Hefestamm zur Überproduktion von TRiC

3.1.4.1.1. Herstellung von Überexpressionsplasmiden für TRiC Untereinheiten

Um die zelluläre Konzentration von TRiC in den Hefen zu erhöhen, wurden alle 8 individuellen TCP/CCT-Gene überexprimiert. Hierzu wurden Überxpressionsvektoren mit Galaktose-induzierbaren Promotoren verwendet, die den 2µ Replikationsursprung von S. cerevisiae enthalten und in der Zelle in zahlreichen Kopien vorliegen. Jedes TCP/CCT-Gen wurde zunächst separat in einen Expressionsvektor unter Kontrolle des GAL1-Promotors und des CYC1-Terminators kloniert (s. Tabelle 3.2). Die Galaktose-vermittelte Überexpression des jeweiligen TCP/CCT-Gens wurde in einem Induktionstest für alle Plasmide in Wildtyp-Hefezellen getestet (Daten nicht gezeigt). In einem 2. Klonierungs-schritt wurden paarweise individuelle TCP/CCT-Gene mit den flankierenden GAL1-Pro-motor- und CYC1-Terminator-Sequenzen in jeweils einen Überexpressionsvektor kloniert (Abb. 3.10, s. folgende Seite). Auf diese Weise wurden 4 Vektoren zur Überproduktion von TRiC generiert (Tab. 3.2), die ebenfalls einem Induktionstest unterzogen wurden. Da alle 8 TCP/CCT-Gene unter Kontrolle derselben Promotorsequenz stehen, wird somit eine gleichstarke Genexpression begünstigt.

Tabelle 3.2: Plasmide zur Überproduktion von TRiC

Plasmid Beschreibung Marker Quelle

pSi240 p424GAL1-TCP1/CCT1 TRP1 Katja Siegers

pUB28 p426GAL1-TCP2/CCT2 URA3 diese Arbeit

pSi250 p424GAL1-TCP3/CCT3 TRP1 „

pUB31 p425GAL1-TCP4/CCT4 LEU2 „

pUB32 p425GAL1-TCP5/CCT5 LEU2 „

pSi239 p424GAL1-TCP7/CCT7 TRP1 „

pUB45 p423GAL1-TCP8/CCT8 HIS3 „

pSi231 p425GAL1-TCP4/CCT4-GAL1-TCP5/CCT5 LEU2 Katja Siegers

pSi241 p424GAL1-TCP1/CCT1-GAL1-TCP7/CCT7 TRP1 „

pUB43 p426GAL1-TCP3/CCT3-GAL1-TCP2/CCT2 URA3 diese Arbeit

pUB46 p423GAL1-TCP6/CCT6-GAL1-TCP8/CCT8 HIS3 „

pSi341 p424GAL1-TCP1/CCT1-TEV-linker-6His-GAL1-TCP7/CCT7 TRP1 Katja Siegers pSi349 p425GAL1-TCP4/CCT4-GAL1-TCP5/CCT5-TEV-linker-6His LEU2 „

Abb. 3.10: Klonierung des TCP6/TCP8-Überexpressionsplasmids. TCP6/CCT6 und TCP8/CCT8 stehen jeweils unter Kontrolle des GAL1-Promotors und des CYC1-Terminators. (AmpR) Ampizillin-Resistenzgen zur Selektion in E. coli, (H I S 3) Auxotrophiemarker zur Selektion in S. cerevisiae. (1) TCP6 -Überexpressionsplasmid wurde mit EagI linearisiert, 5`-Überhänge mittels Klenow-Polymerase aufgefüllt;

GAL1-TCP8-CYC1 Fragment wurde mit PvuII aus dem TCP8-Überesxpressionsplasmid isoliert. (2) Ligation.

(3) TCP6/CCT8-Überexpressionsplasmid.

Zu Anreicherung des überproduzierten Chaperonin-Komplexes wurde die Tcp1p-Unter-einheit C-terminal mit einem TEV-linker-6His-Anhang versehen. Hierzu wurde genomische DNS eines Hefestammes, der für TCP1-TEV-linker-6His kodiert, als Matrize verwendet und hiermit ein Teilbereich von TCP1/CCT1 sowie der kompletten TEV-linker 6His-Sequenz mittels PCR amplifiziert (s. 3.1.4.). Dieses Fragment wurde in das TCP1/TCP7-Überexpressionsplasmid (pSi241) kloniert, wodurch der ursprüngliche Leserahmen von TCP1/CCT1 durch den TEV-linker-6His-tag erweitert wurde (pSi341; Abb. 3.11). Diese Klonierungsstrategie wurde analog für TCP5/CCT5 angewendet (pSi349). Anschließend wurden die neu generierten Expressionsplasmide Überexpressiontests unterzogen.

