In vivo Analyse der Chromatinstruktur ribosomaler DNA in S. cerevisiae
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Naturwissenschaftlichen Fakultät III - Biologie und Vorklinische Medizin der
Universität Regensburg
vorgelegt von
Katharina Merz aus Regensburg Juni 2007
Promotionsgesuch eingereicht am: 21.06.2007
Die Arbeit wurde angeleitet von: Prof. Dr. Herbert Tschochner
Prüfungsausschuß: Vorsitzender Prof. Dr. Reinhard Wirth 1. Gutachter und Prüfer Prof. Dr. Herbert Tschochner 2. Gutachter und Prüfer Prof. Dr. Michael Thomm
3. Prüfer Prof. Dr. Wolfgang Seufert
Tag der mündlichen Prüfung: 08.08.2007
Biochemie der Universität Regensburg angefertigt.
Hiermit erkläre ich, daß ich diese Arbeit selbst verfaßt und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Diese Arbeit war bisher noch nicht Bestandteil eines Prüfungsverfahrens, andere Promotionsversuche wurden nicht unternommen.
Regensburg, den 25. Juni 2007
Ich danke allen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Prof. Dr. Herbert Tschochner danke ich für die interessante Aufgabenstellung und dafür, daß er mir die Möglichkeit gab, diese Arbeit in seinem Labor durchführen zu können.
Mein besonderer Dank gilt Dr. Joachim Griesenbeck für seine außerordentliche Betreuung, seine ständige Diskussionsbereitschaft und Unterstützung.
Dr. Helfried Mallow und Edith Aichinger danke ich für ihre Hilfe in Computer- und Verwaltungsangelegenheiten, sowie allen technischen Mitarbeitern für die unzähligen
„infrastrukturellen“ Hilfen.
Ulrike Stöckl danke ich für die Konstruktion von Hefestämmen.
Bei Gisela Pöll möchte ich mich herzlichst für die angenehme Arbeitsatmosphäre und die belebenden Gespräche am Morgen bedanken.
Prof. Dr. Michael Thomm und seiner Arbeitsgruppe danke ich für die Möglichkeit zur Nutzung ihres Phosphorimagers.
Weiterhin möchte ich mich bei allen Kollegen für die angenehme Laboratmosphäre, die gute Zusammenarbeit, anregende Diskussionen, konstruktive Kritik und die schöne Zeit in Regensburg bedanken.
Inhaltsverzeichnis...I
1. Einleitung ... 1
1.1. Chromatin... 1
1.1.1. Nukleosomen... 1
1.1.2. Übergeordnete Chromatinstrukturen... 2
1.1.3. Eu- und Heterochromatin ... 3
1.1.4. Posttranslationale Histonmodifikationen und Histonvarianten... 4
1.2 Struktur und Transkription ribosomaler DNA (rDNA) in S. cerevisiae... 7
1.2.1. Struktur der rDNA... 7
1.2.2. Transkription der rDNA ... 8
1.3. Regulation der RNA Polymerase I Transkription ... 11
1.3.1. Regulation der Transkriptionsinitiation ... 12
1.3.2. Regulation der Transkriptionselongation ... 13
1.4. Chromatinstruktur der rDNA ... 16
1.4.1. Chromatinzustände der rDNA... 16
1.4.2. Stillegung der rDNA (rDNA silencing)... 18
1.4.3. Organisation des rDNA Lokuses in S. cerevisiae... 19
Zielstellung der Arbeit ... 21
2. Material und Methoden ... 23
2.1. Material ... 23
2.1.1. Chemikalien ... 23
2.1.2. Lösungen, Puffer und Medien... 23
2.1.3. Nukleinsäuren... 25
2.1.4. Enzyme und Polypeptide... 31
2.1.5. Antikörper ... 32
2.1.6. Organismen ... 32
2.1.7. Geräte ... 38
2.2. Methoden... 38
2.2.1. Enzymatische Manipulation von DNA ... 38
2.2.2. Reinigung von Nukleinsäuren... 40
2.2.3. Quantitative und qualitative Analyse von Nukleinsäuren... 42
2.2.4. Nukleipräparation... 46
2.2.5. In vitro ChEC (chromatin endogenous cleavage)... 46
2.2.6. Psoralenvernetzung ... 47
2.2.7. Transformation und Kultur von E. coli zur Amplifikation rekombinanter DNA .. 48
2.2.8. Transformation und Kultur von S. cerevisiae... 49
2.2.9. Proteinbiochemische Methoden ... 51
3. Ergebnisse ... 55
3.1. Lokalisierung chromatinassoziierter Faktoren an der rDNA mittels in vitro ChEC (chromatin endogenous cleavage) ... 55
3.1.1. Etablierung der MNase-Fusionsstämme ... 55
3.1.2. Lokalisierung chromatinassoziierter Faktoren im Wildtypstamm NOY505 ... 56
3.1.3. Die Kombination von ChEC- und Psoralenvernetzungsanalyse ermöglicht die Bestimmung der Chromatinform, mit der rDNA-Bindeproteine assoziiert sind ... 61
3.2. Chromatinstruktur in Stämmen mit Deletionen funktioneller Pol I Transkriptionsfaktoren ... 64
3.2.1. MNase Verdaumuster des Wildtypstammes NOY505... 64
3.2.2. Die Deletion von UAF oder CF Komponenten ändert die Chromatinstruktur der rDNA... 65
3.2.3. Die Ausbildung alternativer Chromatinstrukturen ist von UAF abhängig ... 68
3.2.4. Die Deletion von HMO1 führt zu keiner detektierbaren Veränderung des MNase Verdaumusters der chromosomalen rDNA ... 69
3.2.5. Transkriptionsfaktoren sind nicht mehr mit der rDNA von UAF- und CF-Mutanten assoziiert ... 70
3.3. Chromatinstruktur temperatursensitiver Initiationsmutanten... 71
3.3.1. Gpy11-6: Eine temperatursensitive Pol I-Mutante... 72
3.3.2. YCC95: Eine temperatursensitive Rrn3p-Mutante ... 74
3.4. Bei Nährstoffentzug ist Rrn3p nicht mehr mit dem Promotor assoziiert... 83
3.4.1. Bei Nährstoffentzug bleiben alle Histone und Transkriptionsfaktoren bis auf Rrn3p mit der rDNA assoziiert ... 83
3.4.2. Transkriptionsfaktoren (außer Rrn3p) und Histone bleiben bei Nährstoffentzug mit der gleichen Chromatinform assoziiert wie vor dem Entzug... 87
3.5. NOY886: Ein konstitutiv aktiver Stamm ... 90
3.5.1. UAF ist nicht mit dem Enhancer des konstitutiv aktiven Stammes NOY886 assoziiert... 90
3.6. Chromatinstruktur nach Uracildepletion... 92
3.6.1. Die Depletion von Uracil führt zu einer veränderten Psoralenzugänglichkeit der rDNA von NOY886 ... 92
3.6.2. Die Uracildepletion verhindert möglicherweise die Elongation von Pol I ... 93
3.6.3. Die Depletion von Uracil führt zu einer veränderten Psoralenzugänglichkeit der rDNA von NOY505-MNase-Fusionsstämmen ... 95
3.7. Nukleosomenpositionierung an der rDNA... 98
3.7.1. Die aktive rDNA hat eine stark verminderte Nukleosomenokkupanz... 98
3.7.2 Nukleosomale Organisation der rDNA in stationären Zellen ... 101
3.7.3. Nukleosomales Spacing am rDNA Lokus ... 103
3.8. Die rDNA des Plasmids pKM6 des Stammes YKM1 besitzt eine alternative Chromatinstruktur ... 108
4. Diskussion ... 111
4.1. Organisation der rDNA ... 111
4.1.1. Ist die DNA des upstream Elements um UAF gewunden?... 111
4.1.2. Existiert der „Ribomotor“?... 114
4.2. Dynamik von Assoziations- und Dissoziationsereignissen an der rDNA... 116
4.2.1. Rrn3p ist nach Nährstoffentzug kaum noch mit der rDNA assoziiert ... 116
4.2.2. Die Pol I Transkription wird auch auf Ebene der Elongation reguliert ... 117
4.2.3. Bindung von CF ist nicht zyklisch ... 117
4.2.4. Ist Hmo1p ein funktionelles Homolog zu UBF?... 118
4.3. UAF ist für die Chromatinstruktur am rDNA Lokus verantwortlich... 119
4.4. Die Psoralenzugänglichkeit der rDNA hängt von der Polymerasepräsenz ab ... 121
4.5. Nukleosomen... 125
4.6. Episomale rDNA unterscheidet sich von chromosomaler rDNA ... 128
5. Zusammenfassung... 129
Abkürzungen ... 131
Literaturverzeichnis... 133
1.1. Chromatin
Den Grundbaustein des Chromatins bildet das Nukleosom, welches aus einem Histonoktamer und der darum gewickelten DNA besteht (Kornberg, 1974). Weitere Bestandteile sind eine Vielzahl von Nichthistonproteinen und Enzymen, die mit der DNA assoziiert sind. Chromatin spielt neben der Verdichtung der DNA eine entscheidende Rolle bei allen DNA-abhängigen Prozessen, wie der Transkription, der Rekombination, der DNA-Replikation der DNA- Reparatur oder der Bindung regulatorischer Proteine.
1.1.1. Nukleosomen
Die Histone H2A, H2B, H3 und H4 sind die Hauptproteinkomponenten des Chromatins. Sie befinden sich im Zellkern der Eukaryoten und sind in ihrer Länge und Aminosäuresequenz hoch konserviert. Histon H1 hingegen ist evolutiv weniger stark konserviert und in manchen Geweben durch besondere Histone ersetzt. Hefen fehlt Histon H1 gänzlich.
Die vier Kernhistone sind kleine basische Proteine, mit einer Größe von elf bis 16 kDa, die einen hohen Anteil an den positiv geladenen Aminosäuren Lysin und Arginin aufweisen.
