2.1. Materialien
2.1.4. Kultivierungsmedien 1. Escherichia coli
TY-Medium 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l NaCl
TY-Platten 20 g/l Bacto-Agar, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l NaCl
Gegebenenfalls wird nach dem Autoklavieren ein Antibiotikum als Selektionsmittel zum Medium gegeben (Ampizillin, 100 µg/ml; Kanamyzin, 50 µg/ml; Chloramphenicol, 20 µg/ml).
Minimal-Medium (M9ZB-Medium)
1 g/l NH4Cl, 3 g/l KH2PO4, 6 g/l Na2HPO4, 10 g/l Casein-Hydrolysat, 5 g/l NaCl, ad 1 l H2O, 30 µl MgSO4 (1 M Stocklösung), 400 µl Glukose (20% Stocklösung)
Minimal-Medium (für KC8-Zellen)
75,2 g/l Na2HPO4, 3 g/l KH2PO4, 0,5 g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, ad 1 l H2O
3 m/l MgSO4 (1 M Stocklösung), 20 ml Glukose (20% Stocklösung), 0,1 ml CaCl2 (1 M Stocklösung), 1 ml Ampizillin, 1:500 verdünnt Thiamin HCl (5 mg/ml Stocklösung), 100 ml Aminosäuremix (je 2 g/100 ml: Ala, Asn, Arg, Asp, Cys, Glu, Gly, Ile, Lys, Phe, Pro, Ser, Tyr, Val), bei Bedarf je 0,12 g His, Leu, Trp od Ura zufügen.
SOC-Medium 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 20 g/l Bacto-Trypton, 20 g/l Glukose, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 10 mM NaCl
2.1.4.2. Saccharomyces cerevisiae
YPD-Medium 10 g/l Bacto-Hefeextrakt, 20 g/l Bacto-Pepton, 20 g/l Glukose
YPD-Platten 20 g/l Bacto-Agar, 10 g/l Bacto-Hefeextrakt, 20 g/l Bacto-Pepton, 20 g/l Glukose G418-Platten s. YPD-Platten; nach Autoklavieren Zugabe von 200 mg/l Genetizin (G418; sterilfiltr.) SC-Medium 6,7 g/l Bacto-Hefe Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 20 g/l C-Quelle (z.B. Glukose, s.u.),
2 g/l Drop out Mix
SC-Platten a) 20 g Bacto-Agar ad 500 ml H2O
b) 6,7 g Bacto-Hefe Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 20 g C-Quelle (z.B. Glukose, s.u.), 2 g Drop out Mix, ad 500 ml H2O
a) und b) werden erst nach dem autoklavieren gemischt, um aufgrund des niedrigen pH-Wertes die Hydrolyse des Agars zu verhindern.
5´-FOA-Platten a) 1,34 g Bacto-Hefe Stickstoffbasis ohne Aminosäuren, 4 g Glukose, 0,4 g Drop out Mix, 10 mg Urazil, 0,2 g 5-FOA, ad 100 ml H2O
b) 4 g Bacto-Agar ad mit 100 ml H2O
a) und b) werden erst nach dem autoklavieren gemischt
Der Drop out Mix ist eine Mischung von Substanzen, die für das Wachstum von Hefezellen auf Selektionsmedium notwendig sind. Hierbei wird auf Prototrophie, d.h. die Fähigkeit zur Biosynthese einer für das Wachstum nötigen Substanz, selektiert, die durch Expression eines entsprechenden chromosomal- oder Plasmid-kodierten Gens vermittelt wird. In Abwesenheit dieses Gens ist der Hefestamm auxotroph für die Substanz und kann dementsprechend auf Selektionsmedium nicht wachsen. Die Wildtypstämme YPH499 und YPH500 sind unter anderem auxotroph für Adenin, weshalb dem Medium Adenin stets aus einer 5 mg/ml Stammlösung 1:50 zugegeben wird.
Die Zusammensetzung des Drop out Mix variiert je nach Auxotrophie und gewünschter Selektion. Für die Herstellung eines SC-Ade/-Cys/-His/-Leu/-Met/-Lys/-Trp/-Ura Drop out Mixes werden folgende Substanzen in den angegeben Mengen über Nacht gemischt:
20 g Alanin 20 g Isoleuzin
20 g Arginin 2 g p-Aminobenzoesäure
20 g Asparagin 20 g Phenylalanin
20 g Asparaginsäure 20 g Prolin
20 g Glutamin 20 g Serin
20 g Glutaminsäure 20 g Threonin
20 g Glyzin 20 g Tyrosin
20 g myo-Inositol 20 g Valin
Je nach benötigtem Selektionsmedium werden 34,2 g des Mixes mit folgenden Substanzen versetzt und über Nacht durchmischt.
0,5 g Adenin 4 g Leuzin
2 g Cystein 2 g Methionin
2 g Lysin 2 g Urazil
2 g Histidin 2 g Tryptophan
Anstelle von Glukose werden SC-Medien auch mit 2% Raffinose, 2% Raffinose + 2%
Galaktose, 2% Glukose + 2% Galaktose hergestellt, falls dies für die Versuche erforderlich ist. Raffinose und Galaktose werden jeweils als 20%ige Lösungen sterilfiltriert und zu dem autoklavierten Medium gegeben.
