Mutations- und Expressionsanalyse des FOXP1-Gens bei der akuten myeloischen Leukämie des Erwachsenen

Klinik für Innere Medizin III

Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Hartmut Döhner

Mutations- und Expressionsanalyse des FOXP1-Gens bei der akuten myeloischen Leukämie des Erwachsenen

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm

vorgelegt von Martin Schlegel

geboren in Biberach an der Riß

2019

Amtierender Dekan: Prof. Dr.rer. nat. Thomas Wirth

1. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr. med. Verena Gaidzik

2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Christian von Tirpitz

Tag der Promotion: 16.04.2021

I

INHALTSVERZEICHNIS

I. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS III

1 EINLEITUNG - 1 -

1.1 Die akute myeloische Leukämie - 1 -

1.2 Pathogenese und Klassifikation der AML - 2 -

1.2.1 Entstehung der AML ... - 2 -

1.2.2 Klassifikation der AML ... - 3 -

1.2.3 Pathogenese der AML ... - 6 -

1.2.4 Chromosomale Aberrationen ... - 9 -

1.2.5 Molekulargenetische und epigenetische Veränderungen ... - 12 -

1.2.6 Therapie der AML ... - 19 -

1.2.7 Submikroskopische Läsionen und Deletionen von 3p14.1-p13 .... - 21 -

1.3 FOXP1 - 24 - 1.3.1 Aufbau und Funktionsweise von FOXP1 ... - 24 -

1.3.2 Expression und Funktion von FOXP1 ... - 25 -

1.3.3 Die kontextabhängige Rolle von FOXP1 in Neoplasien ... - 26 -

1.4 Zielsetzung - 30 - 2 MATERIAL UND METHODEN - 32 - 2.1 Geräte-, Material- und Reagenzienverzeichnis - 32 - 2.1.1 Geräte ... - 32 -

2.1.2 Software ... - 33 -

2.1.3 Hilfsmittel ... - 33 -

2.1.4 Chemikalien, Reagenzien, Kits und Primer ... - 34 -

2.1.5 Puffer und eigene Herstellungen ... - 36 -

2.2 Patientenkollektiv - 37 - 2.3 Materialgewinnung und -aufarbeitung - 40 - 2.3.1 Ficoll-Separierung ... - 40 -

2.3.2 DNA/RNA-Extraktion ... - 41 -

II

2.4 Mutationsanalyse - 44 -

2.4.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... - 44 -

2.4.2 Gelelektrophorese der PCR-Produkte ... - 48 -

2.4.3 Aufreinigung der PCR-Produkte ... - 49 -

2.4.4 Cycle Sequencing Reaction (CSR) ... - 50 -

2.4.5 Aufreinigung der CSR-Produkte ... - 52 -

2.4.6 Sequenzierung der DNA-Fragmente ... - 53 -

2.4.7 Lasergene SeqMan ... - 55 -

2.5 Expressionsanalyse - 55 - 2.5.1 cDNA-Synthese ... - 55 -

2.5.2 qPCR (TaqMan) ... - 57 -

2.5.3 BloodSpot ... - 59 -

2.6 Statistische Auswertung - 59 - 3 ERGEBNISSE - 60 - 3.1 Mutationsanalyse von FOXP1 - 60 - 3.1.1 Etablierung der PCR für FOXP1 ... - 61 -

3.1.2 SNP rs140161845 ... - 62 -

3.1.3 Insertionsmutation c.506_510insGCCAT ... - 62 -

3.2 Expressionsanalyse von FOXP1-mRNA - 65 -

4 DISKUSSION - 72 -

4.1 Mutationen von FOXP1 bei der AML des Erwachsenen - 72 - 4.2 Expression von FOXP1 bei der AML des Erwachsenen - 76 -

4.3 Fazit und Ausblick - 79 -

5 ZUSAMMENFASSUNG - 81 -

6 LITERATURVERZEICHNIS - 83 -

7 ANHANG - 102 -

8 DANKSAGUNG - 104 -

9 CURRICULUM VITAE - 105 -

III

I. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

A Adenin

ABL1 ABL proto-oncogene 1 A-HAM All-trans-Retinsäure + HAM ALL Akute lymphatische Leukämie

