Reinigung und in vitro Charakterisierung des eukaryotischen Chaperonins TRiC aus S. cerevisiae

Reinigung und in vitro Charakterisierung

des eukaryotischen Chaperonins TRiC

aus S. cerevisiae

Dissertation

zur

Erlangung des Grades

Doktor der Naturwissenschaften

– Dr. rer. nat. –

des Fachbereichs Biologie, Chemie und Geowissenschaften

der Justus-Liebig-Universität Gießen

vorgelegt von

Diplom-Biologin

Ulrike Böttcher

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Ferner erkläre ich, dass ich weder versucht habe, eine Dissertation anderweitig einzureichen bzw. einer Prüfungskommission vorzulegen noch die Doktorprüfung durchzuführen. Die vorliegende Dissertation ist nicht ganz oder in wesentlichen Teilen einer anderen Prüfungskommission vorgelegt worden.

Die vorliegende Arbeit wurde zwischen April 2000 und April 2005 unter Leitung von Prof. F.U. Hartl am Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried durchgeführt.

Dekan Prof. Dr. Jürgen Mayer

Institut für Biologiedidaktik, FB08 der Justus-Liebig-Universität Gießen Karl-Glöckner-Str. 21, 35392 Gießen Erstgutachter Prof. Dr. Alfred Pingoud

Institut für Biochemie, FB08

der Justus-Liebig-Universität Gießen Heinrich-Buff-Ring 58, 35392 Gießen Zweitgutachter Prof. Dr. Franz-Ulrich Hartl

Abteilung für Zelluläre Biochemie

Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried Am Klopferspitz 18, 82152 Martinsried

Z

Zahlreiche neu-synthetisierte Proteine benötigen für ihre korrekte Faltung die Beteiligung spezieller Helferproteine, die als molekulare Chaperone bezeichnet werden und sowohl ko- als auch posttranslational wirken. Mitglieder der Hsp70 Klasse sowie andere Chaperone, die während der Translation direkt an die naszente Polypeptidkette binden, stabilisieren die wachsende Polypeptidkette und verhindern dadurch Fehlfaltungen und Aggregation. Daneben sind viele Proteine für ihre vollständige Faltung auf die Interaktion mit weiteren Chaperonen, wie z.B. Vertretern der Chaperonin-Klasse, angewiesen. Hierbei handelt es sich um große, zylindrische Komplexe mit zwei zentralen Faltungshöhlen, in deren Innern die Faltung von Substraten abgeschirmt von äußeren Einflüssen erfolgt.

Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht das Chaperonin TRiC des eukaryotischen Zytosols. Dieser hetero-oligomere Komplex setzt sich aus zwei übereinander gelagerten Ringen zusammen, die jeweils eine Faltungshöhle umschließen und aus 8 verschiedenen Untereinheiten gebildet werden. Ursprünglich wurde angenommen, dass es sich bei TRiC um ein hoch spezialisiertes Chaperonin handelt, das ausschließlich für die Faltung der Zytoskelettproteine Aktin und Tubuline benötigt wird. Mittlerweile konnte aber auch eine Beteiligung von TRiC an der Faltung anderer Substrate nachgewiesen werden; so ist das Chaperonin z.B. an der Faltung verschiedener Proteine mit WD-repeat Propeller-Motiven involviert. Für die effiziente Faltung von Substraten benötigt TRiC das Zusammenspiel mit anderen Chaperonen. Während bei der Faltung von Aktin und Tubulinen TRiC eng mit dem Ko-Chaperon GimC/Prefoldin kooperiert, ist das Hsp70 Chaperon Ssb1/2p an der TRiC-vermittelten Faltung von Substraten mit WD-repeats beteiligt.

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Protokolls zur Reinigung von TRiC im Großmaßstab aus S. cerevisiae sowie die Verwendung des gereinigten Komplexes für funktionelle in vitro Studien, anhand derer die TRiC-vermittelte Faltung verschiedener Sub-strate näher untersucht wurde. Da TRiC in Hefezellen nur in geringen Mengen vorhanden ist, wurden anfangs unterschiedliche Strategien zur Reinigung ausreichender Mengen funktioneller Chaperonin-Komplexe verfolgt. Hierbei erwies sich die Epitop-Markierung einer Untereinheit mit einem Histidin-tag bei gleichzeitiger Überproduktion aller Unterein-heiten als erfolgreich. Die Epitop-Markierung interferierte weder mit der Komplex-assemblierung noch beeinflusste sie die Funktionalität des Chaperonins. Durch Verwendung einer Ni2+_{-Affinititätsmatrix sowie drei weiterer chromatographischer}

Reinigungsschritte wurde der funktionelle Komplex zu einem hohen Reinheitsgrad aus Hefelysat isoliert.

Für funktionelle Studien wurde der gereinigte Komplex in einem isolierten System untersucht. Hierzu wurden mittels eines prokaryotischen in vitro Transkriptions–/ Translationssystems TRiC-Substrate (Aktin, Tubuline) in vitro synthetisiert und deren de novo Faltung in An- oder Abwesenheit von gereinigtem TRiC und weiterer gereinigter, eukaryotischer Chaperone (GimC, bzw. Ssb1p) analysiert. Zusätzlich wurde die Faltung

Zunahme der Löslichkeit verfolgt, da fehlgefaltete Proteine zur Aggregation neigen. Zu-sätzlich wurden Substrat-spezifische Faltungstests entwickelt, die auf der Interaktion des neu-synthetisierten Polypeptids mit einem Partnerprotein basieren und direkt Aufschluss über den Faltungszustand geben. Für Aktin und Tubuline konnte gezeigt werden, dass in vitro Zugabe von gereinigtem TRiC oder GimC die Aggregation neu-synthetisierter Polypeptidketten verhindert. Die Substrat-Proteine erlangten aber nur ihren nativen Faltungszustand, wenn TRiC anwesend war, wie am Beispiel von Aktin veranschaulicht werden konnte; die Funktion von GimC war hierfür nicht ausreichend. Diese Ergebnisse bestätigen die Interpretation früherer in vivo Studien, nach denen GimC maßgeblich eine Funktion in der Zulieferung zu TRiC bzw. in der Qualitätskontrolle partiell gefalteter Substrate zukommt. Neben Aktin und Tubulinen wurden auch Mitglieder der neuen Substratklasse der WD-repeat Proteine mittels des hier entwickelten rekonstituierten de novo Faltungssystems untersucht. Hierbei konnte eine Beteiligung von TRiC an der Faltung des WD-repeat Proteins Cdc20p direkt nachgewiesen werden. Ferner konnte gezeigt werden, dass das Hsp70-Chaperon Ssb1p die Löslichkeit von in vitro synthetisiertem Cdc20p beeinflusst, im Gegensatz zu TRiC aber nicht dessen korrekte Faltung vermittelt. Damit nimmt dieses Hsp70-Chaperon hier eine ähnliche Funktion bei der Faltung der WD-repeat Substrate ein wie für GimC bezüglich der TRiC-vermittelten Faltung von Aktin- und Tubulinen beobachtet worden ist.

Zusätzlich zu den in vitro Faltungsstudien wurden in vivo Experimente entwickelt, mittels derer sich die Faltungskinetik von beta-Tubulin bestimmen lässt und die temporäre Assoziation mit Komponenten des Chaperon-Netzwerks näher untersucht werden kann.

Die hier entwickelten Methoden zur effizienten Reinigung von TRiC aus Hefe und zur in vitro Faltungsanalyse verschiedener TRiC-Substrate erlaubten es, in einem isolierten System die direkte Beteiligung einzelner Chaperone an der Proteinfaltung zu untersuchen. Diese Methoden lassen sich zukünftig auch auf die Analyse gereinigter Mutanten von TRiC sowie anderer Chaperone ausweiten und damit gezielt für die Untersuchung bestimmter Prozesse, wie z.B. der Substraterkennung von TRiC, verwenden.

A

µ Mikro (10-6)

Ω Ohm, Maßeinheit für den Widerstand

λ Wellenlänge A Ampère Abb. Abbildung Ac Azetat ad auffüllen auf ADP Adenosindiphosphat APS Ammoniumperoxodisulfat AS Aminosäurerest ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaar(e)

BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)

bzw. beziehungsweise

CCT Chaperonin containing TCP1

Ci Curie

CIP alkalische Phosphatase (calf intestine phosphatase)

C-terminal carboxyterminal C-Terminus Carboxy-Terminus dATP Deoxyadenosintriphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat DIG Digoxygenin DMF Dimethyl Formamid DMSO Dimethylsulfoxid DNaseI Desoxyribonuklease I DNS Deoxyribonukleinsäure dNTP 2´-Desoxy-Nukleosid-5´-Triphosphat DTT Dithiothreitol

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

F Farad, Maßeinheit für die elektrische Kapazität

5´FOA 5´-Fluor-Orotsäure

FPLC Fast Protein Liquid Chromatography

g Gramm

g x Erdbeschleunigung

GimC Genes involved in microtuble bigenesis complex

GroEL Prokaryotisches Hsp60 Chaperonin

GroES Prokaryotisches Hsp10 GST Glutathion-S-Transferase HEPES N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N´-[2-Ethan-sulfonsäure] His Histidin Hsp Hitzeschockprotein Ig Immunglobulin IP Immunpräzipitation IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galaktopyranosid kDa Kilodalton l Liter LiAc Lithiumazetat

m milli (10-3)