Für die Überproduktion von TRiC wird der TCP/CCT-Überexpressionsstamm in SC-Leu/-His/-Trp/-Ura Flüssigmedium mit gespaltener Laktose (Endkonz. 2%) kultiviert. 400 g Laktose (Merck, Darmstadt/BRD) werden in 1 Liter H2O gelöst und in einer 1 Liter Schott-Flasche autoklaviert. Nach Abkühlung der 40%igen Laktose-Lösung werden 100 mg β -Galaktosidase (Aspergillus oryzae; Merck, Darmstadt/BRD) zugegeben. Zur Spaltung von Laktose in Glukose und Galaktose wird die Lösung für ca. 1 Woche bei mind. 37°C (Optimaltemperatur für enzymatische Aktivität: 50°C) inkubiert. Für eine 200 l Fermenter-Kultur werden 20 l 40%ige Laktose gespalten.
2.1. Materialien
2.1.5. Stämme 2.1.5.1. E. coli
2.1.5.2. S. cerevisiae
Hefestamm Genotyp Herkunft
YPH499 Mata ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 Sikorski und Hieter, 1989 YPH500 Matα ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 “ YPH501 Mata/α ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 “
CHY1 Mata TCP1::TCP1-3HA-HIS3MX6 Claudia Hopp
KSY321 Mata pRS316-TCP1 Δtcp1::HIS3MX6 CDC55::CDC55-3HA-kanMX6 Katja Siegers KSY323 Mata pRS316-TCP1 Δtcp1::HIS3MX6 PEX7::PEX7-3HA-kanMX6 “ KSY339 Mata pCMS38-tcp1-2 Δtcp1::HIS3MX6 CDC55::CDC55-3HA-kanMX6 “ KSY340 Mata pCMS38-tcp1-3 Δtcp1::HIS3MX6 CDC55::CDC55-3HA-kanMX6 “ KSY348 Mata pCMS38-tcp1-2 Δtcp1::HIS3MX6 PEX7::PEX7-3HA-kanMX6 “ KSY349 Mata pCMS38-tcp1-3 Δtcp1::HIS3MX6 PEX7::PEX7-3HA-kanMX6 “ KSY355 Mata ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1
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“ KSY356 Matα ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1
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KSY439 KSY355 TCP5::TCP5-TEV-linker-6His-kanMX6 “
KSY440 KSY356 TCP5::TCP5-TEV-linker-6His-kanMX6 “
RC757 Matα his6 met1 sst2-1 cyh2 can1 Chan, 1982
RH448 Mata leu2 his4 lys2 ura3 bar1 Manney, 1983
UBY3 Mata TCP2::TCP2-3HA-HIS3MX6 diese Arbeit
UBY4 Mata TCP4::TCP4-3HA-HIS3MX6 “
UBY5 Mata TCP5::TCP5-3HA-HIS3MX6 “
UBY6 Mata TCP3::TCP3-3HA-HIS3MX6 “
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UBY29 Matα TCP3::TCP3-6HA-klTRP1 “
UBY30 Mata TCP3::TCP3-9MYC-klTRP1 “
UBY31 Matα TCP3::TCP3-9MYC-klTRP1 “
UBY32 Mata TCP8::TCP8-6HA-klTRP1 “
Stamm Genotyp Herkunft
DH5α supE44ΔlacU169 (φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 Invitrogen BL21(DE3)
pLysS
E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) galλ (DE3) [plysSCamR] supE supF Stratagene BL21(DE3)/
codon plus RIL
E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) TetR galλ (DE3) [argU ileY, leuW CamR] supE supF
Stratagene
GM2163 F- ara-14 leuB6 fhuA31 lacY1 tsx78 glnV44 galK2 galT22 mcrA dam-6 hisG4 rfbD1 rspL136 dam13::Tn9(CamR)xylA5 mtl-1 thi-1 mcrB1 hsdR2
New England BioLabs KC8 hsdR, leuB600, trpC9830, pyrF::Tn5(kanR), hisB463, lacDX74, strA, galU,K Stratagene
UBY33 Mata TCP8::TCP8-9MYC-klTRP1 “
UBY34 Mata TCP1::TCP1-TEV-linker-6His-HIS3MX6 “
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UBY39 Mata TCP3::TCP3-TEV-linker-6His-kanMX6 “
UBY40 Mata TCP5::TCP5-TEV-linker-6His-HIS3MX6 “
UBY41 Mata TCP6::TCP6-TEV-linker-6His-HIS3MX6 “
UBY42 Mata TCP6::TCP6-TEV-linker-6His-kanMX6 “
UBY43 Mata TCP7::TCP7TEV-linker-6His-kanMX6 “
UBY48 Mata pCMS38-tcp1-2 Δtcp1::HIS3MX6 Δssb1::loxP Δssb2::loxP CDC55::CDC55-3HA-kanMX6
“ UBY49 KSY436 x KSY437 2n TCP1::TCP1-TEV-linker-6His-kanMX6
pUB43, pUB46, pSI231, pSI341 (TCP/CCT-Überexpressionsstamm)
“ UBY50 KSY439 x KSY440 2n TCP5::TCP5-TEV-linker-6His-kanMX6
pUB43, pUB46, pSI241, pSI349 (TCP/CCT-Überexpressionsstamm)
“ UZY10 YPH499 x YPH500 2n GIM6::GIM6-TEV-6His-kanMX6
pUZ10, pUZ5, pUZ11 (GIM-Überexpressionsstamm)
Ute Zeidler
TCPx::HIS3MX6 (bzw. Δreg1::loxP) bedeutet, dass TCPx (Δreg1) durch das Modul HIS3MX6 (loxP Sequenz) ersetzt wird (2.2.2.6.). TCPx::TCPx3HA-HIS3MX6 bedeutet, dass TCPx C-terminal mit einem 3HA-Epitop sowie einem heterologen Selektionsmarker fusioniert wird (2.2.2.5.).