Die Kombination von ChEC- und Psoralenvernetzungsanalyse ermöglicht die

Durch die Kombination der ChEC- und der DNA-Vernetzungsanalyse mit Psoralen kann die Chromatinform bestimmt werden, mit der rDNA-Bindeproteine assoziiert sind, was bisher nicht möglich war. Nach der Formaldehydvernetzung der Hefezellen und der Nukleiisolierung wird die MNase durch Ca²⁺-Zugabe induziert. Nach dem Stoppen der Reaktion werden die Nuklei mit Psoralen vernetzt und ihre DNA isoliert. Anschließend wird die DNA mit entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut, in einem Agarosegel aufgetrennt und in einer Southernanalyse untersucht. Falls ein Faktor mit der gesamten Population der offenen Chromatinform assoziiert ist, wird diese von der MNase geschnitten und die obere Psoralenbande fehlt somit auf dem Southernblot. Ist nur ein Teil der Population mit dem Faktor assoziiert, nimmt die Intensität der oberen Bande ab (Abb. 3-6A). Für den Fall, daß ein Faktor mit der geschlossenen Form assoziiert ist, nimmt die untere Bande entsprechend ab oder verschwindet (Abb. 3-6B).

Abb. 3-6: Kombination der in vitro ChEC- und Psoralenvernetzungsanalyse. Die Nuklei formaldehydvernetzter Zellen werden isoliert. Das C-terminale MNase-Fusionsprotein wird durch Ca²⁺-Zugabe aktiviert und schneidet die Population der rDNA, mit der es assoziiert ist. Anschließend werden die Nuklei mit Psoralen vernetzt. Nach der DNA-Isolierung wird diese mit einem Restriktionsenzym verdaut (REV), in einem Agarosegel aufgetrennt (AGE) und im Southernblot analysiert. (A) Ist das MNase-Fusionsprotein mit der offenen Chromatinform

A B

assoziiert, wird diese von der MNase verdaut und die obere Psoralenbande verschwindet. (B) Ist es mit der geschlossenen Form assoziiert, verschwindet die untere Psoralenbande.

Rpa43p und Hmo1p sind mit der offenen und Histone mit der geschlossenen Chromatinform des transkribierten Bereichs assoziiert

Zur Untersuchung, mit welcher Chromatinform die Faktoren im transkribierten Bereich assoziiert sind, wurden die Nuklei aus Abb. 3-4 nach dem ChEC mit Psoralen vernetzt und die DNA mit EcoRI linearisiert. Die Ergebnisse sind in Abb. 3-7 dargestellt. Die Histone sind hauptsächlich mit der geschlossenen Form assoziiert, da die untere Psoralenbande präferentiell verschwindet. Für die Untereinheiten von UAF und CF, die an den Promotor der rDNA binden und keine Schnitte im transkribierten Bereich zeigten (Abb. 3-4), bleiben erwartungsgemäß beide Banden erhalten. Hmo1p und Rpa43p, die über den gesamten transkribierten Bereich schnitten, sind mit der offenen Chromatinform assoziiert, da bei ihnen die obere Bande verschwindet. Die Profilanalyse der Southernblots zeigt zusätzlich, keine Veränderung der Intensität der unteren Bande. Als Kontrolle diente der Wildtypstamm NOY505 ohne MNase, der sowohl vor als auch nach der Induktion der MNase zwei Banden zeigt, deren Intensität unverändert bleibt.

Im transkribierten Bereich sind Hmo1p und Rpa43p präferentiell mit der offenen und die Histone mit der geschlossenen Chromatinform assoziiert, während die anderen Transkriptionsfaktoren nicht gebunden sind.

Abb. 3-7: Kombinierte in vitro ChEC- und Psoralenvernetzungsanalyse des transkribierten Bereichs.

Formaldehydvernetzte Nuklei ohne (-) und mit (+) Induktion der MNase durch Ca²⁺ wurden im Anschluß an das ChEC Experiment mit Psoralen inkubiert und die DNA isoliert. Die DNA wurde mit EcoRI linearisiert, in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt und im Southernblot mit der Psoralen-Sonde analysiert (Abb. 3-3), die ein 2,85kb großes Fragment detektiert. Die Profile der Southernblots zeigen links die stark psoralenvernetzte Bande der offenen Chromatinform (s-Bande) und rechts die schwächer vernetzte Bande der geschlossenen Form (f-Bande). Die Y-Achse repräsentiert dabei die Intensität. Als Kontrolle diente der Wildtypstamm NOY505 (ohne MNase).

Histone sind im Promotorbereich mit beiden Chromatinformen assoziiert und Transkriptionsfaktoren mit der offenen Form

Zur Analyse, welche Faktoren im Promotorbereich an welche Chromatinform binden, wurde die DNA aus den oben beschriebenen Experimenten mit XcmI und SacII linearisiert. Für die Histone zeigte sich, daß beide Banden verschwinden. In der Profilanalyse der Southernblots ist deutlich zu sehen, daß die Intensität beider Banden abnimmt. Für die Histone H3 und H4 als Komponenten des UAFs war dies auch zu erwarten. Daß auch für H2B beide Banden verschwinden deutet darauf hin, daß die IGS2 Region unabhängig vom transkriptionellen Zustand der nachfolgenden Transkriptionseinheit nukleosomal sein könnte. Die Transkriptionsfaktoren des UAFs, Uaf30p und Rrn10p sind mit dem Großteil der aktiven Form assoziiert, da die obere Bande hauptsächlich an Intensität verliert. Die Untereinheiten des CFs, Rrn7p und Rrn3p sind ebenfalls mit der aktiven Form assoziiert, wobei die Abnahme der oberen Bande im Vergleich zu den UAF-Komponenten deutlich geringer ist. Hmo1p und Rpa43p sind ausschließlich mit der offenen, aktiven Form assoziiert.

Neben UAF, CF und Rrn3p binden Hmo1p und Pol I am rDNA Promotor präferentiell an die offene Chromatinform, die Histone sind in diesem Bereich hingegen mit beiden Chromatinformen assoziiert.

Abb. 3-8: Kombinierte in vitro ChEC- und Psoralenvernetzungsanalyse des Promotors. Formaldehydvernetzte Nuklei ohne (-) und mit (+) Induktion der MNase durch Ca²⁺ wurden im Anschluß an das ChEC Experiment mit Psoralen inkubiert und die DNA isoliert. Die DNA wurde mit XcmI/ SacII linearisiert, in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt und im Southernblot mit der XcmI-Promotor-Sonde analysiert (Abb. 3-3), die ein 2kb großes Fragment detektiert. Die Profile der Southernblots zeigen links die stark psoralenvernetzte Bande der offenen Chromatinform (s-Bande) und rechts die schwächer vernetzte Bande der geschlossenen Form (f-Bande).

Die Y-Achse repräsentiert dabei die Intensität. NOY505 zeigt ohne (-) und mit (+) Induktion der MNase zwei Banden. Als Kontrolle diente der Wildtypstamm NOY505 (ohne MNase).

3.2. Chromatinstruktur in Stämmen mit Deletionen funktioneller Pol I