzen vor (Tabelle 1, http://

genome.ucsc.edu/goldenpath/credits.html).

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Tabelle 1: Säugetierarten in Sequenzprojekten, assemblierte genomische Sequenz, die Abdeckungsrate des Genoms sowie Abbildungsversion des NCBI Map Viewers (die Daten sind dem UCSC Genome Browser sowie dem NCBI Genome Browser entnommen.)

Säugetierart Assemblierte Sequenz Abdeckung des Genoms Abbildungsversion

Homo sapiens vollständig sequenziert 10x 36.3

Pan troglodytes 2,9 Gigabasen 6x 2.1

Pongo pygmaeus abelii 3,0 Gigabasen 6x -

Macaca mulatta 2,8 Gigabasen 5,1x 1.1

Callithrix jacchus 2,9 Gigabasen 6,x -

Mus musculus 2,7 Gigabasen vollständig sequenziert 37.1

Rattus norvegicus 2,5 Gigabasen 3x 3.4

Felis catus 1,6 Gigabasen 2x -

Equus caballus 2,4 Gigabasen 6,8x 2.0

Bos taurus keine Angabe 7,1x 4.0

Unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/leuks.cgi?p3=12:Mammals&taxgroup=11:|12:Mammals sind 78 Säugetiergenomprojekte aufgelistet, die unterschiedlich weit fortgeschritten sind. Nur die zwei Genome von Homo sapiens und Mus musculus gelten als vollständig sequenziert. Die mei- sten Genome (40) werden zur Zeit noch sequenziert, die verbleibenden 36 liegen als sogenannte Draft-Sequenzen (vorläufiger Entwürfe) vor, die noch bearbeitet werden müssen. Unter diesen vorläufig assemblierten Genomen sind allerdings auch noch humane Genomsequenzen von Ein- zelpersonen wie Greg Venter oder James Watson aufgeführt.

1.2 Kartierung des Hundegenoms

Bevor die umfangreichen Daten des Hundegenomprojektes zur Verfügung standen, wurden DNA-Fragmente und polymorphe Marker kartiert. Genetische Kartierungsmethoden beruhen auf der experimentell ermittelten Rekombinationshäufigkeit zwischen Markern. Für die Entwicklung genetischer Karten werden Mehrgenerationenpedigrees von Referenzfamilien mit möglichst po- lymorphen Markern, vor allem Mikrosatellitenmarkern, genotypisiert.

Physikalische Karten stellen die Lage von DNA-Fragmenten direkt auf dem Chromosom dar.

Man unterscheidet Karten, die auf der Fluoreszenz-in-situ Hydridisierung (FISH) Technik, der Radiation Hybrid (RH-) Kartierung oder der Anordnung überlappender genomischer Klone be-

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men hybridisiert und direkt nachgewiesen. Für die RH-Kartierung werden somatische Zellhybri- de über radioaktive Bestrahlung erstellt, die Chromosomenfragmente einer Zelllinie der zu un- tersuchenden Spezies in Nagetierchromosomen enthalten. Je höher die Strahlendosis, desto klei- ner sind die Fragmente und umso höher ist die Auflösung der RH-Kartierung. Die jetzt zur Ver- fügung stehenden vergleichenden Genomkarten und auch zuletzt sehr dichten RH-Karten des Hundegenoms nutzten auch die Erkenntnisse der humanen und murinen Sequenzierprojekte (Breen et al. 2004, Guyon et al. 2003). Die genaueste physikalische Karte eines Genoms entsteht durch die vollständige Sequenzierung, da dadurch die exakte Basenabfolge auf den Chromoso- men bekannt ist. Mit der nun vorliegenden Hundegenomsequenz, die rund 96 Prozent der 2.500 Mb des Hundegenoms enthält, ist die physikalische Kartierung bei Hunden nahezu abgeschlos- sen.

Die Erkenntnisse der verschiedenen Kartierungsprojekte wurden genutzt, um Mikrosatelliten- markersets für Hundegenomscans zu entwickeln. Das bisher entwickelte Panel enthält 507 Mikrosatelliten mit einem durchschnittlichen Abstand von 5 Mb (Sargan et al. 2007). Diese Markerdichte ermöglicht Kopplungsanalysen mit einer Auflösung von ca. 5-10 cM.

Durch die Sequenzierung des Hundegenoms konnten kürzlich die caninen SNP-Mikroarrays mit 64.000 beziehungsweise ca. 127.000 SNPs pro Chip entwickelt werden, die eine Alternative zu herkömmlichen Genomscans darstellen. Die wesentlich höhere Markerdichte auf den Mikroar- rays sollte die Nachteile der SNP-Marker gegenüber Mikrosatellitenmarker – geringerer Poly- morphie- und niedrigerer Heterozygotiegrad – mehr als ausgleichen und Kopplungs- und Asso- ziationsanalysen mit einer Auflösung von ca. 2 Mb ermöglichen (Andersson 2008).

Die Sequenzdaten, die nun vom Hundegenom vorliegen, und die neuen Technologien, sollten das Auffinden von Genen, die mit Eigenschaften gekoppelt oder assoziiert sind, erleichtern. Ein Vor- teil, der sich durch das Genomprojekt ergibt, ist, dass die Sequenzdaten allen Forschern zur Ver- fügung stehen. Die Datenbanken ermöglichen das Auffinden von Sequenzen nach chromosoma- ler Lokalisation oder nach Homologien. Mit Hilfe bioinformatischer Methoden kann man Se- quenzmotive im Genom suchen und so z. B. neue Mikrosatellitenmarker entwickeln, Vorkom- men und Verteilung von regulativen Sequenzmotiven wie miRNAs untersuchen, Bindungsmoti- ve von Transkriptionsmodulatoren auffinden. Für genetische Studien erweist sich vor allem die SNP-Datenbank als wertvoll. Mittlerweile sind über 3,3 Millionen Einzelbasenaustausche im

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Hundegenom annotiert. Durch das Wissen über die genaue Lokalisation sind sie als genetische Marker einsetzbar. Ein Ergebnis dieser Kenntnisse sind die bereits erwähnten SNP-Mikroarrays.

Darüber hinaus können die SNPs aber auch zu projektbezogenen Markersätzen zusammenge- stellt werden, um so einen bestimmten genomischen Bereich enger mit Markern abzudecken.

Daraus können dann letztendlich für verschiedene Hunderassen spezifische Markersets entwi- ckelt werden, die ein genetisches Profil der Einzeltiere ergeben und in die Zuchtstrategie der Rassen einfließen können.

Auch die Expressionschips, mit denen man Veränderungen der Expressionsprofile zwischen ver- schiedenen Fallgruppen messen kann, sind in Folge der bekannten Genomsequenz entwickelt worden. Werden die Daten von SNP- und Expressionschipanalysen kombiniert, lassen sich Wechselwirkungen der Gene erkennen und führen zu einer Weiterentwicklung der Hundegeno- mik (Georges 2007).

1.3 Methodische Ansätze zur Identifikation von Genen

Um die zu einem Phänotyp führenden (kausalen) Gene zu identifizieren, unterscheidet man prin- zipiell zwei verschiedene Vorgehensweisen: den funktionellen Kandidatengenansatz oder eine positionelle Klonierung nach einer Kopplungs- oder Assoziationsanalyse.

Ein funktioneller Kandidatengenansatz ist am ehesten dann erfolgreich, wenn der Erbgang für die beobachtete Eigenschaft monogen ist und es nur wenige Gene gibt, deren Mutation zu dem beobachteten Phänotyp führen kann. Die Hundegenomsequenz erleichtert nun das Auffinden homologer Genombereiche für Kandidatengene. Aufwändige de-novo-Sequenzierungen können so vermieden und Kandidatengene gleich gezielt untersucht werden. Die Analyse der Kandida- tengenbereiche kann zumeist durch Untersuchung nahe gelegener Mikrosatellitenmarker oder SNPs erfolgen und durch anschließende vergleichende Sequenzierung der Gene. Allerdings führt ein Kandidatengenansatz bei genetisch heterogenen Merkmalen wie beispielsweise Progressiver Retinaatrophie ohne zusätzliche positionelle Information nur selten zum Erfolg (Aguirre- Hernandez und Sargan 2005).