Anreicherung von TRiC aus S. cerevisae

Abb. 3.11: Klonierung des `TCP1-TEV-linker-6His Fragments in den TCP1/CCT1-Leserahmen eines TCP1/TCP7-Überexpressionsplasmids. (1) Amplifizierung eines TCP1-TEV-linker-6His Fragments mit chromosomaler DNS eines TCP1-TEV-linker-6His Hefestammes als Matrize. (2) MscI/EcoRI Restrik-tionsverdau des TCP1-TEV-linker-6His PCR-Fragments sowie des Überexpressionsplasmids. (3) Ligation des ` T C P 1-TEV-linker-6His Fragments mit dem linearisierten Überexpressionsplasmid. (4) Überexpressionsplasmid für TCP1-TEV-linker-6His und TCP7.

3.1.4.1.2. Herstellung eines Hefestammes zur Überproduktion von TRiC

Eine Optimierung der Galaktose-vermittelten Expression wurde durch chromosomale Deletion des REG1-Gens erzielt (2.2.2.6.). In Gegenwart von Glukose ist die Expression Galaktose-regulierter Gene reprimiert. REG1 kodiert für die regulatorische Reg1p-Untereinheit des Glc7p-Proteinphosphatase-Komplexes (Tu et al., 1995). In Anwesenheit von Glukose vermittelt Glc7p-Reg1p Dephosphorylierung des transkriptionellen Repressors Mig1p, worauf dieser in den Zellkern transloziert und die Transkription Galak-tose-induzierbarer Gene reprimiert (Schüller et al., 2003). Durch Deletion von REG1 wird die Mig1p-vermittelte Glukoserepression aufgehoben. Dadurch lässt sich Galaktose-ver-mittelte Expression von TRiC Untereinheiten in Anwesenheit von Glukose erreichen. Da Glukose im Vergleich zu Galaktose schneller metabolisiert wird, stellt es gleichzeitig eine optimale und kostengünstige Kohlenstoffquelle für Überexpression im großen Ansatz dar.

In Abb. 3.12 ist die Deletion des REG1-Gens schematisch dargestellt:

Abb. 3.12: Generierung eines Hefestammes mit REG1-Deletion und chromosomaler TCP1-TEV-linker-6His-tag Genfusion. Für Galaktose-induzierbare Überexpression von TCP/CCT-Genen wurde REG1 (Chromosom IV) deletiert. Zur Entwicklung einer Reinigungsstrategie für TRiC wurde auf Chromosom IV die Sequenz für TEV-linker-6His-tag 3’ an T C P 1 fusioniert. (1) Amplifizierung einer loxP-HIS5-loxP Disruptionskassette mit spezifischen REG1-S4-, REG1-S5 Oligonukleotiden (2+3) Homologe Rekombination und REG1-Disruption. (4) Transformation von Hefezellen mit einem für Cre-Rekombinase kodierenden Plasmid. (5) Cre-vermittelte Rekombination zwischen 2 loxP Abschnitten führt zum HIS5-Marker Verlust.

(6+7) Insertion und Fusion der TEV-linker-6His-kanMX6-Kassette an TCP1 (siehe Abb. 3.6).

Hierzu wurde eine REG1-Disruptionskassette verwendet, bei der der SpHIS5-Marker von zwei Erkennungssequenzen der Cre-Rekombinase (loxP) flankiert ist. An diese schließen jeweils Sequenzen an, die komplementär zu den angrenzenden Genomabschnitten von REG1 sind und der Insertion dienen. Die Deletion erfolgte über homologe Rekombination der Disruptionskassette am chromosomalen REG1 Lokus (s. 2.2.2.6.). Im Anschluss an die REG1-Deletion wurde durch Expression der Cre-Rekombinase das inserierte, von loxP-Sequenzen flankierte SpHIS5-Gen herausgeschnitten, so dass lediglich eine loxP-Sequenz an dieser Genomstelle verbleibt (s. 2.2.2.6.1.). Durch den Verlust des SpHIS5 Selektionsmarkers wurde der Hefestamm erneut auxotroph für Histidin, was die Ver-wendung von Plasmid-kodiertem ScHIS3 Selektionsmarker für folgende Transformationen ermöglichte (siehe unten). Zusätzlich wurde im Δreg1-Stamm TCP1/CCT1 chromosomal

Anreicherung von TRiC aus S. cerevisae

mit der TEV-linker-6His-Epitop-kodierenden Sequenz versehen (analog der Vorgehens-weise in Kapitel 3.1.4.).

Auf diese Weise generierte Δreg1 TCP1/CCT1-TEV-linker-6His Stämme lagen in beiden Paarungstypen (a, α) vor und wurden für die Überproduktion von TRiC verwendet.

Hierzu wurden Hefestämme unterschiedlichen Paarungstyps mit jeweils 2 verschiedenen TCP/CCT-Überexpressionsplasmiden, die je für 2 Untereinheiten kodieren, transformiert.

Die Galaktose-vermittelte Expression der TCP/CCT-Gene wurde in Gegenwart von Glukose überprüft. Anschließend wurden beide Hefestämme miteinander gekreuzt (s.

2.2.2.7.), so dass der resultierende diploide Stamm alle vier verschiedene TCP/CCT-Überexpressionsplasmide enthält (pUB43, pUB46, pSi231, pSi341; siehe Tabelle 3.2). Da TCP1/CCT1 sowohl extrachromosomal als auch chromosomal als Fusion mit TEV-linker-6His exprimiert wird, ist gewährleistet, dass kein TRiC ohne Epitop-Markierung in der Zelle vorliegt.