M molar

MAT Mating type

min Minuten

MOPS 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure

MPa Mega Pascal

mRNA Boten-Ribonukleinsäure

MW Molekulargewicht

N-terminal aminoterminal

N-Terminus Amino-Terminus

ODx Optische Dichte bei x nm

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

PCR Polymerasekettenreaktion

PEG Polyethylenglykol

Pfu Pyrococcus furiosus

RNaseA Ribonkulease A

rpm Umdrehungen pro Minute

RT Raumtemperatur

s Sekunde

s. siehe

S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

S. pombe Schizosaccaromyces pombe

Ssb Stress seventy subfamily B

SDS Natriumdodecylsulfat

Std Stunden

Tab. Tabelle

TAE Tris/Azetat/EDTA-Puffer

Taq Thermus aquaticus

TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin

TEV Tobacco Etch Virus

TCA Trichloressigsäure

TCP1 Tailness complex polypeptide 1

TRiC TCP1 ring complex

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

Triton-X-100 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol

Tween 20® Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat

TY Trypton-Hefeextrakt

U Unit

u.a. unter anderem

UV Ultraviolettes Licht

V Volt

(v/v) volume per volume

W Watt

WT Wildtyp

(w/v) weight per volume

YPD Hefeextrakt-Pepton-Dektrose

I

1. EINLEITUNG 1

1.1. Proteinfaltung 1

1.1.1. Proteinfaltung in vitro 1

1.1.2. Proteinfaltung in vivo 2

1.1.2.1. Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen 2

1.1.2.2. Molekulare Chaperone 3

1.2. Netzwerk der Chaperon-vermittelten Proteinfaltung im Zytosol 4

1.2.1. Hsp70-System 7

1.2.2. Chaperonine 8

1.3. Das eukaryotische Chaperonin TRiC 11

1.3.1. Substrate von TRiC 13

1.3.1.1. GimC und die Faltung von Aktin und Tubulinen 14

1.3.1.2. Ssb und die Faltung von Proteinen mit WD-repeat Motiv 17

1.3.3. Krankheiten assoziiert mit Proteinmissfaltungen von TRiC-Substraten 18

1.4. Ziel der Arbeit 19

2. MATERIAL UND METHODEN 20

2.1. Materialien 20

2.1.1. Verbrauchsmaterialien (Chemikalien, Enzyme) 20

2.1.2. Geräte 20

2.1.3. Lösungen und Puffer 20

2.1.4. Kultivierungsmedien 21 2.1.5. Stämme 23 2.1.6. Plasmide 24 2.1.7. Oligonukleotide 25 2.1.8. Antikörper 27 2.1.9. Standards 27

2.1.10. Säulenmaterial zur Reinigung von Proteinen 28

2.1.14. Waschen von Glasperlen 31

2.2. Mikrobiologische und genetische Methoden 32

2.2.1. Arbeitstechniken für E. coli 32

2.2.2. Arbeitstechniken für S. cerevisiae 33

2.3. Molekularbiologische Techniken 40

2.3.1. Isolierung von Plasmid-DNS aus E. coli 40

2.3.2. Isolierung chromosomaler DNS aus S. cerevisiae 42

2.3.3. Isolierung von Plasmid-DNS aus S. cerevisiae 42

2.3.4. Klonierung von Plasmidkonstrukten 42

2.3.5. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 45

2.3.6. Fällen von DNS 45

2.3.7. Insertion eines DNS-Fragments in den pCR-TOPO 2.1 Vektor 46

2.3.8. DNS-Markierung durch Einbau Digoxygenin-gekoppelten Desoxyuridins 46

2.3.9. Kolonie-Hybridisierung 46

2.3.10. Southern-Hybridisierung 47

2.4. Proteinbiochemische Techniken 48

2.4.1. Gel- und Western-Blot Techniken 48

2.4.2. Herstellung von Zellextrakten 53

2.4.3. Reinigung rekombinanter Proteine aus E. coli 54

2.4.4. Reinigung von Proteinen aus S. cerevisiae 60

2.4.5. Generierung von Antikörpern 67

2.4.6. Kopplung von Antikörpern an ProteinA-Sepharose 68

2.4.7. Kopplung von DNaseI an CNBr-aktivierte Sepharose 69

2.4.12. Depletion von GroEL aus dem RTS-Kit mittels Immunpräzipitation 74

2.4.13. Pulse-Chase Faltungskinetiken von Aktin und Tubulin 74

3. ERGEBNISSE 77

3.1. Reinigung von TRiC aus Saccharomyces cerevisiae 77

3.1.1. Herstellung von Antikörpern und Hefestämmen zum Nachweis von TRiC in S. cerevisiae 77

3.1.1.1. Herstellung polyklonaler Antikörper zur Detektion von TRiC Untereinheiten 77

3.1.1.2. Chromosomale Integration eines Epitop-tags in ein TCP/CCT-Gen 78

3.1.2. Immunpräzipitation von TRiC mittels Untereinheiten-spezifischer Antikörper 80

3.1.3. Immunpräzipitation von TRiC mittels HA-spezifischer Antikörper 81

3.1.4. Reinigung von TRiC mittels eines TEV-linker-6His-tags 82

3.1.4.1. Hefestamm zur Überproduktion von TRiC 85

3.1.4.1.1. Herstellung von Überexpressionsplasmiden für TRiC Untereinheiten 85

3.1.4.1.2. Herstellung eines Hefestammes zur Überproduktion von TRiC 87

3.1.4.1.3. Optimierung der TRiC Überproduktionsbedingungen im Großmaßstab 89

3.1.4.2. Entwicklung des Reinigungsprotokolls für TRiC 91

3.1.4.3. Qualitätskontrollen für gereinigtes TRiC 95

3.2. In vitro Proteinfaltungsstudien mit gereinigtem TRiC im prokaryotischen Translationssystem 99

3.2.1. TRiC-vermittelte Proteinfaltung mit Hilfe akzessorischer Faktoren 100

3.2.1.1. Reinigung von GimC aus S. cerevisiae 100

3.2.1.1.1. Optimierung des Reinigungsprotokolls 100

3.2.1.1.2. Qualitätskontrollen für gereinigtes GimC 103

3.2.1.2. Reinigung von Ssb1p aus E. coli 105

3.2.2. Klassische TRiC Substrate: Aktin und Tubuline 107

3.2.2.1. Löslichkeit von Aktin und Tubulinen in Abhängigkeit eukaryotischer Faktoren 107

3.2.2.2. Faltung von Aktin in Abhängigkeit von TRiC und GimC im prokaryotischen Translationssystem 109 3.2.2.3 Löslichkeitsverhalten von alpha-und beta-Tubulinen in Abhängigkeit von TRiC und GimC 110

3.2.3. Neue Substratklasse von TRiC: Proteine mit WD-repeat Motiv 112

3.2.3.1. Löslichkeit von Cdc20p, Cdc55p und Pex7p in Abhängigkeit eukaryotischer Faktoren 113

3.2.3.2. Bindungspartner für TRiC Substrate mit WD-repeats 115

3.2.3.3. Faltung von WD-repeat Proteinen in Abhängigkeit eukaryotischer Faktoren 116

3.2.3.3.1. Löslichkeit und Faltung von in vitro synthetisiertem Cdc20p in Abhängigkeit von TRiC und Ssb1p 118 3.2.3.3.2. Löslichkeit von in vitro synthetisiertem Cdc55p und Pex7p in Abhängigkeit von TRiC und Ssb1p

121 3.2.3.3.3. Faltung von Cdc55p-3HA und Pex7p-3HA aus Hefelysat in Abhängigkeit von TRiC und Ssb1/2p

122

3.3. Experimente zur Bestimmung der beta-Tubulin Faltungskinetik in vivo 125

4. DISKUSSION 129

4.1. Reinigung von TRiC aus S. cerevisae 129

4.1.1. Vergleich verschiedener Strategien zur Anreicherung von TRiC 129

4.1.2. Entwicklung eines Reinigungsprotokolls von TRiC im Großmaßstab 131

4.2. In vitro Faltungsstudien mit gereinigtem TRiC aus S.cerevisae 133

4.2.1. Entwicklung von in vitro Rekonstitutionstests zur Faltung von TRiC Substraten 133

4.2.2. Anwendung von in vitro Faltungstests zur Validierung potentieller TRiC Substrate 136

4.2.2.1. De novo Faltung von Cdc20p in Abhängigkeit von TRiC und Ssb1p 137

4.2.2.2. Löslichkeit von Cdc55p und Pex7p in Abhängigkeit von TRiC und Ssb 138

4.3. In vivo Faltungskinetiken mit beta-Tubulin 141

4.4. Ausblick 143

1. E

1.1. Proteinfaltung

Proteine spielen in lebenden Zellen eine zentrale Rolle. Sie bilden mengenmäßig den größten Anteil einer Zelle. Sie sind nicht nur Strukturelemente, aus denen die Zellen konstruiert sind, sondern führen z.B. in Form von Enzymen zahlreiche dynamische und metabolische Funktionen aus. Zahlreiche chemische Reaktionen werden durch enzymatisch vermittelte Katalysen begünstigt. Neben vielfältigen Aufgaben wie z.B. allgemeine Transport- und Reservefunktionen ermöglichen Proteine auch den selektiven Transport bzw. Informationsaustausch zwischen unterschiedlichen Kompartimenten, Zellen oder Geweben. Um die Vielfalt dieser Aufgaben abzudecken, müssen Proteine in der Lage sein, mit anderen Proteinen oder Substraten gezielt Wechselwirkungen einzugehen. Die Spezifität dieser Interaktionen wird vor allem durch die drei-dimensionale Struktur aller Proteine gewährleistet. Obwohl eine neu-synthetisierte, lineare Polypeptidkette theoretisch eine Vielzahl unterschiedlicher Konformationen einnehmen könnte, ist die native, drei-dimensionale Struktur eines Proteins, seine Faltung, exakt festgelegt. Die gefaltete Konformation eines Proteins wird durch seine Aminosäureabfolge bestimmt. Während für viele Proteine die Information der Aminosäuresequenz allein ausreicht, um ihre korrekte drei-dimensionale Struktur selbständig zu erreichen, benötigen andere Proteine die Hilfe von Proteinen, den so genannten „molekularen Chaperonen“. In ihrer Funktion als Faltungshelfer verhindern Chaperone (franz. c h a p e r o n e , Anstandsdame) die Missfaltung und Aggregation von Proteinen. Ferner sind sie in die funktionelle Regulation von Signalproteinen sowie in die Regulation des Proteinabbaus involviert. Die Erforschung molekularer Chaperone hat daher das Verständnis für zelluläre Mechanismen zum Ziel, die sich hinter diesen Prozessen verbergen.