Für den positionellen Ansatz ist es nötig, Untersuchungen mit großen Tierzahlen und mit einer hohen Markerdichte durchzuführen, um einen QTL einzugrenzen. Da die zu untersuchende Tier- zahl oft begrenzt ist, kann man versuchen, die Markerdichte zu erhöhen. Ein Mittel dazu sind die

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caninen SNP-Chips, denn die Array-Technologie bietet die Möglichkeit viele Marker an einem Tier in kurzer Zeit zu genotypisieren. Daher scheint für den positionellen Ansatz derzeit die Chip-Technologie am besten geeignet, zuverlässige Ergebnisse zu liefern.

Für monogene rezessive Eigenschaften reichen rund 20 Proben von wenig verwandten Tieren aus, um den Genombereich mittels ca. 30.000 genotypisierter SNPs auf rund 1 Mb einzugrenzen (Karlsson et al. 2007, Andersson 2008). Ist der Genombereich soweit eingegrenzt, kann im anno- tierten Hundegenom nach möglichen kausalen Genen gesucht werden. Für die Analyse polyge- ner Eigenschaften muss eine deutlich höhere Anzahl von Tieren genotypisiert werden.

Dass die SNP-Array-Technologie bei Hunden zur Identifikation von kausalen Mutationen funk- tioniert, wurde beim Rhodesian und beim Thai Ridgeback gezeigt. Bei diesen eng verwandten Rassen wurde die kausale Mutation für den Haarkamm und damit auch die Prädisposition zum Dermoidsinus aufgeklärt (Salmon Hillbertz et al. 2007). Dabei reichte für die genetische Kartie- rung der monogen autosomal dominant vererbten Eigenschaft die DNA-Analyse von 21 Hunden, bei denen ca. 27 000 SNP-Marker ausgewertet worden waren (Karlsson et al. 2007). In der glei- chen Arbeit wurde der Genombereich des Scheckungsgenorts (S-Locus) auf 1 Mb eingegrenzt.

Für die semi-dominant vererbte Eigenschaft der Scheckung wurde die DNA von nur 19 Boxern genotypisiert. Die kausale Mutation für die Scheckung im MITF-Gen, dem einzigen Gen in die- sem Chromosomenabschnitt, ist bislang nicht identifiziert (Karlsson et al. 2007). Für weniger einfache oder eindeutige Erbgänge müssen sicher mehr als 20 DNA-Proben analysiert werden, um einen QTL zu identifizieren. Um die Zahl der zu genotypisierenden Tiere möglichst niedrig zu halten, ist die sichere Diagnose der Merkmalsträger wie auch der anlagefreien Tiere von be- sonderer Bedeutung. Dabei hängt die Anzahl zu genotypisierender Tiere von der Komplexität des Erbgangs und der Struktur der zu untersuchenden Population ab. Insbesondere die Identifi- zierung von Genen, die an der Ausprägung polygener Eigenschaften beteiligt sind, leistet einen Beitrag zum Verständnis der Hundegenomik.

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2 Farbpigmente bei Säugetieren

Bei Säugetieren werden Farbpigmente (Melanine) in spezialisierten Zellen, den Melanozyten, synthetisiert. Diese sind in der Basalschicht der Epidermis lokalisiert. Die Pigmentsynthese und die anschließende Verteilung der Pigmente an die Haar- und Hautzellen sind die Hauptaufgaben der Melanozyten. Das Melanin wird in Zellorganellen, den Melanosomen, hergestellt und in ih- nen in die angrenzenden Zellen transportiert. Melanin wird aus der Aminosäure Phenylalanin in einem enzymkatalysierten Prozess gebildet (Abbildung 1). Im ersten Reaktionsschritt wird Phe- nylalanin durch die Phenylalaninhydroxylase zu Tyrosin hydroxyliert. Tyrosin wiederum wird über die Tyrosinase in DOPA (Dihydroxyphenylalanin) und anschließend über das gleiche En- zym in DOPAquinon umgewandelt. Weitere Zwischenprodukte sind Dihydroxyindol (DHI) und Dihydroxyindol-Carboxylsäure (DHICA). Melanin stellt ein Polymer dieser Substanzen dar.

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Abbildung 1 (Seite 12): Syntheseweg der Melanine in den Melanosomen: Die Ausgangssubstanz sowohl für Eumelanin als auch Phäomelanin ist Phenylalanin. Phenylalanin wird über mehrere enzymatische Reaktionen in Dihydroxyindol (DHI) und Dihydroxyindol-Carboxylsäure (DHICA) umgewandelt. Melanin entsteht durch Polymerisation dieser Produkte. Das Schlüsselenzym der Melanogenese ist die Tyrosinase, ein bifunktionelles Enzym, da es sowohl Tyrosin in DOPA um- wandelt als auch DOPA wiederum in DOPAquinon. Die weitere Umwandlung von DOPAquinon zu Eumelanin kann langsam auch ohne Hilfe zusätzlicher Enzyme erfolgen. Allerdings steuern noch zwei weitere Proteine, TYRP-1 und TYRP-2 (TYRP steht für Tyrosinase related Protein), die Eumelanogenese (Abbildung verändert nach Ortonne und Schwarz 2003).

Es gibt zwei verschiedene Pigmentformen, das Eumelanin, für die Schwarz- und Braunfärbung sowie das Phäomelanin, für die Rot- und Gelbfärbung. Das Verhältnis von Eu- zu Phäomelanin bestimmt die Farbe von Haut und Haaren.

Die Regulation der Farbpigmentsynthese wird durch Signalproteine gesteuert, zwei näher cha- rakterisierte Moleküle sind das Melanozyten-stimulierende Hormon (α-MSH) und das Agouti- Signalprotein (ASIP). Beide binden an den Melanocortinrezeptor (MC1R). α-MSH steigert die Synthese von schwarzem oder braunem Eumelanin, ASIP wirkt antagonistisch, verschiebt die Synthese hin zu gelbem oder rotem Phäomelanin (Abbildung 2 und 3).

Abbildung 2: Agouti-Signalprotein (ASIP) und das Melanozyten-stimulierende Hormon (α-MSH) konkurrieren um die Bindungsstelle am Melanocortinrezeptor (MC1R). Besetzt α-MSH die Bin- dungsstelle, wird Eumelanin synthetisiert. Bindet ASIP, führt eine Signalkaskade zur Phäomela- ninbildung (verändert nach He et al. 2001). cAMP: cyclo-Adenosinmonophosphat

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Abbildung 3: Auswirkung auf Botenstoff und Enzymaktivität nach Bindung vom Agouti-Signal- protein (ASIP) oder vom Melanozyten-stimulierenden Hormon (α-MSH) an den Melanocortinre- zeptor (MC1R): α-MSH (links) bindet an MC1R, die Bildung des cytosolischen Botenstoffs cyclo- Adenosinmonophosphat (cAMP) wird gesteigert, dieses Signal führt zur Bildung von mRNA von Tyrosinase (TYR) und Tyrosinase related Protein 1 und 2 (TYRP-1 und TYRP-2). In den Melano- somen entsteht Eumelanin, die Phäomelaninsynthese wird reduziert. Wird intaktes TYRP-1 ge- bildet, entsteht schwarzes Eumelanin, braunes Pigment wird synthetisiert, wenn das TYRP-1 nicht funktionsfähig ist (verändert nach Jordan und Jackson 1998).

Bindet ASIP (rechts) wird die mRNA-Synthese der für die Eumelaninbildung benötigten Enzyme gestoppt, Phäomelanin entsteht. Phäomelanin wird auch synthetisiert, wenn der MC1-Rezeptor defekt ist. Im Unterschied zur Agouti induzierten Phäomelaninsynthese entstehen dann keine schwarzen oder braunen Pigmentbereiche wie dunkle Haarspitzen oder Ohren.

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Bei Hunden sind Mutationen in verschiedenen Farbgenen beschrieben, die zu einer veränderten Pigmentierung führen (Tabelle 2).

Tabelle 2: Molekulargenetisch charakterisierte Gene mit Einfluss auf Fell- und Haarfarbe beim Hund, deren chromosomale Lokalisation im Hundegenom (CFA), deren kodierte Proteine und zelluläre Funktion, die Allele beim Hund sowie die korrespondierenden Fellfarben der mutierten Gene bei der Maus.