AML Akute myeloische Leukämie

AMLSG Acute Myeloid Leukemia Study Group AML1 Acute myeloid leukemia 1

ANKRD26 Ankyrin Repeat Domain 26 APL Akute Promyelozyten Leukämie ARF Alternate reading frame

ASXL1 Additional sex combs like 1

B2M Beta-2-Mikroglobulin

BCR Breakpoint cluster region

bp Basenpaar (base pair)

C Cytosin

CBFβ Core-binding factor beta

CEPBA CCAAT/enhancer binding protein alpha

cDNA Complementary DNA

CI Konfidenzintervall

CKT Complex karyotype

CLL Chronische lymphatische Leukämie CML Chronische myeloische Leukämie

CMML Chronische myelomonozytäre Leukämie CMP Gemeinsame myeloische Vorläuferzelle

CNA Copy number alteration

CNV Copy number variation

CR Complete remission

CSR Cycle sequencing reaction

D Deutschland

dATP Desoxyadenosintriphosphat

IV dCTP Desoxycytidintriphosphat

DDX41 DEAD-Box Helicase 41

DEK DEK proto-oncogene

Del Deletion

DGHO Deutsche Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie dGTP Desoxyguanosintriphosphat

DLBCL Diffus großzelliges B-Zell-Lymphom

DNA Deoxyribonucleic acid

DNMT3A DNA methyltransferase 3 alpha dTTP Desoxythymidintriphosphat

EFS Ereignisfreies Überleben (event-free survival)

EIF4E3 Eukaryotic translation initiation factor 4E family member 3

ELN European LeukemiaNet

ETO Eight-twenty-one ETV6 ETS Variant 6

EVI1 Ecotropic viral integration site 1 FAB French-American-British

FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung FLT3 FMS-like tyrosine kinase 3

FLT3-ITD Interne Tandemduplikation von FLT3

FLT3-TKD Mutation in der Tyrosinkinasedomäne von FLT3 FOXP1 Forkhead box P1

G Guanin

GATA2 GATA binding protein 2

GB Großbritannien

GBE Glycogen branching enzyme

GLT8D4 Glycosyltransferase 8 domain-containing protein 4 GMP Granulozyten-Monozyten-Vorläufer

GnRH Gonadotropin releasing hormone GPCR G-Protein gekoppelter Rezeptor GPR27 G-protein coupled receptor 27 HAM Hochdosis Cytarabin + Mitoxantron HPLC High performance liquid chromatography

HR Hazard ratio

V

HSC Hämatopoetische Stammzellen

HSCT Stammzelltransplantation

ICD-10 International Classification of Diseases, 10. Ausgabe ICE Idarubicin, Cytarabin, Etoposid

IDH1 Isocitrate dehydrogenase 1 IDH2 Isocitrate dehydrogenase 2 inv(16) Inversion auf Chromosom 16 inv(3) Inversion auf Chromosom 3

KM Knochenmark

KMT2A Histone-lysine N-methyltransferase 2A KRAS Kirsten rat sarcoma

MAR Minimally altered region

Mb Megabasenpaare

mDC Myeloische dentritische Zelle MDS Myelodysplastisches Syndrom

MECOM MDS1 and EVI1 complex locus protein EVI1 MHCII Major histocompatibility complex 2

MKL1 MKL/megakaryoblastic leukemia 1 MLL Mixed-lineage leukemia

MLLT3 MLLT3 super elongation complex subunit MEP Megakaryozyten-erythroide Vorläuferzelle MPN Myeloproliferative Neoplasien

MPO Myeloperoxidase

MNC Mononukleäre Zellen

MRD Minimal residual disease

MRD Matched related donor

MUD Matched unrelated donor

MY Myelozyt

MYH11 Myosin, heavy chain 11 NGS Next generation sequencing NK Natürliche Killerzelle

NL Niederlande

NPM1 Nucleophosmin 1

NRAS Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog

VI NSE Nicht-spezifische Esterase

NUP214 Nucleoporin 214

OS Gesamtüberleben (overall survival)

P53 Protein 53

PB Peripheres Blut

PBGD Porphobilinogen Deaminase PCR Polymerase chain reaction pDC Plasmatische dentritische Zelle