Neben einer C-terminalen histonfold-Domäne, die aus drei α-Helices besteht und für die Wechselwirkungen der Histone untereinander, sowie mit der DNA verantwortlich ist, besitzen die Histone flexible N-terminale Aminoacylenden mit 20 bis 40 Aminosäureresten, die den Hauptteil des Lysins enthalten und aus der globulären Domäne herausragen (Arents et al., 1991). An diesen geladenen Aminoacylenden findet eine Vielzahl posttranslationaler Modifikationen statt, wie die Acetylierung und Methylierung von Lysin und Arginin, die Ubiquitinierung und Sumoylierung von Lysin, die Phosphorylierung von Serin und Threonin, sowie die ADP-Ribosylierung (Kapitel 1.1.4.).
Jedes Nukleosom besteht aus einem Histonkern und der sich darum windenden DNA. Der Histonkern, ein Oktamer, setzt sich aus jeweils zwei Molekülen der Histone H2A, H2B, H3 und H4 zusammen, wobei die Histone H3 und H4 ein stabiles Tetramer (H3/H4)2 bilden, das sich an die DNA angelagert, woran sich schließlich zwei (H2A/H2B)-Dimere lagern (Kleinschmidt et al., 1990). Um die so entstandene scheibenförmige Struktur des Proteinkerns windet sich die DNA linksgängig mit einer Länge von 146 Nukleotiden und 1,65 Windungen (Luger et al., 1997). Benachbarte Nukleosomen sind mit einer Verbindungs- DNA (im weitern als Linker-DNA bezeichnet) verbunden, deren Länge 15 bis 80 Basenpaare beträgt. Dadurch entsteht eine Struktur, mit einem Durchmesser von 10nm, die einer Perlenkette ähnelt (Olins and Olins, 1974).
Nackte DNA wird von sequenzunspezifischen Endonukleasen, wie der DNAse I oder der Mikrokokken-Nuklease (MNase) vollständig verdaut, wobei die MNase AT-reiche Regionen
bevorzugt schneidet („hypersensitive Stellen“). Nukleosomal verpackte DNA hingegen, ist für Endonukleasen weniger sensitiv als die freie DNA des Verbindungsstückes zweier Nukleosomen. Zu diesem Schutz tragen auch die Linker-Histone in gewissem Maße bei. Bei einem unvollständigen MNase Verdau nukleosomaler DNA entsteht bei der Auftrennung der DNA nach ihrer Größe in einem Agarosegel eine „nukleosomale Leiter“, deren Abstände zwischen 150-200 Basenpaare betragen, was genau einem Nukleosom inklusive der Linker- DNA entspricht.
In proliferierenden Zellen wird der Hauptteil der Histone in der S-Phase des Zellzykluses synthetisiert und ist mit der Replikation verbunden, um die Verpackung der neu synthetisierten DNA zu gewährleisten. Histonvarianten hingegen werden außerhalb der S-Phase synthetisiert (s. 1.1.4.D.) und können replikationsunabhängig eingebaut oder ausgetauscht werden. In den Zusammenbau der Nukleosomen sind Histonchaperone involviert, die meist eine Vorzugsaffinität für H2A/H2B oder für H3/H4 besitzen.
1.1.2. Übergeordnete Chromatinstrukturen
Im Gegensatz zu der in Lehrbuchabbildungen vermittelten Klarheit, ist tatsächlich nur sehr wenig über übergeordnete Chromatinstrukturen bekannt. Die Ausbildung dieser Strukturen scheint ein äußerst dynamischer Prozeß zu sein und kann in verschiedene Stufen unterteilt werden, wobei die Ausbildung der 10nm-Perlenschnur die erste Stufe darstellt (Abb. 1-1).
Unter physiologischen Bedingungen bildet sich aus dieser eine kondensierte Faser mit einem Durchmesser von 30nm. Durch die Bindung der Linker-Histone H1 oder H5 an die Linker- DNA zwischen den Nukleosomen wird die Bildung der 30nm-Faser begünstigt, ist dafür jedoch nicht essentiell. Die Linker-Histone berühren die Kernproteine dabei nicht und sind kein Bestandteil der Nukleosomen. Sie stabilisieren jedoch die intermolekulare Faltung und die Interaktionen der Chromatinfasern untereinander (Carruthers et al., 1998). Die weitere Kompaktierung der DNA erfolgt vermutlich über die Assoziation von 30nm- Chromatinfaserschleifen mit einem flexiblen Chromosomengerüst aus Nichthistonproteinen, das als nukleare Matrix oder scaffold bezeichnet wird (Berezney and Coffey, 1974). Dadurch entsteht die für die Interphase charakteristische Form der dekondensierten Chromosomen.
Durch die Spiralisierung des Gerüsts zu einer Helix und deren weitere Kondensation entsteht wahrscheinlich die für die Metaphase typische hoch kondensierte Struktur des Chromosoms.
Abb. 1-1: Modell für die Packung des Chromatins und des Chromosomengerüsts in Metaphasechromosomen;
aus Lodish et al., 2001.
1.1.3. Eu- und Heterochromatin
Chromatin wird nach funktionellen Aspekten in Eu- und Heterochromatin unterteilt.
Euchromatin entspricht dabei im allgemeinen genomischen Regionen, die transkriptionell aktiv sind und in der Interphase dekondensiert vorliegen. Die regulatorischen Sequenzen dieser Regionen sind für sequenzunspezifische Endonukleasen sensitiv und besitzen als charakteristisches Merkmal neben unmethylierten CpG-Inseln (nicht in Hefen, da diese keine DNA Methylierung besitzen), hyperacetylierte Lysine an den N-terminalen Aminoacylenden der Histone H3 und H4. Euchromatische Bereiche werden in der frühen S-Phase repliziert (Arney and Fisher, 2004; Grewal and Elgin, 2002). Die meisten für Proteine codierenden Gene liegen in dieser Form vor.
Heterochromatin hingegen ist transkriptionell inaktiv und hochkondensiert. Die DNA des Heterochromatins ist für Nukleasen, sowie DNA-Bindeproteine weniger zugänglich. Die CpG-Dimere sind normalerweise methyliert und die Aminoacylenden der Histone sind deutlich hypoacetyliert. Heterochromatin wird weiterhin in konstitutives und fakultatives Heterochromatin unterteilt.
Konstitutives Heterochromatin, das in allen somatischen Zellen vorkommt, ist genarm und bildet sich meist an repetitiven Sequenzen, wie dem Centromer und den Telomeren aus.
Diese Regionen werden erst spät in der S-Phase repliziert. Die Histone H3 und H4 sind typischerweise an den Lysinen K9 (nicht in S. cerevisiae) bzw. K20 trimethyliert. In S.
cerevisiae, wird die Genstillegung an den Telomeren durch das Anlagern eines Multiproteinkomplexes aus Rap1p und den SIR Proteinen (silent information regulator) vermittelt (Grunstein, 1997).
Fakultatives Heterochromatin hingegen repräsentiert den Teil des Heterochromatins, an dem keine Genexpression stattfindet, da es während der Entwicklung transkriptionell abgeschaltet wurde. Beispiele hierfür sind die Inaktivierung des weiblichen X-Chromosoms der Säugetiere, der stillen Paarungstyploci (mating-type-Gene) der Hefen und der Hox-Gene von Drosophila. Die Histone H3 und H4 sind typischerweise an den Lysinen K9 (nicht in S.
cerevisiae) bzw. K20 di- bzw. trimethyliert (Schotta et al., 2002). Für die Inaktivierung der stillen Paarungstyploci in S. cerevisiae wird neben den Proteinen zur Telomerstillegung zusätzlich Sir1p benötigt.
Das Chromatin einer Zelle ist keinesfalls starr, sondern äußerst dynamisch, so daß heterochromatische und euchromatische Bereiche aneinander anschließen. Die räumliche Verteilung stärker und schwächer entfalteter Chromatinabschnitte im Zellkern beeinflußt vermutlich nukleäre Funktionen, wie die Genaktivität (Chubb and Bickmore, 2003). Diese kann in euchromatischen Genen unterschiedlich reguliert werden. Euchromatische Gene, die sich in der Nähe heterochromatischer Bereiche befinden, können durch das Ausbreiten (spreading) des Heterochromatins entlang der DNA stillgelegt werden. Dieser Effekt wird als position effect variegation bezeichnet (Reuter and Spierer, 1992; Schotta et al., 2003).
An der Entstehung des Heterochromatins und dessen Erhaltung sind also eine Vielzahl von Faktoren beteiligt, die miteinander interagieren können. Dazu gehören vor allem die Histonmodifikationen, die Umgestaltung des Chromatins (Chromatin remodeling), die DNA Methylierung, sowie der RNA-Interferenz-Mechanismus höherer Eukaryoten (RNAi).
1.1.4. Posttranslationale Histonmodifikationen und Histonvarianten
In den Kernhistonen können über 30 Aminosäurereste im chromosomalen Kontext modifiziert werden, wobei eine Vielzahl der posttranslationalen Modifikationen an den N- terminalen Aminoacylenden stattfindet (Fischle et al., 2003). Zu den Hauptmodifikationen zählen die Acetylierung und Methylierung.
Die Hypothese des sogenannten Histon Codes besagt, daß eine bestimmte Kombination posttranslationaler Histonmodifikationen zur Rekrutierung spezieller transagierender Faktoren führt, die wiederum den funktionellen Zustand der lokalen Chromatinumgebung verändern (Jenuwein and Allis, 2001; Strahl and Allis, 2000). Es wird angenommen, daß die Histonmodifikationen als Markierungssystem dienen, welches von regulatorischen Proteinen erkannt und/oder gelesen (dechiffriert) wird. Diese Markierungen scheinen die Chromatinstruktur direkt zu beeinflussen. Somit spielen die Histonmodifikationen eine entscheidende Rolle bei der Dynamik der Chromatinstruktur und der damit verbundenen Regulation der Genexpression.