Gensymbol CFA Protein Funktion Allele/Phänotyp beim Hund Mausfarbe

TYR 21 Tyrosinase Melanosomenprotein - albino (c)

TYRP1 11 Tyrosinase related Protein Melanosomenprotein B-schwarzes Eumelanin

b braunes Eumelanin braun ((b)

SILV 10 Melanozyten Protein mel 17 Melanosomenprotein

M ohne Farbe Mm merle

m Eu-/Phäomelaninpigmentie- rung

silver (si)

ASIP 24 Agouti Signal Protein Signalprotein

ay gelb bis rot (Phäomelanin) aw dunkel gebänderte Haare at Schwarz/Braun und Tan a rezessive schwarz

agouti (a)

MC1R 5 Mc1-Rezeptor Rezeptorprotein

Em Melaninmaske

E Eumelanin schwarz oder braun e Phäomelanin gelb bis rot

extension (e)

CBD103 16 β-Defensin103 Signalprotein

Kb Eumelaninpigmentierung Kbr brindle

Ky Phäomelanin möglich -

MITF 20 Microphthalmia-associated

transcription factor Signalprotein

S Eu-/Phäomelaninpigmentie- rung

Si / Sp gefleckt Sw extreme weiß

mitf (mi)

MLPH 25 Melanophilin Melanosomentransport

D Eu-/Phäomelaninpigmentie- rung

d farbverdünnt

leaden (ln)

2.1 Farbdilution bei Mensch und Maus

Beim Menschen sind verschiedene komplexe Erkrankungen (Syndrome) mit Albinismus bzw.

Farbaufhellungen assoziiert (Scheinfeld 2003).

Zu den durch Farbaufhellung charakterisierten Syndromen gehören auch die verschiedenen For- men des Griscelli Syndroms (GS). GS ist eine seltene autosomal rezessive Erkrankung, die zu einer charakteristischen Aufhellung (engl. dilution) von Haut und Haar (Silberhaar) führt.

Mikroskopisch kann mitten in den Melanozyten eine Ansammlung von Melanosomen beobachtet werden. Im Haar selber werden die Pigmente nicht gleichmäßig verteilt, sondern verbleiben als

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Pigmentklümpchen im Haarschaft (Mancini et al. 1998). Es sind drei verschiedene Formen (I, II und III) des Griscelli Syndroms beschrieben, die mit Defekten in drei verschiedenen Genen, Myosin 5A (MYO5A) (Pastural et al. 1997), RAB27A (Pastural et al. 2000) und Melanophilin (MLPH) (Ménasché et al. 2003), assoziiert sind, deren Genprodukte am Melanosomentransport beteiligt sind (Abbildung 4-6).

Abbildung 4: Normale Zelle: Die Melanosomen bilden mit den drei Proteinen Myosin VA, RAB27A und Melanophilin einen Transportkomplex. Damit werden die Melanosomen von der Peripherie des Zellkerns (N) entlang der Microtubuli (MT) mit Hilfe von Actinfilamenten in die Zellperipherie und von dort in die Haar- und Hautzellen transportiert (verändert nach Fukuda 2005).

Abbildung 5: Von Griscelli Syndrom (GS) betroffene Zelle: Eines der zum Melanosomentrans- port benötigten Proteine ist defekt, die Melanosomen bleiben in der Zellmitte rund um den Zell- kern (N) liegen (verändert nach Fukuda 2005). MT: Microtubuli

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Die drei Proteine bilden einen Komplex, der zur Bindung der Melanosomen im Cytoplasma und ihrem anschließenden Transport in die Zellperipherie essentiell ist. Dabei bindet das RAB27A -Protein zunächst an die Fracht – die Melanosomen – und anschließend an das RAB-Effektor Protein, Melanophilin. Dieser Rezeptor-Proteinkomplex bindet nun an das an Actinfilamente as- soziierte Motorprotein Myosin VA (Hume et al. 2002, Strom et al. 2002, Wu et al. 2002a, b). Die Actinfilamente dienen im intrazellulären zytoplasmatischen Transport als Zugmaschine, an de- nen entlang das Myosin VA die Melanosomen befördert (Seabra und Coudrier 2004).

Abbildung 6: Der Transportkomplex der Melanosomen: Die Melanosomen binden das RAB27A, welches über Melanophilin (MLPH) mit Myosin VA verbunden ist. Der Myosin-Actinkomplex ist die Zugmaschine, die die Melanosomen entlang der Microtubuli bewegt (verändert nach Fukuda 2005). GTP: Guanosintriphosphat, im Melanophilin sind die Bindungsdomänen für RAB (RBD) Myosin (MBD) und Actin (ABD) gekennzeichnet.

Das Griscelli Syndrom I wird durch Mutationen des Myosin 5A-Gens verursacht. Neben den be- schriebenen Pigmentveränderungen entwickeln Betroffene im frühen Kindesalter neurologische Probleme. Sie weisen zudem oft eine Entwicklungsverzögerung auf (Sanal et al. 2002).

Vom Griscelli Syndrom II betroffene Kinder zeigen keine neurologischen Auffälligkeiten, krankheitsspezifisch ist vielmehr die Entwicklung einer unkontrollierten T-Lymphozyten- und Makrophagenaktivierung, die als hämophagozytisches Syndrom oder hämophagozytische Lym-

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phohistiozytose bezeichnet wird. Diese Erkrankung verläuft tödlich, sofern nicht rechtzeitig eine Knochenmarktransplantation erfolgt. Ursache des GS II sind Mutationen im RAB27A-Gen.

In den wenigen beschriebenen Fällen mit GS III sind die Symptome auf Pigmentveränderungen beschränkt. Ursache für diesen Phänotyp können Mutationen im Melanophilingen oder im ge- webespezifisch exprimierten Exon F des MYO5A-Gens sein (Ménasché et al. 2003).

Mittlerweile ist auch untersucht, warum die Mutationen in diesen drei Genen zu so unterschied- lichen phänotypischen Ausprägungen führen. Melanophilin wird in verschiedenen Epithelgewe- ben wie Haut oder Lunge exprimiert, wird aber intrazellulär anscheinend nur für den Melanoso- mentransport benötigt. RAB27A hingegen ist außer am Melanosomentransport noch am Trans- port lytischer Granula in zytotoxischen T-Zellen beteiligt. Dies bedingt den Effekt auf das Im- munsystem, wenn das Gen mutiert ist. Vom MYO5A-Gen sind verschieden gespleißte Transkripte beschrieben. Die Verteilung der Isoformen ist gewebeabhängig, einige werden bevorzugt in Melanozyten, andere in neuronalem Gewebe exprimiert (Seperack et al. 1995, Westbroek et al.

2003). Daher können sich Mutationen innerhalb des Gens unterschiedlich auf den Organismus auswirken, je nachdem, in welcher Proteinregion eine Base im MYO5A-Gen mutiert ist, und welche der gewebespezifischen Produkte verändert sind.

Bei der Maus sind ebenfalls den Griscelli Syndromen I bis III entsprechende natürliche Phänoty- pen beschrieben. Dem GS I Phänotyp, verursacht durch Mutationen des Myo5a-Gens, entspricht die „dilute“ Maus (Jenkins et al. 1981). Bei der „ashen“ Maus, dem murinen Model für GS II, ist das RAb27a-Gen mutiert (Wilson et al. 2000). Die „leaden“ Maus, verursacht durch eine Mutati- on des Mlph, repräsentiert das GS III Mausmodell (Matesic et al. 2001). Phänotypisch sind die Mausmutanten ihren menschlichen Pendants sehr ähnlich, allerdings wurde für die „ashen“ Maus bislang kein hämophagozytisches Syndrom beschrieben.

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2.2 Der Dilutionsgenort beim Hund und mögliche Assoziationen zu Erkrankungen

Die Fellfarbe ist eines der auffälligsten Merkmale bei Hunden. Wie bei anderen Säugetieren wird die Grundfarbe durch zwei verschiedene Pigmentformen bestimmt: das Eumelanin, für die Schwarz- und Braunfärbung sowie das Phäomelanin für die Rot- und Gelbfärbung. Genloci wie der Agouti- und Dilutionsgenort bestimmen die Verteilung der Pigmente am Körper (Tabelle 1).

Eine Übersicht der bekannten und vermuteten Farbgene beim Hund und ihre Auswirkungen auf die Fellfärbung gibt es im Internet (http://homepage.usask.ca/~schmutz/dogcolors.html).

