3. E RGEBNISSE
3.2. In vitro Proteinfaltungsstudien mit gereinigtem TRiC im prokaryo- prokaryo-tischen Translationssystem
3.2.1. TRiC-vermittelte Proteinfaltung mit Hilfe akzessorischer Faktoren
Für die angestrebten Proteinfaltungsexperimente wurden zusätzlich anhand von bereits im Labor etablierten Protokollen GimC aus Hefe (Diplomarbeit Ute Zeidler) sowie Ssb1p aus E. coli (Andreas Bracher, Abteilung Hartl) gereinigt.
3.2.1.1. Reinigung von GimC aus S. cerevisiae 3.2.1.1.1. Optimierung des Reinigungsprotokolls
Zur Reinigung von GimC wurde ein bereits bestehendes Protokoll (Diplomarbeit Ute Zeidler) herangezogen und bezüglich der Reinigungschritte (Pufferwahl, Säulenvolumina, Wasch- und Elutionsvolumina; s. 2.4.4.3.) optimiert. Für die Isolierung von GimC wurden die für die 6 individuellen Gim-Untereinheiten kodierenden Gene unter Kontrolle eines Kupfer-induzierbaren Promotors in Hefezellen überexprimiert. Analog zur Reinigung von TRiC wurde eine Untereinheit von GimC, Gim6p, mit einer TEV-6His Fusion versehen. Die Anreicherung des Komplexes erfolgte mittels eines Imidazol-Stufengradienten über eine Ni2+-Affinitätssäule (Abb. 3.25; s. 2.4.4.3.1.).
Abb. 3.25: Anreichung von GimC mittels Ni2+Affinitätschromatographie.
Die lösliche Fraktion des GIM-Expressionsstammes wurde einer Ni2+-Affinitätschromatographie unterzogen, und gebundene Proteine wurden mittels eines Imidazol-Stufengradienten eluiert (Gravitationsfluss). (M) Marker, (T) Total-Extrakt, 6 µg Protein, (Ü) Überstand, 10 µg Protein und (S) Sediment nach Zentrifugation, (D) Durchlauf, (W1) 1/12000 Volumenanteil vom Waschschritt (ohne Imidazol), (B1) 1/2000 Volumenanteil der Ni2+-Matrix vor Elution mit Imidazol, (W2) 1/8000 Volumenanteil vom 20 mM Imidazol-Waschschritt, (20, 100, 200, 400, 800 mM) 1/6000 Volumenanteil jeweiliger Fraktionen des Imidazolgradienten, (B2) 1/2000 Volumenanteil der Ni2+-Matrix nach Imidazol-Elution. Fraktion 2 bei 100 mM Imidazol bis einschließlich Fraktion 1 bei 400 mM Imidazol beinhalten GimC.
Nach diesem Reinigungsschritt ließ sich im Coomassie-gefärbten Gel bereits deutlich das für GimC typische Bandenmuster (12-24 kDa) in den Fraktionen mit einem Imidazol-Gehalt von 100-400 mM erkennen. Wie bereits bei der Reinigung von TRiC assoziierte auch bei der GimC-Reinigung Alkoholdehydrogenase 1 (Adh1p) unspezifisch mit der Ni2+ -Matrix (Western-Blot Analyse; Daten nicht gezeigt).
in vitro Proteinfaltungsstudien
Zur Größenfraktionierung wurde die GimC-enthaltende Probe einer Gelfiltrationschroma-tographie mit einer Superdex 200 16/60-Säule unterzogen (Abb. 3.26; s. 2.4.4.3.2.).
Abb. 3.26: Größenfraktionierung von GimC mittels Gelfiltrationschromatographie. Im Anschluss an die Affinitätschromatographie wurde GimC-enthaltende Probe einer Gelfiltrationschromatographie unterzogen und im Coomassie-Gel analysiert. (A) (M) Marker, (A) 10 µg Ausgangsmaterial, (5-38) 1/500 Volumenanteil der Fraktionen 5-38, (*) Adh1p-Kontamination. Fraktionen 17-21 beinhalten vollständig assembliertes GimC.
