der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Vergleichende Untersuchungen zur Calcium-Homöostase des Wiederkäuers: Effekte diätetischer Interventionen, der Laktation
und der Applikation verschiedener Vitamin D Metaboliten
HABILITATIONSSCHRIFT zur Erlangung der Venia legendi
an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Dr. med. vet. Mirja Rosmarie Wilkens
Hannover 2016
Tag der nichtöffentlichen,
wissenschaftlichen Aussprache: 27.04.2016
Die Anfertigung dieser Arbeit wurde durch Sachbeihilfen der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert (Schr 342/8-1, Schr 342/8-2, Wi 3668/1-1).
Abbildungsverzeichnis ... I Tabellenverzeichnis ... II Verzeichnis der verwendeten Veröffentlichungen ... III
1. Vorwort ... 1
2. Einleitung ... 2
2.1. Aufrechterhaltung der Calcium-Homöostase ... 2
2.2. Intestinale und renale Absorption bzw. Resorption von Calcium ... 3
2.3. Besonderheiten beim Wiederkäuer ... 5
2.4. Konzepte zur Hypocalcämie-Prävention ... 7
2.4.1. Fütterung einer Ration mit negativer DCAD vor der Geburt ... 7
2.4.2. Applikation von Vitamin D und seinen Metaboliten ... 8
2.5. Potenzielle, unerwünschte Wirkungen von Vitamin D Metaboliten ... 9
3. Ziele ... 12
4. Ergebnisse ... 13
4.1. Anpassung an Calcium-Restriktion und Behandlung mit Calcitriol ... 13
4.1.1. Diätetische Calcium-Restriktion ... 13
4.1.1.1. Plasmaparameter und hormonelle Anpassung ... 13
4.1.1.2. Renale Exkretion von Calcium und Phosphat ... 15
4.1.1.3. Gastrointestinale Calcium-Absorption ... 15
4.1.2. Calcitriol ... 16
4.1.2.1. Plasmaparameter und hormonelle Anpassung ... 16
4.1.2.2. Renale Exkretion von Calcium und Phosphat ... 17
4.1.2.3. Gastrointestinale Calcium-Absorption ... 18
4.2. Laktation ... 18
4.2.1. Plasmaparameter im peripartalen Zeitraum ... 19
4.2.2. Gastrointestinale Calcium-Absorption ... 20
4.2.3. Renale Anpassung und Vitamin D Metabolismus ... 21
4.3. Fütterung einer Ration mit negativer DCAD ... 21
4.3.1. Pansenstoffwechsel und ruminaler Calcium-Transport ... 21
4.3.2. Bilanzdaten ... 23
4.4. Kombination einer Ration mit negativer DCAD und der oralen Supplementierung
mit 25-Hydroxycholecalciferol zur Prävention der peripartalen Hypocalcämie ... 25
4.4.1. Studie an Milchkühen ... 25
4.4.2. Studie an Schafen ... 28
4.5. Einfluss von Vitamin D Metaboliten auf die Expression von CYP3A und P-gp ... 30
5. Übergreifende Diskussion ... 32
5.1. Vergleichende Betrachtung der Calcium-Homöostase ... 32
5.2. Ruminale Calcium-Absorption ... 36
5.3 Einsatz von Vitamin D Metaboliten zur Stabilisierung der peripartalen Calcium- Homöostase ... 39
6. Zusammenfassung ... 43
7. Summary ... 45
8. Literaturverzeichnis ... 47
9. Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Veröffentlichungen ... 54
10. Danksagung ... 60
11. Anhang ... 61
Publikation 1 ... 61
Publikation 2 ... 62
Publikation 3 ... 63
Publikation 4 ... 64
Publikation 5 ... 66
Publikation 6 ... 67
Publikation 7 ... 68
Publikation 8 ... 69
Tagungsbeitrag ... 70
Publikation 9 ... 72
Publikation 10 ... 73
Publikation 11 ... 74
I
Abbildungsverzeichnis
Abb. 4.1: Vergleich der Auswirkung einer restriktiven Calcium-Versorgung auf die
Plasmakonzentrationen von Calcium, Phosphat, Calcitriol und dem Knochenresorptionsmarker CrossLaps (A, B) sowie die fraktionellen Exkretionen (FE) von Calcium und Phosphat (C) von Schafen (hellgraue Säulen) und Ziegen (dunkelgraue Säulen) im Verhältnis zur jeweils gleich 100% gesetzten Kontrollgruppe (weiße Säulen). Abbildung entnommen aus Publikation 4. ... 14 Abb. 4.2: Vergleich des Quotienten aus dem Knochenformationsmarker Osteocalcin und dem
Resorptionsmarker bei Ziegen (dunkelgraue Säulen), Schafen (hellgraue Säulen) und Kühen (weiße Säulen). Abbildung entnommen aus Publikation 6. ... 19 Abb. 4.3: Unidirektionale Calcium-Fluxraten von serosal nach mucosal (offene Kreise) und von mucosal nach serosal (gefüllte Kreise) nach dreiwöchiger Fütterung einer Ration mit positiver (grau) oder negativer DCAD (schwarz) in Anhängigkeit von der elektrischen Triebkraft. Abbildung entnommen aus Publikation 8. ... 23 Abb. 4.4: Konzentrationen von ionisiertem Calcium im peripartalen Zeitraum von Kühen, die vor der Geburt eine Ration mit negativer (Kreise) oder positiver (Quadrate) DCAD erhalten hatten. Die Hälfte der Tiere wurde zusätzlich mit 25-Hydroxycholecalciferol supplementiert (gefüllte Symbole). Abbildung entnommen aus Publikation 9. ... 26 Abb. 4.5: Konzentrationen von ionisiertem Calcium 12 Stunden p.p. von Kühen, die vor der Geburt eine Ration mit negativer (gefüllte Kreise) oder positiver (offene Quadrate) DCAD erhalten hatten. Abbildung entnommen aus Publikation 9. ... 27 Abb. 5.1: Veränderungen der renalen RNA Expression von CYP27B1, CYP24A1 und VDR durch eine Behandlung mit Calcitriol bei bedarfsgerecht und Calcium-restriktiv gefütterten Schafen und Ziegen.
Abbildung entnommen aus Publikation 4 und modifiziert. ... 34 Abb. 5.2: Korrelationen zwischen der Expression von TRPV6 im Jejunum und der Plasmakonzentration von Calcitriol (links) bzw. 25-Hydroxycholecalciferol (rechts) bei mit 25-Hydroxycholecalciferol über zehn Tage supplementierten Schafen (DCAD 25-OHD, graue Kreise) und der dazugehörigen
Kontrollgruppe (DCAD, weiße Kreise). ... 42
II
Tabellenverzeichnis
Tab. 2.1: Ergebnisse zum Einfluss einer unterschiedlichen Versorgung mit Calcium (Ca) auf
Verdaulichkeit und renalen Exkretion von Ca und Phosphat (P) bei verschiedenen Spezies (Schryver et al., 1970; Braithwaite, 1975; Whiting and Quamme, 1984; van Doorn et al., 2004; Zhang et al., 2008; Taylor et al., 2009). ... 5 Tab. 4.1: Mithilfe der Ussingkammer bestimmte Calcium-Nettofluxraten in Pansen (Rum), Duodenum (Duo) und Jejunum (Jeju) von adäquat (Con) oder restriktiv (Ca-) mit Calcium versorgten Schafen und Ziegen. Tabelle entnommen aus Publikation 5. ... 16 Tab. 4.2: Plasmakonzentrationen von 25-Hydroxycholecalciferol (25-OHD, in ng/ml), 1,25-
Dihydroxycholecalciferol (1,25-(OH)2D3, in pg/ml) und 24,25-Dihydroxycholecalciferol (24,25-(OH)2D3, in ng/ml) am letzten Tag der jeweiligen Bilanzperiode. Plasmakonzentrationen von Ca und Pi, ionisiertes Calcium (Ca2+) im Vollblut (alle Angaben in mmol/l), sowie pH-Werte in Blut und Urin während der Bilanzperioden (Mittelwerte und SEM von je fünf Tieren, ermittelt über fünf Tage). Grau hinterlegt:
Unterschiede zwischen der ersten (DCAD pos.) und der zweiten Bilanzperiode (DCAD neg.) ... 24 Tab. 4.3: Tägliche Aufnahme, Ausscheidung mit dem Kot, scheinbare Verdaulichkeit, Ausscheidung mit dem Urin und Retention von Calcium während der Bilanzperioden (Mittelwerte und SEM von je fünf Tieren, ermittelt über fünf Tage). Mit Ausnahme der scheinbaren Verdaulichkeit alle Angaben in g pro Tag. Grau hinterlegt: Unterschiede bzw. Tendenzen für Unterschiede zwischen der ersten (DCAD pos.) und der zweiten Bilanzperiode (DCAD neg.) ... 24 Tab. 4.4: Plasmakonzentrationen von 25-Hydroxycholecalciferol (25-OHD, in ng/ml), 1,25-
Dihydroxycholecalciferol (1,25-(OH)2D3, in pg/ml) und 24,25-Dihydroxycholecalciferol (24,25-(OH)2D3, in ng/ml) am letzten Tag der jeweiligen Bilanzperiode. Plasmakonzentrationen von Ca und Pi, ionisiertes Calcium (Ca2+) im Vollblut (alle Angaben in mmol/l), sowie pH-Werte in Blut und Urin während der Bilanzperioden (Mittelwerte und SEM von je fünf Tieren, ermittelt über fünf Tage). Grau hinterlegt:
Unterschiede zwischen der ersten (DCAD pos.) und der zweiten Bilanzperiode (DCAD neg.) Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und 25-