1.1.1. Proteinfaltung in vitro

Durch die Arbeiten von Christian Anfinsen konnte in den 1960er Jahren anhand Hitze-denaturierter Ribonuklease A gezeigt werden, dass Proteinfaltung in vitro spontan erfolgen kann ohne die Hilfe zusätzlicher Faktoren (Anfinsen 1969, 1972, 1973). Demzufolge sind alle nötigen Informationen für die Ausbildung der drei-dimensionalen Gestalt eines Proteins in dessen Aminosäuresequenz enthalten. Auf welche Weise aber ein Protein seine native (= energetisch günstigste) Konformation erlangt, war lange Zeit nicht verstanden. Geht man von der stark vereinfachten Annahme aus, dass jeder Aminosäurerest aufgrund des freien Rotationswinkels der C-C Bindung nur zwei unterschiedliche Konformationen in einer Polypeptidkette annehmen könnte, ergäben sich für ein Protein von 100 Aminosäuren bereits 2100 (~1030) unterschiedliche Konformationen. Bei einer Faltungsrate von 1011 Konformationsänderungen pro Sekunde würde demzufolge die theoretische Faltungszeit 1011 Jahren betragen (Dinner et al., 2000).

Gewöhnlich erfolgt die Proteinfaltung in vivo aber innerhalb von Sekunden (Sali et al., 1994). Dieser Widerspruch wird als Paradoxon beschrieben. Das Levinthal-Paradoxon beruht auf der Erkenntnis, dass sich der Faltungsprozess eines Proteins in seine native Struktur nicht durch das zufällige Durchspielen aller möglichen Konformationen erklären lässt (Zwanzig et al., 1992).

Unter der Annahme, dass ein korrekt gefaltetes Protein die niedrigste freie Energie aufweist, lässt sich der Faltungsprozess jedoch nach thermodynamischen Gesetzmäßig-keiten mittels einer so genannten Konformations-Energiekarte beschreiben (Dobson und Karplus, 1999). In diesem Model ist die „Energielandschaft“ trichterförmig, mit vielen nach unten ragenden Ausläufern dargestellt. Die native Proteinstruktur befindet sich am unteren Ende des Trichters (Schultz, 2000). Während des vektoriellen Faltungsprozesses erreicht ein Protein oftmals lokale Energie-Minima, die transienten Faltungsintermediaten oder kinetisch gefangenen, missgefalteten Konfigurationen entsprechen (Pande et al., 1998). Für Proteine mit komplexer Struktur beschreibt das Modell folgende, vereinfachte Faltungsschritte. Zufällig gebildete Sekundärstrukturen kollabieren schnell zum molten globule, d.h. zu einer locker organisierten, aber fast nativen Proteindomäne. Hydrophobe Kernbereiche lagern sich zu einer kompakten, aber noch flexiblen Struktur zusammen. Sekundärstrukturelemente, die mehr oder weniger dem späteren nativen Zustand ähneln, können bereits vorhanden sein. Die molten globules weisen aber noch keine definierte Tertiärstruktur auf und exponieren noch hydrophobe Reste. Langwieriger sind dagegen die anschließenden konformationellen Anpassungen und Assoziationen verschiedener Untereinheiten, die zu einer kompakteren Struktur führen. Schließlich erreicht das Protein in einem letzten schnellen Schritt seine native Struktur (Dinner et al., 2000). Je geringer die Anzahl thermodynamisch favorisierter Zwischenkonformationen ist, die ein Protein während seiner Faltung einnehmen kann, desto kürzer ist auch die Zeitspanne, die eine spontane Proteinfaltung beanspruchen würde. Der gerichtete Faltungsverlauf eines Proteins von hoher bis zu niedriger freier Enthalphie bietet die Erklärung, mit der das Levinthal-Paradoxon aufgehoben wird.

1.1.2. Proteinfaltung in vivo

1.1.2.1. Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen

Verglichen mit in vitro Experimenten ist die Proteinfaltung in vivo wesentlich komplexer. Die Proteinkonzentration im Zytoplasma einer Zelle beträgt bis zu 300 g/l (Cayley et al., 1991; Zimmerman und Trach, 1991). Diese hohen Makromolekülkonzentrationen führen unweigerlich zu einem Volumenausschlusseffekt (excluded volume effect oder molecular crowding). Die Konsequenz solch einer dicht gedrängten Umgebung äußert sich u.a. in verstärkten intra- und intermolekularen Assoziationsraten von Proteinen (Minton, 1983, Zimmerman und Minton, 1993). Daneben können auch Parameter wie Temperatur, pH-Wert oder Ionenkonzentrationen die spontane Proteinfaltung beeinflussen. Ferner lassen

1.1. Proteinfaltung

in vitro Experimente oftmals nur Aufschluss über die Rückfaltung eines zuvor denatu-rierten Proteins zu. Der Faltungsprozess neu-synthetisierter Proteine in vivo unterscheidet sich aber von der Rückfaltung eines Proteins vor allem durch den Umstand, dass er mit der Proteinsynthese gekoppelt ist (ko-translationale Faltung; Netzer und Hartl, 1997). Solange das C-terminale Ende einer Polypeptidkette sich noch im ribosomalen Ausgangs-tunnel befindet (ca. 30-40 Aminosäuren der naszenten Polypeptidkette), kann es nicht in den Faltungsprozess involviert werden. Dieser Umstand impliziert, dass eine Protein-domäne (ca. 100-300 Aminosäuren) erst dann eine stabile Struktur einnehmen kann, nachdem die vollständige Aminosäuresequenz den ribosomalen Ausgangstunnel verlas-sen hat. Damit ist die Wahrscheinlichkeit für unerwünschte intra- und intermolekulare Wechselwirkungen, die durch exponierte hydrophobe Aminosäuren zustande kommen, erhöht (Hartl und Hayer-Hartl et al., 2002). Solche Faltungsintermediate, die während der Elongation der Polypeptidekette entstehen, neigen zur Aggregation.

Fehlfaltungen innerhalb eines Proteins entstehen z.B. durch Interaktionen zwischen Regionen, die im nativen Zustand nicht benachbart liegen. Hydrophobe Seitenketten, die im Inneren des nativen Proteins verborgen sind, können exponiert im hydrophilen Milieu des Zytoplasmas weitere Fehlfaltungen begünstigen. Im weiteren Verlauf können sich Aggregate bilden, die durch hydrophobe Kräfte und Wasserstoff-Brückenbindungen innerhalb der Polypeptidkette zusammengehalten werden (Ellis und Hartl, 1999; Dobson und` Karplus, 1999). Dabei können typisch strukturierte, fibrilläre Aggregate entstehen, die mit der Ausbildung bestimmter Krankheiten wie Alzheimer oder Huntington in Verbindung gebracht werden (Dobson,1999).

1.1.2.2. Molekulare Chaperone

In der Zelle wird die Akkumulation fehlgefalteter Proteine durch das Einwirken molekularer Chaperone reduziert. Die Bezeichnung „molekulares Chaperon“ wurde Ende der 70er Jahre für Nucleoplasmin aufgrund seiner speziellen Rolle bei der Ausbildung der Chroma-tinstruktur geprägt (Laskey et al., 1978). Heute kennt man eine ganze Reihe von Chape-ron-Familien, die im Reich der Eubacteria, Archaea und Eukarya vorzufinden sind. Alle Chaperone teilen folgende charakteristische Eigenschaften (Ellis und Hartl, 1999): Sie ent-halten weder sterische Informationen für andere Proteine noch sind sie Teil der nativen Struktur des gefalteten Proteins. Im Gegensatz zu Enzymen (z.B. Isomerasen) beein-flussen Chaperone nicht die Faltungsrate ihrer Substratproteine. Ihre Wirkungsweise be-schränkt sich hauptsächlich darauf, zur Aggregation neigende Bereiche eines nicht gefal-teten Proteins abzuschirmen, bis dieses seine native Struktur erreicht hat (Agashe und Hartl, 2000). Dies geschieht gewöhnlich durch wiederholtes Binden und Freisetzen einer ungefalteten Polypeptidkette in Abhängigkeit von ATP-Hydrolyse. Demzufolge begünsti-gen Chaperone intrazelluläre Bedingunbegünsti-gen, in denen unerwünschte Wechselwirkunbegünsti-gen, die zur Missfaltung oder Aggregation führen können, reduziert werden und somit eine produktive Proteinfaltung gefördert wird.

Eine effiziente Proteinfaltung ist umso wichtiger, wenn der Organismus Stressfaktoren, wie z.B. extremen Temperatur- oder pH-Wert-Änderungen, ausgesetzt ist. Unter diesen Bedin-gungen kann es zur Destabilisierung der nativen Konformation eines bereits gefalteten Proteins kommen, die mit der Exponierung hydrophober Bereiche einhergeht und somit Akkumulation von Proteinaggregaten begünstigt. Die Zelle reagiert auf die erhöhte Menge ungefalteter Proteine mit einer verstärkten de novo Synthese bestimmter Chaperone (Lindquist, 1986; Morimoto, 1998). Basierend auf Untersuchungen an Zellen, die Temperaturstress ausgesetzt worden waren, wurde in diesem Zusammenhang der Begriff Hitzeschock-Protein (heat-shock protein, Hsp) erstmalig geprägt. Viele Chaperone gehören insofern zu den HitzeschockProteinen, als sie obwohl konstitutiv exprimiert -unter Stress-Bedingungen vermehrt gebildet werden. Mittlerweile handelt es sich bei der Abkürzung Hsp um ein weit verbreitetes Synonym für Chaperone. Hsp-Chaperone binden partiell ungefaltete Proteine, verhindern dadurch deren Aggregation und halten sie solange stabil, bis die Zelle eine korrekte Rückfaltung gewährleisten kann. Demzufolge über-nehmen Chaperone eine essentielle Schutzaufgabe in der Zelle. Die Auslösung verschie-dener neurodegenerativer Erkrankungen wird auf die Akkumulation von Protein-aggregaten, wie z.B. im Fall des Prion Proteins oder Huntingtins, zurückgeführt. In diesen Aggregaten wurden verschiedene Chaperone assoziiert vorgefunden. Demzufolge wird bei der Ausprägung des Krankheitsbildes eine verminderte Schutzfunktion von Chaperonen diskutiert, die mit einem Ungleichgewicht zwischen dem Chaperonsystem und der massiven Akkumulation toxischer Proteinaggregate erklärt werden könnte (Soti und Csermely, 2002; Barral et al., 2004).