(B) Chromatogramm der Eichproteine: (1) Dextran, 2000 kDa; (2) Thyroglobulin, 669 kDa; (3) Ferritin, 440 kDa; (4) Katalase, 232 kDa; (5) Aldolase, 158 kDa; (6) Ovalbumin, 43 kDa; (7) Chymotrypsinogen, 25 kDa;
(8) RibonukleaseA, 13 kDa. (C) Chromatogramm der GimC-enthaltenden Probe.
GimC fraktioniert als Komplex in Fraktionen 17-21. Obwohl die errechnete Größe von GimC einem Molekulargewicht von etwa 96 kDa entspricht, fraktioniert GimC im Vergleich mit dem Elutionsprofil der Eichproteine erfahrungsgemäß im Bereich von 158 kDa. Dieses Migrationsverhalten ist vermutlich auf die sterischen Eigenschaften des Komplexes zu-rückzuführen. Zusätzlich zeigte sich im Coomassie-Gel eine weitere Bande bei ca. 40 kDa, die als Adh1p identifiziert wurde und als tetramere Alkoholdehydrogenase (Buhner und Sund, 1969) mit GimC ko-fraktioniert.
Im weiteren Verlauf der Reinigung wurde mittels TEV-Protease der Hexahistidin-Rest von der Gim6p-Untereinheit abgespalten (s. 2.4.4.3.3.). In Abb. 3.27 lässt sich deutlich das unterschiedliche Migrationsverhalten von Gim6p vor und nach Abtrennung des TEV-6His-tags erkennen (das Fusionsprotein ko-migriert mit Gim1p). Gim2p und TEV-Protease migrieren zusammen, und lassen sich daher im Coomassie-Gel nicht einzeln detektieren.
Abb. 3.27: Abspalten des TEV-6His-tags von Gim6p mittels TEV-Protease.
GimC-enthaltende Fraktionen wurden nach Gelfiltration mit TEV-Protease inkubiert. Proben vor (-) und nach (+) Inkubation mit TEV-Protease wurden im 17 % Polyacrylamidgel analysiert. TEV-6His-Protease komigriert mit Gim2p. Vor Inkubation migriert Gim6p-6His mit Gim1p (ca. 15 kDa), während nach TEV-Inkubation Gim6p ohne TEV-6His-tag etwas schneller migriert (ca. 14 kDa).
Im letzten Reinigungsschritt wurde GimC über eine zweite Ni2+-Affinitätssäule (s.
2.4.4.3.4.) von abgespaltenem TEV-6His-tag, His-markierter TEV-Protease sowie weiteren Proteinen, die unspezifisch an die Ni2+-Affinitätsmatrix binden, separiert (Abb. 3.28). Mit diesem Protokoll lassen sich aus 60 g Hefezellen bis zu 6,9 g GimC isolieren.
Abb. 3.28: GimC wird mittels einer 2. Ni2+-Affinitätschromatographie von weiteren Kontaminationen separiert. Nach Abspaltung des TEV-6His-tags mittels TEV-Protease wurde GimC-enthaltende Probe einer zweiten Ni2+-Affinitätschromatographie unterzogen. (M) Marker, (A) 1/3250 Volumenanteil vom Ausgangsmaterial, (G) 1/3250 Volumenanteil GimC (Durchlauf und 20 mM Imidazol-Waschschritt vereint), (B) 1/200 Volumenanteil der Ni2+-Matrix nach Inkubation mit GimC-enthaltender Probe. Adh1p (~42 kDa) und TEV-6His-Protease (~ 27 kDa) binden an die Ni2+-Matrix und werden auf diese Weise von GimC abgetrennt.
in vitro Proteinfaltungsstudien
3.2.1.1.2. Qualitätskontrollen für gereinigtes GimC
Die Stabilität des gereinigten Komplexes wurde mittels analytischer Gelfiltrations-chromatographie überprüft (Abb. 3.29; s. 2.4.4.3.5.). Das Elutionsprofil zeigt ein einziges Maximum (Wellenlänge 280 nm), das sich mit den im Western-Blot detektierten Gim2p-Signalen in den Fraktionen 19-22 deckt.
Abb. 3.29: Analyse von gereinigtem GimC mittels analytischer Gelfiltration.