Hydroxycholecalciferol-Gruppe in der zweiten Bilanzperiode (DCAD neg.). ... 29 Tab. 4.5: Tägliche Aufnahme, Ausscheidung mit dem Kot, scheinbare Verdaulichkeit, Ausscheidung mit dem Urin und Retention von Ca während der Bilanzperioden (Mittelwerte und SEM von je fünf Tieren, ermittelt über fünf Tage). Mit Ausnahme der scheinbaren Verdaulichkeit alle Angaben in g pro Tag. Grau hinterlegt: Unterschiede bzw. Tendenzen für Unterschiede zwischen der ersten (DCAD pos.) und der zweiten Bilanzperiode (DCAD neg.) Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen signifikante
Unterschiede zwischen Kontroll- und HyD-Gruppe in der zweiten Bilanzperiode (DCAD neg.). ... 30
III
Verzeichnis der verwendeten Veröffentlichungen
Publikation 1: Wilkens MR, Mrochen N, Breves G, Schröder B. (2010): Effects of 1,25- dihydroxyvitamin D3 on calcium and phosphorus homeostasis in sheep fed diets either adequate or restricted in calcium content. Domestic Animal Endocrinology 38:190-199
Publikation 2: Wilkens MR, Mrochen N, Breves G, Schröder B. (2011): Gastrointestinal calcium absorption in sheep is mostly insensitive to an alimentary induced challenge of calcium homeostasis. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology 158:199-207
Publikation 3: Wilkens MR, Richter J, Fraser DR, Liesegang A, Breves G, Schröder B. (2012):
In contrast to sheep, goats adapt to dietary calcium restriction by increasing intestinal absorption of calcium. Comparative Biochemistry and Physiology Part A, Molecular & Integrative Physiology 163:396-406
Publikation 4: Herm G, Muscher-Banse AS, Breves G, Schröder B, Wilkens MR. (2015): Renal mechanisms of calcium homeostasis in sheep and goats. Journal of Animal Science 93:1608-1621
Publikation 5: Wilkens MR, Breves G, Schröder B. (2014): A goat is not a sheep: physiological similarities and differences observed in two ruminant species facing a challenge of calcium homeostatic mechanisms. Animal Production Science 54: 1507-1511
Publikation 6: Wilkens MR, Liesegang A, Richter J, Fraser DR, Breves G, Schröder B. (2014):
Differences in peripartal plasma parameters related to calcium homeostasis of dairy sheep and goats in comparison with cows. Journal of Dairy Research 81: 325-332
IV Publikation 7: Starke S, Reimers J, Muscher-Banse AS, Schröder B, Breves G, Wilkens MR.
(2016): Gastrointestinal transport of calcium and phosphate in lactating goats. Livestock Science 189: 23-31
Publikation 8: Wilkens MR, Praechter C, Breves G, Schröder B. (2016): Stimulating effects of a diet negative in cation-anion difference on calcium absorption from rumen in sheep. Journal of Animal Nutrition and Animal Physiology 100: 156-166
Tagungsbeitrag: Klinger S, Schröder B, Breves G, Wilkens MR. (2014): Effects of 25- hydroxycholecalciferol on gastrointestinal calcium absorption in sheep. Proceedings of the Australian Society of Animal Production 30: 220
Publikation 9: Wilkens MR, Oberheide I, Schröder B, Azem E, Steinberg W, Breves G. (2012):
Influence of the combination of 25-hydroxyvitamin D3 and a diet negative in cation-anion difference on peripartal calcium homeostasis of dairy cows. Journal of Dairy Science 95: 151- 164
Publikation 10: Wilkens MR, Cohrs I, Lifschitz AL, Fraser DR, Olszewski K, Schröder B, Breves G. (2013): Is the metabolism of 25-hydroxyvitamin D3 age-dependent in dairy cows?
Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 136: 44-46
Publikation 11: Wilkens MR, Maté LM, Schnepel N, Klinger S, Muscher-Banse AS, Ballent M, Virkel G, Lifschitz AL.: Influence of 25-hydroxyvitamin D3 and 1,25-dihydroxyvitamin D3 on expression of P-glycoprotein and cytochrome P450 3A in sheep. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 2015 Aug 28. doi: 10.1016/j.jsbmb.2015.08.019. [Epub ahead of print]
1
1. Vorwort
Mit dem Einsetzen der Laktation kommt es bei der Milchkuh zu einer plötzlichen, mit kaum einer anderen Spezies zu vergleichenden Erhöhung des Calcium-Bedarfs. Im Unterschied zur späten Trächtigkeit, in der 10-12 g Calcium pro Tag ausreichend für die Mineralisierung des fetalen Skeletts und den Ausgleich der eigenen endogenen Verluste sind, verliert die Kuh im peripartalen Zeitraum bereits bei einer Produktion von nur 10 kg Kolostrum 23 g Calcium über die Milch (Goff et al., 1991). Da nur circa 3 g Calcium im Plasma vorliegen, wird dieser Pool innerhalb von kürzester Zeit mehrfach komplett ausgetauscht (Reinhardt et al., 1988). Angesichts dieser erheblichen Belastung der Calcium-Homöostase ist es nicht verwunderlich, dass die klinisch manifeste Gebärparese in problematischen Betrieben mit einer Inzidenz von bis zu 10% auftritt und in Abhängigkeit von der Laktationsnummer zwischen 25 und 54% der Kühe eine subklinische Hypocalcämie entwickeln (DeGaris and Lean, 2008; Reinhardt et al., 2011). Ein unbemerktes, und damit unbehandeltes Absinken des Plasmacalciumspiegels kann zu Funktionsstörungen der glatten Muskulatur und somit unter anderem zu einer reduzierten Motilität von Pansen und Labmagen führen und ist darüber hinaus mit erhöhten Plasmakonzentrationen von unveresterten Fettsäuren und Cortisol assoziiert (Huber et al., 1981;
Horst and Jorgensen, 1982; Daniel, 1983; Al-Eknah and Noakes, 1989; Reinhardt et al., 2011).
Da die subklinische Hypocalcämie die Tiere so für Mastitiden, Ketosen, Dystokien, Labmagenverlagerungen, Uterusvorfälle, Nachgeburts-verhaltungen und Muskeltraumen prädisponiert, kommt ihr eine erhebliche wirtschaftliche Bedeutung zu (Curtis et al., 1983; Risco et al., 1984; Goff and Horst, 1997; Houe et al., 2001; DeGaris and Lean, 2008).
Forschungsergebnisse aus Studien an monogastrischen Tieren lassen sich nur begrenzt zum besseren Verständnis der Mechanismen zur Aufrechterhaltung der Calcium-Homöostase des Wiederkäuers und damit zur Entwicklung erfolgreicher Präventionsstrategien nutzen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher neben der Erhebung grundsätzlicher Daten der Einfluss von verschiedenen diätetischen Interventionen, Vitamin D Metaboliten und der Laktation selbst mithilfe funktioneller und struktureller Untersuchungen an verschiedenen Wiederkäuerspezies überprüft. Da sowohl Schafe, als auch Ziegen häufig als Modell für die Milchkuh verwendet werden, wurden auch tierartlich vergleichende Aspekte berücksichtigt.
Einleitung
2
2. Einleitung
2.1. Aufrechterhaltung der Calcium-Homöostase
Bei einem Absinken der Konzentration von ionisiertem Calcium im Blut kommt es vermittelt über den Calcium-sensing-Rezeptor augenblicklich zur Freisetzung des Peptidhormons Parathormon aus der Nebenschilddrüse, das zu einer vermehrten Mobilisation von Calcium und Phosphat aus dem Skelett führt (Talmage, 1967; Brown and MacLeod, 2001). An der Niere beeinflusst Parathormon zum einen die tubuläre Resorption von Calcium und Phosphat (Greger et al., 1978). Sowohl bei Ratten als auch bei Kaninchen und Pferden, Pflanzenfressern mit einem mit dem Wiederkäuer vergleichbarem Urin-pH, verringert sich die Exkretion von Calcium, während die von Phosphat deutlich erhöht wird, wenn die Tiere mit einer Calcium-restriktiven Diät versorgt werden (Whiting and Quamme, 1984; van Doorn et al., 2004; Zhang et al., 2008).
Zum anderen stimuliert Parathormon die renale 1α-Hydroxylase (Murayama et al., 1999). Dieses Enzym katalysiert den letzten Schritt der Umwandlung von Vitamin D in seinen biologisch aktivsten Metaboliten, das Calcitriol (Fraser and Kodicek, 1970).