PM Promyelozyt

PMN Polymorphonukleäre Zellen

PML Promyelocytic leukemia gene

PPP4R2 Protein phosphatase 4, regulatory subunit 2 PROK2 Prokineticin 2

PUM1/2 Pumilio RNA Binding Family Member 1/2

qPCR Real-time quantitative polymerase chain reaction Rag1 Recombination activating 1

Rag2 Recombination activating 2

RAS Rat sarcoma

RARA Retinoic acid receptor alpha RBM15 Putative RNA-binding protein 15

RD Refractory disease

RFS Rezidivfreies Überleben (relapse-free survival) RPN1 Ribophorin 1

RT Reverse Transkriptase

RTK Rezeptor-Tyrosinkinase

RUNX1 Runt-related transcription factor 1 RUNX1T1 RUNX1 translocation partner 1 RYBP RING1 and YY1 binding protein

SB Sudanschwarz

SHQ1 Eigenname, Alias H/ACA ribonucleoprotein assembly factor

shRNA Small hairpin RNA

SNP Einzelnukleotidpolymorphismus (single nucleotide polymorphism) S1PR2 Sphingosine-1-Phosphate Receptor 2

T Thymin

VII

TCGA The Cancer Genome Atlas

TET2 Tet methylcytosine dioxygenase 2 TGFβ Transforming growth factor β TP53 Tumor protein p53 (syn. P53)

UPD Uniparentale Disomie

USA Vereinigte Staaten von Amerika

UTR Untranslated region

U/min Umdrehungen pro Minute WHO World Health Organization

WT Wildtyp

WT1 Wilms tumor 1

- 1 -

1 EINLEITUNG

1.1 Die akute myeloische Leukämie

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine maligne Entartung der Myelopoese, bei der es durch klonale Proliferation und Expansion unreifer, myeloischer Zellen zur Verdrängung der übrigen Hämatopoese kommt. Infolgedessen steigt die Anzahl myeloischer Vorstufen sowohl im Knochenmark (KM) als auch im peripheren Blut (PB). Dies führt schließlich zur Verdrängung der normalen Hämatopoese, was sich in Form von Neutropenie, Thrombozytopenie und Anämie widerspiegeln kann.

Charakteristische Symptome sind allgemeine Schwäche, Blutungsneigung und eine erhöhte Infektanfälligkeit. Die Erkrankung tritt typischerweise akut auf und führt, falls unbehandelt, durchschnittlich zwei Monate nach Diagnosestellung zum Tod.

Mit ca. 80 % stellt die AML die häufigste akute Leukämieform im Erwachsenenalter dar [98, 201]. Die jährliche Inzidenz der AML in Deutschland lässt sich aufgrund eines fehlenden zentralen und flächendeckenden Krebsregisters nur schätzen. In Anlehnung an das US-amerikanische Krebsregister erkranken jährlich 4,3/100.000 Männer und 2,9/100.000 Frauen an der AML [125]. In Kombination mit europäischen Inzidenzen liegt die Inzidenz der AML stabil bei 3-5 Fällen pro 100.000 Einwohner [154, 166]. Grundsätzlich kann die AML in allen Altersgruppen auftreten, doch steigt die Inzidenz der Erkrankung mit dem Alter (Abbildung 1). Das mediane Alter bei Diagnosestellung liegt bei ca. 68,7-72 Jahren [86, 166].

- 2 - Abbildung 1: Inzidenz der akuten myeloischen Leukämie (AML) zwischen 2007 und 2011 (Neuerkrankungen pro 100 000 Einwohner in US-amerikanischer Bevölkerung) entsprechend Alter und Geschlecht basierend auf [125]

1.2 Pathogenese und Klassifikation der AML

Die AML ist eine Erkrankung, die durch genetische und epigenetische Aberrationen entsteht. Diese Veränderungen werden erworben und nehmen in hämatopoetischen Vorläuferzellen ihren Ursprung. Da die normalen Mechanismen von Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung gestört sind, bildet sich ausgehend von dieser betroffenen Vorläuferzelle durch klonale Proliferation eine Vielzahl unreifer Myeloblasten im KM. Die exzessive Vermehrung der Myeloblasten führt schließlich zur Verdrängung der normalen Blutbildung und Ausbildung des typischen klinischen Bildes.