1.2. Netzwerk der Chaperon-vermittelten Proteinfaltung im Zytosol

Molekulare Chaperone beeinflussen und kontrollieren die Konformation anderer Proteine in vielfältiger Weise. Sie sind an zahlreichen zellulären Prozessen beteiligt wie z.B. Bindung und Schutz naszenter Polypeptidketten bei der Translation, der Stabilisierung faltungskompetenter Übergangsformen, der Assemblierung oligomerer Proteine und der korrekten Rückfaltung missgefalteter Proteine. Die einzelnen Chaperone haben überlappende Funktionen und kooperieren miteinander. Zahlreiche Befunde deuten darauf hin, dass unterschiedliche Chaperone ein Netzwerk bilden, innerhalb dessen Substrate vom Ribosom bis zu ihrer nativen Struktur mit verschiedenen Chaperonen interagieren (Young et al., 2004). Obwohl viele Fragen bezüglich der Funktion oder des Substratspektrums bestimmter Chaperone noch unbeantwortet sind, so ist doch das Zusammenspiel der einzelnen Chaperonen in solch einem Netzwerk verständlicher geworden. Abbildung 1.1 zeigt anhand eines vereinfachten Schaubildes, wie die verschiedenen Komponenten bei der Faltung de novo synthetisierter Polypeptidketten miteinander kooperieren.

1.2. Netzwerk der Chaperon-vermittelten Proteinfaltung im Zytosol

Abb. 1.1: Modell für die Chaperon-vermittelte Faltung neu-synthetisierter Proteine in Eubacteria, Archaea und im Zytosol der Eukarya. N: Natives Protein, TF: trigger factor, NAC: nascent chain

asso-ciated complex, PFD: Prefoldin in Archaea und Säugetieren (= GimC in Saccharomyces cerevisiae),

DnaK/DnaJ: bakterielle Hsp70/Hsp40-Proteine, GroEL/GroES: bakterielles Chaperonin, Thermosom: Chaperonin in Archaea, TRiC: Chaperonin im Zytosol der Eukarya. Kofaktoren und zusätzliche Faltungs-wege wurden nicht in das Schema aufgenommen. (A) Eubacteria, (B) Archaea: Nur manche Archaea beinhalten DnaK/DnaJ und PFD. Die Interaktion zwischen Chaperonen und der naszenten Polypeptidkette ist bislang nicht experimentell erwiesen. (C) Eukarya: Im Gegensatz zu GroEL können Chaperonine der Gruppe II an der ko-translationalen Proteinfaltung beteiligt sein. Nach Hartl und Hayer-Hartl, 2002.

Bei einigen, weniger komplexen Proteinen läuft die Proteinfaltung nach Freisetzung der Polypeptidkette vom Ribosom spontan ab. Eine Vielzahl von Proteinen, insbesondere Proteine mit mehreren strukturellen Domänen, benötigt dagegen die Hilfe von Chaperonen während und nach der Translation (Hartl und Hayer-Hartl, 2002). Noch während der Synthese verlässt der N-terminale Bereich der naszenten Polypeptidkette den Polypeptid-Ausgangstunnel der großen ribosomalen Untereinheit. Zu diesem Zeitpunkt können bereits erste Wechselwirkungen der wachsenden Polypeptidkette mit Ribosomen-assoziierten Faktoren entstehen. Bei diesen Ribosomen-gebundenen Faktoren handelt es sich in Escherichia coli um TF (trigger factor), der direkt an das ribosomale Protein L23

bindet. Es wird angenommen, dass TF den ersten Kontakt mit hydrophoben Regionen der wachsenden Polypeptidkette außerhalb des ribosomalen Ausgangstunnels herstellt. TF zeigt keine ATPase Aktivität, besitzt aber eine Peptidyl-Prolyl-Isomerase Funktion. Allerdings stellt TF keine essentielle Komponente dar, und seine biologische Relevanz für die Proteinfaltung ist noch nicht vollständig geklärt (Bukau et al., 2000; Kramer et al., 2002). Ein strukturell homologes Protein zu TF ist für das eukaryotische Zytosol zwar nicht bekannt, jedoch interagiert in Saccharomyces cerevisiae und höheren Eukaryoten ein analoger Ribosomen-gebundener Komplex mit der wachsenden Polypeptidkette, NAC (nascent chain associated complex). Seine Funktion könnte vermutlich in der Bindung und damit dem Schutz hydrophober Bereiche der naszenten Polypeptidkette liegen. Des Weiteren wurde in S. cerevisiae ein zusätzlicher Ribosomen-assoziierter Komplex identifi-ziert, RAC (ribosome, associated complex), der aus dem Hsp70 Chaperon Ssz1p und dem Hsp40 Ko-Chaperon Zuotin besteht (Näheres hierzu siehe 1.2.1).

Daneben binden weitere Mitglieder der Hsp70-Familie an die noch nicht vollständig synthetisierte Polypeptidkette. Das bekannteste Hsp70 Protein ist das bakterielle DnaK (Teter et al., 1999). In S. cerevisiae interagiert Ssb1/2p (stress-seventy subfamily B) mit der naszenten Polypeptidkette (Craig et al., 2003). Hsp70 Chaperone verhindern hierdurch unkorrekte intramolekulare Interaktionen der wachsenden Polypeptidkette bzw. inter-molekulare Interaktionen mit anderen nicht-gefalteten Polypeptidketten (Blond-Elguindi et al., 1993; Rudiger et al., 1997). Für einige, meist kleinere Proteine reicht die Unterstützung von Hsp70 Chaperonen aus, um schrittweise zu ihrer nativen Konformation zu gelangen (Netzer und Hartl, 1998). Andere Proteine benötigen dagegen für ihre korrekte Faltung weitere Chaperone, die in unterschiedlichen Faltungswegen fungieren. In Eukaryoten werden einige Proteine z.B. an das Hsp90-System weitergeleitet, in welchem Hsp70 gemeinsam mit Hsp90 und einer Vielzahl von Kofaktoren die Faltung dieser Proteine begünstigt. Das Hsp90-System ist an der Faltung von diversen Proteinen, wie z.B. Trans-kriptionsfaktoren oder Kinasen, beteiligt. Strukturelle oder funktionelle Gemeinsamkeiten sind bei den bislang bekannten Substraten jedoch nicht erkennbar.

Andere Substrate werden während ihrer Faltung an die Familie der Chaperonine, die einen zylindrischen Aufbau mit einer zentralen Faltungshöhle besitzen, weitergeleitet, in deren Inneren der Faltungsprozess des Proteins gegenüber dem Zytosol abgeschirmt stattfindet (Young et al., 2004). Bakterielle Chaperonine wie GroEL benötigen einen Kofaktor, GroES, der eine Deckelfunktion für die Faltungshöhle einnimmt. Eukaryotische Chaperonine wie TRiC benötigen für ihre eigentliche Funktion keinen Kofaktor. TRiC kooperiert aber bei Faltung von Substraten eng mit anderen Chaperonen (GimC/Prefoldin bzw. Ssb1/2p, s. 1.3.1.1 .und 1.3.1.2.), die an die naszente Polypeptidkette binden.

1.2. Netzwerk der Chaperon-vermittelten Proteinfaltung im Zytosol

1.2.1. Hsp70-System

Mitglieder der Hsp70-Familie haben ein Molekulargewicht von ungefähr 70 kDa und kommen in Eubacteria, Eukarya und in manchen Archaea vor. Hsp70 Chaperone sind an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt, so z.B. an der Faltung neu-synthetisierter Proteine, der Rückfaltung denaturierter Proteine oder am Abbau fehlgefalteter Proteine (Zylicz und Wawrzynow, 2001). Hsp70-Proteine binden an exponierte hydrophobe Bereiche von denaturierten bzw. nicht-gefalteten Proteinen. Solange Hsp70-Chaperone an das partiell gefaltete Substrat gebunden sind, ist dessen weitere Faltung und damit eine eventuelle Aggregation blockiert. Die meisten Hsp70-Proteine kooperieren während ihres funktionellen Zyklus mit Partnerproteinen, zu denen Hsp40-Proteine und Nukleotid-Aus-tausch-Faktoren zählen.

DnaK aus E. coli ist das am besten untersuchte Hsp70-Protein. Während des Bin-dungszyklus wird DnaK einer starken strukturellen Konformationsänderung unterzogen, die durch Bindung und Freisetzung von Nukleotiden ausgelöst wird (Bukau und Horwich, 1998; Naylor und Hartl, 2001). Das Zusammenspiel mit dem Hsp40 Ko-Chaperon DnaJ und dem Nukleotid-Austauschfaktor GrpE kontrolliert den Bindungszyklus. Die Bindung eines nicht-nativen Proteins an DnaK wird durch DnaJ initiiert. DnaJ stimuliert die DnaK vermittelte ATP-Hydrolyse und führt somit zu einer stärkeren Interaktion zwischen DnaK und Substrat. GrpE katalysiert den Austausch von DnaK-gebundenem ADP mit ATP, worauf die Substrat-Interaktion vermindert wird und sich hierdurch die Möglichkeit einer korrekten Faltung des Substrats ergibt. Die Bindungszyklen können sich solange fortsetzen, bis z.B. das Substrat seine native Struktur erhalten hat (s. Abb. 1.2 für E. coli).

Abb. 1.2: Model des Reaktionszyklus von DnaK.

