Eigene Beiträge zur DCM beim Irischen Wolfshund

Evaluation of tafazzin as candidate for dilated cardiomyopathy in Irish wolfhounds Philipp U, Broschk C, Vollmar A, Distl O.

J Hered. 2007; 98: 506-509.

Männliche Irische Wolfshunde erkranken früher und häufiger an DCM als weibliche Tiere. Um eine Beteiligung X-chromosomaler Gene an der Ausprägung der Erkrankung zu überprüfen, wurde in dieser Arbeit ein Set von acht X-chromosomalen Mikrosatellitenmarkern bei Irischen Wolfshundfamilien, die für DCM segregieren, auf Kopplung mit DCM getestet. Die Marker wurden an DNA Proben von 89 Irischen Wolfshunden genotypisiert, von denen 25 Proben von DCM betroffenen Irischen Wolfshunden stammen und 64 von DCM freien Tieren. Außerdem wurde das Tafazzin-Gen (TAZ), ein humanes X-chromosomales Kandidatengen für DCM analy-siert.

Die statistische Auswertung der Marker gab keinen Hinweis auf Kopplung von X-chromosoma-len Genorten und DCM. Die Untersuchung des TAZ-Genes ergab, dass die Sequenzen innerhalb der Irischen Wolfshunde monomorph waren. Im Vergleich zu der Boxerreferenzsequenz des Hundegenomprojekts konnten in den rund 5800 sequenzierten Basen acht Sequenzunterschiede

identifiziert werden. Die Ergebnisse der Kopplungsanalyse und das Fehlen von Mutationen im TAZ-Gen innerhalb der Irischen Wolfshunde zeigten, dass TAZ-Gen an der Entstehung der DCM beim Irischen Wolfshund nicht beteiligt ist.

Evaluation of six candidate genes for dilated cardiomyopathy in Irish wolfhounds

Philipp U, Vollmar A, Distl O.

Anim Genet. 2008; 39: 88-89.

In dieser Studie wurden sechs humane autosomale Kandidatengene (ACTC1, CSRP3, DES, PLN, SGCD und TMOD1) auf Kopplung und Assoziation zu DCM bei Irischen Wolfshunden getestet.

Dazu wurden genomische Sequenzen der Gene auf Polymorphismen untersucht und intrageni-sche Marker entwickelt. Außerdem wurden cDNA Sequenzen aus Herzgewebe eines DCM er-krankten Irischen Wolfshundes sowie Skelettmuskulatur eines gesunden Jack Russell Terriers untersucht sowie die DNA-Sequenzen der 5’- und 3’- untranslatierten Bereiche der Gene analy-siert.

Im Vergleich zur Boxerreferenzsequenz wurden in den Genen ACTC1, CSRP3 und TMOD1 kei-ne Mutatiokei-nen in der kodierenden Region oder den flankierenden UTR gefunden (Tabelle 4). In SGCD und PLN wurde eine Mutation im 5’- bzw. 3’- UTR detektiert und in DES wurden zwei synonyme Substitutionen in der cDNA identifiziert (Tabelle 4). Bei keinem der Gene gab es ei-nen Hinweis auf Spleißmutatioei-nen.

Für jedes der sechs Gene wurden intragenische Marker entwickelt (Tabelle 4), die in einer Kopp-lungs- und Assoziationsanalyse verwendet werden konnten. Dazu wurden die Marker an der DNA von 89 Irischen Wolfshunden genotypisiert. 64 der in dieser Untersuchung einbezogenen Tiere waren DCM frei, 25 Proben stammten von DCM betroffenen Tieren. In den Genen ACTC1, CSRP3, SGCD, PLN und TMOD1 sind die DNA-Marker in intronischen Genbereichen lokalisiert. Im Gen DES ist ein polymorpher Marker in Exon 8, die anderen drei Polymorphis-men sind in Intron 7. Die statistische Auswertung ergab, dass keine Kopplung oder Assoziation zwischen den analysierten intragenischen Polymorphismen und DCM vorliegt. Unsere Ergebnis-se ließen den Schluss zu, dass die Ergebnis-sechs analysierten Kandidatengene als Ursache für DCM bei Irischen Wolfshunden ausgeschlossen werden können. Die in dieser Arbeit identifizierten

DNA-Marker können für weitere genetische Studien zur DCM bei anderen Hunderassen eingesetzt werden.