Bezüglich der Entstehung kann die AML in eine de novo AML oder sekundäre AML eingeteilt werden. Dies trägt der Tatsache Rechnung, dass die AML ohne assoziierte Vorerkrankung (de novo) oder auf dem Boden einer vorbestehenden Erkrankung wie beispielsweise einem myelodysplastischen Syndrom (MDS) oder einer myeloproliferativen Erkrankung (sekundär) entstehen kann. Zu den

- 3 - sekundären Formen der AML zählt auch die AML nach Behandlung mit Chemotherapie oder Radiatio (sogenannte therapie-assoziierte AML).

In diesem Sinne wurden auch Risikofaktoren für die Entwicklung der AML definiert [7, 140, 145, 153], zu denen unter anderem das Alter, vorherige hämatologische Erkrankungen, Erbkrankheiten, Viren, Strahlung, Chemikalien oder andere Schadstoffe, sowie der Zustand nach Chemotherapien zählen. Allerdings können diese nur bei einer Minderheit aller AML-Patienten beobachtet und in Verbindung mit der Entstehung der AML gebracht werden [153].

1.2.2 Klassifikation der AML

Vor Einführung der AML-Klassifikation durch die World Health Organisation (WHO) galt die French-American-British (FAB) Klassifikation [19] als Standard. Sie teilte die AML nach primär morphologischen und zytochemischen Kriterien der Leukämiezellen ein; mögliche zugrunde liegende genetische Veränderungen wurden dabei nicht berücksichtigt. Dazu erstellte man bei Diagnosestellung der AML einen Ausstrich aus PB sowie KM und beurteilte die leukämischen Zellen anhand oben genannter Kriterien: Während eine panoptische Färbung die Beurteilung der Morphologie erleichterte, dienten die zytochemischen Färbungen als zusätzliche Differenzierungs- und Einteilungshilfe. Um die Diagnose AML stellen zu können, musste der Anteil der Blasten an allen kernhaltigen Zellen ≥ 30 % betragen.

Mindestens 3 % der Blasten mussten Peroxidase-positiv sein. Auf diese Weise erfolgte eine Einteilung in sieben FAB-Subtypen M0-7 (Tabelle 1). Gegebenenfalls konnten immunhistochemische Verfahren hinzugezogen werden, um die Abgrenzung der AML von der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) und die Diagnose der AML M7 zu erleichtern.

- 4 - Tabelle 1: French-American-British (FAB)-Klassifikation der AML basierend auf zytomorphologischen und zytochemischen Kriterien [18, 19]

AML: Akute myeloische Leukämie, PML: Promyelocytic leukemia gene, RARA: Retinoic acid receptor alpha, t: Translokation, mit Bindestrich verbundene Gennamen: Fusionsgene

FAB-Subtyp Nomenklatur

M0 Akute myeloische Leukämie mit minimaler Differenzierung M1 Akute myeloische Leukämie ohne Ausreifung

M2 Akute myeloische Leukämie mit Ausreifung

M3 Akute Promyelozyten Leukämie (APL)

M3V Akute myeloische Leukämie mit t(15;17) (PML-RARA)

M4 Akute myelomonozytäre Leukämie

M4eos Akute myelomonozytäre Leukämie mit atypischen Eosinophilen

M5A Akute monoblastäre Leukämie

M5B Akute monozytäre Leukämie

M6 Akute erythroide Leukämie

M7 Akute megakaryozytäre Leukämie

Durch die Veröffentlichung der WHO-Klassifikation der AML im Jahr 2001 [82]

wurde die FAB-Klassifikation praktisch abgelöst. Die von der WHO entwickelte Einteilung kategorisiert die AML, im Gegensatz zur FAB-Klassifikation, zunächst auf dem Boden zytogenetischer Veränderungen und seit 2008 auch anhand molekulargenetischer Merkmale [180]. Die WHO-Klassifikation umfasst insgesamt acht Subgruppen, wobei alleine anhand der zugrunde liegenden genetischen Defekte schon über 50 % [40, 174] aller AML-Patienten definiert werden können.

Diese Einteilung trägt also den AML-assoziierten genetischen Veränderungen Rechnung und hat auf diese Weise den entscheidenden Vorteil einer weitaus objektiveren Kategorisierung im Vergleich zu der FAB-Klassifikation [8, 38, 82, 180].