(1) Schnelle, transiente Assoziation von DnaJ (J) mit Substrat (S). (2) Substrattransfer zu DnaK, geringe Substrataffinität, hohe Assoziations- und Dissoziationsraten. (3) DnaJ stimuliert ATP-Hydrolyse und stabilisiert so die Substratbindung. (4) Assoziation von GrpE führt zur Nukleotid-Freisetzung. (5) ATP-Bindung an DnaK und Disassemblierung des Komplexes. Nach Hartl und Hayer-Hartl, 2002.

Eukaryotische Hsp70 Chaperone (z.B. Ssa1-4p in S. cerevisiae, Hsc70 in Säugetierzellen) unterliegen einem ähnlichen Bindungszyklus. Eukaryotische Hsp40 Homologe von DnaJ (z.B. Ydj1p oder Sis1p in S. cerevisiae, Hdj1 und Hdj2 in Säugetieren; Cyr et al., 1994) interagieren ebenso mit ungefalteten Substraten und stimulieren die ATP-Hydrolyse ihres Hsp70-Partners. Dagegen sind für das eukaryotische Zytosol keine GrpE-homologen Proteine bekannt. Allerdings wurden andere Proteine mit ähnlicher Funktion identifiziert, die aber keine strukturellen Gemeinsamkeiten zu GrpE aufweisen (z.B. Fes1p S . cerevisiae, BAG1 oder HspBP1 in Säugetieren; Kabani et al., 2002a; Kabani et al., 2002b; Höhfeld und Jentsch, 1997).

Im Zytosol und in einzelnen Kompartimenten von S. cerevisiae wurden zahlreiche Hsp70-Chaperone identifiziert, die sich in verschiedene Unterklassen einordnen lassen. Die Klasse der Ssa1-4p- und Ssb1/2p-Chaperone (stress-seventy subfamilies A und B) gelten bislang als die am besten untersuchten zytosolischen Hsp70-Unterklassen. Das Genom von S. cerevisiae beinhaltet 4 SSA- und 2 SSB-Gene, wobei die Genprodukte in-nerhalb einer Unterklasse eine Aminosäuresequenz-Übereinstimmung von mehr als 90% aufweisen. Ssa1-4p Chaperone spielen eine entscheidende Rolle in post-translationalen Prozessen, wie z.B. der Faltung und Membrantranslokalisation von Polypeptiden ins ER oder Mitochondrien (Mayer und Bukau, 2005). Einige Mitglieder dieser Gruppe unterliegen einer Hitzeschock-induzierbaren Genexpression. Im Gegensatz zur Ssa-Unterklasse ist die Gruppe der Ssb-Chaperone nicht essentiell. Ssb1p und Ssb2p sind Ribosomen-assoziiert und interagieren direkt mit naszenten Polypeptidketten. Ssb1/2p scheint einer besonderen Regulation zu unterliegen, da der vermeintliche Hsp40-Partner, Zuo1p, mit einem weiteren Hsp70 Chaperon, Ssz1p, in dem RAC Komplex vorliegt (Craig et al., 2003). Inwieweit die drei Komponenten einen funktionenellen Komplex bilden und RAC die Interaktion von Ssb1/2p mit der naszenten Polypeptidkette begünstigt, ist bislang jedoch nicht geklärt.

1.2.2. Chaperonine

Bei den Chaperoninen handelt es sich um eine essentielle, hoch konservierte Proteinfamilie (Fayet et al., 1989), die in allen drei Reichen (Eubacteria, Archaea und Eukarya) vorkommt. Die multimeren, zylindrischen Komplexe mit einem Molekulargewicht von ca. 950 kDa sind aus zwei übereinander gelagerten Ringstrukturen aufgebaut. Jeder der beiden Ringe umschließt eine zentrale Höhle. Chaperonine zeichnen sich durch ihren einzigartigen Faltungsmechanismus aus, bei dem Substrate im Inneren der Faltungshöhle abgeschirmt von störenden Einflüssen einen Faltungszyklus durchlaufen (Martin et al., 1993; Mayhew et al., 1996; Leroux und Hartl, 2000).

Die Klasse der Chaperonine lässt sich in zwei Untergruppen teilen, die zwar struk-turell verwandt sind, aber partiell starke Sequenzunterschiede aufweisen. Zur Gruppe I ge-hören Chaperonine der Eubacteria (GroEL in E. coli) und der eukaryotischen Organellen

1.2. Netzwerk der Chaperon-vermittelten Proteinfaltung im Zytosol

(Cpn60 in Chloroplasten, Hsp60 oder Cpn60 in Mitochondrien). Mitglieder dieser Gruppe kooperieren mit einem Kofaktor der Hsp10-Familie (GroES in E. coli, Hsp10 oder Cpn10 in Mitochondrien und Chloroplasten). Durch die Bindung des Kofaktors an das Chaperonin ist das Substrat komplett in der Faltungshöhle eingeschlossen. Die Gruppe II umfasst Chaperonine der Archaea (Thermosom in Thermoplasma acidophilium) und des eukaryo-tischen Zytosols (TRiC, auch bekannt als CCT; siehe unten). Diese Chaperonine benö-tigen anders als Mitglieder der Gruppe I keinen Kofaktor, kooperieren aber mit anderen Chaperonen wie GimC/Prefoldin und Hsp70 (Näheres siehe 1.3.1.1. und 1.3.1.2.).

GroEL aus E. coli gilt als das am besten untersuchte Chaperonin. Bei diesem prokaryotischen Chaperonin handelt es sich um einen homo-oligomeren Komplex, in dem die beiden Ringe von je 7 Untereinheiten gebildet werden. Die monomeren, ca. 60 kDa großen Untereinheiten sind aus 3 Domänen aufgebaut. Bezogen auf ihre Position in der Doppel-Ringstruktur werden sie als äquatoriale, intermediäre oder apikale Domäne bezeichnet (Abb. 1.3).

Abb. 1.3: Allgemeine Struktur der Chaperonine. (A) Seitenansicht des asymmetrischen

GroEL-GroES-(ADP)7 Komplexes (Xu et al., 1997). Rot: äquatoriale Domäne, Grün: intermediäre Domäne, Gelb: apikale

Domäne. (B) Seitenansicht der hexadekameren Thermosom-Struktur. (C) Thermosom-Untereinheit mit den 3 Domänen. Abbildung aus Ditzel et al., 1998.

Die Substratbindung erfolgt über die hydrophoben Bereiche der apikalen Domänen. In einem phasenverschobenen Prozess kann Substrat immer nur von einem Ring aufgenommen werden (Fenton et al., 1994; Hartl, 1996). Der Faltungszyklus beginnt mit der Substratanlagerung an die apikale Domäne des offenen Rings (trans-Ring; Abb. 1.4, siehe folgende Seite). Bindung von ATP an die äquatorialen Domänen seiner Untereinheiten führt zu drastischen Konformationsänderungen innerhalb des Rings, die eine Vergrößerung des Volumens der Faltungskammer und ein Verschieben der Substratbindestellen zur Folge haben (cis-Ring). Dies erlaubt einerseits die Anlagerung des Kofaktors GroES an die apikalen Domänen sowie den Transfer des Substrats ins Innere der hydrophilen Faltungskammer (Braig et al., 1994; Roseman et al., 1996; Xu et al, 1997; Bukau und Horwich, 1998). Durch die Anlagerung von GroES werden Substrate mit einem Molekulargewicht von bis zu 60 kDa vollständig in der Faltungskammer

eingeschlossen (Ellis, 2001; Mayhew und Hartl, 1996; Brinker et al., 2001). Dieser so genannte „Anfinsen-Käfig“ begünstigt den Prozess der Substratfaltung in einer abgeschirmten Umgebung unbeeinflusst von Aggregation-auslösenden Faktoren (Anfinsen, 1973; Ellis, 1996). Allerdings konnte bislang noch nicht geklärt werden, ob GroEL nur durch das alleinige Bereitstellen eines Faltungskompartiments passiv die Substratfaltung begünstigt. Ein anderes Model favorisiert die Hypothese, dass Konforma-tionsänderungen innerhalb des Chaperonins partiell die Entfaltung des Substrats verur-sachen oder aber dessen Bindung an die apikalen Chaperonin-Bereiche beeinflussen, so dass es zu einer Neurorientierung des Substrats kommt (Todd et al., 1996; Fenton und Horwich, 1997). Im Anschluss an die ATP-Hydrolyse dissoziiert GroES zusammen mit dem Substrat. Liegt das Protein zu diesem Zeitpunkt noch nicht in seiner nativen Form vor, kann nach wiederholter Bindung ein erneuter Faltungszyklus eingeleitet werden.

Abb. 1.4: Schematisiertes Model des GroEL/GroES Reaktionszyklus.

Ungefaltete Substrate binden an die apikalen Domänen von GroEL (trans-Ring). Bindung von ATP und GroES führt zu einer konformationellen Änderung des Substrat-bindenden Ringes (cis-Ring). Das ungefaltete Substrat geht in der Faltungskammer in seinen nativen Zustand (N) oder einen intermediären Faltungszustand über. Gleichzeitig erfolgt Hydrolyse von ATP zu ADP. An den gegenüberliegenden, trans-Ring bindet ATP. ADP löst sich vom cis-trans-Ring, GroES dissoziiert und Substrat entweicht. Faltungsintermediate können einen erneuten Zyklus durchlaufen. Nach Hartl und Hayer-Hartl, 2002.

Unter normalen Bedingungen interagieren ungefähr 10-15% aller zytoplasmatischen Proteine mit GroEL (Ewalt et al., 1997). Studien ergaben, dass ein hoher Anteil von GroEL-Substraten sich oftmals durch βα-barrel Sekundärstrukturen auszeichnet, in denen hydrophobe β−Faltblätter von α−Helices Tonnen- oder Sandwich-förmig umgeben sind (Houry et al., 1999; Kerner et al., 2005). Die Notwendigkeit der Chaperonin-vermittelten Faltung wird durch die Tatsache unterstrichen, dass die Deletion von GroEL für die Zelle letal ist (Horwich et al., 1997).