A. Acetylierung von Lysin
Die Histonacetylierung, wurde bereits 1964 mit dem Anstieg der transkriptionellen Aktivität in Zusammenhang gebracht (Allfrey et al., 1964). Hyperacetylierte Bereiche (mindestens
zwei Lysinreste beliebiger Kernhistone eines einzelnen Nukleosoms sind acetyliert) korrelieren dabei meist mit der transkriptionellen Aktivität, weniger starke Acetylierung korreliert mit dem reprimierten Zustand und kompaktiertes, stillgelegtes Chromatin liegt hypoacetyliert vor (Fischle et al., 2003; Grunstein, 1997; Katan-Khaykovich and Struhl, 2002). In S. cerevisiae ist der Großteil des Genoms transkriptionell aktiv, die Kernhistone sind hyperacetyliert (Clark et al., 1993), die wenigen stillgelegten Bereiche, wie die mating- type-Gene und die Telomere, besitzen hypoacetyliertes Histon H4 (Braunstein et al., 1993).
Das Gleichgewicht von Acetylierung und Deacetylierung spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation zahlreicher zellulärer Prozesse, wie der genomweiten basalen Transkription, der Wahl des günstigsten Replikationszeitpunktes, der DNA-Reparatur oder der genspezifischen Transkription (Hasan and Hottiger, 2002; Kurdistani and Grunstein, 2003).
B. Methylierung von Lysin und Arginin
Die Histonmethylierung wurde sowohl im Zusammenhang mit der transkriptionellen Reprimierung als auch der Aktivierung als wichtige Modifikation identifiziert (Margueron et al., 2005) und ist für die Histone H3 und H4 am besten untersucht. Sechs Lysinreste wurden dabei besonders intensiv erforscht (H3K4, -9, -27, -36 und -79 und H4K20) und sowohl mit der transkriptionellen Regulation als auch der DNA-Reparatur in Zusammenhang gebracht (Margueron et al., 2005; Martin and Zhang, 2005). Lysin kann mono-, di- oder trimethyliert werden (Bannister and Kouzarides, 2004), Arginin kann sowohl mono- als auch symmetrisch oder asymmetrisch dimethyliert werden (Bedford and Richard, 2005). Für die Funktionalität der Methylierung ist die Anzahl der Modifikationen in Kombination mit den Positionen der modifizierten Aminosäurereste entscheidend (Lachner and Jenuwein, 2002; Lachner et al., 2003).
Viele der kovalenten Histonmodifikationen sind reversibel. Dadurch kann die Zelle auf Änderungen schnell reagieren und die Genexpression entsprechend regulieren. Für die Methylierung galt die letzen 30 Jahre, daß sie irreversibel sei, doch LSD1 (Lysin spezifische Demethylase) wurde von Shi et al., 2004 als erste Histondemethylase identifiziert.
C. andere Histonmodifikationen
Neben den bereits genannten Modifikationen gibt es eine Vielzahl weiterer Histonmodifikationen. Die Phosphorylierung von Serin und Threonin wird beispielsweise mit der Mitose und der Transkriptionsaktivierung in Zusammenhang gebracht (Hsu et al., 2000).
Eine neuere Studie gibt Hinweise darauf, daß die Phosphorylierung von Serin 1 des Histons H4 die Sporulation von S. cerevisiae reguliert und eine evolutiv konservierte Rolle bei der Kompaktierung des Chromatins in den späteren Stadien der Gametogenese spielt.
(Krishnamoorthy et al., 2006). Die Peptide Ubiquitin und SUMO (small ubiquitin-related modifier) können kovalent an Lysin angehängt und auch wieder entfernt werden. Am häufigsten sind davon die Histone H2A und H2B höherer Eukaryoten betroffen. Die Ubiquitinierung ist meist mit transkriptionell aktivem Chromatin verbunden (Sun and Allis,
2002). Die Sumoylierung scheint hingegen mit der transkriptionellen Repression verbunden zu sein (Shiio and Eisenman, 2003). Die ADP-Ribosylierung, bei der ADP-Ribose auf eine Glutaminsäure oder auf Arginin der Kernhistone übertragen wird, spielt z.B. bei der Reparatur beschädigter DNA eine wichtige Rolle und ist für die transkriptionelle Aktivität bestimmter induzierbarer Gene wichtig, sowie an der Stillegung anderer Gene beteiligt (Kraus and Lis, 2003). Über die Biotinylierung von Lysin, die mit stillgelegtem Chromatin verbunden scheint, ist bisher wenig bekannt. Einige der Kernhistone humaner Zellen sind davon betroffen (Stanley et al., 2004). Weitere Modifikationen sind die Glycosylierung und die Glutaminylierung.
D. Histonvarianten
Zusätzlich zu den Histonmodifikationen können die Kernhistone durch Histonvarianten ersetzt sein. Diese unterscheiden sich von den normalen Histonen meist in der Zusammensetzung ihrer N-terminalen Aminoacylenden und verleihen den Nukleosomen somit eine spezialisierte Funktion (Henikoff et al., 2004). Einige dieser Varianten reichern sich in spezifischen chromosomalen Bereichen an. Histonvarianten von H2A und H3 sind seit langem bekannt und in die Ausbildung alternativer Chromatinzustände involviert. Das centromerische Protein A (CENP-A) ist eine Histon H3 Variante und für die Struktur und Funktion von Centromeren essentiell (Ahmad and Henikoff, 2001). Höhere Eukaryoten haben außerdem eine H3 Austauschvariante, H3.3, die sich in nur vier Aminosäureresten von H3 unterscheidet. H3.3 wird während des gesamten Zellzykluses synthetisiert und mit Hilfe des HIRA-Komplexes in die Nukleosomen eingebaut (Tagami et al., 2004), Histon H3 hingegen wird nur während der Replikation eingebaut. Euchromatin und hoch transkribierte Regionen, wie die ribosomale DNA, sind besonders reich an H3.3. Replikationsunabhängiger Einbau von H3.3 zeichnet aktives Chromatin aus (Ahmad and Henikoff, 2002). H2A.Z ist eine weitere Histonvariante, die mit transkriptionell aktivem Chromatin assoziiert ist. In S.
cerevisiae wird die H2A.Z-Variante Htz1 in der Nähe stillgelegter Chromatinbereiche des Genoms eingebaut und verhindert damit das Ausbreiten des Heterochromatins (s. 1.1.3.) (Meneghini et al., 2003).
1.2 Struktur und Transkription ribosomaler DNA (rDNA) in S. cerevisiae
1.2.1. Struktur der rDNA
Die rDNA ist in vielerlei Hinsicht einzigartig. Sie ist eines der redundantesten Gene eines eukaryotischen Genoms, sie besitzt ihre eigene RNA Polymerase (Pol I) und nur etwa die Hälfte ihrer Genkopien wird aktiv transkribiert. Eukaryoten besitzen drei zelluläre RNA Polymerasen zur Synthese eines jeweils anderen RNA Typs. RNA Polymerase II transkribiert alle proteincodierenden Gene (mRNA), sowie kleine Kern-RNAs (small nuclear RNAs, snRNAs), RNA Polymerase III synthetisiert die 5S rRNA, die tRNA und andere kurze, relativ stabile RNAs. RNA Polymerase I (Pol I) ist für die Transkription der ribosomalen DNA (rDNA) zuständig. In einer Hefezelle beträgt die Transkription der rDNA ~60% der Gesamttranskription und die der ribosomalen Proteine ~50% der Pol II Transkription (Rudra and Warner, 2004; Warner, 1999). Die rDNA codiert für ein 35S-rRNA-Vorläufertranskript, das zu den drei großen ribosomalen Struktur-RNAs, der 18S, 25S und 5.8S rRNA prozessiert und anschließend mit der 5S rRNA und den ribosomalen Proteinen zu den Ribosomenuntereinheiten zusammengebaut wird. Das Ribosom besteht aus der kleinen 40S- (beinhaltet die 18S rRNA) und der großen 60S- (beinhalted die 5S, 5,8S und 25S rRNA) Untereinheit. Die Synthese und Prozessierung der rRNA, sowie der Ribosomenzusammenbau finden im Nukleolus statt. Die fertigen Ribosomen werden mit Hilfe der Noc-Proteine vom Zellkern ins Zytoplasma transportiert, wo sie schließlich für die Proteinsynthese zur Verfügung stehen.
Die rDNA Kopienzahl kann von Hunderten in Säugern bis hin zu Tausenden in Pflanzen reichen. Die rRNA Gene können dabei gruppiert auf einem oder mehreren Chromosomen lokalisiert sein. Werden diese Bereiche aktiv abgelesen, können sie in EM-Analysen als distinkte nukleäre Strukturen, sog. Nukleolus organisierende Regionen (NORs), erkannt werden. In S. cerevisiae sind 150-200 Kopien auf dem rechten Arm von Chromosom XII tandemartig in „Kopf-Schwanz“-Formation (head to tail) angeordnet und machen ungefähr ein Zehntel des gesamten Genoms aus. Eine einzelne Transkriptionseinheit umfaßt einen Bereich von 9,1kb und enthält die Information für alle vier rRNA-Spezies. Die 35S rDNA wird von zwei extern transkribierten Spacern (5’ETS und 3’ETS) umgeben, die Sequenzen der „reifen“ rRNAs (18S, 5.8S und 25S) werden durch zwei intern transkribierte Spacer (ITS1 und ITS2) voneinander getrennt (Abb. 1-2). Am 3’Ende der 35S rDNA liegt der Terminator und unmittelbar dahinter, ein Enhancer benannter DNA-Bereich, welcher als trans-Element der Regulation von RNA Pol I abhängiger Transkription beschrieben wurde.
Der Enhancer ist allerdings für das Zellwachstum entbehrlich (Wai et al., 2001). Die 5S rDNA liegt hinter der 35S rDNA, zwischen zwei intergenen Spacern (IGS1 und IGS2) und wird bezüglich der 35S rDNA in gegenläufiger Richtung von Pol III transkribiert. Zwischen der 35S und der 5S rDNA liegt die Barriere für die Replikationsgabel (replication fork
barrier RFB), zwischen der 5S rDNA und der nächsten Transkriptionseinheit liegt eine autonome Replikationssequenz (ARS), die als Replikationsursprung dient (s. 1.4.3.).
Abb. 1-2: Schematische Darstellung des rDNA Lokuses in S. cerevisiae. R/L rechts und links flankierende Sequenzen der rDNA, TEL Telomer, CEN Zentromer, P Promotor, E Enhancer, T Terminator, RFB Replikationsgabelbarriere, ARS autonome Replikationssequenz, IGS1/2 intergener Spacer 1 und 2, ITS1/2 intern transkribierter Spacer 1 und 2, ETS extern transkribierter Spacer.