Bei Hunden des aufgehellten Farbschlags variiert der Phänotyp des Fells entsprechend der gene- tischen Grundausstattung: eine schwarze Fellfarbe wird zu blau, eine braune zu isabell und eine rote zu sandfarben. Der Dilutionsgenort (D) ist bei Hunden von Little (1957) beschrieben wor- den und gehört in die Reihe der Farbverdünnungsgene (Laukner 1998). Der Erbgang der Farbdi- lution ist autosomal rezessiv. Mutationen im Dilutions-Locus bei Hunden bewirken eine Ver- klumpung der Pigmentgranula wie es bei Mäusen mit verdünnter Fellfarbe oder GS Betroffenen beschrieben wurde. Außer im Fell wird die Pigmentverteilung auch in Haut und Iris beeinflusst, so ist der Nasenspiegel der Hunde daher oft grau oder hellbraun, die Iris gelblich (Laukner 1998).

Während bei einigen Hunderassen Tiere mit aufgehellten Fellfarben wie zum Beispiel blaue Doggen als Rassestandard zugelassen sind, sind beim Dobermann oder auch beim Deutschen Pinscher verdünnte Farbschläge nicht erlaubt. Der Grund ist, dass in diesen Hunderassen Tiere mit verdünnter Fellfarbe häufig von der Farbverdünnungsalopezie (CDA, engl: Color Dilute Alopecia) betroffen sind. Synonyme für diese Erkrankung sind „Blue Dog Syndrome“, „Blue Dobermann Syndrome“, „Color Mutant Alopecia“ oder auch Farbmutantenalopezie. Die klini- schen Symptome umfassen Trichorrhexis, Alopezie, Hyperkeratose und Parakeratose. Die Haut- partien dieser Tiere zeigen zudem eine erhöhte Sonnenempfindlichkeit. Von der Erkrankung scheinen eher die Träger blauer Farbschläge betroffen zu sein, wenn auch Fälle bei isabellfarbe- nen Tieren beschrieben sind. Die Erkrankung tritt außer bei Pinschern sporadisch bei verschie- densten Rassen wie Yorkshire Terrier, Deutsche Dogge, Saluki, Dachshund, Chow Chow, Iri- scher Setter und italienischem Windspiel auf (Austin 1975, Austin 1979, Laukner 1998). Eine sehr ähnliche, wenn nicht sogar identische Erkrankung wie CDA, wird bei gescheckten Hunden wie dem Großen Münsterländer als Black-Hair-Follikeldysplasie (BHFD) bezeichnet (Schmutz et al. 1998). Bei diesen Tieren sind die sonst schwarz gefärbten Fellareale zu silbergrau aufge-

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hellt. Die für CDA beschriebenen Symptome sind auf die aufgehellten Bereiche beschränkt, während die weißen Fellpartien keine Auffälligkeiten zeigen. Histologisch weisen Hautbiopsien der aufgehellten Fellbereiche die gleichen Auffälligkeiten wie Hautbiopsien von Hunden mit verdünnten Farbschlägen auf (von Bomhard et al. 2006).

Obwohl ein Zusammenhang zwischen CDA und Farbdilution vorhanden ist, ist unklar, welche Faktoren zur Ausprägung der CDA besonders bei Tieren mit aufgehellten Farbschlägen führen (Laukner 1998). Innerhalb dieser Arbeit sollte die molekulargenetische Ursache der Farbdilution untersucht werden.

2.3 Zusammenfassung der Ergebnisse der molekulargenetischen Untersuchungen am caninen Farbdilutionsgenort

Im Rahmen des hier vorliegenden Projektes konnte bei verschiedenen Hunderassen (Deutscher Pinscher, Dobermann Pinscher, Beagle und Großer Münsterländer) das kausale Gen für die Farbdilution identifiziert werden sowie eine Mutation, die bei diesen Hunderassen vollständig mit dem Phänotyp der Farbdilution assoziiert ist.

Zur molekulargenetischen Untersuchung des caninen Farbdilutionsgenortes wurde ein funktio- neller Kandidatengenansatz gewählt. Das heißt, es wurden Gene analysiert, die für die Merk- malsausprägung Farbdilution Schlüsseleiweiße kodieren. Bei Hunden mit verdünntem Farb- schlag werden histologisch Verklumpungen der Pigmentgranula beobachtet. Geeignete funktio- nelle Kandidatengene sind daher Gene, deren Genprodukte am Melanosomentransport beteiligt sind. Die Untersuchungen bei Mensch und Maus haben gezeigt, dass die von MYO5A, RAB27A und MLPH kodierten Proteine Bestandteil des Melanosomentransportkomplexes sind (Barral und Seabra 2004, van Gele et al. 2009). Zudem führen Mutationen in diesen drei Genen bei Mensch und Maus zu einem Phänotyp, der dem Phänotyp von Hunden mit verdünnter Fellfarbe ähnlich ist.

Die caninen Gene MYO5A, RAB27A und MLPH wurden isoliert und charakterisiert. Durch ver- gleichende Sequenzierung betroffener und nicht betroffener Tiere konnte für die oben genannten Rassen eine Assoziation zwischen der Farbdilution und dem MLPH-Gen hergestellt und zunächst ein indirekter Gentest entwickelt werden. Im Laufe der weiteren Arbeit wurde die wahrschein- lich zugrunde liegende kausale Mutation identifiziert.

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2.4 Eigene Beiträge zur molekulargenetischen Aufklärung des Farbdilutionsgenorts bei Hunden

Assignment of the canine myosin Va gene (MYO5A) to chromosome 30q14 by fluorescence in situ hybridization and radiation hybrid mapping

Philipp U, Scott A,Rak S, Quignon P, André C,Breen M, Leeb T Cytogenet Genome Res. 2003; 101: 92C.

In dieser Studie wurde das canine MYO5A-Gen, ein Kandidatengen für Farbdilution beim Hund, auf Chromosom 30q14 des Hundegenoms lokalisiert. Dazu wurde der BAC-Klon RP81-108N13 durch Hybridisierung einer humanen cDNA-Sonde in der caninen BAC-Bank RP81 identifiziert.

Die Sequenzierung des BAC-Klons bestätigte, dass das MYO5A-Gen teilweise auf dem Klon vorhanden war. Die genaue chromosomale Zuordnung erfolgte durch FISH- und RH-Kartierung.

Die Fluoreszenz in-situ Hybridisierung zeigte, dass sich MYO5A auf CFA30q14 befindet. Die RH-Kartierung bestätigte die chromosomale Zuordnung und ein Zweifarben-FISH zeigte, dass MYO5A proximal zu RAB27A lokalisiert ist. Diese Anordnung der beiden Gene entspricht auch der relativen Lage der humanen orthologen Gene zueinander auf dem syntänen Bereich von HSA15. Die Kenntnis der genauen Lage der beiden Kandidatengene sollte das Auffinden gen- flankierender Marker aus bekannten Markersets vereinfachen und die Durchführung von Kopp- lungsstudien erleichtern.

Assignment of the RAB27A gene to canine chromosome 30q15.1 by fluorescence in situ hybridization and radiation hybrid mapping

Philipp U, Scott A, Quignon P, André C,Breen M, Leeb T Cytogenet Genome Res. 2003; 101: 92E.

RAB27A ist ein Kandidatengen für die Farbdilution beim Hund. In dieser Arbeit konnte das cani- ne RAB27A-Gen auf CFA30 lokalisiert werden. Dazu wurde ein BAC-Klon (RP81-109O1) aus der caninen BAC-Bank RP81 isoliert. Die Sequenzierung der BAC-Randsequenzen sowie von Shotgun-Klonen bestätigte, dass der Klon das RAB27A-Gen enthält. Die Größe des caninen ge- nomischen Inserts wurde durch Pulsfeld-Gelelektrophorese auf etwa 140 kb geschätzt. Mithilfe der FISH-Technik wurde das Gen auf Chromosom 30q15.1 lokalisiert. Eine RH-Kartierung be- stätigte die chromosomale Zuordnung. Das humane orthologe Gen befindet sich auf HSA15q15-

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21. Dieser Bereich ist in der vergleichenden humanen-caninen RH-Karte syntän zu der Region, in der das canine RAB27A liegt. Die genaue chromosomale Lokalisierung sollte weiterführende Kopplungsstudien vereinfachen.

Chromosomal assignment of the canine melanophilin gene (MLPH):

A candidate gene for coat color dilution in Pinschers Philipp U, Scott A,Quignon P,André C,Breen M, Leeb T

J Hered. 2005; 96: 774-776.