Tabelle 4: Identifizierte Mutationen in den sechs Kandidatengenen im Vergleich zur Boxerrefe-renzsequenz, Gen, Chromosom, Markerposition, Lokalisierung im Gen, Boxer und Irische Wolfshund (IW) Allele. Fett: Polymorphismen, die für die Kopplungs- und Assoziationsstudie verwendet wurden.

Gen CFA Caniner Genort Marker Lokalisierung Boxer Allel IW Allele

ACTC1 30 LOC478250 g.2937C>T Intron 4 C C/T

CSRP3 21 LOC610946 g.137A>G Intron 1 A G

g.8763T>C Intron 2 T C/T

g.8959delA Intron 2 A A/del A

DES 37 LOC497091 g.1808T>C Exon 3, synonym T C

g.5840G>A Intron 7 G G/A

PLN 1 LOC414755 g.7867delA Intron 1 A A/del A

g.10830A>C Exon 2, 3´UTR A C

SGCD 4 LOC612079 g.378499G>C Intron 7 G G/C

g.4985C>T Exon 1, 5´UTR C T

TMOD1 11 LOC474771 g.43126G>A Intron 7 G G/A

g.53452C>T Intron 8 C C/T

Evaluation of the titin-cap gene (TCAP) as candidate for dilated cardiomyopathy in Irish wolfhounds

Philipp U, Vollmar A, Distl O.

Animal Biotechnol. 2008; 19: 231-236.

Mutationen im Titin-cap-Gen (TCAP oder telethonin) können bei Menschen DCM auslösen. In dieser Untersuchung wurde TCAP als Kandidatengen für DCM bei Irischen Wolfshunden evalu-iert. Dazu wurden die zwei Exons und das Intron des TCAP-Gens sowie flankierende intergeni-sche Bereiche, die regulatoriintergeni-sche Sequenzen enthalten könnten, analysiert.

Wir sequenzierten die cDNA von einem an DCM erkrankten Irischen Wolfshund sowie von zwei nicht an DCM erkrankten Hunden der Rassen Tibet Terrier und Dackel. Die cDNA-Sequenzen

zeigten keine Unterschiede zwischen den drei Tieren, jedoch einen c.753G>C (äquivalent zu g.1134G>C) Austausch im 3’- UTR im Vergleich zur Boxerreferenzsequenz des Hundegenom-projekts.

Das Intron sowie Teile der Exons mit flankierenden intergenischen Sequenzen wurden bei 13 Irischen Wolfshunden sequenziert, von denen acht an DCM erkrankt und fünf nicht von DCM betroffen waren. Die Sequenzen der Irischen Wolfshunden waren untereinander monomorph, im Vergleich zur Boxerreferenzsequenz wurden zwei Sequenzunterschiede (g.349A>G und g.408T>C) im Intron identifiziert. Um zu überprüfen, ob die bei den Irischen Wolfshunden ge-fundenen Sequenzunterschiede einen DCM prädisponierenden Haplotyp darstellen könnten, wurden die drei DNA-Polymorphismen zusätzlich bei 24 Elos analysiert. Die Rasse Elo weist keine Prädisposition für DCM oder andere Herzerkrankungen auf und ist daher als Kontroll-gruppe geeignet. Die Untersuchung zeigte, dass 80 Prozent der genotypisierten Elos den TCAP-Haplotypen der Irischen Wolfshunden besitzen. Damit ist dieser Haplotyp nicht spezifisch für den Irischen Wolfshund. Da der Haplotyp zudem bei einer für DCM nicht prädisponierten Rasse nachgewiesen wurde, schließen wir, dass dieser Haplotyp bei Irischen Wolfshunden nicht die Suszeptibilität für DCM erhöht.

