Eigener Beitrag zur Untersuchung von MDR1 Polymorphismen beim Hund

A sex-dependent functional polymorphism in the canine multidrug-resistance (MDR1) gene Philipp U, Fecht S, Wöhlke A, Distl O. (submitted)

Im vorliegenden Teil der Arbeit wurde die cDNA von vier Elo-Hunden sequenziert. Dabei wurde ein zuvor auf genomischer DNA identifizierter nichtsynonymer SNP in Exon 26 des Elo MDR1-Gens bestätigt (c.3439A>G, Met1147>Val) sowie zwei weitere synonyme SNPs (c.504C>T und c.1663C>T in den Exons 6 und 14) und ein SNP (c.*230G>A in Exon 28) im 3’-UTR entdeckt.

Die vier Polymorphismen wurden an 186 Tieren genotypisiert und Allel- und Genotypfrequen-zen berechnet. Keine der GenotypfrequenGenotypfrequen-zen zeigte eine Abweichung vom Hardy-Weinberg Gleichgewicht.

Die Loci c.504C>T, c.3439A>G und c.*230G>A befinden sich im Kopplungsungleichgewicht.

Das aminosäureverändernde c.3439G-Allel hat in der untersuchten Elo Stichprobe einen Anteil von 56,45 Prozent, seine Frequenz wird hauptsächlich durch den Einfluss der Gründerrasse Sa-moyed bestimmt. In den Rassen Labrador Retriever, Do-Khyi, Dalmatiner, Deutsch Drahthaar, Hovawart und Border Collie konnte das G-Allel ebenfalls nachgewiesen werden, während in den Stichproben weiterer neun Hunderassen nur das A-Allel auftrat. Um zu testen, ob der c.3439A>G SNP oder auch die anderen Polymorphismen Auswirkungen auf die Transkripthöhe des P-Glykoproteins haben, wurden von 42 Elos mit bekanntem Genotyp für den c.3439A>G SNP Haarwurzelproben für eine RT-PCR gwonnen. Sechzehn der Hunde waren homozygot für das c.3439A-Allel und zehn waren homozygot für das c.3439G-Allel. Siebzehn Elos waren an der c.3439 Possition heterozygot. Die quantitative Analyse zeigte, dass nur der c.3439A>G Po-lymorphismus die relative Expressionshöhe von MDR1 beeinflusst. Die Auswertung nach dem Genotyp zeigte, dass G/G-Tiere eine signifikant geringere relative Transkriptmenge aufweisen als A/A-Tiere.

Eine Auswertung unter Berücksichtigung der Genotyp-Geschlecht-Interaktion zeigte, dass nur die Rüden den genotypabhängigen Effekt bewirken. Bei homozygot A/A-Elo-Rüden konnte eine signifikant höhere relative MDR1 Transkriptmenge nachgewiesen werden, als bei homozygot G/

G-Elo-Rüden. Die weiblichen Hunde wiesen eine insgesamt geringere Transkripthöhe auf, der Einfluss des c.3439 A>G Polymorphismus auf die Transkripthöhe war nicht signifikant.

Hetero-zygote Tiere lagen mit ihrer relativen Transkriptmenge zwischen den homoHetero-zygoten Tieren. Die genotyp- und geschlechtsabhängige Transkription von MDR1 könnte bei den Hunden zu einer veränderten Metabolisierung von Substraten führen, die MDR1-abhängig transportiert werden.

Auch wenn die Ergebnisse auf einen Einfluss des c.3439A>G Austausches auf die Transkription hinweisen, ist nicht auszuschließen, dass noch weitere unbekannte Mutationen in regulatorischen Bereichen des MDR1-Gens die Transkripthöhe mit beeinflussen.

4.6 Diskussion

In dieser Studie wurden im caninen MDR1-Gen vier bislang nicht beschriebene Mutationen – jeweils Einzelbasenaustausche – identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Genverände-rungen innerhalb der Rasse Elo polymorph sind. Drei der Mutationen sind stille Mutationen, füh-ren also zu keiner Veränderung der Proteinsequenz, wähfüh-rend die vierte zu einem – wirkungsneu-tralem – Aminosäureaustausch führt, in der Nähe eines synonymen Polymorphismus im ortholo-gen humanen MDR1-Gen, der zu veränderter Genexpression führt.