Um die molekulargenetische Grundlage der Farbdilution bei Pinschern aufzuklären, wurde der BAC-Klon RP81-203J24 isoliert, der das zum humanen MLPH orthologe Hundegen enthält. Das canine Insert wurde mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese auf etwa 190 kb geschätzt. Die Sequen- zierung von Shotgun-Klonen zeigte, dass der Klon Sequenzbereiche des MLPH- und des COL6A3-Gens enthielt. Diese Gene sind auch im humanen Genom benachbart. Eine RH-Kartie- rung des MLPH Gens wurde mit einem STS-Marker durchgeführt, der von Sequenzen des BAC- Klons abgeleitet wurde. Das canine MLPH konnte auf dem distalen Ende von CFA25 lokalisiert werden. Eine zusätzliche Zweifarben-FISH-Kartierung ergab die genaue Position auf CFA25q24.

Dieser Abschnitt des caninen Chromosoms 25 ist syntän zur Region 2q36-37 des humanen Ge- noms, in der sich das humane MLPH-Gen befindet.

Polymorphisms within the canine MLPH gene are associated with dilute coat color in dogs

Philipp U, Hamann H, Mecklenburg L, Nishino S, Mignot E, Günzel-Apel AR, Schmutz SM, Leeb T. BMC Genet. 2005; 6: 34.

Für diese Arbeit wurde das MLPH-Gen sequenziert und eine Mutationsanalyse der 16 caninen Exons und ihrer flankierenden Intronsequenz an der DNA von sechs Dobermann Pinschern (El- tern und vier Vollgeschwisternachkommen) sowie von fünf Deutschen Pinschern (Muttertier mit 4 Vollgeschwisternachkommen) durchgeführt. In jeweils beiden Familien traten Nachkommen mit aufgehellter Fellfarbe auf. Insgesamt wurden 48 Sequenzunterschiede innerhalb und zwi- schen den beiden Rassen identifiziert. Die weiteren Untersuchungen wurden auf eine Familie Großer Münsterländer, die für BHFD segregierte und eine Beagle-Familie ausgedehnt.

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Im MLPH-Gen konnte weder in der kodierenden Region noch an den Spleißstellen eine Mutati- on identifiziert werden, die kausal für die Farbdilution sein könnte. cDNA-Analysen ergaben ebenfalls keinen Hinweis auf Spleißmutanten.

Bei Deutschen Pinschern wurde ein vollkommen mit dem Phänotyp der Farbdilution gekoppelter Polymorphismus in Exon 7 des MLPH-Gens entdeckt. Der nichtsynonyme SNP verursachte ei- nen R199H Aminosäureaustausch. Da dieser Aminosäureaustausch auch in wildfarbenen Tieren anderer Rassen nachgewiesen wurde, musste die Mutation als kausal ausgeschlossen werden.

Bei den Rassen Dobermann Pinscher, Großer Münsterländer und Beagle war ein Set von Poly- morphismen in und um Exon 2 des MLPH-Gens vollständig mit dem Phänotyp der Farbverdün- nung assoziiert. Diese Sequenz war beim Deutschen Pinscher monomorph. Die Identifizierung vollständig assoziierter, wenn auch zum Teil rassespezifischer Polymorphismen, wies daraufhin, dass die Farbdilution bei Hunden durch eine oder mehrere Mutationen innerhalb des MLPH- Gens oder eines anderen Gens nahe des MLPH Gens verursacht wird.

Die Polymorphismen, die eng mit dem Phänotyp der aufgehellten Fellfarbe assoziiert waren, bo- ten zunächst die Möglichkeit, einen markergestützten genetischen Test für Pinscher und Große Münsterländer anzubieten und so auf Hunde mit definierten Fellfarben zu selektieren bezie- hungsweise Verpaarungen zu verhindern, die zu Dilutions- oder BHFD-Merkmalsträgern führen könnten.

A noncoding melanophilin gene (MLPH) SNP at the splice donor

of exon 1 represents a candidate causal mutation for coat color dilution in dogs Drögemüller C, Philipp U, Haase B, Günzel-Apel AR, Leeb T.

J Hered. 2007; 98: 468-473.

In der vorausgegangenen Studie hatten wir gezeigt, dass innerhalb verschiedener Hunderassen bestimmte Polymorphismen des MLPH-Gens mit dem Phänotyp der Farbdilution vollständig ko- segregieren. Bei den untersuchten Rassen wurden drei verschiedene Dilutions-Haplotypen iden- tifiziert und keiner der Polymorphismen im kodierenden Bereich des Gens schien kausal zu sein.

Daher resequenzierten wir den 5’- Bereich des Gens zunächst bei sechs wildfarbenen und sechs Hunden mit aufgehellter Fellfarbe, die die drei Dilutions-Haplotypen repräsentierten. Es konnte ein 7,8 kb großer Bereich identifiziert werden, in dem die drei Dilutions-Haplotypen gemeinsa-

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me Allele besitzen. Innerhalb dieses Bereiches identifizierten wir im untranslatierten ersten Exon des MLPH Gens einen G/A-Polymorphismus (c.-22G>A), der am Ende des ersten Exons direkt vor der Spleißstelle lokalisiert war. Der c.-22G>A SNP wurde bei 65 Hunden mit verdünntem Farbschlag, die sieben verschiedenen Rassen angehörten, genotypisiert. Bei allen 65 Tieren konnte der homozygote c.-22A Genotyp nachgewiesen werden.

Die Dilutions-A-Mutante sollte - computergeneriert - eine achtfach verringerte Spleißeffektivität besitzen. Eine mRNA-Expressionsstudie mittels quantitativer PCR bestätigte, dass dd-Tiere mit aufgehellter Fellfarbe nur etwa ein Viertel der MLPH-Transkriptmenge von wildfarbenen DD- Hunden besitzen. Heterozygote Tiere (Dd) lagen mit der nachgewiesenen Transkripthöhe zwi- schen dd und DD-Tieren. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass eine regulatorische Mutati- on im MLPH-Gen verantwortlich für die Farbverdünnung bei Hunden ist. Auch wenn nicht ein- deutig geklärt werden konnte, welche der 14 assoziierten Mutationen innerhalb des 7,8 kb Ge- nombereichs die verringerte Transkriptionsrate verursacht, erscheint die c.-22 A-Mutation der wahrscheinlichste Kandidat dafür zu sein.

2.5 Diskussion

Das Farbdilutionsgen ist beim Hund ein Beispiel für die molekulargenetisch untersuchten Merkmale, die die Fellfarbe beeinflussen. Vier weitere Gene, das Agouti-Gen (ASIP), das Mela- nocortin 1 Rezeptor Hormon-Gen (MC1R), das Tyrosinase related Protein 1-Gen (TYRP1) und das β-Defensin 103 (CDB103), deren unterschiedliche Allele den Phänotyp der Fellfarbe be- stimmen, sind bislang molekulargenetisch analysiert (Newton et al. 2000, Schmutz et al. 2002, Kerns et al. 2004, Candille et al. 2007).

Der hier untersuchte Farbschlag der Farbdilution führt bei Hunden zu einer charakteristischen Farbaufhellung des Felles, das oft wie von einem grauen Schleier überzogen aussieht, die Farbe wie ausgewaschen wirkt. Nase und Augen der Tiere sind zudem meist aufgehellt. Der Farbschlag ist bei vielen Hunderassen beschrieben und könnte daher möglicherweise eine von der Evolution her „alte“ Mutation sein. Weitere Tierarten, bei denen ein verdünnter Farbschlag beobachtet wurde, sind unter anderem Pferd, Rind, Hauskatze, Nerz (Silbernerz) und Huhn. Molekulargene- tisch sind diese Phänotypen bislang noch nicht bei allen Tierarten aufgeklärt. Weitere Gene, de- ren Mutation eine Farbaufhellung verursachen können, sind das SILV-Gen bei Rindern und Po-

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al. 2003). Mutationen in diesen Genen führen aber nicht zu den histologisch beschriebenen Ver- klumpungen der Melanosomen wie sie bei Hunden mit verdünntem Farbschlag, „dilute-“, „lea- den-“ und „ashen“-Mäusen und von GS betroffenen Menschen beobachtet werden. Aufgrund dieser histologischen Beobachtungen schien ein Gen, dessen Genprodukt am Melanoso- mentransport beteiligt ist, als wahrscheinlichster Kandidat.