1.3. Das eukaryotische Chaperonin TRiC

1.3. Das eukaryotische Chaperonin TRiC

Bei den Chaperoninen der Gruppe II handelt es sich um hetero-oligomere Komplexe. Sie bilden ebenfalls Zylinder aus zwei Ringen, jedoch bestehen die Ringe aus 8 oder 9 Unter-einheiten. Chaperonine der Archaea beinhalten zwei oder drei verschiedene Untereinhei-ten, die eine 8- oder 9-fach symmetrische Anordnung im Ring erfahren. TRiC (TCP-1 ring complex; TCP-1: tailless complex polypeptide 1 ), auch bekannt als CCT (chaperonin con-taining TCP-1), ist das Chaperonin des eukaryotischen Zytosols und besteht aus 8 ver-schiedenen Untereinheiten (Tcp1-8p; jeweils 50-60 kDa) pro Ring (Kubota et al., 1995). Die 8 zueinander homologen TRiC-Untereinheiten besitzen eine ca. 30%ige Übereinstim-mung bezüglich ihrer Aminosäuresequenz. Während in allen untersuchten Organismen und Geweben jede der 8 verschiedenen TRiC-Untereinheiten von einem individuellen Gen kodiert wird, wurde im Hodengewebe von Säugetieren neben den 8 TCP/CCT-Genen ein zusätzliches Gen (CCTζ2) identifiziert. Das CCTζ2-Gen ist stark homolog zum CCTζ-Gen, welches in S. cerevisiae TCP/CCT6 entspricht (Kubota et al., 1995).

Die Lösung der Kristallstruktur des zu TRiC homologen Thermosom-Komplexes aus T. acidophilum ergab, dass die Domänen der einzelnen Untereinheiten eine ähnliche strukturelle Anordnung einnehmen wie in GroEL. Höhe und Durchmesser des Komplexes betragen 158 Å bzw. 164 Å (GroEL: 184 Å Höhe und 140 Å Durchmesser; Ditzel et al., 1998). Die Aminosäuresequenzen der äquatorialen und intermediären Domänen sind in den Chaperoninen der Eubacteria, Archaea und Eukarya stark konserviert. Sequenzab-weichungen finden sich dagegen vor allem im Bereich der apikalen Domäne, der die Substratinteraktion zugeschrieben wird. Bezeichnenderweise besitzen die Chaperonine der Gruppe II im apikalen Bereich α−helikale Fortsätze (Abb. 1.5).

Abb. 1.5: Helikales Segment der apikalen Domäne der α-Untereinheit des Thermosom. Links oben ist

eine Übereinanderlagerung mit einer GroEL-Untereinheit (grün) gezeigt, die das Ausmaß der α-helikalen Extension (gelb) verdeutlicht. Aus Klumpp et al., 1997.

Das Schließen der Faltungskammer wird hier durch Rotation der apikalen Domänen im Uhrzeigersinn erreicht. Dabei bilden die α−helikalen Fortsätze gemeinsam, ähnlich einer Irisblende, das Deckelsegment der Faltungskammer (Klumpp et al., 1997; Ditzel et al., 1998; Meyer et al., 2003).

Basierend auf der Kristallstruktur des Thermosoms wird angenommen, dass Substrate bei allen Gruppe II Chaperoninen ähnlich wie bei GroEL in der Faltungskammer eingeschlossen werden und dort ihre native Konformation in Abhängigkeit von ATP-Hydrolyse erlangen. Analog zu GroEL ist in Abwesenheit von ATP die Faltungskammer des Thermosoms offen (Ditzel et al., 1998). Allerdings zeigte eine jüngste Studie mit TRiC, dass ATP-Bindung allein nicht zum Schließen der Faltungshöhle ausreicht; dieses wird erst durch ein Zwischenstadium während der ATP-Hydrolyse ausgelöst (Meyer et al., 2003). Dissoziation des abgespaltenen gamma-Phosphats von ATP führt wieder zum Öffnen der Faltungshöhle und ermöglicht die Freisetzung des gefalteten Substrats (Spiess et al., 2004). Bislang ist aber noch nicht genau geklärt, wie die Faltung des Substrats durch ATP-Hydrolyse stimuliert wird. Obwohl kein weiterer Faktor wie GroES in den Faltungszyklus eingreift, scheint TRiC nicht als symmetrischer Komplex zu operieren. Jüngste Daten sprechen dafür, dass beide TRiC-Ringe ähnlich wie bei GroEL negativ kooperieren und somit in unterschiedlichen Stadien (trans bzw. cis) der Nukleotidbindung vorliegen (Kafri et al., 2001; Meyer et al., 2003).

Welche Abschnitte im apikalen Bereich für die Substratbindung erforderlich sind, ist bislang noch nicht geklärt. Die unmittelbaren helikalen Extensionen scheinen hierfür nicht unbedingt erforderlich zu sein, da zumindest Deletionen dieser Bereiche beim Gruppe II Chaperonin des Archaeums Thermococcus sp. KS-1 die Substratbindung nicht beein-trächtigen (Iizuka et al., 2004). Alternativ könnten zwei zu GroEL homologe, distal gele-gene Bereiche der apikalen Domäne mit α−helikaler Struktur die Substratbindung vermitteln. Schließlich werden als Substratbindungsstellen auch geladene und polare Ami-nosäuren diskutiert, die an der Innenseite im apikalen Bereich der Faltungshöhle lokalisiert und in orthologen Untereinheiten konserviert sind (Pappenberger et al., 2002). Die einzel-nen Hypothesen schließen sich jedoch nicht gegenseitig aus. Angesichts der beachtlichen Sequenzunterschiede in den apikalen Domänen von Gruppe II Chaperoninen könnten die individuellen Untereinheiten durchaus unterschiedliche Bindungsmotive zur Verfügung stellen, die bei der Substrat-Bindung miteinander kooperieren (Spiess et al., 2004). Die Di-versität der potentiellen Bindungsmotive könnte aber auch dazu dienen, verschiedene Substrate mittels unterschiedlicher Untereinheiten spezifisch zu erkennen (Llorca et al., 2000).

Die Abwesenheit eines GroES-ähnlichen Kofaktors lässt die Möglichkeit zu, dass Substrate nicht vollständig in die Faltungskammer gelangen müssen und stattdessen die Faltung von größeren Proteinen auf bestimmte Proteindomänen beschränkt ist (Frydman et al., 1994; Ditzel et al., 1998; Llorca et al., 2001). Diese Annahme ist in

Übereinstim-1.3. Das eukaryotische Chaperonin TRiC

mung mit dem Befund, dass verschiedene Proteine, deren Molekulargewicht die Größe von 100 kDa und damit die hypothetische Kapazität der Faltungshöhle überschreitet, mit TRiC assoziiert vorgefunden wurden (Thulasiraman et al., 1999). Diese Hypothese würde auch der Beobachtung Rechnung tragen, dass TRiC im Gegensatz zu GroEL nicht nur post-translational, sondern auch ko-translational mit neu-synthetisierten Polypeptidketten interagiert (Ewalt et al., 1997; Roobol und Carden, 1999; McCallum et al., 2000).

1.3.1. Substrate von TRiC

Konditionale Mutanten der TRiC-Untereinheit TCP1/CCT1 aus S. cerevisiae weisen schwere Zellteilungsdefekte auf (z.B. bezüglich der Knospung und Karyokinese) und sind hypersensitiv gegenüber anti-mitotischen Wirkstoffen wie Benomyl, welches die Mikro-tubuli-Polymerisation inhibiert. Zusätzlich zeigen solche Mutanten genetische Interaktionen mit konditionalen Mutanten von Aktin- und Tubulin-kodierenden Genen (Ursic und Culbert-son, 1991; Ursic et al., 1994). Ähnliche Befunde wurden für Mutanten anderer TRiC-Unter-einheiten kodierender Gene festgestellt (Chen et al., 1994; Vinh und Drubin, 1994). Diese genetischen Daten legten nahe, dass TRiC eine Rolle in der de novo Synthese von Aktin und Tubulinen spielt. Biochemische Daten belegten schließlich, dass der Chaperonin-Komplex die Faltung von Aktin und Tubulinen vermittelt (Gao et al., 1992; Frydman et al., 1992; Lewis et al., 1992; Yaffe et al., 1992).

Lange Zeit galt TRiC als ein spezialisiertes Chaperonin für Aktin und Tubulin (Lewis et al., 1996; Stoldt et al., 1996). Die Identifizierung anderer, weniger abundanter Substrat-proteine war durch die essentielle Bedeutung von TRiC für die Faltung von Aktin und Tubulinen besonders erschwert. Berechnungen zufolge beanspruchen diese Zytoskelett-proteine ca. 50-60% der gesamten Kapazität von TRiC (Siegers et al., 2003). Anhand von Pulse Chase Experimenten mit Säugetierzellen konnte aber gezeigt werden, dass TRiC auch mit zahlreichen anderen Proteinen transient interagiert. Dabei wurde für ca. 12% aller neu-synthetisierten Proteine mit einem Molekulargewicht von 30-120 kDa eine Assoziation mit TRiC gezeigt (Thulasiraman et al., 1999).

Zu dem erweiterten Substratspektrum von TRiC gehören beispielsweise das bei der retinalen Phototransduktion involvierte Gα-Transduzin (Farr et al., 1997), der Zellzyklus-abhängige Kinaseaktivator Zyklin E (Won et al., 1998), das virale Protein EBNA 1 (Kashuba et al., 1999), das Motorprotein Myosin (Srikakulam et al., 1999) oder das Tumorsuppressor-Protein VHL (Feldman et al., 1999). Kürzlich konnten anhand von groß angelegten Proteom-Studien in Kombination mit Massenspektrometrie weitere TRiC-as-soziierte Proteine identifiziert werden (Ho et al., 2002; Gavin et al., 2002). Interessanter-weise zeichnen sich viele dieser Proteine durch so gennante WD-repeat Motive aus. Bio-chemische und genetische Analysen belegten für einige dieser Proteine, dass es sich hierbei tatsächlich um Faltungssubstrate von TRiC handelt (Siegers et al., 2003; Camas-ses et al., 2003; s. Kapitel 1.3.1.2.). Damit war es zum ersten Mal möglich TRiC-Substrate

einer strukturellen Klasse zuzuordnen. Bei WD-repeat Motiven handelt es sich um schwach-konservierte, sich wiederholende Sequenzen von 40-60 Aminosäuren, die mit den Aminosäureresten Tryptophan-Aspartat (WD) enden. Mehrere dieser Sequenz-Wie-derholungen bilden eine stark konservierte, zirkuläre Struktur, die auch als β-Propeller be-zeichnet wird. Jedes einzelne Propeller-Blatt wird dabei von kurzen, antiparallelen β-Falt-blattstrukturen gebildet. WD-repeat Motive werden in Proteinen mit unterschiedlichen zellulären Funktionen gefunden (s. auch Kapitel 1.3.1.2.).