Aufgrund seiner Herkunft wird Calcitriol auch „Vitamin D Hormon“ genannt. Das mit der Nahrung aufgenommene oder durch UV-Exposition in der Haut gebildete Vitamin wird zunächst in der Leber an Position 25 hydroxyliert. Da diese Reaktion keiner relevanten Regulierung unterliegt, sondern weitestgehend von der Substratverfügbarkeit abhängt, wird die Plasmakonzentration von 25-Hydroxycholecalciferol auch als aussagekräftiger Parameter zur Erfassung des Vitamin D Status angesehen (Holick 1981). Die zweite Hydroxylierung an Position 1 findet hauptsächlich in der Niere katalysiert durch die 1α-Hydroxylase (CYP27B1) statt und ist eng durch Parathormon, Calcium und Phosphat kontrolliert (Littledike and Goff, 1987). Die Inaktivierung von sowohl Calcitriol als auch 25-Hydroxycholecalciferol wird durch eine von der 24-Hydroxylase (CYP24A1) katalysierte Hydroxylierung an Position 24 eingeleitet (Prosser and Jones, 2004).
Als Steroidhormon erhöht Calcitriol in der Niere und im Gastrointestinaltrakt über den genomischen Weg die Expression von Komponenten des aktiven Calciumtransports (Hoenderop et al., 2005). Am Knochen kommt es unter Einfluss von Calcitriol zu einer gesteigerten Differenzierung und Reifung von Osteoklasten und damit zu einer Erhöhung der
3 Knochenresorption (Dusso et al., 2005). Beim Vorliegen erhöhter Calcium- und Phosphatspiegel kann Calcitriol aber auch die Mineralisierung des Skeletts stimulieren (Brown et al., 1999).
Calcitonin, das bei erhöhten Konzentrationen von Calcium im Plasma aus den C-Zellen der Schilddrüse ausgeschüttet wird, führt über eine Hemmung der Osteoklasten zu einer Verminderung der Knochenresorption (Ramasamy, 2006). Bezüglich einer möglichen Wirkung auf die renale Calcium-Exkretion sind in der Literatur widersprüchliche Ergebnisse zu finden, so dass die physiologische Relevanz angezweifelt werden muss.
2.2. Intestinale und renale Absorption bzw. Resorption von Calcium
Bei ausreichender alimentärer Versorgung wird Calcium hauptsächlich über passive, parazelluläre Mechanismen aus dem Gastrointestinaltrakt absorbiert (Bronner and Pansu, 1999).
Voraussetzung hierfür ist das Vorliegen eines chemischen oder osmotischen Gradienten, also eines Konzentrationsgefälles für Calcium oder eines durch aktive Transporte anderer Ionen induzierten „solvent drag“ (Karbach, 1992). Inwieweit diese passiven Mechanismen einer Regulation unterliegen bzw. ob durch eine mögliche Regulation quantitativ bedeutsame Steigerungen der parazellulären Calciumabsorption erreicht werden können, konnte bislang nicht hinreichend geklärt werden.
Bei erhöhtem Calciumbedarf bzw. erniedrigtem Calciumangebot gewinnt die aktive, transzelluläre Absorption an Bedeutung (Bronner and Pansu, 1999). Der seit circa 15 Jahren bekannte zugrunde liegende Mechanismus besteht aus drei Schritten: Calcium wird über die apikal gelegenen, konstitutiv geöffneten Kanäle TRPV6 und TRPV5 (transient receptor potential vanilloid channel type 6 bzw. type 5) in die Zelle aufgenommen (Hoenderop et al., 1999; Peng et al., 1999), dann an das cytosolische Protein Calbindin-D9K (CaBPD9K) gebunden, um die intrazelluläre Konzentration an freiem Calcium niedrig zu halten (Bronner, 1987; Schröder et al., 1996), und schließlich an der basolateralen Seite über eine aktive Calcium-ATPase (PMCA1b) aus der Zelle ausgeschleust (van Abel et al., 2003). Für die beteiligten Strukturen konnte eine deutliche Stimulation der Expression durch Calcitriol über so genannte vitamin D responsive elements (VDRE) in den jeweiligen Promotorregionen gezeigt werden (Darwish and DeLuca, 1992; Pannabecker et al., 1995; Glendenning et al., 2000; Meyer et al., 2006). Diese Wirkung lässt sich auch funktionell zeigen. In Untersuchungen mithilfe der Ussing-Kammer konnten bei
Einleitung
4 Ratten die duodenalen Calcium-Nettofluxraten durch eine Behandlung mit Calcitriol verdoppelt werden (Jungbluth and Binswanger, 1989).
Inzwischen geht man davon aus, dass ein weiterer Mechanismus für die aktive, transzelluläre Absorption von Calcium existiert. Ein möglicher Kandidat ist der L-Typ Ca-Kanal Cav1.3 (Morgan et al., 2003). Im Gegensatz zu dem oben beschriebenen, klassischen Mechanismus ist der Transport über Cav1.3 wahrscheinlich unabhängig von Calcitriol und eng mit der Aufnahme von Glucose in die Zelle assoziiert (Kellett, 2011).
In der Niere erfolgt im proximalen Teil des Tubulus eine passive Calcium-Resorption, im distalen Tubulus und im Verbindungsstück zum Sammelrohr konnte ein aktiver Transportmechanismus nachgewiesen werden (Loffing and Kaissling, 2003). Er ähnelt prinzipiell dem für den Darm beschriebenen, statt TRPV6 wird hauptsächlich TRPV5 exprimiert, der Transport von Calcium durch das Cytosol erfolgt nach Bindung an Calbindin-D28K und die basolaterale Ausschleusung vor allem über den sekundär aktiven Natrium/Calcium-Austauscher NCX1 (Hoenderop et al., 2005). Während PTH zumindest beim monogastrischen Tier innerhalb von Minuten zu einer Steigerung der renalen Calcium-Resorption führt (Kurbel et al., 2003), wirkt Calcitriol auch hier über den genomischen Weg stimulierend (Hoenderop et al., 2002).
Mäuse reagieren auf eine diätetische Calcium-Restriktion mit einer Zunahme der renalen Expression von TRPV5 und CaBPD28K (Ko et al., 2009).
Durch Trächtigkeit und Laktation wird die Expression Calcium-transportierender Strukturen in Dünndarm und Niere bei der Maus ebenfalls induziert. Wie in knock-out Modellen gezeigt werden konnte, geschieht dies teilweise ohne Beteiligung des Vitamin D Rezeptors (Van Cromphaut et al., 2003). Für Östrogen wurde nicht nur ein stimulierender Effekt auf die Expression von TRPV5 in der Niere gezeigt (Van Abel et al., 2002), in der Promotorregion des für TRPV6 der Maus codierenden Gens konnte auch ein estrogen responsive element gezeigt werden (Weber et al., 2001).
5 2.3. Besonderheiten beim Wiederkäuer
Betrachtet man die Bedeutung der renalen Exkretion für die Aufrechterhaltung der Calcium- Homöostase beim Wiederkäuer, so fallen grundlegende Unterschiede zum monogastrischen Tier auf. In Tabelle 1 dargestellt sind Ergebnisse von Bilanzstudien an monogastrischen Tieren und Wiederkäuern.
Tab. 2.1: Ergebnisse zum Einfluss einer unterschiedlichen Versorgung mit Calcium (Ca) auf Verdaulichkeit und renalen Exkretion von Ca und Phosphat (P) bei verschiedenen Spezies (Schryver et al., 1970; Braithwaite, 1975; Whiting and Quamme, 1984; van Doorn et al., 2004;
Zhang et al., 2008; Taylor et al., 2009).
Van Doorn et al., 2004:
Ponys, vier Jahre alt, ca. 160 kg
Taylor et al., 2009:
Milchkühe, ca. 600 kg
Ca in der Ration [g/kg T] 26,9 16,3 7,80 11,0 7,50 4,50
scheinbare Ca-Verdaulichkeit [%] 27 28 42 26 36 32
Ca im Urin [g/Tag] 13,6 10,0 8,0 1,1 1,0 1,0
P im Urin [g/Tag] 0,18 0,38 1,30 1,0 3,0 0,7
Schryver et al., 1970:
Ponys, sechs bis 14 Monate alt
Braithwaite, 1975:
Schafe, fünf Monate alt
Ca-Aufnahme [mg/kg KGW] 242 130 29 275 98 25
scheinbare Ca-Verdaulichkeit [%] 37 35 -6,9 18 15 -58
wahre Ca-Verdaulichkeit [%] 46 51 70 24 27 2,4
Ca im Urin [mg/kg KGW] 33 21 5,5 1,7 1,3 2,3
P im Urin [mg/kg KGW] n.b. n.b. n.b. 17 2,5 25
Whiting & Quamme, 1984:
weibliche Kaninchen
Zhang et al., 2008:
weibliche Ratten
Ca in der Ration [g/kg T] 18,9 6,10 2,90 12,0 6,00 1,00
Fraktionelle Ca-Exkretion [%] 6,17 1,09 2,10 n.b. n.b. n.b.
Fraktionelle P-Exkretion [%] 6,60 13,8 24,5 n.b. n.b. n.b.
Ca/Creatinin im Urin [mg/mg] n.b. n.b. n.b. 0,197 0,060 0,028 P/Creatinin im Urin [mg/mg] n.b. n.b. n.b. 1,595 3,077 3,487
Es wird deutlich, dass mit einer Verringerung der alimentären Calcium-Zufuhr bei Ponys, Kaninchen und Ratten die renale Calcium-Exkretion sinkt, während die Ausscheidung von
Einleitung
6 Phosphat ansteigt. Beim Wiederkäuer hingegen wird schon bei ausreichender Calcium- Versorgung nur wenig Calcium mit dem Urin abgegeben. Im Umkehrschluss bedeutet dieser Umstand, dass bei einer Belastung des Calcium-Haushalts wenig bis gar kein Spielraum für eine Erhöhung der Retention durch eine gesteigerte renale Resorption besteht (Ramberg et al., 1970).