1.2.2. Transkription der rDNA
Für die Initiation der rDNA Transkription in S. cerevisiae sind neben der RNA Polymerase I, die aus 14 Untereinheiten besteht, zwei weitere Multiproteinkomplexe erforderlich, die an den rDNA Promotor binden (Abb. 1-3). Dieser erstreckt sich über rund 150bp und enthält neben dem core Element (CE; von -28 bis +8) im Bereich des Transkriptionsstarts, das upstream Element (UE; von -146 bis -51; Choe et al., 1992; Kulkens et al., 1991). An das UE bindet der upstream activating Faktor (UAF), bestehend aus den sechs Untereinheiten Rrn5p, Rrn9p, Rrn10p, Uaf30p, sowie den Histonen H3 und H4 (Keener et al., 1997; Keys et al., 1996; Siddiqi et al., 2001a). Der core Faktor (CF), der aus den drei Polypeptiden Rrn6p, Rrn7p und Rrn11p besteht, bindet daraufhin an das CE (Keys et al., 1994; Lin et al., 1996).
Beide Multiproteinkomplexe sind über das TATA-Bindeprotein (TBP) miteinander verbunden (CF über Rrn6p und UAF über Rrn9p; Steffan et al., 1998). Die Assoziation von UAF mit dem Promotor ist sehr stabil und UAF bleibt während des gesamten Trankriptionszykluses an ihn gebunden. UAF fördert die Bindung des für die Transkription essentiellen CFs, dessen Bindung hingegen zyklisch sein könnte (Aprikian et al., 2001; Bordi et al., 2001). Deletionen von UAF-Komponenten (Rrn5p, Rrn9p oder Rrn10p) führen dazu, daß die Pol I Transkription komplett abgeschaltet wird. Die Umstellung der endogenen rDNA Transkription von Pol I auf Pol II, auch polymerase switch for growth (PSW) genannt, verleiht Hefen mit einer solchen Mutation die Fähigkeit zu wachsen, wenn auch nur extrem
Abb. 1-3: Bindung des RNA Polymerase I Transkriptionskomplexes an den rDNA Promotor und Initiation der Transkription in S.cerevisiae. UE upstream Element, Core core Element, TBP Tatabindeprotein, RPI RNA Polymerase I; aus Moss et al., 2007.
langsam und kaum dazu befähigt, Kolonien zu bilden. Für den PSW ist neben einer Deletion in UAF und der Expansion der chromosomalen rDNA Kopien Rpd3p erforderlich. Rpd3p wird für eine effiziente Pol II Transkription, nicht jedoch für die Pol I Transkription der rDNA benötigt (Oakes et al., 2006a). Hefen mit einer Uaf30p-Deletion weisen eine höhere Wachstumsrate auf und können sowohl von Pol I als auch Pol II transkribiert werden (Siddiqi et al., 2001a).
Mutationen in Genen, die die Rekombination der rDNA Kopien beeinflussen, wie fob1 (replication fork blocking; Kobayashi and Horiuchi, 1996) oder sir2 (silent information regulator 2), vermindern bzw. steigern die Fähigkeit zum PSW. Mutationen der Pol I oder anderer Transkriptionsfaktoren, wie CF oder Sir2p, können nicht eigenständig zur rDNA Transkription durch Pol II führen.
UAF nimmt somit eine spezielle Rolle dabei ein, die Transkription der rDNA durch Pol II zu unterbinden (Conrad-Webb and Butow, 1995; Oakes et al., 1999; Siddiqi et al., 2001b; Siddiqi et al., 2001a; Vu et al., 1999).
Daß Pol II dazu befähigt ist, funktionale rRNA zu synthetisieren wurde bereits in
Mutanten gezeigt, denen eine funktionelle Pol I fehlte und die die rDNA von einem Helferplasmid unter Kontrolle von dem RNA Polymerase II abhängigen GAL7-Promotor abschrieben (Nogi et al., 1991).
Nach der Bindung der basalen Transkriptionsfaktoren wird die Transkription durch die Rekrutierung der Pol I initiiert, wobei diese nur mit Rrn3p komplexiert initiationskompetent ist. Rrn3p interagiert dabei neben der A43-Untereinheit von Pol I auch mit Rrn6p des core Faktors (Milkereit and Tschochner, 1998; Peyroche et al., 2000; Yamamoto et al., 1996).
Nach der Initiation der Transkription geht die rRNA Synthese in die Elongationsphase über, bei der keiner der Transkriptionsfaktoren mit Pol I verbunden bleibt. Rrn3p dissoziiert von Pol I, während oder kurz nachdem diese den Promotor verläßt (Bier et al., 2004). Die Termination wird durch Reb1p vermittelt, das an eine definierte Bindesequenz am 3’Ende der Transkriptionseinheit bindet und die Termination direkt stomaufwärts über eine T-reiche Sequenz, die als Entlassungselement für die Polymerase dient, fördert (Lang et al., 1994;
Lang and Reeder, 1993). Kempers-Veenstra et al., 1986 postulierten das Modell des
„Ribomotors“, welches die Vorstellung vertritt, daß jede rDNA Einheit die Form einer Schleife (loop) annimmt, so daß der Promotor und das Terminator/Enhancer-Element der gleichen, sowie der benachbarten Transkriptionseinheit in unmittelbare Nähe gebracht werden. Terminierende Pol I Moleküle könnten somit direkt vom Terminator/Enhancer- Element auf den Promotor der gleichen oder der proximal stomabwärts gelegenen Transkriptionseinheit übergehen, ohne zuvor in den freien Pool überzutreten. Die Bindung von Reb1p an eine zweite Bindestelle, ca. 215bp stromaufwärts der 35S rDNA Transkriptionsstartstelle (Morrow et al., 1989), wurde mit möglichen Änderungen der Chromatinstruktur in Zusammenhang gebracht, die über das Wechselpiel von Enhancer, Promotor und Transkriptionsfaktoren die Transkription regulieren könnten (Kulkens et al., 1992). Eine andere Studie hingegen schließt eine unmittelbare Beteiligung von Reb1p bei der Pol I Transkription aus (Bordi et al., 2001). Rpa12p, die kleine Untereinheit der Pol I, die zu den Untereinheiten Rpb9p von Pol II und Rpc11p von Pol III, die beide in die Transkriptionstermination involviert sind, homolog ist, spielt möglicherweise auch bei der Termination der Pol I Transkription eine Rolle (Prescott et al., 2004). Nach der Termination und dem Abdissoziieren der Pol I von der rDNA, bleibt die Polymerase ohne einen Austausch ihrer Untereinheiten vorzunehmen intakt und steht für weitere Transkriptionsrunden zur Verfügung (Schneider and Nomura, 2004).
Hmo1p, ist ein sequenzunspezifisches HMG-Box Protein, das als „funktionelles“ Homolog des rDNA Transkriptionsfaktors UBF (upstream binding factor) diskutiert wird. Wie der humane UBF asoziiert Hmo1p mit dem gesamten rDNA Lokus und neben seiner Rolle in der Transkription wird dieses Protein für die Prozessierung der rRNA benötigt (Hall et al., 2006).
Hmo1p agiert synergistisch mit Rpa49p und scheint die Transkription der rRNA Gene zu steigern (Gadal et al., 2002). Vor kurzem konnte gezeigt werden, daß es kooperativ mit den Transkriptionsfaktoren Rap1p und Fhl1p an die Promotoren vieler ribosomaler Proteine (rPs) bindet (Martin et al., 2004; Schawalder et al., 2004; Wade et al., 2004). Die Bindung dieser Faktoren ist für eine effiziente Transkription der rPs notwendig. Hmo1p könnte somit eine Rolle bei der Koordination der Transkription ribosomaler und der für ribosomale Proteine codierenden Gene spielen (Hall et al., 2006). Zur Übersicht siehe Comai, 2004; Moss, 2004;
Moss et al., 2007; Russell and Zomerdijk, 2005.
Die Transkriptionsmaschinerie von Pol II und Pol III ist in Hefen und Vertebraten weitgehend konserviert. Obwohl UAF und UBF, sowie CF und SL1 ähnliche biochemische Eigenschaften besitzen, besteht der grundlegende Unterschied der Pol I Transkription von Hefen und Vertebraten darin, daß in der Hefe bisher keinerlei Homologe für SL1 und UBF gefunden wurden (Comai, 2004). Die Transkriptionsinitiation läuft bei den Säugern jedoch auf ähnliche Weise ab. UBF, ein Dimer, bindet über seine HMG-Boxen an das upstream control element (UCE), woraufhin der Selektivitätsfaktor (SL1; in der Maus: TIF-IB), bestehend aus TBP und mindestens drei TBP-assoziierten Faktoren (TAF), TAFI48, TAFI68/63 und TAFI95/110, an CE bindet. TAFI68 ist zu Rrn7p und TAFI48 zu Rrn11p des core Faktors der Hefe homolog (Russell and Zomerdijk, 2005 und Referenzen darin). TBP besitzt die Fähigkeit zur Bildung eines Enhanceosoms, bei dem ein UBF-Dimer die DNA mit
einer Länge von 140bp einmal um 360°C windet (Bazett-Jones et al., 1994), so daß eine nukleosomenähnliche Struktur entsteht, und somit die Interaktion von SL1 und UBF unterstützt. Die Bindung von UBF ist jedoch nicht nur auf die regulatorischen Sequenzen der rDNA beschränkt, es ist wie Hmo1p vielmehr über die gesamte rDNA verteilt (O'Sullivan et al., 2002). Das unterscheidet dieses von einem „klassischen“ Enhanceosom, welches nur an den Enhancer bindet und die Initiation der Transkription beeinflußt. Der Phosphorylierungszustand von UBF spielt hingegen bei der Elongation der Pol I Transkription eine Rolle (s. 1.3.2.). Im Gegensatz zur Pol II Transkription bindet TBP nicht an die DNA und die Promotorerkennung erfolgt anstelle von TBP über die TAFIs (Grummt, 2003). Pol I, die wiederum mit hRrn3p (Maus: TIF-IA) assoziiert ist (Bodem et al., 2000;
Moorefield et al., 2000), wird daraufhin durch die Interaktionen der SL1 Untereinheiten TAFI63 und TAFI110 und Rrn3p, sowie des UBFs mit PAF53 (Homolog von Rpa49p der Hefe), rekrutiert (Hanada et al., 1996; Seither et al., 1997). In neueren Studien wurde TAFI41 als weiterer Bestandteil von transkriptionell aktivem SL1 identifiziert. SL1, inklusive der TAFI41 Untereinheit, könnte eine Rolle bei der Rekrutierung von Pol I und somit bei der Ausbildung des Preinitiationskomplexes in vivo spielen (Gorski et al., 2007). In der Maus ist zusätzlich noch der Faktor TIF-IC mit Pol I assoziiert, der sowohl in die Transkriptionsinitiation, sowie die Elongation involviert ist (Schnapp et al., 1994). Die Transkription wird durch den Transkriptionsterminationsfaktor I TTF-I beendet (Jansa and Grummt, 1999). Zur Übersicht siehe Comai, 2004; Moss, 2004; Moss et al., 2007; Russell and Zomerdijk, 2005.