Zur Diagnosestellung der AML gemäß der WHO-Klassifikation sind, im Gegensatz zur FAB-Klassifikation, ≥ 20 % Myeloblasten im Blut aus dem KM oder dem PB nötig. Die 2001 eingeführte WHO-Klassifikation wurde 2008 und 2016 aktualisiert

- 5 - und enthält nun auch die drei molekulargenetischen Marker Nucleophosmin 1 (NPM1) und CCAAT/enhancer binding protein alpha (CEBPA) sowie als sogenannte vorläufige Entität „die AML mit runt-related transcription factor 1 (RUNX1)“ [8] sowie die “AML mit BCR-ABL1“ (Fusionsgen aus breakpoint cluster region und ABL proto-oncogene 1).

Tabelle 2: Revidierte Klassifikation der AML gemäß Weltgesundheitsorganisation (WHO) von 2016 [8]

ABL1: ABL proto-oncogene 1, non-receptor tyrosine kinase, AML: Akute myeloische Leukämie, APL:

Akute Promyelozyten Leukämie, BCR: Breakpoint cluster region, CBFB: Core binding factor beta, CEBPA: CCAAT/enhancer binding protein alpha, DEK: DEK proto-oncogene, EVI1: Ecotropic viral integration site 1, KMT2A: Histone-lysine N-methyltransferase 2A, inv: Inversion, MKL1:

MKL/megakaryoblastic leukemia 1, MLLT3: MLLT3 super elongation complex subunit, MYH11:

Myosin heavy chain 11, NPM1: Nucleophosmin 1, NUP214: Nucleoporin 214, p: Kurzer Arm eines Chromosoms, PML: Promyelocytic leukemia gene, q: Langer Arm eines Chromosoms, RARA:

Retinoic acid receptor alpha, RBM15: RNA binding motif protein 15, RPN1: Proteasome regulatory particle base subunit RPN1, RUNX1: Runt related transcription factor 1, RUNX1T1: RUNX1 translocation partner 1, t: Translokation, mit Bindestrich verbundene Gennamen: Fusionsgene

Akute myeloische Leukämie mit rekurrenten genetischen Veränderungen AML mit t(8;21)(q22;q22.1); RUNX1-RUNX1T1

AML mit inv(16)(p13.1q22) oder t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11 APL mit t(15;17)(q22;q12); PML-RARA

AML mit t(9;11)(p21.3;q23.3); MLLT3-KMT2A AML mit t(6;9)(p23;q34.1); DEK-NUP214

AML mit inv(3)(q21.3q26.2) oder t(3;3)(q21.3;q26.2); GATA2, MECOM AML (megakaryoblastisch) mit t(1;22)(p13.3;q13.3); RBM15-MKL1 Vorläufige Entität: AML mit BCR-ABL1

AML mit mutiertem NPM1

AML mit biallelisch mutiertem CEBPA

Vorläufiger Entität: AML mit mutiertem RUNX1

Akute myeloische Leukämie mit MDS-verwandten Veränderungen Therapieinduzierte myeloische Neoplasien

Akute myeloische Leukämie ohne andere Einordnungsmöglichkeit AML mit minimaler Differenzierung

AML ohne Ausreifung

Fortsetzung Tabelle 2 auf Seite 6

- 6 -

Fortsetzung Tabelle 2

AML mit Ausreifung

Akute myelomonozytäre Leukämie

Akute monoblastische/monozytäre Leukämie Akute erythrozytäre Leukämie

Pure erythroide Leukämie

Akute megakaryoblastische Leukämie Akute Basophilenleukämie

Akute Panmyelose mit Myelofibrose (syn.: akute Myelofibrose; akute Myelosklerose) Myelosarkom

Myeloische Proliferationen bei Down-Syndrom Transiente abnormale Myelopoese

Myeloische Leukämie assoziiert mit Down-Syndrom

Blastische plasmazytoide Neoplasie dendritischer Zellen Akute Leukämien unterschiedlicher Zelllinien

Akute undifferenzierte Leukämie

Akute Leukämie gemischten Phänotyps mit t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR-ABL1 Akute Leukämie gemischten Phänotyps mit t(v;11q23.3); KMT2A umgeordnet

Akute Leukämie gemischten Phänotyps, B/myeloisch, ohne andere Einordnungsmöglichkeit

Akute Leukämie gemischten Phänotyps, T/myeloisch, ohne andere Einordnungsmöglichkeit