Auch wenn diese Daten teilweise nur schwer miteinander zu vergleichen sind, deutet sich an, dass die Anpassung der Verdaulichkeit von Calcium beim Wiederkäuer ebenfalls weniger stark ausgeprägt zu sein scheint. Die Expression von TRPV6 und CaBPD9K konnte zwar im Dünndarm von Schafen gezeigt werden (Schröder et al., 2001; Wilkens et al., 2009), beim Vergleich von unter identischen Bedingungen mit Hilfe der Ussingkammer-Technik bestimmten duodenalen Calcium-Nettofluxraten verschiedener Tierarten fallen allerdings erhebliche quantitative Unterschiede auf. Während bedarfsgerecht mit Calcium versorgte Schafe und Ziegen verschiedenen Alters Werte zwischen 0 und 16 nmol/(cm2·h) aufwiesen, konnten bei Pferden Nettofluxraten um 100 nmol/(cm2·h) ermittelt werden (Schröder et al., 1997; Cehak et al., 2012).
Auch eine neunwöchige diätetische Calcium-Restriktion hatte bei der Ziege nur eine Erhöhung der duodenalen Fluxraten von 12 auf 21 nmol/(cm2·h) zur Folge (Schröder et al., 1997).
Aufgrund der verglichen mit dem Duodenum höheren Expression von TRPV6 im Jejunum wurde vermutet, dass die Hauptlokalisation der intestinalen Calcium-Absorption beim Wiederkäuer in diesem Darmabschnitt zu finden ist (Wilkens et al., 2009). Aber auch die jejunalen Calcium- Nettofluxraten lagen mit 11 nmol/(cm2·h) bei wachsenden Ziegen und 5 nmol/(cm2·h) bei adulten Schafen weit unter denen des Pferdes (Schröder et al., 1997).
Der Grund für diese offenbar geringe Ausprägung aktiver Transportprozesse könnte in einer physiologisch relevanten, d.h. zur Bedarfsdeckung maßgeblich beitragenden Beteiligung des Vormagensystems an der Calcium-Absorption liegen. Studien an fistulierten Schafen und Rindern lieferten jedoch widersprüchliche Ergebnisse in Bezug auf die Bedeutung der präintestinalen Calcium-Bewegungen. So konnte in einigen Arbeiten eine Netto-Absorption ermittelt werden (Grace et al., 1974; Dillon and Scott, 1979; Rayssiguier and Poncet, 1980; Ben- Ghedalia et al., 1982; Khorasani, 1992), während andere Autoren eine Netto-Sekretion feststellten (Pfeffer et al., 1970; Greene et al., 1983; Wylie et al., 1985).
Mit Hilfe von transportphysiologischen Untersuchungen in der Ussingkammer konnte allerdings gezeigt werden, dass das Pansenepithel prinzipiell zur aktiven, transzellulären Calcium-
7 Absorption befähigt ist (Höller et al., 1988; Sidler-Lauff et al., 2010). Der zugrundeliegende Mechanismus ist von der Anwesenheit kurzkettiger Fettsäuren auf der mucosalen Seite des Epithels abhängig und unterscheidet sich damit funktionell von dem für den Dünndarm beschriebenen (Schröder et al., 1997; Schröder et al., 1999; Uppal et al., 2003). Darüber hinaus konnten im Pansen von Schafen weder eine Expression von CaBPD9K und TRPV6 in physiologisch relevanter Menge, noch ein Effekt durch diätetische Calcium-Restriktion oder Behandlung der Tiere mit Vitamin D festgestellt werden (Schröder et al., 1999; Schröder et al., 2001; Wilkens et al., 2009).
Obwohl es dagegen bei wachsenden Ziegen durch eine diätetische Calcium-Restriktion zu einer Erhöhung der ruminalen Calcium-Nettofluxraten kam und bei Schafen die ruminale Strontium- Absorption durch die Gabe von 1α-Hydroxycholecalciferol zur Erhöhung der Calcitriol- konzentration im Plasma gesteigert werden konnte (Schröder et al., 1997; Hyde and Fraser, 2014), ist eine direkte Regulation des Calcium-Transportes im Pansen durch Calcitriol also nicht gesichert.
2.4. Konzepte zur Hypocalcämie-Prävention
2.4.1. Fütterung einer Ration mit negativer DCAD vor der Geburt
Die Fütterung einer anionenreichen Diät in den letzten zwei bis drei Wochen vor der Geburt ist auch unter den Namen „DCAD-Konzept (dietary anion cation difference)“ und „saure Salze füttern“ bekannt. Das Prinzip beruht darauf, dass durch ein entsprechendes Mineralfutter die Verhältnisse der für den Säuren-Basen-Haushalt relevanten Ionen Natrium, Kalium, Chlorid und Sulfat in der Ration zugunsten der Anionen verschoben werden. Dadurch entwickelt sich eine milde metabolische Azidose, die in der Regel problemlos vom Organismus kompensiert wird (Stewart, 1983; Constable, 1999; Gelfert et al., 2007).
Obwohl die Eignung des DCAD-Konzeptes als Präventionsmaßnahme allgemein anerkannt ist (Ender et al., 1971; Moore et al., 2000; Seifi et al., 2010), konnte der Wirkmechanismus bislang nicht vollständig geklärt werden. Aufgrund klinischer Beobachtungen und verschiedener in-vitro- Studien wird vermutet, dass die Sensitivität des Parathormon-Rezeptors gegenüber seinem Liganden erhöht wird (Goff and Horst, 2003; Goff et al., 2014). Beim Einsetzen der Laktation
Einleitung
8 und dem damit plötzlich erhöhten Calciumbedarf könnte eine Mobilisation von Calcium aus dem Skelett so unterstützt werden.
Es ist hinlänglich bekannt, dass die Fütterung einer Ration mit negativem DCAD zu einer vermehrten renalen Ausscheidung von Calcium führt (Gaynor et al., 1989; Gelfert et al., 2007).
Kontrovers diskutiert wird aber die Frage, ob es sich bei diesen, für die Verhältnisse beim Wiederkäuer ungewöhnlich hohen Mengen von Calcium im Urin, um eine Art Überschuss durch vermehrte Freisetzung aus dem Skelett handelt (Block, 1984), oder ob es aufgrund der azidotischen Stoffwechsellage durch Inhibition der tubulären Calcium-Resorption zu erhöhten renalen Verlusten kommt (Yeh et al., 2003). Dies könnte die Milchkuh eventuell durch eine künstlich hervorgerufene, aber kompensierbare Mangelsituation auf den mit Einsetzen der Laktation plötzlich erhöhten Bedarf vorbereiten.
2.4.2. Applikation von Vitamin D und seinen Metaboliten
In Europa kann Vitamin D als Futtermittelzusatzstoff in Mengen bis zu 250 µg/kg (Kälber) bzw.
100 µg/kg (Rinder) dem Futter beigemischt werden. Dies geschieht im Wesentlichen aus zwei Gründen: Zum einem, um in einer reinen Stallhaltung die fehlende UV-Exposition auszugleichen, zum anderen kann eine über den üblichen Bedarf hinausgehende Vitamin D Supplementierung erfolgen, um der Belastung des Calcium- und Phosphathaushaltes während Trächtigkeit und Laktation zu begegnen.
Die Applikation von Vitamin D vor dem Geburtstermin soll vor allem die intestinale Calcium- Absorption stimulieren. Die für diese Indikation empfohlene Dosierung liegt in einer Größenordnung von 10 000 bis 20 000 I.E., also 250 bis 500 µg/kg KGW (Radostits et al., 2000;
Löscher et al., 2006). Zu bedenken ist in diesem Zusammenhang, dass für die Umwandlung in Calcitriol allerdings die durch ein Absinken der Konzentration von ionisiertem Calcium hervorgerufene Ausschüttung von Parathormon notwendig ist. Da Calcitriol über den genomischen Weg die Expression der calciumtransportierenden Strukturen stimuliert, ist mit deutlichen funktionellen Effekten erst nach mehreren Stunden zu rechnen. Darüber hinaus ist kritisch zu beurteilen, dass die nachweislich wirksame Dosis nahe an der toxisch wirkenden Dosierung liegt (Littledike and Horst, 1982).
9 Aufgrund ihrer kürzeren Halbwertszeiten und der damit geringeren Toxizität sind auch Versuche mit der Applikation der hydroxylierten Metaboliten durchgeführt worden. Da die biologische Halbwertszeit von Calcitriol nur wenige Stunden beträgt (Beer et al., 2005), ist der Erfolg einer entsprechenden Behandlung abhängig von der exakten Terminierung in Bezug auf die Geburt und damit, was die praktische Anwendbarkeit angeht, nicht besonders vielversprechend. Dieser Nachteil besteht aufgrund seiner längeren Halbwertszeit von 15 Tagen beim 25-Hydroxy- cholecalciferol nicht (Jones, 2008). Zur Wirksamkeit dieses Metaboliten liegen widersprüchliche Ergebnisse vor. Die parenterale Gabe schien die peripartalen Calcium-Plasmaspiegel zu stabilisieren (Jorgensen et al., 1978). In einer Studie, die den oralen Einsatz von 25-Hydroxy- cholecalciferol zur Milchfieber-Prophylaxe zum Inhalt hatte, konnten allerdings keine positiven Effekte festgestellt werden. Die Autoren vermuteten eine unzureichende Umwandlung in Calcitriol (Taylor et al., 2008).