3.5 Diskussion

Die hier zugrunde liegenden Untersuchungen führten beim Irischen Wolfshund zum Ausschluss von acht Kandidatengenen für DCM. Die untersuchten Gene erschienen als geeignete Kandida-ten, da Mutationen in sieben dieser Gene beim Menschen mit DCM assoziiert sind. Für die Gene ACTC1, CSRP3, DES, PLN, SCGD und TCAP (OMIM #115200) ist beim Menschen bereits nachgewiesen, dass Mutationen zu familiärer DCM oder auch anderen Myopathien führen. Auch für das X-chromosomale TAZ-Gen ist bei Menschen gezeigt worden, dass eine Mutation zu DCM führen kann. Eine Mutation im TAZ-Gen hätte bei den Irischen Wolfshunden den ge-schlechtsspezifischen Alleleffekt erklären können. Für das Gen TMOD1 gibt es bislang ein DCM Mausmodell. Außerdem wurde in einer Familie eine Kopplung zwischen DCM und dem Chro-mosomenbereich HSA9q13-q.22 festgestellt, dem Genombereich, in dem TMOD1 lokalisiert ist (OMIM #600884).

Die Gene ACTC1, CSRP3, PLN, SCGD und TMOD1 wurden aus zwei Gründen als kausal für DCM beim Irischen Wolfshund ausgeschlossen. Zum einem wurde keine Mutation in der kodie-renden Sequenz identifiziert, zum anderen wurde zwischen den von uns entwickelten intrageni-schen DNA-Markern und dem Phänotyp DCM keine Kopplung oder Assoziation festgestellt. Die im Vergleich zur Boxerreferenzsequenz identifizierten Polymorphismen in den untranslatierten Bereichen von PLN und SCGD waren zwischen einem DCM betroffenen und einem DCM freien Irischen Wolfshund ebenfalls monomorph. DES wurde als DCM verursachendes Gen ausge-schlossen, da die zwei Mutationen im kodierenden Bereich von DES zu keinem Aminosäureaus-tausch führen. Außerdem konnte zwischen keinem der vier benachbarten SNPs in Intron 7 und Exon 8 und dem Phänotyp DCM eine Assoziation oder Kopplung gezeigt werden. Das X-chro-mosomale TAZ-Gen wurde als kausal für DCM beim Irischen Wolfshund ausgeschlossen, da die analysierten Gensequenzen innerhalb der Irischen Wolfshunde monomorph waren und die in-formativen flankierenden Mikrosatellitenmarker keine Kopplung oder Assoziation zum Phänotyp DCM zeigten. Für TCAP wurde bei den Irischen Wolfshunden ein im Vergleich zur Boxerrefe-renzsequenz neuer Haplotyp identifiziert, der allerdings innerhalb der Irischen Wolfshunde mo-nomorph war. Der Sequenzvergleich mit Hunden der Rasse Elo, die nicht für DCM prädisponiert ist, zeigte, dass der Irische Wolfshund Haplotyp auch bei Elos dem häufigeren Haplotyp ent-spricht. Daher wird dieser Haplotyp nicht die Empfänglichkeit für DCM beim Irischen Wolfs-hund erhöhen und somit kann das TCAP-Gen beim Irischen WolfsWolfs-hund als DCM verursachend ausgeschlossen werden.