Analog wurde ein Δreg1 Stamm mit TCP5/CCT5-TEV-linker-6His Fusion generiert.

Demnach standen für die Entwicklung eines Reinigungsprotokolls für TRiC zwei verschiedene, diploide Überexpressionsstämme zur Verfügung, die sich lediglich in der Expression unterschiedlicher Genfusionen (TCP1/CCT1 oder TCP5/CCT5 mit TEV-linker-6His) unterschieden. Wie bereits in Kapitel 3.1.4. erwähnt, sind bei den einzelnen Hefestämmen, die verschiedene TCP/CCT-TEV-linker-6His Fusionsgene chromosomal exprimieren, keine Wachstumsunterschiede zu beobachten. Die Verwendung beider Hefestämmen ermöglichte eine vergleichbare Anreicherung von TRiC mittels des in Kapitel 3.1.4.2. beschriebenen Reinigungsprotokolls.

3.1.4.1.3. Optimierung der TRiC Überproduktionsbedingungen im Großmaßstab Für die Reinigung von TRiC in großen Mengen wurde nach Bestimmung der Verdopp-lungszeit (204 min) der TCP/CCT-Überexpressionsstamm (UBY49) im Fermenter kultiviert (s. 2.2.2.3.). Die reg1 Deletion erlaubte, neben Galaktose zur Genexpression der Unter-einheiten auch die Verwendung von Glukose als optimale Kohlenstoffquelle im Medium.

Beide Saccharide wurden durch Spaltung von Laktose mittels beta-Galaktosidase ge-wonnen und anschließend dem Medium zugefügt (s. 2.1.4.2.). Unter dem Aspekt, Kulti-vierung von Hefezellen zur Überproduktion von TRiC im Großmaßstab durchzuführen, stellt dies vor allem gegenüber der direkten Verwendung von Galaktose eine kosten-günstige Methode dar. Testinduktionen mit unterschiedlichen Konzentrationen gespaltener Laktose ergaben eine Endkonzentration von 1% als optimalen Galaktose-Gehalt.

Probe-Extrakte der Fermenterkultur vor und nach Galaktose-induzierter Genexpression wurden im Western-Blot miteinander verglichen. Für alle TRiC Untereinheiten konnte ein 20-50facher Anstieg der zellulären Menge durch die Galaktose-vermittelte Überexpression erzielt werden (Abb. 3.13).

Abb. 3.13: Galaktose-induzierte Überexpression von TCP/CCT-Genen. Diploide Δreg1 Zellen, die chromosomal für Tcp1p-TEV-linker-6His kodieren und zusätzlich TCP/CCT-Überexpressionsplasmide enthalten, wurden mit Galaktose inkubiert. Vor (-) und nach (+) Induktion wurden äquivalente Mengen Proben entnommen. Die Überproduktion einzelner TRiC Untereinheiten wurde über SDS-PAGE und Western-Blots mittels TRiC Untereinheiten-spezifischer Antikörper analysiert. (Tcp1p*) Da TCP1 chromosomal und extrachromosomal nur als Fusionsgen mit dem TEV-linker-6His-tag existiert, werden im Western-Blot auch keine Wildtyp-Tcp1p Signale detektiert.

Des Weiteren konnte anhand von Gelfiltrationschromatographie die Komplex-Assemblierung überproduzierter TRiC Untereinheiten gezeigt werden (Abb. 3.14). Hierzu wurde Lysat vom TCP/CCT-Überexpressionsstamm nach Induktion sowie von Wildtyp-hefen einer analytischen Gelfiltrationschromatographie unterzogen (SMART-System).

Anhand eines anti-Tcp5p Western-Blots wurde ersichtlich, dass die Signalstärke der Fraktionen des Überexpressionsstammes gegenüber denen des Wildtypstamms um ca.

das 50fache angestiegen war, sich beide Stämme in ihrem Elutionsprofil von TRiC aber nicht unterschieden (Fraktionen 16-20).

Abb. 3.14: Gleichzeitige Überproduktion individueller TRiC Untereinheiten führt zur vollständigen Assemblierung des Chaperonin-Komplexes. Lysat von Wildtyp-Hefezellen sowie TCP/CCT-Überexpres-sionsstamm wurde einer Gelfiltration (Superose 6) unterzogen und die Assemblierung überproduzierter TRiC Untereinheiten wurde im anti-Tcp5p Western-Blot analysiert. (A) Wildtyp-Zelllysat, (B) TCP/CCT-Überex-pressionsstamm. (C) Eichchromatogramm: (1) Dextran, 2000 kDa; (2) Thyroglobulin, 669 kDa; (3) Ferritin, 440 kDa; (4) Katalase, 232 kDa; (5) Aldolase, 158 kDa; (6) Ovalbumin, 43 kDa; (7) Chymotrypsinogen, 25 kDa; (8) RibonukleaseA, 13 kDa. (D) Chromatogramm, TCP/CCT-Überexpressionsstamm (Lysat). TRiC fraktioniert in den Fraktionen16-20 als vollständiger Komplex.

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