2.5. Potenzielle, unerwünschte Wirkungen von Vitamin D Metaboliten
Neben der offensichtlichen Gefahr einer Intoxikation durch Überdosierung oder gleichzeitiger Anwendung mehrerer Vitamin D Metaboliten, sollte auch geprüft werden, inwieweit es durch die Verabreichung oder Fütterung entsprechender Präparate zu unerwünschten Wechselwirkungen mit anderen Therapeutika kommen kann.
Über die Hälfte aller in der Humanmedizin eingesetzten Medikamente unterliegen einer Metabolisierung durch Cytochrom P450 3A (CYP3A) Enzyme (Guengerich, 1999). Im Anschluss an diese Phase I und entsprechende Phase II Reaktionen werden die so biochemisch veränderten Substanzen über intestinale, hepatische und renale Transportmechanismen ausgeschieden.
Für diese Prozesse entscheidend sind sowohl die Strukturen zur Aufnahme der Substanzen aus dem Blut in die Zelle, als auch die Transporter, die der Exkretion in Darmlumen, Galle oder Urin dienen. Die Aufnahme von Stoffen in die Zelle erfolgt unteranderem über Mitglieder der OAT/OCT (organic anion transporter/organic cation transporter) Familie. Zu den bekannten Exkretions-mechanismen zählen Mitglieder der MRP (multidrug resistance protein) und der MDR/TAP (multidrug resistance / transporters of antigen presentation) Familien, wie beispielsweise P-gp (P-glycoprotein) (König et al., 2013). Beispiele für in der Veterinärmedizin
Einleitung
10 wichtige Substrate dieser Transportsysteme sind Benzylpenicillin, verschiedene Cephalosporine, Tetrazykline, Ivermectin und Eprinomectin (König et al., 2006; Pulido et al., 2006; Kiki- Mvouaka et al., 2010; Emami Riedmaier et al., 2012).
Substanzen und Medikamente, die diese Enzyme und Transporter induzieren oder aber auch hemmen, können so zu Veränderungen der Absorption, Exkretion oder Verteilung von gleichzeitig therapeutisch eingesetzten Medikamenten führen. So erhöht sich beispielsweise bei Schafen die Plasmakonzentration des Anthelminthikums Ivermectin, wenn die Tiere gleichzeitig mit den P-gp und CYP3A inhibierenden Antimykotika Ketoconazol oder Itraconazol behandelt werden (Ballent et al., 2007; Alvinerie et al., 2008). Ähnliches wird bei Hunden bei gleichzeitiger Anwendung von Ivermectin und dem gegen Ektoparasiten angewendeten Spinosad beobachtet (Dunn et al., 2011).
Zu möglichen Interaktionen zwischen Vitamin D Metaboliten und Mechanismen der Arzneimittelelimination gibt es bislang nur wenige Arbeiten an Zelllinien und Labornagern. An Caco-2 Zellen führen sowohl 1,25-Dihydroxy- als auch 25-Hydroxycholecalciferol zu einer Induktion der Expression von CYP3A und P-gp (Schmiedlin-Ren et al., 1997). Auch bei der Ratte erhöhte sich durch Behandlung mit 1,25-Dihydroxycholecalciferol die Expression der intestinalen und renalen CYP3A (Chow et al., 2010). Dass die Plasmakonzentrationen von Medikamenten, die als CYP3A Substrate bekannt sind, in Abhängigkeit der Jahreszeit und damit des Vitamin D Status schwanken, konnte bereits für den Menschen gezeigt werden (Lindh et al., 2011).
In an Mäusen durchgeführten Arbeiten konnte nach Behandlung mit 1,25-Dihydroxy- cholecalciferol eine Stimulation der hepatischen, renalen und intestinalen Expression von P-gp beobachtet werden (Chow et al., 2011; Chow et al., 2013). Die Gabe des im Organismus schnell in 1,25-Dihydroxycholecalciferol umgewandelten Metaboliten 1α-Hydroxycholecalciferol resultierte in einer Erhöhung der intestinalen MRP4 und der renalen MRP2,3 und 4 Expression (Nishida et al., 2009). Bei Ratten führte eine Behandlung mit 1,25-Dihydroxycholecalciferol zu einer Erhöhung der RNA Expression von P-gp im Ileum und einer leichten Stimulation von MRP3 und P-gp in der Leber, während in der Niere OAT1, OAT3 und P-gp verändert waren (Chow et al., 2009; Chow et al., 2010). Die pharmakokinetische Bedeutung der Veränderungen der renalen Transportsysteme konnte auch auf funktioneller Ebene bestätigt werden: Durch eine
11 Verringerung der renalen Expression von OAT1 und OAT3 und der damit verbundenen Abnahme der renalen Exkretion kam es bei Ratten zu deutlich erhöhten Plasmaspiegeln von Cephalosporinen bei gleichzeitiger Applikation von 1,25-Dihydroxycholecalciferol (Kim et al., 2014).
Ziele
12
3. Ziele
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, am kleinen Wiederkäuer grundsätzliche Daten zur gastrointestinalen Calcium-Absorption, zur renalen Calcium-Resorption, zum Knochenstoff- wechsel und zum Vitamin D Metabolismus zu erheben, um Grundlagen für die weitere Erforschung möglicher Maßnahmen zur Prävention der Hypocalcämie der Milchkuh zu schaffen.
Dabei wurde in Hinblick auf die Verwendbarkeit der beiden Spezies als Modell besonderer Wert auf tierartlich vergleichende Aspekte gelegt.
Des Weiteren sollte die Eignung des Vitamin D Metaboliten 25-Hydroxycholecalciferol zur Stabilisierung der peripartalen Calcium-Homöostase der Milchkuh untersucht werden.
Im Einzelnen wurden folgende Fragestellungen bearbeitet:
o Sind die Anpassungsmechanismen der renalen und gastrointestinalen Calcium-Absorption an eine verminderte Calcium-Aufnahme beim Wiederkäuer tatsächlich so eingeschränkt, wie Daten aus der Literatur vermuten lassen?
o Lässt sich die Calcium-Absorption aus dem Pansen in irgendeiner Weise stimulieren?
o Wie erfolgt die Anpassung an den erhöhten Calcium-Bedarf zu Beginn und während der Laktation?
o Kann der Vitamin D Metabolit 25-Hydroxycholecalciferol in Kombination mit einer Ration mit negativer DCAD (dietary cation anion difference) zur Prävention der peripartalen Hypocalcämie eingesetzt werden?
o Sind beim Einsatz von Vitamin D Metaboliten unerwünschte Wirkungen zu erwarten?
13
4. Ergebnisse
4.1. Anpassung an Calcium-Restriktion und Behandlung mit Calcitriol
Um die Vergleichbarkeit der beiden Spezies Schaf und Ziege zu gewährleisten, wurden im Gegensatz zu früheren Studien die Untersuchungen zur diätetischen Calcium-Restriktion stets an Tieren weiblichen Geschlechts, gleichen Alters und gleicher Rationsgestaltung durchgeführt.
Verwendet wurden weibliche Tiere im Alter von sechs bis sieben Monaten, die für einen Zeitraum von vier bis acht Wochen entweder ein Futter mit einem adäquaten Calcium-Gehalt von 0,92 bzw. 1,10% oder einem deutlich niedrigeren Calcium-Gehalt von 0,26 bzw. 0,22% erhielten.
Im Anschluss wurde jeweils die Hälfte der Tiere jeder Fütterungsgruppe mit Calcitriol in einer pharmakologischen Dosierung behandelt (0,5 µg/kg KGW).
Neben den Plasmakonzentrationen von Calcium, Phosphat, Calcitriol und einem Knochenresorptionsmarker wurden die fraktionellen Exkretionen von Calcium und Phosphat bestimmt. Im Anschluss wurden die Tiere zur Organentnahme getötet. Zum einen wurden transportphysiologische Untersuchungen mithilfe der Ussingkammer-Technik durchgeführt, zum anderen wurde die RNA und Proteinexpression der am Calcium-Transport beteiligten Gene TRPV6, CaBPD9K, PMCA1b im Gastrointestinaltrakt, sowie TRPV5, CaBPD28K und NCX1 in der Niere quantifiziert. In Bezug auf den Vitamin D Metabolismus wurde die renale RNA Expression von CYP24A1, CYP27B1, VDR und PTHR bestimmt.
Veröffentlicht wurden die Ergebnisse dieser Studien in den Publikationen 1 bis 4, eine gezielte Gegenüberstellung einiger Aspekte findet sich in Publikation 5. Die folgende Darstellung der wichtigsten Ergebnisse erfolgt in Hinblick auf die spätere Diskussion bereits übergreifend.