1.3. Regulation der RNA Polymerase I Transkription
Als Reaktion auf intra- wie extrazelluläre Wachstumsignale wie Nährstoffangebot, Temperatur oder Streß wird die Ribosomenbiogenese streng reguliert (Gasch et al., 2000; Ju and Warner, 1994; Warner, 1999). Der TOR (target of rapamycin) Kinase Signaltransduktionsweg ist ein wichtiger Signaltransduktionsweg für die Modulation der rRNA, der ribosomalen Proteine und der 5S rRNA als Reaktion auf die Verfügbarkeit von Nährstoffen. Er ist bei Nährstoffverfügbarkeit aktiv und bei Nährstoffmangel inaktiv. TOR wird durch das Antibiotikum Rapamycin inaktiviert, wobei der Effekt eines Nährstoffmangels imitiert wird (Crespo and Hall, 2002). Die Unterdrückung des TOR Signaltransduktionsweges durch Rapamycin reprimiert die rDNA Transkription von Pol I und Pol III, sowie die Pol II Transkription ribosomaler Proteine (Powers and Walter, 1999;
Zaragoza et al., 1998), wobei über die genaue Regulation der Synthese ribosomaler Komponenten durch TOR noch wenig bekannt ist. Während die TOR Inaktivierung bei der Pol I Transkription die Bildung des Rrn3p-Pol I Initiationskomplexes verhindert (Claypool et al., 2004), werden bei der Pol II abhängigen Transkription der ribosomalen Proteine
Transkriptionsfaktoren in ihrer Funktion beeinflußt (Jorgensen et al., 2004; Martin et al., 2004; Schawalder et al., 2004; Wade et al., 2004).
Die Regulation der Ribosomenbiogenese auf Ebene der rRNA Synthese ist ein Objekt intensiver Forschungsbemühungen. Laferte et al., 2006 konnten vor kurzem zeigen, daß die Genexpression ribosomaler Proteine in S. cerevisiae von der rRNA Syntheserate abhängt.
Lange Zeit wurde darüber diskutiert, ob die Transkription durch die Anzahl aktiver rRNA Gene oder die Transkriptionsrate aktiver rRNA Gene reguliert würde. Da die Anzahl der aktiven rRNA Gene auch nach dem Abschalten der Pol I Transkription weitgehend konstant bleibt (Claypool et al., 2004; Conconi et al., 1989; Fahy et al., 2005; French et al., 2003) ist offensichtlich nur deren Transkriptionsrate von Bedeutung. Im Gegensatz zu den für Proteine codierenden Genen, wird die Pol I Transkription nur auf Ebene der Transkriptionsinitiation und -Elongation reguliert.
1.3.1. Regulation der Transkriptionsinitiation
Die Regulation der rRNA-Synthese durch Wachstumssignale, wie Nährstoffangebot, Temperatur oder Streß ist evolutiv hoch konserviert und wurde in Bakterien, Hefen, Pflanzen und Vertebraten gefunden.
Für die Initiation der Transkription durch Pol I ist die Assoziation der Pol I mit Rrn3p essentiell, wobei nur ein geringer Teil (< 2%) der Pol I komplexiert vorliegt. Fehlt dieser transkriptionskompetente Pol I-Rrn3p Komplex, wie es z.B. während der stationären Phase der Fall ist, wird die rDNA Transkription herunter reguliert (Milkereit and Tschochner, 1998). Für die Bildung des funktionellen Pol I-Rrn3p-Komplexes, ist die Phosphorylierung der Pol I erforderlich. Rrn3p liegt ebenfalls in phosphorylierter Form vor, die Phosphorylierung scheint jedoch in der Hefe, im Gegensatz zu den Säugern, keine Voraussetzung für die Initiation der Transkription zu sein (Fath et al., 2001). Kurz nach der Transkriptionsinitiation verläßt Rrn3p den Komplex und seine Initiationsfähigkeit ist erschöpft (Milkereit and Tschochner, 1998). Für die Elongation ist die Dissoziation des Pol I- Rrn3p Komplexes jedoch nicht erforderlich (Laferte et al., 2006).
Nährstoffmangel oder Inhibitoren der Proteinbiosynthese führen bei Säugern wie Hefen gleichermaßen zur Inaktivierung von Rrn3p. Rrn3p ist also der Schlüsselregulator der rDNA Transkription. In Säugerzellen wird die Pol I Transkription durch die mTOR und MAP- Kinase (EGF (epidermal growth factor) und ERK (extracellular signal-regulated kinase)) Signaltransduktionswege über hRrn3p beeinflußt (Russell and Zomerdijk, 2005). In Hefezellen wird das Eintreten in die stationäre Phase durch den RAS/Protein Kinase A und den TOR Kinase Signaltransduktionsweg reguliert (Thevelein and de Winde, 1999).
Rapamycinbehandlung von Hefezellen (Claypool et al., 2004) und das Eintreten in die stationäre Phase (Milkereit and Tschochner, 1998) reduzieren die rRNA-Syntheserate etwa auf ein Zehntel, ebenso die Mengen an Pol I und Rrn3p. „Miller spread“ Analysen der rRNA Gene zeigen, daß Rapamycin die Anzahl der Polymerasen eines einzelnen rRNA Gens
reduziert, die Anzahl an aktiv transkribierten rRNA Genen jedoch nicht verändert (Claypool et al., 2004).
Weder in Hefen noch in Säugern wurde bisher eine vom Zellwachstum abhängige Regulation der Initiationskomplexe UAF/CF und SL1 gefunden. Im Gegensatz zu den Hefen wird die Transkription in Säugerzellen auch in Abhängigkeit des Zellzykluses reguliert. Die Transkription ist in der S und G2 Phase am höchsten, wird während der Mitose abgeschaltet und beginnt langsam wieder in der G1 Phase. Änderungen im Phosphorylierungsmuster von UBF spielen dabei eine Schlüsselrolle. UBF kann an den beiden N-terminalen HMG1-Boxen durch ERK1/2 reversibel phosphoryliert werden, was für die Initiation der Transkription nötig ist. Jüngste Ergebnisse zeigen, daß diese Phosphorylierung auch die Transkriptionselongation reguliert (s. 1.3.2.). Die Phosphorylierung des C-Terminuses von UBF durch die Casein Kinase II erleichtert die Interaktion von UBF mit SL1 (Tuan et al., 1999). In ruhenden Zellen ist UBF hypophosphoryliert und transkriptionell inaktiv (Voit et al., 1995; Voit et al., 1992). Die Acetylierung des UBFs durch die Histonacetyltransferase CBP steigert die Pol I Aktivität (Hirschler-Laszkiewicz et al., 2001). SL1 kann ebenfalls phosphoryliert und acetyliert werden. Die Acetylierung von TAFI68 durch PCAF erleichtert die Bindung des TAFI68 an die DNA, wohingegen seine Deacetylierung durch mSir2a die Pol I Transkription reprimiert (Muth et al., 2001). TAFI110 ist während der Mitose durch CDK1/Cyklin B phosphoryliert, wodurch die Fähigkeit des SL1 zur Interaktion mit UBF reprimiert wird und die Transkription abgestellt wird (Heix et al., 1998). Zur Übersicht siehe Grummt, 2003.
1.3.2. Regulation der Transkriptionselongation
„Miller spread“ Analysen der rRNA Gene zeigen, daß die rDNA mit einer außerordentlich hohen Dichte an Pol I Komplexen beladen ist (Miller and Beatty, 1969). Während die meisten Pol II transkribierten Gene mit nur einer Polymerase assoziiert sind (Jackson et al., 1998), befindet sich auf der rDNA schätzungsweise alle 110-130 Nukleotide ein Pol I Komplex (French et al., 2003). Dies schließt eine großartige Steigerung der Beladung der Gene mit Pol I aus. In Tierzellen wurde tatsächlich beobachtet, daß die Anzahl der Pol I Komplexe an der rDNA trotz großen Unterschieden in der rRNA Synthese nahezu konstant bleibt, was dafür spricht, daß die Elongation in vivo reguliert werden muß (Moss et al., 2007;
Stefanovsky et al., 2006b).