(A) 100 µg Eichmix (bestehend aus (1) Dextran, 2000 kDa; (2) Thyroglobulin, 669 kDa; (3) Ferritin, 440 kDa;
(4) Katalase, 232 kDa; (5) Aldolase, 158 kDa; (6) Ovalbumin, 43 kDa; (7) Chymotrypsinogen, 25 kDa; (8) RibonukleaseA, 3 kDa) bzw. (B) 150 µg gereinigtes GimC wurden zur Größenfraktionierung (Superose 6, SMART) eingesetzt. Fraktionen 19-22 beinhalten vollständigen Gim-Komplex. (C) Western-Blot Analyse.
Signale decken sich mit dem Maximum (280 nm) des Chromatogramms.
Die Integrität des Komplexes wurde anhand einer Western-Blot Analyse mit Antiseren gegen individuelle GimC-Untereinheiten überprüft (Abb. 3.30). Neben gereinigtem GimC (0.5 µg) wurde Total-Extrakt des GIM-Überexpressionsstamms als Kontrolle geladen. Die Western-Blot Analyse mit anti-Gim6p Antiserum zeigt deutlich das unterschiedliche Migra-tionsverhalten von Gim6p-TEV-6His (Spur 1) und Gim6p ohne TEV-6His-tag (Spur 2).
Zusätzliche Signale im Gim4p Western-Blot lassen sich dadurch erklären, dass das anti-Gim4p Antiserum neben anti-Gim4p auch Gim6p detektiert. Im anti-Gim2p Western-Blot tritt in der Spur mit Total-Extrakt (Spur 1), nicht aber mit gereinigtem Komplex (Spur 2) ein weiteres Signal auf, das sich vermutlich auf proteolytische Degradation von Gim2p zurückführen lässt.
Abb. 3.30: Western-Blot Analyse bestätigt die Integrität von gereinigtem GimC.
Aliquots von (1) je 10 µg Protein des Total-Extraktes und (2) je 0.5 µg GimC wurden mittels Western-Blots mit individuellen GimC-Antikörpern analysiert. Deutlich detektiert anti-Gim6p das unterschiedliche Migrationsverhalten von (1) Gim6p-TEV-6His und (2) Gim6p ohne TEV-6His-tag. Anti-Gim4p detektiert neben Gim4p auch Gim6p.
Der Reinheitsgrad von gereinigtem GimC und TRiC wurde im Western-Blot überprüft (Abb.
3.31). Selbst bei Analyse großer Mengen gereinigter Chaperone (15 µg GimC, 8 µg TRiC) wurden weder Aktin noch alpha-Tubulin, beides prominente Substrate von GimC und TRiC, immunologisch nachgewiesen. Diese Tatsache belegt den hohen Reinheitsgrad der gereinigten Chaperon-Komplexe und ermöglicht die Verwendung beider Komplexe für die folgenden in vitro Substratbindungsstudien.
Abb. 3.31: Gereinigtes GimC und TRiC enthalten keine nachweisbaren Mengen von Substrat. Zur Bestimmung des Reinheitsgrads gereinigter Proteinkomplexe wurden je 15 µg GimC und 8 µg TRiC einer SDS-PAGE unterzogen und im Coomassie-Gel sowie im Western-Blot mit anti-Aktin und anti-alpha-Tubulin Antikörpern analysiert. (M) Marker. Als Positiv-Kontrolle (K) wurde Hefe-Zelllysat geladen (15 µg Gesamtprotein). Die Western-Blot Analyse zeigt, dass die gereinigten Komplexe keine nachweisbaren Mengen der Substrate Aktin und alpha-Tubulin enthalten.
in vitro Proteinfaltungsstudien
3.2.1.2. Reinigung von Ssb1p aus E. coli
SSB1 wurde rekombinant in E. coli als Fusion mit der Sequenz für 6 Histidine und einer integrierten Erkennungssequenz für TEV-Protease exprimiert. Ähnlich wie TRiC und GimC wurde auch 6His-TEV-Ssb1p zunächst über eine Ni2+-Affinitätschromatographie angerei-chert (Abb. 3.32; s. 2.4.3.8.1.). 6His-TEV-Ssb1p eluierte bei einer Imidazolkonzentration von 250 mM.