4.1.1. Diätetische Calcium-Restriktion
4.1.1.1. Plasmaparameter und hormonelle Anpassung
Eine Übersicht über die Auswirkung einer unterschiedlichen Versorgung mit Calcium liefert die aus Publikation 4 entnommene Abbildung 4.1. Details finden sich in den Publikationen 1 und 3.
Während die diätetische Calcium-Restriktion bei den Schafen zu einer signifikanten Erniedrigung der Konzentrationen von Gesamtcalcium im Plasma und ionisiertem Calcium im Vollblut bei einer gleichzeitigen Erhöhung der Phosphatkonzentration im Plasma führte, waren die
Ergebnisse
14 entsprechenden Plasmaparameter bei den Ziegen unverändert. Gleichzeitig konnte beobachtet werden, dass die endogenen Calcitriolspiegel und die Plasmakonzentration des Knochenresorptionsmarkers CrossLaps bei beiden Spezies durch die gegenüber der Kontrollgruppe verringerte Calcium-Zufuhr signifikant anstiegen.
Abb. 4.1: Vergleich der Auswirkung einer restriktiven Calcium-Versorgung auf die Plasmakonzentrationen von Calcium, Phosphat, Calcitriol und dem Knochenresorptionsmarker CrossLaps (A, B) sowie die fraktionellen Exkretionen (FE) von Calcium und Phosphat (C) von Schafen (hellgraue Säulen) und Ziegen (dunkelgraue Säulen) im Verhältnis zur jeweils gleich 100% gesetzten Kontrollgruppe (weiße Säulen). Abbildung entnommen aus Publikation 4.
Interessanterweise war jedoch die Erhöhung des Plasmacalcitriols bei den Ziegen trotz unveränderter Plasmacalciumkonzentration mit einem Anstieg um den Faktor 2,5 deutlich ausgeprägter als bei den Schafen (1,4). Gleichzeitig stieg aber die RNA Expression von CYP27B1, also des für den letzten Schritt der Umwandlung von Vitamin D in Calcitriol erforderlichen Enzyms 1α-Hydroxylase, bei den Schafen um das Zwölffache, bei den Ziegen aber nur um das Achtfache an (Publikation 4). Umgekehrtes konnte für den Knochen-
15 resorptionsmarker gezeigt werden. Dieser war bei den Ziegen weniger stark erhöht als bei den Schafen.
4.1.1.2. Renale Exkretion von Calcium und Phosphat
Bei beiden Spezies war die renale Exkretion von Calcium und Phosphat vom Calcium-Gehalt in der Ration unbeeinflusst (Abb. 1). Dies spiegelte sich auch in den in Pubikation 4 veröffentlichen Ergebnissen zur RNA und Proteinexpression der an der renalen Calcium-Resorption beteiligten Gene TRPV5, CaBPD28K und NCX1 wieder. Durch die diätetische Calcium-Restriktion kam es zu keiner Stimulation. Im Gegenteil, die RNA Expression von CaBPD28K war bei den Ziegen, die von NCX1 bei den Schafen sogar durch die diätetische Intervention signifikant gegenüber der Kontrollgruppe erniedrigt. Auf Proteinebene konnte ein gleichsinniger Effekt bei den Schafen für alle beteiligten Transportproteine, bei den Ziegen für CaBPD28K und NCX1 beobachtet werden.
Die RNA Expression des an der Phosphat-Resorption beteiligten NaPi2a war nicht von der Ration beeinflusst.
4.1.1.3. Gastrointestinale Calcium-Absorption
Detaillierte Informationen zu den funktionellen und strukturellen Untersuchungen zum gastrointestinalen Calcium-Transport finden sich in den Publikationen 2 und 3.
Für Pansenepithelien beider Spezies konnten mithilfe der Ussing-Kammer in Abwesenheit eines elektrochemischen Gradienten signifikante Calcium-Nettofluxraten in vergleichbarer Größenordnung gezeigt werden, deren Komponenten in Richtung von mucosal nach serosal nicht mit den unidirektionalen Fluxraten des als Marker für den parazellulären Weg eingesetzten Mannits in Zusammenhang standen. Dies ist als deutlicher Hinweis auf einen aktiven, transzellulären Transportmechanismus zu verstehen. Eine relevante Expression der am aktiven, intestinalen Calcium-Transport beim monogastrischen Tier beteiligten Gene TRPV5, TRPV6 und CaBPD9K war im Pansengewebe nicht nachweisbar. Durch die diätetische Calcium-Restriktion waren weder die Fluxraten, noch die Expression der Gene PMCA1b und NCX1 beeinflusst.
Ergebnisse
16 In Bezug auf den intestinalen Calcium-Transport konnten speziesspezifische Unterschiede festgestellt werden. Eine Übersicht liefert die aus Publikation 5 entnommene Tab. 4.1. Während bei Schafen auch nach Belastung der Calcium-Homöostase durch die Calcium-restriktive Ration mithilfe der Ussing-Kammer in beiden untersuchten Abschnitten keine signifikanten Calcium- Nettofluxraten bestimmt werden konnten, kam es bei den Ziegen zu einer deutlichen Stimulation des Calcium-Transportes sowohl im Duodenum als auch im Jejunum. Diese funktionellen Ergebnisse ließen sich teilweise auch strukturell absichern: Die RNA und Proteinexpression von TRPV6 im Jejunum und die Proteinexpression von CaBPD9K im Duodenum waren bei Tieren, die eine Calcium-restriktive Ration erhalten hatten gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöht, während bei den identisch gehaltenen Schafen keinerlei relevante Veränderung festzustellen war.
Tab. 4.1: Mithilfe der Ussingkammer bestimmte Calcium-Nettofluxraten in Pansen (Rum), Duodenum (Duo) und Jejunum (Jeju) von adäquat (Con) oder restriktiv (Ca-) mit Calcium versorgten Schafen und Ziegen. Tabelle entnommen aus Publikation 5.
4.1.2. Calcitriol
4.1.2.1. Plasmaparameter und hormonelle Anpassung
Bei adäquat mit Calcium versorgten Schafen und Ziegen kam es durch das exogene Calcitriol zu einer Erhöhung der Calcium-und Phosphat-Plasmakonzentrationen. Wurden die Tiere vor der Behandlung restriktiv mit Calcium versorgt, fiel der Anstieg des Plasma-Calciums bei unveränderten Phosphatspiegeln geringer aus. Details zum genauen Zeitverlauf sind in den Publikationen 1 und 3 dargestellt.
Der Knochenresorptionsmarker stieg nur bei den Schafen an, die restriktiv mit Calcium versorgt und mit Calcitriol behandelt worden waren (um 48%), während die Behandlung bei den Ziegen
17 unabhängig von der Ration zu einer Erhöhung des Knochenmarkers von ca. 30% innerhalb von 12 Stunden führte.
Bei den Schafen führte das Calcitriol zu einer Erhöhung der renalen VDR Expression, ein solcher Effekt konnte bei den Ziegen nicht beobachtet werden. Ein weiterer Unterschied zwischen den Spezies zeigt sich in Bezug auf die Expression der am Vitamin D Metabolismus beteiligten Enzyme CYP27B1 und CYP24A1. In den adäquat mit Calcium versorgten Gruppen beider Spezies kam es durch die Calcitriol-Behandlung zu einer Verringerung der RNA Expression von CYP27B1 in der gleichen Größenordnung, die Induktion der Expression von CYP24A1, dem Enzym, das die Inaktivierung von Calcitriol einleitet, war jedoch bei den Ziegen doppelt so hoch wie bei den Schafen. Bei restriktiv mit Calcium versorgten Tieren kam es bei beiden Spezies durch das exogene Calcitriol zu einer vergleichbaren Induktion der CYP24A1 RNA Expression um den Faktor 11, die Verringerung der CYP27B1 Expression fiel aber bei den Schafen deutlich stärker aus als bei den Ziegen. Im direkten Vergleich zur jeweils unbehandelten, adäquat ernährten Gruppe kam es durch die Kombination aus diätetischer Calcium-Restriktion und Calcitriol-Behandlung bei den Schafe zu einer Verringerung der CYP27B1 Expression um den Faktor 3,4 und zu einer Erhöhung der CYP24A1 um den Faktor 21. Bei den Ziegen ergaben sich für die CYP27B1 keine Unterschiede zwischen den entsprechenden Gruppen, die CYP24A1 war um den Faktor 14 erhöht (Publikation 4).
4.1.2.2. Renale Exkretion von Calcium und Phosphat
Die Behandlung mit Calcitriol führte bei beiden Spezies zu einer Induktion der RNA Expression von TRPV5, bei der Ziege auch zu der von NCX1. Die bei den zuvor restriktiv mit Calcium versorgten Tieren verringerte Expression von CaBPD28K wurde durch die Behandlung wieder auf das Niveau der Kontrollgruppe erhöht. Die Expression von NaPi2a wurde durch die Behandlung tendenziell bei den Ziegen verringert. Auf Proteinebene konnten keine Effekte festgestellt werden (Publikation 4).
Ergebnisse
18 4.1.2.3. Gastrointestinale Calcium-Absorption
Weder bei Schafen noch bei Ziegen führte die Behandlung zu einer Veränderung der ruminalen Calcium-Nettofluxraten oder der Expression der untersuchten Strukturen.