Die Sequenzierung des caninen MLPH-Gens zeigte, dass der 5’- und 3’- Bereich der orthologen Gene zwischen Hund, Maus und Mensch konserviert ist. Diese über die Tierarten konservierten Sequenzbereiche kodieren im Protein die Bindungsdomänen für RAB27A bzw. Myosin VA und Actin. Im caninen Gen wurde ein zusätzliches Exon identifiziert, das zwischen dem Exon 4 und 5 der orthologen murinen und humanen Gene liegt. Das zusätzliche Exon scheint bei Hunden konstitutiv exprimiert zu werden, da keine Transkriptisoformen in der analysierten cDNA be- obachtet wurden. Das canine Exon 5 ist in einem Genbereich lokalisiert, der außerhalb der kon- servierten Proteinbindungsdomänen liegt. Ein dem humanen Exon 9 homologer Sequenzbereich fehlt hingegen im Hundegenom. Den analysierten Transkripten fehlt daher auch ein zu Exon 9 homologer Bereich. Allerdings wird Exon 9 beim Menschen fakultativ exprimiert, während es bei der Maus anscheinend konstitutiv exprimiert wird. Ein Vergleich mit mittlerweile ebenfalls bekannten MLPH-Transkripten der Hauskatze zeigte, dass bei der Katze ein dem caninen Exon 5 homologes Exon fakultativ exprimiert wird und eine zum humanen Exon 9 homologe Sequenz ebenfalls fehlt (Ishida et al. 2006).

Bei den hauptsächlich untersuchten Hunderassen – Dobermann Pinscher, Deutscher Pinscher, Beagle und Großer Münsterländer – konnten acht nichtsynonyme SNPs identifiziert werden, die nicht mit dem Phänotyp der Farbdilution assoziiert waren. Allerdings wurden bei allen Rassen auch Polymorphismen beobachtet, die innerhalb der Rasse vollständig mit dem Phänotyp des verdünnten Farbschlags korrelierten. Bei anderen Rassen zeigten diese Polymorphismen aber keine oder eine unvollständige Assoziation zum Phänotyp der Farbdilution. So war der beim Do- bermann Pinscher vollkommen assoziierte c.106C>T Polymorphismus beim Deutschen Pinscher monomorph und damit uninformativ. Andererseits war der beim Deutschen Pinscher vollständig assoziierte c.596A>G Polymorphismus beim Dobermann Pinscher und beim Großen Münster- länder nicht vollständig assoziiert. Insgesamt konnten bei den in die Untersuchungen einbezoge- nen Rassen drei Haplotypen unterschieden werden, die mit der aufgehellten Fellfarbe assoziiert waren.

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Bei Katzen sind die Farben blau, lilac oder cream die Farbpendants zu blau und isabell bei den Hunden, bei Nerzen die bereits erwähnten Silbernerze. Bei Hühnern wird der „lavender“ Farb- schlag durch Mutation des MLPH-Gens verursacht (Vaez et al. 2008) Beim Silbernerz wurde ebenfalls eine Kopplung zwischen dem farbverdünnten Phänotyp und dem MLPH-Gen beschrie- ben (Anistoroaei und Christensen 2007).Bei Katzen konnte die Deletion einer Base als kausal für diese Farbschläge identifiziert werden (Ishida et al. 2006). Die Mutation liegt in dem felinen Exon des MLPH-Gens, das zum caninen Exon 2 homolog ist. Die Deletion verursacht eine Ver- schiebung des Leserasters, die während der Translation zu einem Stoppkodon elf Aminosäuren stromabwärts der Mutation und so zu einem stark verkürzten und funktionslosen Protein führt.

Bei Mensch, Maus und Huhn liegen die kausalen Mutationen in einem eng benachbarten Se- quenzbereich. Bei Mensch und Huhn wurde die gleiche kausale Mutation c.103C>T identifiziert, die einen R35W Aminosäureaustausch verursacht. Bei der Maus mit der „leaden“-Fellfarbe sind die Aminosäuren 30 bis 37 des MLPH-Proteins deletiert. Mutationen in diesem Bereich des Gens bewirken, dass das MLPH-Genprodukt in dem Transportkomplex bestehend aus RAB27A, MLPH und Myosin VA nicht seine Funktion als Bindeglied erfüllen kann, da die spezifische und auch zwischen den Spezies konservierte RAB27A Bindungsstelle verändert ist.

Die Untersuchungen am caninen MLPH-Gen zeigten, dass Polymorphismen im MLPH-Gen mit der Farbverdünnung eng assoziiert waren. Allerdings konnte in der translatierten Sequenz keine kausale Mutation und auch keine Spleißvariante identifiziert werden. Eine für alle Dilutions- Haplotypen identische kausale Mutation wurde daher im regulatorischen oder untranslatierten Bereich des Gens vermutet. Denn im 5’- untranslatierten Bereich konnten bei Tieren mit aufge- helltem Farbschlag identische Allele von drei SNPs identifiziert werden.

Die Sequenzanalyse eines 12,5 kb großen Genombereiches, der ca. 9 kb 5’- flankierende Region des ersten Exons und 3 kb des ersten Introns umfasste, zeigte, dass die drei Dilutions-Haplotypen innerhalb eines 7,8 kb Sequenzbereiches einen gemeinsamen Haplotyp aufwiesen. Von den 14 identifizierten Polymorphismen erwies sich der c.-22G>A SNP direkt am 3’-Ende von Exon 1 als geeignetster kausaler Kandidat, die MLPH-Transkriptionsrate durch eine veränderte Spleiß- aktivität zu erniedrigen.

Es gibt verschiedenste Untersuchungen wie stumme Mutationen die Expression beeinflussen. So können synonyme Mutationen die Sekundärstruktur der mRNA und dadurch ihre Stabilität be-

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einflussen (Duan und Antezana 2003, Chamary und Hurst 2005). Mutationen am 5’- oder 3’- Bereich eines Exons hingegen können Auswirkungen auf die Spleiß-Aktivität haben, wie bereits für humane Gene gezeigt worden ist. So wurde im Tumorsuppressorgen APC beobachtet, dass Mutationen nahe den Exon-Intron-Übergängen zu dem Verlust eines Exons führen können, auch wenn die Mutation an sich still war (Aretz et al. 2004). Eine Erklärung für den beschriebenen Effekt ist, dass Mutationen direkt an den oder nahe den Exon-Intron-Übergängen die Bindungs- stelle für die snRNAs der Spleißosomen betreffen und dadurch die Effektivität des Spleißens der nukleären pre-mRNA beeinflussen. Bei Säugetieren sind zusätzlich zu den Spleißosomen intro- nische und exonische Spleißverstärker beschrieben, die für vollständiges Spleißen der mRNA benötigt werden (Fu 2004). Diese Elemente verstärken oder hemmen die Funktion als Donor- und Akzeptor-Spleißstelle. Ihre Bindungsstellen befinden sich ebenfalls in der Nähe der klassi- schen Spleißstellen, so dass Mutationen nahe den kanonischen Spleißstellen die Effektivität des Spleißens beeinträchtigen können (Parmley et al. 2006). Eine Studie an humanen Genen, die in der Human Gene Mutation Datenbank (www.hgmd.org) aufgelistet sind, zur Auswirkung von Einzelbasenaustauschen in Exon-Intron-Übergängen auf die mRNA zeigte, dass Mutationen am 3’- Ende eines Exons (Spleißdonorseite) zum Überspringen eines Exons oder zur Nutzung einer kryptischen Spleißstelle führen (Krawczak et al. 2007). Eine genauere Aufschlüsselung der Da- ten ergab für humane Gene, dass Mutationen, die die letzte Base des Exons betreffen, zu etwa 15 Prozent mit krankheitsverursachenden Genen assoziiert sind.

Diese Daten zusammen mit dem eigenen computergenerierten Ergebnis, dass die Effektivität der Spleißreaktion durch die Mutation in Exon 1 reduziert ist, lässt den Schluss zu, dass der c.-22G>A SNP kausal für die Farbdilution bei Hunden sein könnte. Gleichwohl ist experimentell nicht gezeigt, welche Auswirkungen auf die canine MLPH-Transkriptsequenz bestehen und dass der c.-22G>A Polymorphismus die Farbdilution auslöst. Theoretisch könnte auch einer der ande- ren 13 assoziierten Polymorphismen kausal sein. Dass der Dilutions-Haplotyp aber tatsächlich einen Einfluss auf die Transkription hat, zeigten die Untersuchungen zur Expressionshöhe. Im Quantifizierungsexperiment mittels Realtime-PCR wiesen Tiere mit verdünntem Farbschlag im Vergleich zu homozygot wildfarbenen Tieren eine auf ein Viertel reduzierte Expressionsrate des MLPH-Gens auf. Anlageträger für die Farbdilution lagen mit der nachgewiesenen relativen Tran- skriptmenge zwischen Merkmalsträgern der Farbdilution und homozygoten Wildtyptieren. Somit

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ist das kausale Gen für die Farbdilution bei Hunden identifiziert. Der genaue molekulare Mecha- nismus, der bei Hunden zur Farbaufhellung führt, ist jedoch nicht bekannt.