Eine bemerkenswerte Ausnahme bildet jedoch S. cerevisiae, die ihre rRNA Synthese durch das Anpassen der Polymerasedichte an aktiven Genen regulieren kann. So produzieren beispielsweise exponentiell wachsende Hefezellen eines Stammes (NOY886), der nur ~42 rDNA Kopien besitzt, die gleiche rRNA Menge und zeigen ein ähnliches Wachstumsverhalten auf wie ein Wildtypstamm mit ~143 rDNA Kopien, von denen etwa die Hälfte aktiv ist (~50 ± 20 Polymerasen/Gen, d.h. eine Polymerase/~132nt; Abb. 1-4). Im 42- Kopienstamm hingegen sind alle rRNA Gene aktiv (~100 ± 29 Polymerasen/Gen, d.h.
eine Polymerase/~67nt). Die Anzahl der aktiven Polymerasen pro Nukleus ist demnach die gleiche, obwohl die Anzahl der aktiven Gene um das zweifache variiert. Dies zeigt, daß die Transkription nicht von der Anzahl aktiver Gene, sondern von der Gesamtinitiationsrate bestimmt wird (French et al., 2003). Ein weiteres Beispiel ist der Eintritt der Hefezellen in die stationäre Phase, bei dem die Stillegung der Transkription mit der Reduktion der Anzahl an transkribierenden Polymerasen pro Gen korreliert (Dammann et al., 1993; Sandmeier et al., 2002), wobei die Anzahl der aktiven rRNA Gene zeitgleich reduziert wird. Letztere Resultate beruhen auf Ergebnissen von Psoralenvernetzungsanalysen (s. 1.4.3) mit ganzen Hefezellen. Werden hingegen Nuklei aus stationären Zellen mit Psoralen vernetzt, ist die beobachtete Reduktion aktiver rRNA Gene deutlich geringer (Fahy et al., 2005, s. 1.4.3.). Für die Stillegung der rRNA Gene beim Eintritt in die stationäre Phase wird die Histondeacetylase Rpd3p benötigt. Deren Verlust verhindert den Übergang von rRNA Genen von einem Psoralen zugänglichen zu einem Psoralen unzugänglichen Zustand, er verhindert jedoch nicht, daß die Transkription abgeschaltet wird. Dies deutet darauf hin, daß die Transkriptionsregulation und die über Psoralenzugänglichkeit gemessene Geninaktivierung zwei voneinander unabhängigen Mechanismen unterliegen (Sandmeier et al., 2002).
Abb. 1-4: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von transkribierten rRNA Genen im (a) ~42 Kopienstamm und (b) Wildtypstamm. Die rRNA Gene des 42 Kopienstammes ist dichter mit Polymerasen besetzt als der Wildtypstamm. Der Balken entspricht 0,5µm; aus French et al., 2003.
Für Vertebraten hingegen wird seit einiger Zeit diskutiert, daß die Transkription auf Ebene der Elongation reguliert werden müsse, indem die Geschwindigkeit der Elongation durch nachfolgende Prozesse wie Prozessierung der rRNA oder den Ribosomenzusammenbau kontrolliert wird (Moss et al., 2006). In Säugern besitzt UBF die Fähigkeit zur Bildung eines Enhanceosoms (Bazett-Jones et al., 1994; s.1.2.2.). Kürzlich konnte gezeigt werden, daß die
Phosphorylierung von UBF durch ERK das Enhanceosom umgestaltet und dadurch tatsächlich die Transkriptionselongationsrate der Pol I
Komplexe durch das nukleoläre Chromatin bestimmt (Abb. 1-5;
Stefanovsky et al., 2006a; Stefanovsky et al., 2006b). Die Pol I Transkription der Säuger wird durch EGF aktiviert. Diese Reaktion wird wahrscheinlich durch die direkte Interaktion von ERK mit den HMG-Boxen, die es phosphoryliert, vermittelt (Stefanovsky et al., 2001).
Mutationen in den ERK-Stellen von UBF inhibieren dessen normale Funktion und blockieren die Aktivierung der ribosomalen Transkription durch EGF. Die Phosphorylierung durch ERK, sowie Mutationen, die diese
Phosphorylierung simulieren, vermindern die Affinität der einzelnen
HMG-Boxen des UBFs für lineare rDNA. Sie haben aber nur einen geringen oder keinen Effekt auf das Bindevermögen von diesen HMG-Boxen an gekrümmte DNA-Strukturen und beeinflussen die Gesamtbindekonstante von UBF an die DNA nicht.
Elektronenspektroskopische Untersuchungen ergaben, daß Stämme mit Mutationen in den ERK-Stellen des UBFs das charakteristische Looping der DNA zum Enhanceosom nicht induzieren und UBF mit weniger als der Hälfte der enhanceosomalen DNA assoziiert. Die Phosphorylierung von UBF durch ERK verhindert dessen Bindung über seine ersten zwei HMG-Boxen an die DNA, was zu einer kooperativen Entfaltung des Enhanceosoms führt (Stefanovsky et al., 2006a; Stefanovsky et al., 2006b). Somit scheint die enhanceosomale DNA das Passieren elongierender Pol I Komplexe zu blockieren und die Umgestaltung des Enhanceosoms nach der Phosphorylierung der HMG-Boxen das Fortsetzen der Elongation zu ermöglichen.
Neuerdings gibt es Hinweise darauf, daß die Transkription in S. cerevisiae möglicherweise auch auf Ebene der Elongation reguliert werden könnte. Die Pol II Elongationsfaktoren Spt4 und Spt5 sind vermutlich als Spt4/5 Komplex ebenfalls in die Transkriptionselongation von Pol I und evtl. die rRNA Prozessierung involviert. Demnach führt die Deletion von Spt4 zu einer Beeinträchtigung der Elongationseffizienz von Pol I, indem die Prozessivität des Enzyms reduziert wird. Es wurde vorgeschlagen, daß die verminderte Elongationsrate zu Defekten bei der rRNA Prozessierung und dem Ribosomenzusammenbau führt (Schneider et al., 2006). Zwei weitere Faktoren, die die Pol II Elongation beeinflussen, wurden bereits
Abb. 1-5: Modell der Elongationsregulation durch UBF- Phosphorylierung. Oben sind mehrere Enhanceosomezu sehen, die das Passieren der Pol I (RPI) verhindern, wohingegen unten die lokale Entfaltung des Enhanceosoms durch die ERK-vermittelte Phosphorylierung von UBF (*) die Elongation ermöglicht. Die DNA ist in hellgrau, die core-UBF- Dimere in dunkelgrau und das Transkript in schwarz dargestellt. Aus Stefanovsky et al., 2006b.
früher mit der Pol I Elongation in Zusammenhang gebracht. Zum einen Fcp1p, eine Phosphatase, die die C-terminale Domäne (CTD) von Pol II dephosphoryliert und für die Pol II Transkription benötigt wird und zum anderen die CTD Kinase 1 (CTDK-1; Bouchoux et al., 2004; Fath et al., 2004).
1.4. Chromatinstruktur der rDNA
1.4.1. Chromatinzustände der rDNA
Frühe Studien aus den 1970er und 80er Jahren führten zu der Hypothese von zwei in der gleichen Zelle koexistierenden rDNA Zuständen (Elgin and Weintraub, 1975; Foe et al., 1976; Franke et al., 1976; Gottesfeld et al., 1976; Higashinakagawa et al., 1977; Labhart and Koller, 1982; Laird et al., 1976; Mathis and Gorovsky, 1976; Matsui and Busch, 1977; Ness et al., 1983; Piper et al., 1976; Reeder, 1975; Reeves, 1976; Reeves, 1977; Reeves, 1978a;
Reeves, 1978b; Reeves and Jones, 1976; Weintraub and Groudine, 1976). Diese Hypothese bestätigte sich in den folgenden Jahrzehnten durch grundlegende Arbeiten des Labors von José Sogo. MNase Verdaue isolierter Nuklei zeigten ein nukleosomales Muster, das von einem „Schmier“ überlagert wurde, was für die Koexistenz verschiedener Chromatinformen sprach (Conconi, 1987). Diese Resultate zeigen jedoch auch, daß der MNase Verdau zur Untersuchung der ribosomalen Chromatinstruktur in seiner Aussagekraft limitiert ist: Das beobachtete Protektionsmuster repräsentiert die DNA-Zugänglichkeit in einer Mischung verschiedener Chromatinformen, die nicht eindeutig zugeordnet werden können. Desweiteren ist es mit Nukleaseverdauen nicht möglich, die Faktoren zu bestimmen, die die DNA vor Nukleasen schützen. Neben den Nukleosomen kommen alle anderen DNA-Bindeproteine (z.B. Transkriptionsfaktoren) in Betracht. Eine Methode, die zwischen aktivem und inaktivem Chromatinzustand unterscheiden kann, ist die Psoralenvernetzung (Abb. 1-6).
Psoralen ist ein aus drei Ringen bestehendes Furocumarin, das von Pflanzen der Gattung der Psoralea produziert wird. Es kann in doppelsträngige DNA interkalieren, und nach der Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht (UVA, z.B. 288nm) kovalente Bindungen mit zwei Thymidinen unterschiedlicher DNA-Stränge eingehen und somit zur Vernetzung der DNA- Stränge untereinander führen. Der Psoraleneinbau geschieht bevorzugt in den Linkerregionen zwischen Nukleosomen (Cech and Pardue, 1977) und in nukleosomenfreien Regionen, wie Promotoren, Enhancern oder rDNA codierender Regionen, ohne dabei die Nukleosomenstruktur oder höhere Chromatinstrukturen zu beeinträchtigen (Conconi et al., 1984; Gale and Smerdon, 1988). Nach der Aufreinigung der DNA bleibt die Signatur des Chromatins in Form einer charakteristischen Psoralenvernetzung erhalten. Wird die DNA anschließend mit einer Restriktionsendonuklease fragmentiert, über ein Agarosegel aufgetrennt und mittels Southernblot analysiert, so kann hochvernetzte DNA von weniger stark vernetzter DNA durch ein unterschiedliches Laufverhalten unterschieden werden.