Beim Menschen konnten bislang verschiedene familiäre Formen der DCM mit Mutationen in diesen und anderen Kandidatengenen erklärt werden. Bislang sind alle identifizierten Mutatio-nen, die bei Menschen mit DCM assoziiert sind, Mutationen in den kodierenden Bereichen der Gene (OMIM http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=OMIM&cmd=search&term=). Al-lerdings wurden Untersuchungen zur DCM stets an kleineren Gruppen (Familien) durchgeführt, die oft nur eine geringe Probandenzahl und wenige Generationen erfassen. Die beobachteten Erbgänge entsprachen einem einfachen monogenen Erbgang. Die identifizierten Mutationen gel-ten daher oft nur innerhalb der untersuchgel-ten Gruppe. Gentests für ein breites Screening konngel-ten bislang nicht entwickelt werden, zumal auch nur rund 30 Prozent der familiären Fälle mit Muta-tionen in den bereits analysierten Genen erklärt werden können (Osterziel et al. 2005a).

In den hier vorliegenden Untersuchungen bei Irischen Wolfshunden konnten einige beim Men-schen als für DCM kausal bekannte Gene ausgeschlossen werden. Ob weitergehende Analysen von Kandidatengenen zur Identifizierung von DCM auslösenden Genvarianten führen, bleibt un-sicher, da die genaue Zahl der Gene, deren Mutation DCM auslösen könnte, nicht bekannt ist.

Und wie Aguirre-Hernández und Sargan (2005) nach Auswertung verschiedener Studien mit Kandidatengenansatz feststellten, ist das Auffinden von kausalen Mutationen nur aufgrund der Auswahl bekannter Kandidatengene ohne zusätzliche positionelle Information wenig erfolgreich, insbesondere wenn eine genetische Heterogenität für die zu untersuchende Eigenschaft bekannt ist. Diese These scheint auch eine neue Untersuchung bei Neufundländern zu belegen, bei der 15 Kandidatengene für DCM ausgeschlossen wurden (Wiersma et al. 2008). Allerdings führt ein rein positioneller Ansatz auch nicht unbedingt zum Erfolg. So konnte in einer prospektiven Stu-die mit einer Familie aus 41 Dobermann Pinschern, deren DNA an 372 Mikrosatelliten genotypi-siert worden waren, keine signifikante Kopplung zu einem Genombereich festgestellt werden (Meurs et al. 2007). Entscheidend für dieses Ergebnis könnte hier die geringe Tierzahl bei noch zu geringer Markerdichte gewesen sein.

Ein weiterer Grund, der das Auffinden DCM verursachender Gene erschwert, ist, dass sich beim Irischen Wolfshund und bei anderen Hunderassen der Erbgang nicht mit einem einfachen mono-genen Modell beschreiben lässt. Die Segregationsanalyse für Wolfshunde ergab ein Hauptgen-Modell mit geschlechtsspezifischem modulierenden Einfluss (Distl et al. 2007). Dies könnte die Zuordnung eines krankheitsassoziierten Haplotyps erschweren. Zudem könnte sich der krank-heitsassoziierte Haplotyp bei männlichen und weiblichen Tieren unterscheiden. Daher kann es sein, dass es gar nicht den einen krankheitsassoziierten Haplotyp bei den Irischen Wolfshunden gibt. Die krankheitsassoziierten Haplotypen könnten in Abhängigkeit vom genetischen Hinter-grund variieren. Dies belegen Untersuchungen zum geschlechtsspezifischen Größendimorphis-mus beim Portugiesischen Wasserhund, bei dieser Rasse wurde je ein QTL auf dem X Chromo-som und CFA15 identifiziert. Die Genprodukte dieser QTL interagieren bei männlichen und weiblichen Tieren unterschiedlich (Chase et al. 2005). In dieser Studie zum geschlechtsspezifi-schen Größendimorphismus wurden rund 450 Tiere genotypisiert. Das zeigt auch, dass gerade für polygene Eigenschaften eine hohe Anzahl von eindeutig diagnostizierten Tieren notwendig ist, um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten.

Das belegt auch die Untersuchung des Addison-Syndroms beim Portugiesischen Wasserhund.