Abb. 3.32: Anreichung von 6His-TEV-Ssb1p mittels Ni2+-Affinitätschromatographie. 6His-TEV-SSB1 wurde rekombinant in E. coli exprimiert, und die lösliche Fraktion wurde einer Ni2+-Affinitätschromatographie (Gravitationsfluss) unterzogen. (M) Marker, (T) Total-Extrakt, 10 µg Protein, (S) Sediment und (Ü) Über-stand, 10 µg Protein, nach Zentrifugation, (D) Durchlauf, (20 mM, 50 mM,100 mM) 1/5000 Volumenanteil von Waschschritten mit unterschiedlichen Imidazolkonzentrationen, (1-6) 1/100 Volumenanteil von 250 mM Imidazol-Elutionen.
Der 6His-TEV-tag wurde mittels TEV-Protease abgespalten und der tag sowie die Protease über eine zweite Ni2+-Affinitätschromatographie (s. 2.4.3.8.3.) von Ssb1p separiert (Abb. 3.33).
Abb. 3.33: Ssb1p wird mittels einer zweiten Ni2+-Affinitätschromatographie von Verunreinigungen separiert. Nach Abspaltung des 6His-TEV-tags mittels TEV-6His-Protease wurde Ssb1p-enthaltende Probe auf eine zweite Ni2+-Affinitätssäule geladen und mit einem Säulenvolumen 20 mM Imidazol-Puffer gespült.
(A) Ausgangsmaterial, 10 µg Protein, (M) Marker, (1-20) jeweils 1/300 Volumenanteil gesammelter Frak-tionen. Im Gegensatz zur TEV-6His-Protease und zum abgespaltenen 6His-TEV-tag bindet Ssb1p nicht an die Säule. Fraktionen mit höchstem Reinheitsgrad (9-18) wurden für weitere Reinigungsschritte von Ssb1p eingesetzt.
Abschließend erfolgte ein Gelfiltrationsschritt mit einer Superdex 200-Säule (Abb. 3.34; s.
2.4.3.8.4.). Die Fraktionen wurden einer SDS-Gelanalyse unterzogen (Abb. 3.34 A). Die-jenigen Fraktionen wurden vereint, die im Vergleich mit Eichstandardproteinen (Abb.
3.34 B) einem Molekulargewicht von ca. 70 kDa entsprachen und ein Maximum im Elu-tionsprofil bei 280 nm aufwiesen (Abb. 3.34 C). Ein weiteres Maximum, das sich im Elutionsprofil erkennen lässt (Fraktionen 2-12), ist vermutlich auf Nukleinsäuren zurück-zuführen, weil in diesem Bereich nur geringe Proteinmengen im Coomassie-Gel nachge-wiesen wurden. Geringe Mengen an Ssb1p, die in diesen Fraktionen höheren Molekular-gewichts eluierten, lassen sich vermutlich durch Wechselwirkungen mit Nukleinsäuren er-klären (Fraktionen 3-9: hohe Absorbtion bei 280 nm und geringe Proteinmenge). Mit dieser Methode lassen sich 6 mg Ssb1p aus 4 Litern einer stationären E. coli-Kultur isolieren.
Abb. 3.34: Größenfraktionierung von Ssb1p zur Separierung von Verunreinigungen mittels Gelfiltrationschromatographie. Im Anschluss an die zweite Affinitätschromatographie wurde Ssb1p-enthaltende Probe einer Gelfiltrationschromatographie (Superdex200) unterzogen. (A) Coomassie-Gel: (M) Marker, (A) Ausgangsmaterial, 10 µg Protein, (1-25) 1/100 Volumenanteil der Fraktionen 1-25. (B) Chroma-togramm der Eichproteine (bestehend aus (1) Dextran, 2000 kDa; (2) Thyroglobulin, 669 kDa; (3) Ferritin, 440 kDa; (4) Katalase, 232 kDa; (5) Aldolase, 158 kDa; (6) Ovalbumin, 43 kDa; (7) Chymotrypsinogen, 25 kDa; (8) Ribonuklease A, 13 kDa). (C) Chromatogramm der Ssb1p-enthaltenden Probe. (D) Coomassie-Gel von 2 µg gereinigtem Ssb1p (Fraktion 13-16).
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