Die intestinalen Calcium-Nettofluxraten waren bei den Ziegen im Duodenum, bei den Schafen im Jejunum nach Behandlung mit exogenem Calcitriol signifikant erhöht. Auf Ebene der RNA Expression zeigte sich für TRPV6, TRPV5 und bei den Schafen auch für PMCA1b eine deutliche Induktion. Die Bestimmung der RNA Expression von CaBPD9K war zum damaligen Zeitpunkt noch nicht möglich.
Auf Proteinebene konnte die Induktion von TRPV6 im Jejunum tendenziell bei beiden Spezies und die von PMCA1b im Jejunum der Schafe signifikant bestätigt werden.
Weitere Daten finden sich in den Publikationen 2 und 3.
4.2. Laktation
Ziel der in Publikation 6 veröffentlichten Untersuchungen war es, mit der Calcium-Homöostase und dem Knochenstoffwechsel in Zusammenhang stehende Plasmaparameter von pluriparen Schafen, Ziegen und Kühen im peripartalen Zeitraum und nach dem Trockenstellen zu vergleichen. Die zur gastrointestinalen Calcium- und Phosphat-Absorption an Ziegen am 21. Tag p.p. bzw. sechs Wochen nach dem Trockenstellen erhobenen funktionellen und strukturellen Daten finden sich in Publikation 7. Die entsprechenden Ergebnisse aus den Untersuchungen an laktierenden Schafen waren zum Zeitpunkt des Einreichens dieser Habilitationsschrift noch nicht zur Publikation vorbereitet und wurden daher zunächst als „unveröffentlichte Ergebnisse“ in diesem Kapitel und in der späteren Diskussion erwähnt. Da die entsprechende Arbeit mittlerweile publiziert worden ist, wird sie nun korrekterweise als „Klinger et al., 2016“ zitiert, ist jedoch nicht als Bestandteil der schriftlichen Habilitationsleistung anzusehen.
Daten zur Anpassung der renalen Calcium- und Phosphat-Resorptionsmechanismen beider Spezies sowie der Schlüsselenzyme des Vitamin D Metabolismus finden sich in Publikation 5.
In diesen Untersuchungen wurden die Tiere stets bedarfsdeckend gefüttert, d.h. die kleinen Wiederkäuer erhielten neben Heu ad libitum Kraftfutter in einer Menge, die sich an der
19 individuellen Milchleistung orientierte. Die Kühe stammten von einem kommerziellen Milchviehbetrieb. Sie erhielten a.p. eine TMR mit einem Calcium-Gehalt von 7,8 g/kg T, die Ration p.p. enthielt 10,0 g Calcium pro kg T.
4.2.1. Plasmaparameter im peripartalen Zeitraum
Während es bei den Ziegen und Kühen zur Geburt zu einem Abfall der Konzentrationen von Gesamtcalcium bzw. ionisiertem Calcium kam, wiesen die Calcium-Konzentrationen im Blut der Schafe eine Konstanz auf. Der bei Ziegen und Kühen (Publikation 9) gleichzeitig auftretende Anstieg in der Plasmakonzentration von Calcitriol blieb bei den Schafen ebenfalls aus.
Erwähnenswert erscheint in diesem Zusammenhang, dass trotz später auftretender Unterschiede in der Milchproduktion die Einsatzleistungen der Schafe und Ziegen vergleichbar waren.
Abb. 4.2: Vergleich des Quotienten aus dem Knochenformationsmarker Osteocalcin und dem Resorptionsmarker bei Ziegen (dunkelgraue Säulen), Schafen (hellgraue Säulen) und Kühen (weiße Säulen). Abbildung entnommen aus Publikation 6.
In der der Publikation 6 entnommenen Abb. 4.2 ist der Quotient aus dem Knochen- formationsmarker Osteocalcin und dem Knochenresorptionsmarker CrossLaps im zeitlichen Verlauf dargestellt. Bei Ziegen und Kühen kam es zu einem deutlichen Abfall zur Geburt.
Ergebnisse
20 Während der Quotient bei den Ziegen an Tag 10 p.p. wieder das Niveau der a.p. erhobenen Werte erreicht hatte, blieb das Verhältnis aus Formations- und Resorptionsmarker bei den Kühen bis zum Ende der Beobachtungsperiode niedrig. Bei den untersuchten Schafen wurden über die gesamte Zeit konstant niedrige Werte ermittelt. Dass es sich hierbei um ein mit Trächtigkeit und Geburt in Zusammenhang stehendes Phänomen handelt, wird daran deutlich, dass sechs Wochen nach dem Absetzen kein Unterschied zwischen Schafen und Ziegen bestand (62 ± 12 vs. 62 ± 5,2).
4.2.2. Gastrointestinale Calcium-Absorption
Bei beiden Spezies konnten für laktierende Tiere mithilfe der Ussingkammer-Technik höhere ruminale Calcium-Fluxraten als bei trockengestellten Tieren festgestellt werden. Die statistische Absicherung ergab bei den Schafen nur eine Tendenz (Klinger et al., 2016), bei den Ziegen aber einen signifikanten Unterschied (Publikation 7). Dieses Phänomen war von einem geringfügig höheren Kurzschlussstrom und einem zügigeren Abfall desselben nach Zugabe von Ouabain, einem Inhibitor der Na+/K+-ATPase, bei den laktierenden Tieren begleitet. Die Expression der PMCA war unverändert.
Obwohl sich in Abwesenheit eines elektrochemischen Gradienten in der Ussingkammer keine signifikanten Calcium-Nettofluxraten für die untersuchten Dünndarmabschnitte Duodenum und Jejunum verzeichnen ließen, waren RNA und Proteinexpression der mit dem transzellulären Calcium-Transport in Verbindung stehenden Gene TRPV6, CaBPD9K und PMCA1b im Jejunum laktierender Ziegen deutlich gegenüber trockenstehenden Tieren erhöht. Dieser Umstand kann als Hinweis auf eine gesteigerte Transportkapazität der Epithelien laktierender Ziegen unter in vivo- Bedingungen, also beim Vorliegen hoher luminaler Calcium-Konzentrationen, wie sie bei bedarfsgerechter Fütterung zu erwarten sind, gewertet werden.
Bei den Schafen konnten derartig ausgeprägte Effekte nicht beobachtet werden. Die Proteinexpression von CaBPD9K war im Jejunum laktierender Tiere lediglich tendenziell erhöht (Klinger et al., 2016).
21 4.2.3. Renale Anpassung und Vitamin D Metabolismus
Obwohl die auf Creatinin normalisierte Exkretion von Calcium und Phosphat durch die Laktation nicht erhöht war, wiesen laktierende Ziegen im Unterschied zu Schafen eine Verringerung der RNA Expression von TRPV5, CaBPD28K und NCX1b gegenüber trockenstehenden Tieren auf. Für die Proteinexpression konnte tendenziell eine Abnahme des NCX1 bei laktierenden Ziegen und eine Reduktion des TRPV5 bei laktierenden Schafen beobachtet werden.
Während die RNA Expression von VDR und PTHR bei beiden Spezies, und die der CYP27B1 bei den Ziegen unbeeinflusst war, stellte sich die RNA Expression der CYP27B1 bei laktierenden Schafen etwas ausgeprägter und die der CYP24A1 bei beiden Spezies etwas geringer als bei trockenstehenden Tieren dar. Aufgrund hoher individueller Varianzen ließ sich aber nur die Abnahme der CYP24A1 Expression bei laktierenden Ziegen als statistische Tendenz bestätigen.
4.3. Fütterung einer Ration mit negativer DCAD
In Publikation 8 wurden Ergebnisse aus zwei Versuchen zu den Auswirkungen einer Ration mit negativem DCAD (-167 bis -177 meq/kg T) auf den Säure-Basen-Haushalt, den Pansenstoff- wechsel und den ruminalen Calcium-Transport bei männlichen und weiblichen Schafen im Vergleich zu mit einer positiven DCAD gefütterten Kontrolle (+154 bis +160 meq/kg T) veröffentlicht. Da die Veränderungen der Plasmaparameter mit hinreichend aus der Literatur bekannten Daten vergleichbar waren, soll an dieser Stelle nur auf die in Bezug auf den Pansen erzielten Ergebnisse eingegangen werden.
Kürzlich ebenfalls an Schafen erhobene Bilanzdaten sind zur Publikation vorbereitet, wurden aber bislang nur als Tagungsbeitrag vorgestellt. In diesen Untersuchungen wurden Stoffwechselkäfige eingesetzt, um zwei verschiedene Rationen (+161 vs. -132 meq/kg T) miteinander zu vergleichen.
4.3.1. Pansenstoffwechsel und ruminaler Calcium-Transport
Weder die Potenzialdifferenz zwischen Blut und Pansen, noch pH-Wert, Osmolarität oder die Fettsäureproduktion wurden von der Fütterung mit niedrigem DCAD im Vergleich zur
Ergebnisse
22 Kontrollfütterung beeinflusst. Ebenso wenig unterschieden sich die Konzentrationen von Gesamtcalcium, Phosphat, Natrium und Kalium in der Pansenflüssigkeit. Die Fütterung mit der negativen DCAD hatte aber eine signifikante Erhöhung der Konzentrationen von ionisiertem Calcium, Magnesium und Chlorid zur Folge.