Für diese auch beim Menschen beschriebene Autoimmunerkrankung wurden bei den Portugiesi-schen Wasserhunden zwei autosomale QTL mittels Mikrosatellitengenomscan identifiziert. Da die Zahl der von dieser Krankheit betroffenen Tiere aber gering ist, führte eine Haplotypanalyse bislang zu keinem eindeutigen Ergebnis (Chase et al. 2006).

Die aufgeführten Beispiele zeigen, dass es nötig ist, einen positionellen Ansatz mit hohen Tier-zahlen und mit einer hohen Markerdichte durchzuführen, um QTL eingrenzen zu können. Bei Irischen Wolfshunden hat ein positions- und nicht nur kandidatengengestützter Ansatz für die Untersuchung der DCM den Vorteil, dass auch Genombereiche außerhalb der klassischen Kandi-datengenregionen analysiert werden. Denn in der seit rund 100 Jahren bestehenden Zucht der Irischen Wolfshunde können sich Defekte von Genen durchgesetzt haben, deren Mutation bei Mensch oder Maus selten zur Erkrankung an DCM führen. Durch anschließenden Einsatz von Expressionsarrays können zudem Gene, die in assoziierten Genregionen liegen auf unterschied-liche Expressionsmuster untersucht werden und so die Wahl der näher zu analysierenden Gene weiter eingrenzen. Bei Hunden konnten bereits kausale Mutationen identifiziert werden, nach-dem genomweite Assoziationsstudien mit hoher Markerdichte (SNP-Arrays) durchgeführt wor-den waren. Bei wor-den engverwandten Rassen Rhodesian und Thai Ridgeback wurde die kausale Mutation für den Haarkamm und damit auch die Prädisposition zum Dermoid sinus mithilfe der Array-Technologie aufgeklärt (Salmon Hillbertz et al. 2007). Auch die Mutation für die mono-gen autosomal semi-dominant vererbte canine ektodermale Dysplasie, die bei Mexikanischen und Peruanischen Nackthunden sowie beim Chinesischen Schopfhund den Phänotyp der Haarlo-sigkeit und damit oft verbunden der ZahnloHaarlo-sigkeit verursacht, konnte mithilfe von SNP-Arrays aufgeklärt werden (Drögemüller et al. 2008). Das heißt, der Einsatz einer großen Anzahl von ge-netischen Markern führt zur Identifikation von Genombereichen, die merkmalsausprägende Ge-ne enthalten.

Für die Identifikation DCM verursachender Genombereiche bei Irischen Wolfshunden muss auf-grund des komplexen Erbgangs die Anzahl der zu genotypisierenden Tiere hoch sein. Um das Problem einer eventuell zu geringen Tierzahl zu überwinden, bietet die Untersuchung von Parker und Ostrander (2005) einen möglichen Ansatz. Diese Autoren haben einen phylogenetischen Stammbaum der Haushundrassen erstellt und stellen die These auf, dass sich in eng verwandten Rassen eine Anfälligkeit für eine Krankheit oft auf eine gemeinsame Urmutation zurückführen

lässt. So könnte man für die molekulargenetischen Untersuchungen die Probandenzahl erhöhen, indem man die Untersuchung auf eng verwandte Rassen ausweitet. Dieser Ansatz wurde auch in der Studie von Salmon Hillbertz et al. (2007) bestätigt, deren Untersuchung vom Rhodesian Ridgeback auf Thai Ridgeback erweitert wurde, um den Genombereich, der die kausale Verände-rung für den Haarkamm enthielt, besser eingrenzen zu können.

Für die weiteren Untersuchungen der DCM bei Irischen Wolfshunden bietet der eben diskutierte methodische Ansatz die Möglichkeit, die Zahl der zu analysierenden Tiere zu erhöhen, indem die Studie auf andere ebenfalls von DCM betroffene Windhundrassen erweitert wird. Dadurch und durch den Einsatz der SNP-Array-Technologie sollte es möglich sein, QTL zu identifizieren, in denen DCM verursachende Gene lokalisiert sind.

4 Untersuchungen am caninen MDR1 Gen