Abb. 1.6: β-Propeller Struktur der β-Untereinheit des G-Proteins Transducin. Die β-Untereinheit von

Transducin enthält sieben WD-repeat Motive (grün), die jeweils in antiparallelen Faltblattstrukturen angeord-net sind und zusammen die Propellerstruktur ausbilden. Nach Sondek et al., 1996.

Interessanterweise zeichnen sich auch viele andere TRiC-Substrate durch einen hohen Gehalt an β-Faltblattstrukturen aus. Da die Faltung dieser Sekundärstruktur im Vergleich zur α-Helix-Ausbildung mehr Zeit in Anspruch nimmt, wird vermutet, dass dieses Strukturmotiv bei der Substratspezifität von TRiC eine Rolle spielen könnte (Spiess und Frydman, 2003).

1.3.1.1. GimC und die Faltung von Aktin und Tubulinen

Für die effiziente Faltung von Aktin und Tubulinen konnte gezeigt werden, dass TRiC auf eine funktionelle Kooperation mit dem Ko-Chaperon GimC/Prefoldin angewiesen ist. Der hetero-oligomere Komplex aus S. cerevisiae wird als GimC (Geissler et al., 1998; Siegers et al., 1999) und dessen Homologe in Archaea und höheren Eukaryoten als Prefoldin be-zeichnet (Vainberg et al., 1998). GimC/Prefoldin wird aus 6 konservierten Untereinheiten gebildet. Während der eukaryotische Komplex von 6 verschiedenen Genen (GIM1-6 bzw. PFD1-6) kodiert wird, besteht der Komplex der Archaea aus nur zwei verschiedenen Untereinheiten (α und β). Sequenzvergleiche ordnen die GimC-Untereinheiten Gim2p und

1.3. Das eukaryotische Chaperonin TRiC

Gim5p den α-Untereinheiten des Komplexes aus Archaea zu, während Gim1p, Gim3p, Gim4p und Gim6p den β-Untereinheiten entsprechen.

Die Kristallstruktur von Prefoldin aus Archaea (Methanobacterium thermoautotro-phicum) zeigt, dass die zentralen Bereiche der einzelnen Untereinheiten zusammen eine Plattform bilden, von der sich die N- und C-terminalen Enden tentakelförmig fortsetzen (Siegert et al., 2000). Die N- und C-terminalen Regionen der 6 Untereinheiten zeichnen sich durch ihre α-helikalen Strukturen aus, die als „spiralisierte Spiralen“ (coiled coils) die Tentakel bilden. Die Enden dieser Tentakel sind reich an hydrophoben Aminosäuren und werden für die Substratinteraktion verantwortlich gemacht (Abb. 1.7; Siegert et al., 2000).

Abb. 1.7: Kristallstruktur von Prefoldin aus M. thermoautotrophicum. Seitenansicht von Prefoldin. Zwei

zentrale α-Untereinheiten (orange) und 4 β-Untereinheiten (blau). Aus Siegert et al., 2000.

In S. cerevisiae wurde GimC im Rahmen genetischer Studien identifiziert. Deletionen von GIM-Genen sind synthetisch letal mit einer konditionalen Mutante von γ-Tubulin und wie-sen auf eine Funktion des Gim-Komplexes (genes involved in microtubule biogenesis complex) in der Mikrotubuli-Biogenese hin. Darüber hinaus sind gim-Deletionsmutanten hypersensitiv gegenüber Latrunculin-A, welches die Depolymerisation von Aktin-Filamen-ten bewirkt (Geissler et al., 1998). Die Tatsache, dass MutanAktin-Filamen-ten von GimC phänotypisch denen von TRiC ähneln, legte eine Funktion des Gim-Komplexes in der TRiC-vermittelten Faltung nahe. Funktionelle Studien in vitro und in vivo konnten schließlich belegen, dass GimC/Prefoldin und TRiC während der Faltung von Aktin und Tubulinen eng kooperieren (Vainberg et al., 1998; Siegers et al., 1999). Insbesondere zeigen gim-Deletionsmutanten eine niedrigere, TRiC-vermittelte Aktinfaltungsrate, die einhergeht mit einer erhöhten Menge missgefalteten Aktins (Siegers et al., 1999). GimC selber zeigt keine ATPase-Aktivität. Die funktionelle Kooperation von TRiC mit GimC ist aber nicht mit dem

Zusam-menspiel von GroEL/GroES vergleichbar. Im Gegensatz zu GroES bindet GimC ko- und post-translational ungefaltete Substrate wie Aktin und Tubuline. Demnach nimmt GimC im Vergleich zu GroES eine aktivere Rolle in der Chaperon-vermittelten Proteinfaltung ein. Allerdings ist GimC nur unter bestimmten Bedingungen für das Wachstum von Zellen essentiell; so sind gim-Deletionsmutanten kältesensitiv und mit konditionalen Mutanten von TRiC synthetisch letal. Dagegen ist TRiC unter allen Bedingungen lebensnotwendig.

Während TRiC und GimC für das Erlangen der nativen Konformation von Aktin ausreichen, benötigen alpha- und beta-Tubulin für ihre Dimerisierung zusätzliche Kofak-toren. Viele dieser Faktoren konnten bereits identifiziert werden, wenn auch ihre genaue molekulare Funktion teilweise noch ungeklärt ist. In Säugetieren bindet im Anschluss an die TRiC/Prefoldin(GimC)-vermittelte Faltung der Tubulin-Kofaktor B an alpha-Tubulin und der Kofaktor A an beta-Tubulin. Während des Dimersierungsprozesses werden diese Kofaktoren von Kofaktor E bzw. D ersetzt. Schließlich formiert sich ein so genannter „Super-Komplex“, der sich aus alpha- und beta-Tubulin, Kofaktor E, D und dem weiteren Kofaktor C zusammensetzt. Die Freisetzung des alpha-/beta-Tubulin Heterodimers wird unter GTP-Hydrolyse katalysiert (Fontalba et al., 1993; Gao et al., 1993; Tian et al., 1996).

Abb. 1.8: Schematisiertes Model für die Faltung von Aktin und Tubulinen in Säugetieren. (1) Aktin

erreicht allein durch TRiC/Prefoldin(GimC)-vermittelte Faltung seine native Struktur. Alpha- und beta-Tubulin benötigen zusätzliche Unterstützung von Kofaktoren. (2) Kofaktor B (S cerevisiae: Alf1p) bindet an alpha-Tubulin, Kofaktor A (S cerevisiae: Rbl2p) bindet an beta-Tubulin. (3+4) Im Folgenden bindet Kofaktor E (S cerevisiae: Pac2p) alpha-Tubulin und Kofaktor D (S cerevisiae: Cin1p) beta-Tubulin. Zusammen mit Kofaktor C (S cerevisiae: Cin2p) bildet sich ein „Super-Komplex“. (5) Nach GTP-Hydrolyse dissoziieren alpha- und beta-Tubulin als Heterodimer von den Kofaktoren. Nach Tian et al., 1996 und 1997.

Für S. cerevisiae wurden homologe Proteine für die einzelnen Kofaktoren aus Säugetieren identifiziert, die auch an alpha- bzw. beta-Tubulin binden (Rbl2p, Alf1p, Cin2p Cin1p und Pac2p für Kofaktor A, B, C, D bzw. E; Lopez-Fanarraga et al., 2001). Allerdings ist bislang nicht vollständig geklärt, welche genaue Rolle Kofaktoren bei der Dimerisierung der Tubuline spielen, da sie in S. cerevisiae im Gegensatz zu in vitro Experimenten in vivo nicht essentiell sind. Zusätzlich könnten aber auch weitere, redundante Proteine an der Dimerisierungsreaktion beteiligt sein, die bislang noch nicht identifiziert worden sind.

1.3. Das eukaryotische Chaperonin TRiC

1.3.1.2. Ssb und die Faltung von Proteinen mit WD-repeat Motiv

Kürzlich wurde für einige Protein mit WD-repeat Motiv, wie z.B. Cdc20p, Cdc55p oder Pex7p, gezeigt, dass ihre Faltung durch TRiC vermittelt wird (Siegers et al., 2003; Camasses et al., 2003). In S. cerevisiae wurden über 90 Proteine mit WD-repeats identifiziert, was mehr als 1% des Hefegenoms entspricht (Valpuesta et al., 2002). Die meisten dieser Proteine sind Bestandteile hetero-oligomerer Protein-Komplexe, und die komplexen Faltungsanforderungen dieser Proteine könnten demnach die Notwendigkeit von TRiC begründen. TRiC kooperiert bei der Faltung von WD-repeat Proteinen nicht mit GimC sondern mit Chaperonen der Hsp70 Ssb1/2p-Unterklasse. Dabei scheint Ssb1/2p ko- und post-translational mit der Polypeptidkette zu interagieren, bis die Faltung durch die Beteiligung von TRiC abgeschlossen wird (Siegers et al., 2003). Interessanterweise kann GimC die Funktion von Ssb1/2p in einem ssb1/ssb2 Deletionsstamm partiell kompensieren. Umgekehrt kann Ssb1/2p aber nicht die Rolle von GimC für die Faltung von Zytoskelettproteine übernehmen. Eine kombinierte Deletion der GIM1-6- und SSB1/2-Gene ist jedoch für die Zelle letal und deutet daraufhin, dass in vivo für eine effiziente Faltung TRiC allein nicht ausreichend ist (Siegers et al., 2003).