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3 Dilatative Kardiomyopathie

3.1 Dilatative Kardiomyopathie beim Menschen

Bei Menschen ist die Herzinsuffizienz häufig eine Folge von dilatativer Kardiomyopathie (DCM). Die Erkrankung ist durch einen progredienten Verlauf mit zunehmender ventrikulärer Dilatation und abnehmender systolischer Funktion charakterisiert. In 20-30 Prozent der Fälle ist die Erkrankung genetisch bedingt, dabei wird eine familiäre DCM angenommen, wenn in der Familie eines DCM-Patienten eine zweite an DCM erkrankte Person identifiziert worden ist oder wenn bei einem Angehörigen ersten Grades ein unerklärter plötzlicher Herztod vor dem 35. Le- bensjahr aufgetreten ist.

Bislang sind 26 Gene beschrieben worden, die bei Menschen DCM verursachen (Tabelle 3).

Zwei weitere Gene TMOD1 und CTNNA3 (OMIM #190930, #601493) sind aufgrund von Kopp- lungsanalysen mögliche Kandidatengene (Tabelle 3).

Die Funktion der von diesen Genen kodierten Proteine und ihre Lokalisation innerhalb der Zelle sind sehr unterschiedlich. So sind die Genprodukte DCM verursachender Gene am Zytoskelett- oder Sarkomeraufbau, an der Muskelkontraktion oder an der Regulation des Ionentransports be- teiligt (Tabelle 3). Biochemisch ist noch unklar, wie die Störungen solch verschiedener Stoff- wechselwege zu phänotypisch gleichen Erkrankungen führen können. Die Auswirkung veränder- ter Gene konnte für einige der Kandidaten in Mausmodellen untersucht werden, für den größten Teil der bei Menschen mit DCM assoziierten Gene existiert jedoch kein Mausmodell (Tabelle 3, http://www.informatics.jax.org). Hingegen sind bei Mäusen zusätzliche Gene mit DCM assozi- iert, die beim Menschen bislang nicht mit DCM in Verbindung gebracht werden konnten (http://www.informatics.jax.org).

Der Erbgang für DCM ist bei Menschen in rund 60 Prozent der Fälle autosomal dominant. Als erstes kausales Gen für eine familiäre DCM wurde das kardiale α-Actin identifiziert (Olson et al.

1998). Die häufigsten Ursachen einer familiären DCM sind Mutationen im Troponin T-Gen und im β-Myosingen (Osterziel et al. 2005a). Mutationen in den Genen Desmin, δ-Sarcoglycan, Phospholamban und Metavinculin verursachen ebenfalls eine isolierte DCM ohne Skelettmusku- laturbeteiligung, werden aber nur selten als Ursache einer familiären DCM beobachtet (Sylvius et al. 2003, Villard et al. 2005). Ein weiteres mit familiärer DCM assoziiertes Gen ist das CHRM2, das für den muscarinischen Acetylcholinrezeptor M2 kodiert (Zhang et al. 2008), wäh-

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rend PDLIM3 nur in einem einzelnen idiopathischen DCM-Fall als kausal beschrieben worden ist (Arola et al. 2007).

Neben diesen ausschließlich auf den Herzmuskel beschränkten familiären Formen gibt es Er- krankungen, in denen die DCM mit Erregungsleitungsstörungen kombiniert vorkommt oder eine Skelettmuskelbeteiligung vorliegt (Taylor et al. 2003).

Eine relativ häufige Ursache der familiären DCM sind X-chromosomal vererbte Formen. Sie tre- ten in ca. 5–10 Prozent aller familiären DCM-Fälle auf (Osterziel et al. 2005a, b). Verschiedene Mutationen im Dystrophin-Gen sind in der Regel für die DCM verantwortlich (Muntoni et al.

1993) aber auch das Tafazzin-Gen kann eine isolierte DCM verursachen (D`Adamo et al. 1997, Ichida et al. 2001).

Tabelle 3: DCM Kandidatengene beim Menschen, ihre Abkürzung, chromosomale Lokalisation bei Mensch und Hund, Funktion ihrer Genprodukte sowie existierende Mausmodelle

Kandidatengen Abkürzung Homo sapiens Chromosom

Canis lupus familiaris Chromosom

Funktion Maus- modell

Lamin A/C LMNA 1q21 7 Genexpression und

Zellkernstabilität ja

Troponin 2 TNNT2 1q32 7 Muskelkontraktion

α-Actinin 2 ACTN2 1q43 4 Interaktion mit Titin

und Actin

Titin TTN 2q31 36 Funktion als elasti-

sches Element

Desmin DES 2q35 37 Transduktion der

kontraktilen Kraft ja

Troponin I TNNC1 3q21 20 Muskelkontraktion

Cardiac Na-Channel SCN5A 3p22 23 α-Untereinheit des

Natriumkanals ja

PDZ and LIM domain 3 PDLIM3 4q35 16 Zytoskelett-Aufbau

δ-Sarcoglycan, (35 kDa dystrophin-

associated glycoprotein) SGCD 5q33 4 Transduktion der

kontraktilen Kraft ja

Phospholamban PLN 6q22-1 1 Regulation der

Calciumhomöostase Eyes absent homolog 4 EYA4 6q23-24 1 Transkriptionsfaktor

für Myogenese

Desmoplakin DSP 6q24 35 Zell-Zell-Verbin-

dung

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Fortsetzung Tabelle 3

Kandidatengen Abkürzung Homo sapiens Chromosom

Canis lupus familiaris Chromosom

Funktion Maus- modell

Cholinergic receptor, muscarinic 2 CHRM2 7q31-35 16 Signaltransduktion

Tropomodulin 1 TMOD1 9q22 11 Sarkomeraufbau Ja

LIM domain binding 3 LDB3 10q22-23 4 Aufbau und Anord-

nung von Mem- branproteinen α-Catenin 3 (cadherin-associated

protein), CTNNA3 10q22-23 4 wahrscheinlich

Zell-Zell-Verbin- dung

(Meta-)Vinculin VCL 10q22-23 4 Verankerung von F-

Actin an der Plas- mamembran Myosin binding protein C, cardiac MYBPC 11p11.2 18 Muskelkontraktion Cysteine and glycine-rich protein 3

(cardiac LIM protein) CSRP3 11p15.1 21 Spannungssensor ja

ATP-binding cassette, sub-family C

(CFTR/MRP), member 9 ABCC9 12p12.1 27 Regulatorische Un- tereinheit des K- Kanals Kir6.2 β-Myosin, heavy polypeptide 7,

cardiac muscle, MYH7 14q12 8 Muskelkontraktion

α-Myosin, heavy polypeptide 6,

cardiac muscle, MYH6 14q11 8 Muskelkontraktion ja

α-Actin, cardiac muscle 1 ACTC1 15q14 30 Muskelkontraktion ja

Tropomyosin 1 TPM1 15q22 30 Muskelkontraktion

Titin-cap (telethonin) TCAP 17q12 9 Sarkomeraufbau

Troponin I type 3, cardiac TNNI3 19q13 1 Muskelkontraktion

Dystrophin DMD Xp21.2 X Kraftübertragung

Tafazzin TAZ Xq28 X unbekannt

Eine autosomal rezessiv vererbte DCM soll in bis zu 15 Prozent aller familiären DCM-Fälle vor- liegen (Mestroni et al. 1999). Bislang konnten jedoch nur wenige Familien mit rezessiv vererbter DCM aufgeklärt werden (Murphy et al. 2004).

Neben diesen bereits bekannten, DCM verursachenden Genen werden noch weitere DCM auslö- sende Gene vermutet.