Werden solche Untersuchungen mit Fragmenten aus dem codierenden Bereich des rDNA Lokuses durchgeführt, so könen zwei Banden beobachtet werden, eine schneller migrierende (f-band, fast migrating band), die aktive nukleosomale, schwach vernetzte rDNA Population repräsentierende und eine langsamer migrierende Bande (s-band, slow migrating band), die die aktive nukleosomenfreie, stark vernetzte rDNA repräsentiert. Dammann et al., 1993 haben die Banden für die aktive und inaktive Population aus einem Agarosegel isoliert und einzeln unter dem Elektronenmikroskop analysiert. Für die aktive Bande sahen sie eine stark vernetzte doppelsträngige DNA, wohingegen sie für die inaktive Fraktion einzelsträngige blasenartige Strukturen mit regelmäßigen Abständen sahen, wie es für Nukleosomen charakteristisch ist. Um herauszufinden, ob die s-Bande tatsächlich die transkriptionell aktive DNA enthält, markierten sie die RNA unter run-on Bedingungen mit α32P-CTP und α32P- UTP und vernetzten die Zellen anschließend mit Psoralen. Die DNA wurde linearisiert, im Agarosegel aufgetrennt und das Gel direkt analysiert. Nur die langsamer migrierende s-Bande war markiert, so saß sie bestätigen konnten, daß nur die stark psoralenzugängliche Fraktion transkriptionell aktive Gene enthält. Das Verhältnis der beiden Banden spiegelt das Verhältnis von aktiver zu inaktiver rDNA Population einer Zelle wider (Conconi et al., 1984;
Conconi et al., 1989; Wellinger and Sogo, 1998). Es ist stark variabel und vom Organismus und Zelltyp abhängig, die aktive Fraktion kann 20% bis hin zu 70% stellen (Toussaint et al., 2005).
Abb. 1-6: (A) Schematische Darstellung der Psoralvernetzung und (B) elektronenmikroskopische Aufnahmen der langsam (s-band) und schnell (f-band) migrierenden Banden. Der Balken entspricht 1kb; aus Dammann et al., 1993.
A
B
1.4.2. Stillegung der rDNA (rDNA silencing)
In S.cerevisiae sind nur drei Loci bekannt, an denen Genstillegung stattfindet, die stillen Paarungstyploci, die Telomere und die rDNA. Die Stillegung der rDNA unterdrückt die übermäßige Rekombination von rRNA Genen (Gottlieb and Esposito, 1989) und die Transkription von Pol II transkribierten Genen, die in den rDNA Lokus integriert wurden (Bryk et al., 1997; Fritze et al., 1997; Smith and Boeke, 1997). Die Stillegung der Pol II transkribierten Gene am rDNA Lokus wird durch den RENT Komplex (regulator of nucleolar silencing and telophase exit) vermittelt, der Sir2p, eine NAD-abhängige Protein- und Histondeacetylase enthält, die für die Deacetylierung der Lysine 9 und 14 des Histons H3 und Lysin 16 des Histons H4 verantwortlich ist (Fritze et al., 1997; Huang and Moazed, 2003; Imai et al., 2000). Diese Deacetylierung ist für die Ausbildung des eukaryotischen Heterochromatins essentiell. Für die rDNA Stillegung wird zusätzlich Set1p, eine Histonmethyltransferase benötigt (Briggs et al., 2001; Bryk et al., 2002). Als weiterer Faktor, der entweder direkt oder indirekt in die rDNA Stillegung involviert ist, wurde der Swi/Snf- Komplex, ein ATP-abhängiger Chromatinumgestaltungskomplex (remodeling Komplex), der die Transkription aktivieren oder reprimieren kann, indentifiziert. Die Stillegung durch den Swi/Snf-Komplex scheint durch einen von Sir2p und Set1p unabhängigen Mechanismus vermittelt zu werden. Swi/Snf wird auch für die Stillegung der Telomere, nicht jedoch für die der stillen Paarungstyploci benötigt (Dror and Winston, 2004).
Pol II transkribierte Reportergene, die in inaktive rDNA Gene, denen der Pol I Promotor fehlte, integriert wurden, wurden im chromosomalen Kontext nicht stillgelegt (Cioci et al., 2003). Die Stillegung von Reportergenen war in Stämmen mit ~25 rDNA Kopien, die alle transkriptionell aktiv waren, wesentlich stärker ausgeprägt als in Kontrollstämmen mit ~190 Kopien. Dies führte zum Modell der wechselseitigen Beziehung von RNA Polymerase I und II bei der Genexpression (reciprocal silencing): rDNA Chromatinstrukturen, die die Pol I Transkription der rRNA Gene begünstigen, vermindern die Genexpression von Pol II transkribierten Reportern oder legen sie still und umgekehrt (Cioci et al., 2003).
Während am rDNA Lokus von S. cerevisiae bisher nur die Stillegung Pol II transkribierter Gene gefunden wurde, werden bei höheren Eukaryoten die Pol I transkribierten rRNA Gene stillgelegt. In der Maus wird die Stillegung von rRNA Genen durch NoRC (nucleolar remodeling complex) vermittelt, wobei NoRC mit dem Transkriptionsterminationsfaktor TTF-I interagiert. Diese Interaktion ist für die Bindung von TTF-I an eine promotornahe Bindestelle und die Rekrutierung von NoRC an den Promotor verantwortlich. Nach der Rekrutierung verändert NoRC die Position eines promotorgebundenen Nukleosoms und unterdrückt somit die Pol I Transkription (Längst et al., 1997). NoRC spielt somit eine wichtige Rolle bei der Stillegung der rRNA Gene höherer Eukaryoten und trägt durch Interaktionen mit DNA- und histonmodifizierenden Enzymen zur Erhaltung dieser Stillegung bei (Strohner et al., 2004). In inaktiven Genen korreliert die Methylierung des Promotors mit hypoacetyliertem Histon H4 und der Mehtylierung von Lysin 9 des Histons H3 (Santoro et al., 2002). In S. cerevisiae gibt es weder die Methylierung der DNA noch die von H3K9.
1.4.3. Organisation des rDNA Lokuses in S. cerevisiae
Die rRNA Gene liegen also gleichzeitig in mindestens zwei funktionellen Zuständen in der Zelle vor, als aktiv transkribiertes, nukleosomenfreies Euchromatin und als inaktives, nukleosomales Chromatin. Die aktiven und inaktiven rDNA Kopien sind zufällig über den gesamten rDNA Lokus verteilt, wobei immer ein bis drei Gene eine aktive Gruppe bilden (Dammann et al., 1995). Bei der Replikation transkriptionell aktiver Gene entstehen zwei Tochterstränge mit regelmäßig angeordneten Nukleosomen (Lucchini and Sogo, 1995), die sich direkt nach der Replikation innerhalb von Sekunden an der neu synthetisierten DNA positionieren (Lucchini et al., 2001). Der nichtnukleosomale Anteil der rRNA Gene muß also nach jeder Replikationsrunde wiederhergestellt werden, so daß alle rRNA Gene, unabhängig von ihrem Ausgangszustand, die gleiche Wahrscheinlichkeit zur Aktivierung besitzen. In S. cerevisiae ist nur ein kleiner Teil der autonomen Replikationssequenzen (ARS) als Replikationsursprung aktiv und die Replikation kann nur stromabwärts von transkriptionell aktiven Genen initiiert werden (Muller et al., 2000). Die Replikation startet bidirektionell, wobei die vom Promotor stromaufwärts wandernde Replikationsgabel am 3’Ende aktiver rRNA Gene an der Replikationsgabelbarriere (RFB) gestoppt wird. Die stromabwärts wandernde Replikationsgabel setzt ihre Arbeit fort, bis sie auf die erste angehaltene Replikationsgabel stößt (Lucchini and Sogo, 1994). Somit werden aktive und inaktive rRNA Gene in der gleichen Richtung wie die rDNA Transkription repliziert. Die intergenen Spacer, die inaktive rDNA Kopien flankieren, sind in regelmäßigen Abständen mit Nukleosomen besetzt, wohingegen die Spacer, die aktive Gene flankieren, sowohl mit Nukleosomen als auch regulatorischen Proteinen assoziiert sind (Dammann et al., 1995; Vogelauer et al., 1998). Da nach der DNA-Replikation alle Spacer nukleosomal sind, muß auch die Bindung aller regulatorischen Proteine hinterher wiederhergestellt werden (Lucchini and Sogo, 1994).
Am 3’Ende der 35S rDNA, ca. 2kb stromabwärts vom Promotor der nächsten Transkriptionseinheit, liegt der Enhancer. Psoralenanalysen zeigten, daß der Enhancer am 3’Ende eines jeden aktiv transkribierten Genes frei von Nukleosomen ist, wohingegen auf inaktive, nukleosomale Gene ein regelmäßig mit Nukleosomen besetzter Enhancer folgt. Die offene Chromatinstruktur von Enhancern ist von der Transkription jedoch unabhängig, da in Pol I Mutanten, ebenfalls nukleosomenfreie Enhancer gefunden wurden. Dies deutet auf spezifische Protein-DNA Interaktionen an den Enhancern vor Beginn der Transkription hin.
Zusätzlich fand man in diesen Mutanten, daß alle rDNA codierenden Sequenzen nukleosomal sind, was ein Hinweis darauf ist, daß für die Ausbildung der offenen Chromatinstruktur elongierende Pol I Komplexe benötigt werden (Dammann et al., 1995).
In exponentiell wachsenden Hefezellen sind etwa 50% der Gene aktiv. Beim Eintritt der Zellen in die stationäre Phase sinkt die Pol I Transkription der rRNA Gene drastisch, wobei die Anzahl der aktiven rRNA Gene nahezu konstant bleibt. So konnte bei der Psoralenvernetzung ganzer Hefezellen eine Reduktion der aktiven rRNA Gene von 10-17%
gemessen werden (Dammann et al., 1993; Sandmeier et al., 2002), wofür Rpd3p erforderlich
ist. Fahy et al., 2005 detektierten für psoralenvernetzte Nuklei hingegen nur eine reproduzierbare Reduktion von vier bzw. 6% in der frühen bzw. späten stationären Phase.
Die Differenz in der Abnahme ist vermutlich auf unterschiedliche Vernetzungseffizienzen ganzer Zellen und Nuklei zurückzuführen (Fahy et al., 2005). Nachdem die Zellen in frischem Medium resuspendiert wurden, stieg die Tanskription innerhalb weniger Minuten wieder an und das Verhältnis von aktiven zu inaktiven rDNA Kopien wurde wiederhergestellt (Fahy et al., 2005). Auch das Abschalten der Pol I Transkription durch Wachstumsfaktoren, wie etwa die Behandlung mit Rapamycin ändert am Verhältnis von offenen zu geschlossenen rRNA Genen nichts (Claypool et al., 2004). Dies zeigt, daß der TOR-Signaltransduktionsweg nicht am Wechsel der rRNA Gene vom offenen in den geschlossenen Zustand beteiligt ist und somit von Rpd3p unabhängig sein sollte. Gestützt wird diese Annahme durch zahlreiche Experimente, wie Puls-labeling oder elektronenmikroskopische Analaysen des rDNA Lokuses von Oakes et al., 2006a, die zeigen konnten, daß Rpd3p für die Inaktivierung der Pol I Transkription durch Rapamycin nicht benötigt wird.