Eine Expressionsstudie mittels qPCR zum Einfluss der c.3439-Allele zeigte tatsächlich, dass bei Elos, die homozygot das c.3439A-Allel tragen, eine signifikant höhere relative MDR1 Trans-kriptmenge gemessen wurde als bei Elos, die das c.3439G-Allel besitzen. Allerdings zeigte die Studie hohe individuelle Unterschiede in der Transkripthöhe. Individuelle Variationen in der Transkripthöhe sind auch zwischen Menschen eines Genotyps des c.3435C>T Polymorphismus beschrieben worden (Nakamura et al. 2002). Auch das Geschlecht und der Hormonstatus schei-nen die Expression von MDR1 zu beeinflussen. Bei weiblichen Elos schwankte die relative Tran-skripthöhe zwischen Tieren eines Genotyps stärker und bei heterozygoten weiblichen Tieren war die relative MDR1-Transkripthöhe niedriger als bei homozygot G-Allel tragenden Elos. Bei männlichen Elos und bei allen Tieren ohne Berücksichtigung des Geschlechts wurde bei homo-zygot G-tragenden Tieren die geringste relative Transkripthöhe beobachtet. Der Hormoneinfluss auf die MDR1-Expression zeigte sich insbesondere bei weiblichen Elos. Bei einer tragenden Hündin konnte eine fast 300-fache Menge des Transkripts nachgewiesen werden, bei einer wei-teren Hündin zu Beginn der Tragezeit war die Transkriptmenge rund 20-fach erhöht.

Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit Beobachtungen bei Mensch und Nagetieren, bei denen eine östrogen- und progesteronabhängige Regulierung der orthologen Gene im uteropla-zentaren Gewebe gezeigt wurde (Arceci et al. 1990; Axiotis et al. 1991; Piekarz et al. 1993). All-erdings konnte für die mdr1-Expression in Rattenleber kein östrogensteuernder Effekt festge-stellt werden (Schuetz et al. 1995). Diese Ergebnisse deuten auf eine unterschiedliche Regulie-rung der MDR1-Expression in verschiedenen Geweben hin. Der beobachtete geschlechtsabhän-gige Effekt könnte durch die Wirkung geschlechtshormonspezifischer Rezeptoren entstehen. Im humanen Intestinaltrakt wird die MDR1-Expression unter anderem durch steroidabhängige Re-zeptorproteine induziert (Geick et al. 2001, Burk et al. 2005). Geschlechtsabhängige

Auswirkun-im Troponin T-Gen bei Männern mit einem schwereren DCM Erkrankungsbild als bei Frauen assoziiert (Stefanelli et al. 2004). Und in dem SCARB1-Gen ist bei Frauen ein Polymorphismus mit hohen High-Density-Lipoprotein-Cholesterin-Werten assoziiert, während bei Männern keine Assoziation zwischen Cholesterin-Werten und Polymorphismen im SCARB1-Gen bestand (Ro-berts et al. 2007). Die molekulare Grundlage dieser geschlechtsabhängigen Effekte ist bislang nicht bekannt. Eine mögliche Erklärung wäre eine gekoppelte Mutation in einem regulatorischen DNA-Element, das mit geschlechtsspezifischen Rezeptorproteinen interagiert.

Unsere Untersuchungen wurden an Haarwurzelzellen durchgeführt, da dies ein Gewebe ist, das ohne invasive Methoden entnommen werden kann. Es ist zwar bekannt, dass MDR1 in Haut und angrenzendem Gewebe exprimiert wird (Fojo et al. 1987), weitergehende Studien sind bislang nicht durchgeführt worden. Die physiologische Bedeutung unserer Ergebnisse muss daher noch geklärt werden.

Allerdings scheint das c.3439A-Allel bei den untersuchten Hunderassen weiter verbreitet zu sein als das G-Allel, da das G-Allel bei neun Rassen nicht nachgewiesen wurde. Die Allelfrequenz bei den Rassen, bei denen es beobachtet wurde, wurde aufgrund der zu geringen Tierzahlen nicht bestimmt. Dass das G-Allel bei einem kleineren Teil der untersuchten Rassen vorkommt, kann Zufall sein. Die züchterische Selektion der Hunde durch den Menschen kann zu einem Verlust einzelner Allele führen, ohne dass dies einen Einfluss auf die Fitness der Tiere hat. Welche Aus-wirkung die caninen MDR1-Genotypen auf den Transport MDR1-abhängiger Substrate in vivo haben und ob damit eventuelle Vorteile oder Nachteile auf die Fitness verbunden sind, müssen weitere Studien zeigen.