3.2 Dilatative Kardiomyopathie beim Hund

DCM ist eine Erkrankung, die besonders bei groß gezüchteten Hunderassen wie Dobermann Pinscher, Neufundländer, Deutsche Dogge und Irischer Wolfshund beobachtet wird (O`Grady und Horne 1995, O`Grady und Horne 1998, Vollmar 1999a, b, Vollmar 2000, Dukes-McEwan

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und Jackson 2002). Genetische Ursachen sind bei diesen Rassen wahrscheinlich, scheinen bei den verschiedenen Hunderassen aber heterogen zu sein, da das Erkrankungsalter und die Erb- gänge zwischen den Rassen variieren. So wird für Boxer ein autosomal dominanter Erbgang vermutet (Meurs et al. 1999), während bei Doggen ein X-chromosomaler rezessiver Erbgang be- schrieben ist (Meurs et al. 2001a). Bei Neufundländern beschreibt ein autosomal dominantes Modell mit unvollständiger Penetranz den Erbgang am ehesten. Beim portugiesischen Wasser- hund wurde bei einer juvenilen DCM-Form ein autosomal rezessiver Erbgang angenommen (Dambach et al. 1999) und beim Dobermann Pinscher scheint die DCM durch einen autosomal dominanten Erbgang am ehesten erklärt zu werden (Meurs et al. 2007).

Bislang konnte bei keiner Rasse ein DCM verursachendes Gen identifiziert werden. Allerdings wurden für die adulte DCM beim Dobermann Pinscher bereits das kardiale α-Actingen (Meurs et al. 2001b) sowie die Gene Desmin (Stabej et al. 2004), SGCD, PLN (Stabej et al. 2005a, b), LMNA, Troponin C und T, CSRP3 und MYH7 (Meurs et al. 2008) als kausal für DCM ausge- schlossen. Auch Mutationen in der Promotorregion des Dystrophin-Gens konnten beim Dober- mann Pinscher als generelle Ursache der DCM ausgeschlossen werden (Schatzberg et al. 1999).

Bei Irischen Wolfshunden ist DCM eine Erkrankung, die bei adulten Tieren auftritt, mit einem mittleren Diagnosealter von 4,52 ± 1,99 Jahren. Männliche Tiere sind häufiger und früher von der Erkrankung betroffen (Brownlie und Cobb 1999, Vollmar 2000). Eine Segregationsanalyse zeigte, dass der Erbgang durch ein autosomal dominantes Hauptgen-Modell mit geschlechtsspe- zifischem Alleleffekt am ehesten erklärt werden kann (Distl et al. 2007).

Da DCM bei den Irischen Wolfshunden meist erst diagnostiziert wird, nachdem die Tiere bereits in der Zucht einsetzt worden sind, ist es ohne molekulargenetische Analyse schwierig, die Präva- lenz der Erkrankung innerhalb der Rasse zu senken. Der generelle Zuchtausschluss DCM betrof- fener Familien könnte zu einer zu starken Einengung des genetischen Pools führen. Eine frühzei- tige Diagnose der DCM – bevor Tiere erstmalig in der Zucht eingesetzt werden – wäre daher ein Mittel, die Erkrankungsrate in der Rasse zu senken. Daher sollen die Untersuchungen dazu bei- tragen, die molekulargenetische Ursache für die DCM bei Irischen Wolfshunden aufzuklären.

Zusätzlich hätte man ein weiteres definiertes Tiermodell, dessen Studium die Erkenntnisse über Entstehung und Entwicklung auch der humanen Erkrankung erweitern.

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3.3 Zusammenfassung der Ergebnisse zur Untersuchung von Kandidatengenen, die an der Ausprägung einer DCM beim Irischen Wolfshund beteiligt sein könnten In dem hier vorliegenden Teil wurden canine Gene, deren orthologe Pendants beim Menschen mit DCM assoziiert sind, bei Irischen Wolfshunden molekulargenetisch analysiert. Die Untersu- chungen umfassten cDNA-Analysen, die Identifizierung und Genotypisierung intragenischer DNA-Marker bzw. die Analyse bekannter Mikrosatellitenmarker. Die Genotypisierungsdaten wurden zur Berechnung von Kopplung bzw. Assoziation zwischen diesen Genen und der Aus- prägung von DCM bei Irischen Wolfshunden genutzt. Von den 24 in Tabelle 3 aufgeführten Ge- nen wurden acht näher untersucht: das X-chromosomal lokalisierte TAZ-Gen, sowie die autoso- mal lokalisierten Gene ACTC1, CSRP3, DES, PLN, SGCD, TMOD1 und TCAP. Es konnte keine Assoziation oder Kopplung zwischen DCM bei Irischen Wolfshunden und einem dieser Gene festgestellt werden.

3.4 Eigene Beiträge zur DCM beim Irischen Wolfshund

Evaluation of tafazzin as candidate for dilated cardiomyopathy in Irish wolfhounds Philipp U, Broschk C, Vollmar A, Distl O.

J Hered. 2007; 98: 506-509.

Männliche Irische Wolfshunde erkranken früher und häufiger an DCM als weibliche Tiere. Um eine Beteiligung X-chromosomaler Gene an der Ausprägung der Erkrankung zu überprüfen, wurde in dieser Arbeit ein Set von acht X-chromosomalen Mikrosatellitenmarkern bei Irischen Wolfshundfamilien, die für DCM segregieren, auf Kopplung mit DCM getestet. Die Marker wurden an DNA Proben von 89 Irischen Wolfshunden genotypisiert, von denen 25 Proben von DCM betroffenen Irischen Wolfshunden stammen und 64 von DCM freien Tieren. Außerdem wurde das Tafazzin-Gen (TAZ), ein humanes X-chromosomales Kandidatengen für DCM analy- siert.

Die statistische Auswertung der Marker gab keinen Hinweis auf Kopplung von X-chromosoma- len Genorten und DCM. Die Untersuchung des TAZ-Genes ergab, dass die Sequenzen innerhalb der Irischen Wolfshunde monomorph waren. Im Vergleich zu der Boxerreferenzsequenz des Hundegenomprojekts konnten in den rund 5800 sequenzierten Basen acht Sequenzunterschiede

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identifiziert werden. Die Ergebnisse der Kopplungsanalyse und das Fehlen von Mutationen im TAZ-Gen innerhalb der Irischen Wolfshunde zeigten, dass TAZ-Gen an der Entstehung der DCM beim Irischen Wolfshund nicht beteiligt ist.

Evaluation of six candidate genes for dilated cardiomyopathy in Irish wolfhounds

Philipp U, Vollmar A, Distl O.

Anim Genet. 2008; 39: 88-89.

In dieser Studie wurden sechs humane autosomale Kandidatengene (ACTC1, CSRP3, DES, PLN, SGCD und TMOD1) auf Kopplung und Assoziation zu DCM bei Irischen Wolfshunden getestet.

Dazu wurden genomische Sequenzen der Gene auf Polymorphismen untersucht und intrageni- sche Marker entwickelt. Außerdem wurden cDNA Sequenzen aus Herzgewebe eines DCM er- krankten Irischen Wolfshundes sowie Skelettmuskulatur eines gesunden Jack Russell Terriers untersucht sowie die DNA-Sequenzen der 5’- und 3’- untranslatierten Bereiche der Gene analy- siert.

Im Vergleich zur Boxerreferenzsequenz wurden in den Genen ACTC1, CSRP3 und TMOD1 kei- ne Mutationen in der kodierenden Region oder den flankierenden UTR gefunden (Tabelle 4). In SGCD und PLN wurde eine Mutation im 5’- bzw. 3’- UTR detektiert und in DES wurden zwei synonyme Substitutionen in der cDNA identifiziert (Tabelle 4). Bei keinem der Gene gab es ei- nen Hinweis auf Spleißmutationen.

Für jedes der sechs Gene wurden intragenische Marker entwickelt (Tabelle 4), die in einer Kopp- lungs- und Assoziationsanalyse verwendet werden konnten. Dazu wurden die Marker an der DNA von 89 Irischen Wolfshunden genotypisiert. 64 der in dieser Untersuchung einbezogenen Tiere waren DCM frei, 25 Proben stammten von DCM betroffenen Tieren. In den Genen ACTC1, CSRP3, SGCD, PLN und TMOD1 sind die DNA-Marker in intronischen Genbereichen lokalisiert. Im Gen DES ist ein polymorpher Marker in Exon 8, die anderen drei Polymorphis- men sind in Intron 7. Die statistische Auswertung ergab, dass keine Kopplung oder Assoziation zwischen den analysierten intragenischen Polymorphismen und DCM vorliegt. Unsere Ergebnis- se ließen den Schluss zu, dass die sechs analysierten Kandidatengene als Ursache für DCM bei Irischen Wolfshunden ausgeschlossen werden können. Die in dieser Arbeit identifizierten DNA-

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