In exponentiell wachsenden Hefen liegen die rRNA Gene also immer in zwei Chromatinformen vor, der offenen, psoralenzugänglichen, transkriptionell aktiven und der inaktiven, psoralenunzugänglichen Form. MNase Studien haben gezeigt, daß die geschlossene Form nukleosomal ist und die offene Fraktion eine andere Chromatinstruktur besitzt. Es ist inzwischen weitgehend akzeptiert, daß transkriptionell aktive rDNA frei von regulären Nukleosomen ist. Analysen mit in vitro assembliertem Chromatin haben ergeben, daß alleine die Histone H3/H4 ausreichen, um die DNA vor Psoralenzugänglichkeit zu schützen (Sogo et al., 1984). Die codierenden Sequenzen transkriptionell aktiver rRNA Gene könnten also frei von den meisten Nukleosomen sein und nur mit Proteinen, die an der Pol I Transkription beteiligt sind, assoziiert sein. Neuere Studien besagen hingegen, daß die Histone H3 und H4 für die Pol I Transkription benötigt werden, denn ihre Deletion führt zur Unterdrückung der Transkription, nicht nur auf Ebene der Initiation (als Komponenten von UAF), sondern auch auf Ebene der Elongation (Tongaonkar et al., 2005). Ein anderes Modell schlägt den Besatz der rDNA mit strukturell veränderten Nukleosomen, sogenannten Lexosomen, vor (Prior et al., 1983). Studien dazu zeigten, daß diese Lexosomen die gleiche Psoralenzugänglichkeit wie nukleosomenfreie DNA aufweisen (Conconi et al., 1984). Mit dem Psoralencrosslink kann also nicht geklärt werden, ob sich Lexosomen auf der aktiven rDNA befinden oder nicht. Somit bleibt die Frage nach der tatsächlichen Chromatinstruktur transkriptionell aktiver rRNA Gene bisher ungeklärt.
Nach dem Abschalten der Transkription wurde beobachtet, daß das Verhältnis von offenen zu geschlossenen rRNA Genen nahezu konstant bleibt (Claypool et al., 2004; Conconi et al., 1989; Fahy et al., 2005; Sandmeier et al., 2002). Auch hier stellt sich nun die Frage, inwiefern sich die Chromatinkomposition und -Struktur der offenen, transkriptionell inaktiven rRNA Gene gegenüber den transkriptionell aktiven Genen ändert. Bleiben Transkriptionsfaktoren, Komponenten der Pol I Transkriptionsmaschinerie, Nukleosomen
oder andere Proteine mit der psoralenzugänglichen Form assoziiert? Zur Beantwortung dieser Fragen stoßen die bekannten Methoden an ihre Grenzen und die Antworten stehen noch aus.
Zielstellung der Arbeit
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Komposition und Struktur ribosomalen Chromatins in Abhängigkeit von der transkriptionellen Aktivität in vivo zu untersuchen.
Zum einen kamen klassische Methoden wie die Psoralenvernetzung und Endonukleaseverdaue mit der MNase zum Einsatz, um zu klären, ob und inwiefern sich die Chromatinstruktur nach dem Abschalten der Pol I Transkription ändert. Dazu wurden temperatursensitive Stämme mit Mutantionen in der Pol I Transkriptionsmaschinerie (Rpa43p, Rrn3p) und Stämme mit Deletionen von Transkriptionsfaktoren (UAF, CF, Hmo1p) untersucht. Deletionen in UAF führen zum PSW von Pol I zu Pol II (siehe 1.2.2.; (Oakes et al., 1999; Siddiqi et al., 2001b; Siddiqi et al., 2001a; Vu et al., 1999)), so daß die Chromatinstruktur der rDNA auch in Abhängigkeit von der Pol II Transkription untersucht werden konnte.
Die präzise Lokalisierung einzelner chromatinassoziierter Faktoren wurde andererseits durch den Einsatz einer neuen Methode, dem ChEC (chromatin endogenous cleavage) möglich (Schmid et al., 2004). Diese Methode basiert auf der Expression eines C-terminalen Fusionsproteins, das aus dem Protein, dem das Interesse gilt, und einer MNase besteht. Zur Aktivierung benötigt die MNase Ca2+, dessen cytoplasmatische und nukleäre Konzentration zur Aktivierung zu gering sind. Nach der Formaldehydvernetzung und Nukleipräparation, wird die MNase durch Ca2+-Zugabe aktiviert, so daß die DNA an den Stellen geschnitten wird, an denen sie mit dem Fusionsprotein assoziiert ist. Die genaue Lokalisierung der Assoziationsstellen erfolgt mittels Southernblot und indireker Endmarkierung. Zur Analyse der Dynamik von Assoziations- und Dissoziationsereignissen an der rDNA, in Abhängigkeit von der transkriptionellen Aktivität, wurde eine Kollektion von Hefestämmen mit Fusionsproteinen bekannter rDNA-Bindeproteine etabliert.
Zur Klärung der Frage, mit welcher der beiden Chromatinformen bestimmte Faktoren assoziiert sind und inwiefern sich die Chromatinkomposition und/oder -Struktur der offenen, transkriptionell inaktiven rRNA Gene gegenüber den transkriptionell aktiven Genen ändert, sollte die Kombination von ChEC- und Psoralenvernetzungsanalysen beitragen.
2.1. Material
2.1.1. Chemikalien
Die verwendeten Grob- und Feinchemikalien stammen, soweit nicht an entsprechender Stelle anders vermerkt, von ROTH, der SIGMA-ALDRICH Firmengruppe oder von MERCK und waren von analytischer Reinheit.
H2O steht für deionisiertes Wasser aus einer Wasseraufbereitungsanlage (ELGA).
2.1.2. Lösungen, Puffer und Medien
Es wurde immer, wenn nicht anders angegeben, H2O als Lösungsmittel verwendet. Die pH- Werte beziehen sich auf Raumtemperatur. Prozentangaben sind immer, falls nicht anders angemerkt, als Masse pro Volumen (m/v) zu verstehen.
LB-Medium Trypton (BDBIOSCIENCES) 10g/l
Hefeextrakt (BDBIOSC.) 5g/l
NaCl 5g/l
1M NaOH 1ml/l
Agar (Platten) (BDBIOSC.) 20g/l
autoklaviert
LB/Amp bzw. Ampicillin bzw. Tetracyclin 50µg/ml LB/Tet im respektiven LB-Medium;
Zusatz nach Abkühlen auf
≤ 50°C
Soc-Medium Trypton 20g/l
Hefeextrakt 5g/l
NaCl 0,5g/l
Glucose 3,6g/l
KCl 2,5mM
MgCl2 10mM
1M NaOH 1ml/l
autoklaviert
YPD Hefeextrakt 10g/l
Pepton (BDBIOSCIENCES) 20g/l
Glukose 20g/l Agar (Platten) 20g/l autoklaviert
YPG Hefeextrakt 10g/l
Pepton 20g/l
Galaktose 20g/l
Agar (Platten) 20g/l autoklaviert
YPD/ Geneticin Geneticin (Gibco) 400mg/l YPG/ Geneticin im respektiven YP-Medium;
Zusatz nach Abkühlen auf
≤ 50°C
CSM (complete YNB (yeast nitrogen base) 6,7g/l supplement mixture) (SUNRISE SCIENCE PRODUCTS)
Zucker 20g/l
CSM-dropout nach Herstellerangabe (BIO101®SYSTEMS)
Zusatz fehlender 1x
Aminosäuren
Agar (Platten) 20g/l
autoklaviert
50x Lysin Lysin 2,5mg/ml
50x Uracil Uracil 1mg/ml
IR-Puffer Tris-HCl pH 8 50mM
EDTA 20mM
IRN-Puffer Tris-HCl pH 8 50mM
EDTA 20mM
NaCl 0,5M
TAE-Puffer Tris 40mM
Essigsäure 20mM
EDTA 1mM
TBE-Puffer Tris 90mM
Borsäure 90mM
EDTA 1mM
10x Ladepuffer Bromphenolblau 0,25%
Glycerin 40%
TE-Puffer Tris 10mM
EDTA 1mM
pH 7,5 oder 8 mit HCl
20x SSC NaCl 3M
Trinatriumcitrat 0,3M pH 7 mit HCl
50x Denhardts BSA 10mg/ml
Reagens Ficoll 10mg/ml
Polyvinylpyrrolidon 10mg/ml
5x MaBS Maleinsäure 0,5M
NaCl 0,75M
pH 7,5 mit NaOH ca. 40g/l
Puffer A Tris-HCl (pH 7,4) 15 mM
Spermin 0,2mM
Spermidin 0,5mM
KCl 80mM
EDTA 2mM
Puffer Ag Puffer A ohne EDTA, mit
EGTA 0,1mM
Proteaseinhibitoren Benzamidin 33mg/ml
100x (PI) PMSF 17mg/ml
Pepstatin A 137µg/ml
Leupeptin 28,4µg/ml
Chymostatin 200µg/ml
4x Upper Tris Tris 0,5M
SDS 0,4%
Bromphenolblau
pH 6,8 mit HCl
4x Lower Tris Tris 1,5M
SDS 0,4%
pH 8,8 mit HCl
10x Elektrophorese- Tris 250mM
puffer (SDS-PAGE) Glycin 1,9M
SDS 1 %
10x PBS NaCl 1,37M
KCl 27mM
Na2HPO4⋅2H2O 10mM
KH2PO4 20mM
pH 7,4 mit HCl oder NaOH
2.1.3. Nukleinsäuren
A. Nukleotide
Zur Synthese von DNA wurde der „Desoxynucleotide Solution Mix“ von NEW ENGLAND
BIOLABS benutzt, der jedes der vier Desoxyribonukleotide in einer Konzentration von 10mM enthält.