Mithilfe der Ussingkammer-Technik konnte gezeigt werden, dass die Ration mit der negativen DCAD zu einer signifikanten Erhöhung der Gewebeleitfahigkeit des Pansens führte. In diesen Experimenten wurden Calcium-Fluxraten in Abwesenheit eines elektrochemischen Gradienten und mit künstlich angelegten Potenzialdifferenzen von -25 mV und +25 mV bestimmt. Diese Methode mit unterschiedlichen elektrischen Triebkräften erlaubt die Differenzierung der unidirektionalen Fluxraten in einen elektrogenen und einen elektroneutralen Anteil. Wie Abbildung 4.3 zu entnehmen ist, war der elektroneutrale Anteil der Fluxraten von mucosal nach serosal, die an Pansenepithelien von mit negativer DCAD in der Ration gefütterten Tieren bestimmt wurden, repräsentiert vom y-Achsenabschnitt der linearen Regression, signifikant höher als der der Kontrollgruppe. Die Fluxraten von serosal nach mucosal unterschieden sich nicht.
23 Abb. 4.3: Unidirektionale Calcium-Fluxraten von serosal nach mucosal (offene Kreise) und von mucosal nach serosal (gefüllte Kreise) nach dreiwöchiger Fütterung einer Ration mit positiver (grau) oder negativer DCAD (schwarz) in Anhängigkeit von der elektrischen Triebkraft.
Abbildung entnommen aus Publikation 8.
4.3.2. Bilanzdaten
Die Bilanzen wurden an ausgewachsenen weiblichen, nicht-laktierenden, nicht-tragenden Schafen über einen Zeitraum von fünf Tagen erhoben. Wie erwartet, kam es durch den Wechsel von der positiven zur negativen DCAD zu einem drastischen Abfall des Urin-pH.
Überraschenderweise waren aber auch die Plasmakonzentrationen von 25- Hydroxycholecalciferol und Calcitriol (1,25-Dihydroxycholecalciferol) nach der Fütterung der negativen DCAD gegenüber der Kontrollperiode erniedrigt (Tab. 4.2). Trotzdem war die scheinbare Calcium-Verdaulichkeit während der Fütterung mit negativer DCAD signifikant erhöht. Da gleichzeitig die renale Calcium-Exkretion um ein Vielfaches anstieg, ergaben sich für die Retention keine Unterschiede zwischen den beiden Bilanzperioden (Tab. 4.3).
Ergebnisse
24 Tab. 4.2: Plasmakonzentrationen von 25-Hydroxycholecalciferol (25-OHD, in ng/ml), 1,25- Dihydroxycholecalciferol (1,25-(OH)2D3, in pg/ml) und 24,25-Dihydroxycholecalciferol (24,25- (OH)2D3, in ng/ml) am letzten Tag der jeweiligen Bilanzperiode. Plasmakonzentrationen von Ca und Pi, ionisiertes Calcium (Ca2+) im Vollblut (alle Angaben in mmol/l), sowie pH-Werte in Blut und Urin während der Bilanzperioden (Mittelwerte und SEM von je fünf Tieren, ermittelt über fünf Tage). Grau hinterlegt: Unterschiede zwischen der ersten (DCAD pos.) und der zweiten Bilanzperiode (DCAD neg.)
DCAD pos. DCAD neg.
25-OHD3 19,24 ± 3,12 16,93 ± 4,04 1,25-(OH)2D3 18,76 ± 2,51 12,28 ± 1,26 24,25-(OH)2D3 0,40 ± 0,09 0,34 ± 0,08
Ca 2,46 ± 0,04 2,43 ± 0,03
Pi 2,19 ± 0,07 2,16 ± 0,07
Ca2+ 1,32 ± 0,01 1,33 ± 0,02
Blut-pH 7,47 ± 0,01 7,43 ± 0,01 Urin-pH 8,78 ± 0,06 6,73 ± 0,33
Tab. 4.3: Tägliche Aufnahme, Ausscheidung mit dem Kot, scheinbare Verdaulichkeit, Ausscheidung mit dem Urin und Retention von Calcium während der Bilanzperioden (Mittelwerte und SEM von je fünf Tieren, ermittelt über fünf Tage). Mit Ausnahme der scheinbaren Verdaulichkeit alle Angaben in g pro Tag. Grau hinterlegt: Unterschiede bzw.
Tendenzen für Unterschiede zwischen der ersten (DCAD pos.) und der zweiten Bilanzperiode (DCAD neg.)
DCAD pos. DCAD neg.
Aufnahme 11,15 ± 0,16 12,91 ± 0,38
Kot 9,83 ± 0,19 10,44 ± 0,24
scheinbare Verdaulichkeit [%]
11,69 ± 2,52 18,98 ± 1,94
Urin 0,05 ± 0,01 1,16 ± 0,11
Retention 1,27 ± 0,28 1,31 ± 0,28
25 4.4. Kombination einer Ration mit negativer DCAD und der oralen Supplementierung mit 25-Hydroxycholecalciferol zur Prävention der peripartalen Hypocalcämie
4.4.1. Studie an Milchkühen
Die Ergebnisse einer in einem kommerziellen Milchviebetrieb durchgeführten Studie zur Kombination einer Ration mit negativem DCAD und der oralen Supplementierung mit 25- Hydroxycholecalciferol werden in Publikation 9 vorgestellt. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurden Kühe 10 Tage vor der Geburt in zwei Fütterungsgruppen eingeteilt (+ 144 vs. -168 meq/kg T). Da die Ansäuerung der Ration über ein Magnesiumchlorid-haltiges Mineralfutter erreicht wurde, war der Calcium-Gehalt der Ration nur leicht beeinflusst (positive DCAD: 7,8 g/kg T; negative DCAD: 8,8 g/kg T). Jeweils die Hälfte der Tiere jeder Gruppe wurde zusätzlich täglich mit 3 mg 25-Hydroxycholecalciferol oral supplementiert. Unmittelbar nach der Geburt erhielten alle Kühe die gleiche Ration (Calcium: 10 g/kg T). Blutproben zur Bestimmung von 25- Hydroxycholecalciferol, Calcitriol, Parathormon, Osteocalcin, CrossLaps, Calcium, ionisiertem Calcium und Phosphat wurden ab Beginn der Behandlung jeden zweiten Tag, zur Geburt, sechs, 12 und 24 Stunden p.p., und anschließend zwei und vier Tage p.p. entnommen und die Resultate der Analysen für alle Tiere, sowie getrennt für Kühe der zweiten und höherer Laktationsnummern ausgewertet.
Die wesentlichen Ergebnisse dieser Studie sind in Abbildung 4.4 dargestellt. Tiere, die die Kombination aus der Ration mit negativer DCAD und Supplementierung mit 25- Hydroxycholecalciferol erhalten hatten, erholten sich schneller von dem transienten Abfall der Calcium-Plasmakonzentration zur Geburt. Allerdings zeigten die Kühe höherer Laktationsnummern, die 25-Hydroxycholecalciferol zusammen mit einer Ration mit positiver DCAD bekommen hatten, die niedrigsten Calcium-Plasmakonzentrationen. Die Rolle der negativen DCAD in Bezug auf die in der Einleitung angesprochene Parathormon-.Sensitivität der Zielgewebe wird auch aus Abbildung 4.5 ersichtlich. Bei vergleichbaren Parathormon-Spiegeln im Plasma ließen sich bei Kühen, die vor der Geburt eine Ration mit negativer DCAD erhalten hatten, unabhängig von der zusätzlichen 25-Hydroxycholecalciferol-Supplementierung höhere Calcium-spiegel im Blut nachweisen.
Ergebnisse
26 Abb. 4.4: Konzentrationen von ionisiertem Calcium im peripartalen Zeitraum von Kühen, die vor der Geburt eine Ration mit negativer (Kreise) oder positiver (Quadrate) DCAD erhalten hatten.
Die Hälfte der Tiere wurde zusätzlich mit 25-Hydroxycholecalciferol supplementiert (gefüllte Symbole). Abbildung entnommen aus Publikation 9.
27 Abb. 4.5: Konzentrationen von ionisiertem Calcium 12 Stunden p.p. von Kühen, die vor der Geburt eine Ration mit negativer (gefüllte Kreise) oder positiver (offene Quadrate) DCAD erhalten hatten. Abbildung entnommen aus Publikation 9.
Da in weiterführenden Studien bei gleicher Dosierung des Vitamin D Metaboliten ein Effekt der Laktationsnummer auf die Plasmakonzentrationen von 25-Hydroxycholecalciferol während des Beobachtungszeitraumes festgestellt wurde, hatte Publikation 10 eine mögliche Altersabhängigkeit der Elimination von 25-Hydroxycholecalciferol zum Inhalt. Es konnte gezeigt werden, dass der Anstieg der Plasmakonzentrationen während der oralen Supplementierung bei jüngeren Tieren stärker und der nach Beendigung stattfindende Abfall schwächer ausgeprägt waren. Die zwischen den beiden Altersgruppen signifikant verschiedenen Plasmahalbwertszeiten von 25-Hydroxycholecalciferol korrelierten dabei nicht mit seiner Maximalkonzentration im Plasma am Ende der Supplementierung, Parathormon oder dem die CYP24A1 und damit die Inaktivierung induzierendem Calcitriol. Es wurde daher ein direkter Effekt des Alters auf die Elimination vermutet.