Proteine mit WD-repeats existieren nicht im Reich der Eubacteria und Archaea (Smith et al., 1999). Das Auftreten von WD-repeat Proteinen und die Entwicklung eines komplexen Zytoskelettsystems in Eukaryoten korreliert mit der Heterogenität von TRiC und lässt die Vermutung zu, dass die Diversität der einzelnen 8 Untereinheiten der Komplexität und Spezifität der verschiedenen Substrate von TRiC Rechnung trägt. So kann GroEL zwar ungefaltete TRiC-Substrate binden, dennoch ist es nicht in der Lage, deren Faltung zu bewirken (Tian et al., 1995). Ferner wurde aufgrund elek-tronenmikroskopischer Aufnahmen von TRiC in Assoziation mit nicht-nativem Aktin bzw. Tubulin die Hypothese aufgestellt, dass bestimmte Untereinheiten präferenziell bestimmte Substratproteine binden (Llorca et al., 1999; Llorca et al., 2000; Martín-Benito et al., 2002; Simons et al., 2004). Inwieweit die einzelnen Chaperon-Untereinheiten eine unterschied-liche Rolle bei der Faltung verschiedener Substrate spielen, ist bislang jedoch noch weitgehend unverstanden.

Abb. 1.9: Chaperon-vermittelte Faltung von Proteinen mit WD-repeats sowie Aktin und Tubulinen in

S. cerevisiae. (A) Faltung von Proteinen mit WD-repeats. RAC rekrutiert vermutlich Ssb zum Ribosom (Craig et al., 2001). Ssb kooperiert mit TRiC während der Faltung von Proteinen mit WD-repeats. Inwieweit TRiC auch ko-tranlational an die Polypeptidkette bindet, ist noch nicht eindeutig geklärt. (B) Faltung von Aktin und Tubulinen durch GimC und TRiC (ko- und post-translationale Chaperon-vermittelte Faltung). GimC unterstützt TRiC in der Faltung von Proteinen mit WD-repeats in Abwesenheit von Ssb. Nach Siegers et al., 2003.

1.3.3. Krankheiten assoziiert mit Proteinmissfaltungen von TRiC-Substraten Zahlreiche humane Krankheiten werden mittlerweile als eine direkte oder indirekte Konsequenz unerwünschter Faltungsreaktionen betrachtet, wie sie unter anderem bei neurodegenerativen Krankheiten auftreten. Verschiedene zytosolische Chaperone wurden in Proteinaggregaten vorgefunden (DebBurman et al., 1997; Cummings et al., 1998), die als Auslöser einiger dieser Erkrankungen diskutiert werden. Im Fall der Alzheimer Erkran-kung wurde über Aggregationen von Zytoskelettproteinen berichtet, und für Patienten konnte post mortem eine erniedrigte zelluläre Menge der zeta-Untereinheit von TRiC (Tcp6p) festgestellt werden (Schuller et al., 2001). Daneben wird auch eine beeinträchtigte Funktion von TRiC bei vererbbaren sensorischen Neuropathien (hereditary sensory neuropathies, HSN) vermutet, da in einem Tiermodell die Krankheit u.a. durch eine Punktmutation in TCP4/CCT4 ausgelöst wird (Lee et al., 2003).

Auch Tumor-Erkrankungen lassen sich in einen Zusammenhang mit Defekten in der Proteinfaltung bringen. Bei dem TRiC Substrat VHL (von Hippel-Lindau) handelt es

1.4. Ziel der Arbeit

sich um ein Tumorsupressor Protein (Feldman et al., 1999; Melville et al., 2003). Mutatio-nen im VHL Gen (loss-of-function mutations) führen zu Tumoren im Nierengewebe, der Nebennierenrinde und zentralen Nervensystem. Einige dieser Mutationen beeinträchtigen direkt die Faltung und Assemblierung von VHL in einen funktionellen Multiproteinkomplex. Bezeichnender Weise werden diese Abschnitte im VHL Protein, die von Tumor-aus-lösenden Mutationen betroffen sind, auch für die Assoziation von VHL mit TRiC benötigt (Feldman et al., 2003). Folglich kann der Ausfall der TRiC-vermittelten Faltung bzw. Komplexassemblierung von VHL direkt zu Tumorentstehungen führen.

1.4. Ziel der Arbeit

Zwei wesentliche Aspekte wurden innerhalb dieser Arbeit verfolgt: Die Entwicklung eines Reinigungsprotokoll für TRiC aus S. cerevisiae sowie die funktionelle Analyse des gerei-nigten Chaperonin-Komplexes in einem isolierten System mittels in vitro Faltungsstudien mit bekannten Substraten (Aktin, Tubuline). Darüber hinaus wurden die hier entwickelten in vitro Faltungsexperimente auch zur Substratvalidierung bislang weniger gut charakteri-sierter Substrate der WD-repepat Proteinklasse herangezogen.

Bislang wurde TRiC entweder aus Säugetierzellen oder Geweben, in dem das Chaperonin in großen Mengen vorkommt (z.B. Rinderhoden), gereinigt. Diese Systeme erlauben jedoch kaum den Einsatz genetischer Methoden wie z.B. die Verwendung von TRiC-Mutanten, mit deren Hilfe sich gezielt einzelne Bereiche des Chaperonins untersuchen lassen. Dagegen zeichnet sich Hefe als detailliert charakterisierter und vor allem leicht genetisch manipulierbarer Modellorganismsus aus. Im Vergleich zu Rinderhoden kommt TRiC allerdings in Hefe in geringeren zellulären Mengen vor, was die Entwicklung einer äußerst effizienten Reinigungsstrategie notwendig machte.

Um den Komplex mittels funktioneller Studien in vitro untersuchen zu können, wurde ein prokaryotisches in vitro Transkriptions-/Translations-System gewählt, in dem keine eukaryotischen Chaperone vorkommen. Ziel war es, Substrate von TRiC mittels dieses in vitro Systems zu synthetisieren und deren de novo Faltung in Gegenwart von gereinigtem TRiC sowie anderer, gereinigter eukaryotischer Chaperone (GimC, Ssb1p) zu untersuchen. Hierfür war es zusätzlich erforderlich, geeignete Methoden zur Faltungs-analyse der verschiedenen Substrate von TRiC zu entwickeln.

Schließlich wurde die TRiC-vermittelte Faltung von beta-Tubulin auch in vivo analysiert. In Anlehnung an Experimente mit Aktin wurde hierzu eine Methode enwickelt, mit deren Hilfe sich die Faltungskinetik von beta-Tubulin bestimmen lässt.

2.1. Materialien

2.1.1. Verbrauchsmaterialien (Chemikalien, Enzyme)

Chemikalien werden mit dem Reinheitsgrad p.a. (pro analysis grade) von Fluka (Deisenhofen, BRD), Merck (Darmstadt, BRD), Roche (Basel, Schweiz) und Sigma-Aldrich (Steinheim, BRD) bezogen. Bei allen anderen Reagenzien wird die Bezugsfirma direkt bei der angewendeten Methode angegeben. Restriktionsenzyme werden von New England Biolabs (Frankfurt am Main, BRD) oder Roche bezogen. Radiochemikalien stammen von Amersham Bioscience (Freiburg, BRD). Komponenten für die Herstellung von Kulturmedien stammen von Difco (Heidelberg, BRD).

2.1.2. Geräte

Amersham Bioscience (Freiburg, BRD) FPLC-System, SMART-System, Säulen

Avestin (Ottawa, Kanada) High Pressure Homogenizer

Beckman (München, BRD) Zentrifugen: Avanti J-20, J6 MI, LE-80K

UV-VIS Spektralphotometer DU640

Bender & Hobein (Zürich, Schweiz) Vortex

Biometra (Göttingen, BRD) PCR-Apparatur

BioRad (Hercules, USA) Gelelektrophorese System für DNA und Proteingele

Bioengineering (Wald, Schweiz) 200 l Fermenter

Biospec (Bartlesville, USA) Bead Beater

Eppendorf (Hamburg, BRD) Tisch-Zentrifugen, Thermomixer

Fuji (Stamford, USA) Phosphorimager Fuji Film FLA2000; LAS-3000 Luminescent

Image Analyser

Heraeus (Hanau, BRD) Incubator (Inkubator)

Lauda (Königshofen, BRD) Wasserbad

Life Science (Freiburg, BRD) Geltrockner SGD2000

Kodak (Stuttgart, BRD) Filmentwickler X-Omat

Max-Planck-Institut, Zentralwerkstatt (München, BRD)

Säulen

Mettler-Waagen (Gießen, BRD) Elektronischen Feinwaage AE160, Laborwaage Toledo

Misonix Inc. (New York, USA) Sonicator Ultrasonic Processor XL (Sonifizierer)

New Brunswick Scientific (Nörttingen, BRD) Innova 4430 Incubator Shaker (Schüttler)

Padenberg (Lahr/Baden, BRD) Durchflusszentrifuge

Rainin (Woburn, USA) Gilson Pipetten

Savant (Holbrook, USA) Geltrockner SGD300

Thermoquest (Egelsbach, BRD) Forma Science, Orbital Shaker (Schüttler)

2.1.3. Lösungen und Puffer

Allgemeine Puffer:

1 x PBS 1,5 mM KH2PO4, 8,1 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,7

50 x TAE 2 M Tris, 64 mM EDTA, pH 7,7 mit Eisessig eingestellt

10 x TBS 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, pH 7,6 mit HCl eingestellt

Probenpuffer für Proteingele:

Laemmli-Probenpuffer 62,5 mM Tris/HCl pH6,8, 2% (v/v) SDS, 10% (w/v) Glyzerin, 0,0025% (w/v) Bromphenolblau, 5% (v/v) β-Mercaptoethanol