1.2.3 Pathogenese der AML

Derzeit wird angenommen, dass die Entstehung der AML einen mehrstufigen Prozess darstellt, bei dem eine hämatopoetische Vorläuferzelle unterschiedlichen Entwicklungsstadiums durch genetische und epigenetische Veränderungen ihre regulären Mechanismen der Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung verliert [54]. Dieses Konzept der mehrstufigen Leukämogenese (Abbildung 2) beruht auf Daten, die zeigen, dass zur Leukämogenese im Rahmen der AML mehrere unterschiedliche genetische Veränderungen ineinander greifen müssen [54, 91]. So legen Tiermodelle nahe, dass eine einzige Mutation zur Entstehung der AML nicht ausreicht. Beispielsweise zeigte sich nur bei gleichzeitiger Mutation von Npm1 und FMS-like tyrosine kinase 3 mit interner Tandemduplikation (Flt3-ITD) das

- 7 - Vollbild einer AML, wohingegen bei Einzelmutationen von entweder Npm1 oder Flt3-ITD nur nach langer Latenz und bei nur sehr wenigen Mäusen eine Leukämie oder eine myeloproliferative Neoplasie beobachtet wurde [124].

Abbildung 2: Konzept der mehrstufigen Leukämogenese. Eine initiale genetische Mutation (1. Hit bzw. driver mutation) in entweder hämatopoetischen Stammzellen (HSC) oder davon ausgehenden Progenitorzellen (A) induzieren ein prä-leukämisches Stadium der expandierenden, klonalen Zelle (B). Alle zu diesem Zeitpunkt zufällig erworbenen Mutationen (passenger mutation) liegen ebenfalls in dieser klonalen, präleukämischen Zelle vor. Durch den Erwerb einer weiteren Mutation (2. Hit bzw. driver mutation) entsteht eine klonale, leukämische Stammzelle und konsekutiv die AML.

Aktuelle Daten des Cancer Genome Atlas (TCGA) zeigen, dass bei der Mehrzahl aller AML-Fälle mehr als eine genetische Mutation gefunden werden kann [28].

Interessanterweise ist die Anzahl von Genmutationen, die bei Patienten mit AML gefunden werden trotzdem signifikant geringer als bei den meisten anderen Krebsarten. So konnten bei 200 untersuchten AML-Patienten durchschnittlich je 13 mutierte Gene ausgemacht werden, fünf davon traten rekurrent auf. Außerdem konnte erstmalig gezeigt werden, dass fast alle Mutationen bei AML-Patienten auf neun Genkategorien zurückgeführt werden können. 99 % von 200 untersuchten AML-Patienten wiesen mindestens eine Mutation aus diesen neun Genkategorien auf. Die neun Genkategorien umfassten 1) fusionierte Transkriptionsfaktoren, 2) myeloische Transkriptionsfaktoren 3) NPM1, 4) Tumorsuppressorgene, 5) DNA- Methylierungsgene, 6) chromatinmodifizierende Gene, 7) Signaltransduktionsgene, 8) Gene des Cohesin-Komplexes und 9) Gene des Spliceosome-Komplexes.

Mit Hilfe dieser funktionellen Kategorisierung war es möglich, weitere Einblicke in die pathogenetische Relevanz dieser Gene zu gewinnen. Zudem gab es spezifische Mutationsmuster innerhalb der neun Genkategorien. So traten manche Mutationen aus einer Genkategorie ausschließlich exklusiv auf, andere häufig in Kombination mit Genmutationen anderer Kategorien. Die Autoren schlussfolgerten daher, dass

- 8 - gegenseitig exklusive Mutationen wie Fusionen von Transkriptionsfaktoren und häufige molekulargenetische Mutationen wie z. B. NPM1 und CEBPA ähnliche AML-initiierende Pathomechanismen haben müssen. Gegenseitige Exklusivität innerhalb bestimmter biologischer Klassen wie Cohesine, Spliceosome, Signaltransduktionsproteine und histon-modifizierende Proteine sprechen dafür, dass eine Mutation innerhalb dieser Signalkaskaden zur Entstehung der AML ausreichen kann.

In Anlehnung an diese Erkenntnisse des Cancer Genome Atlas wurde im Rahmen einer weiteren aktuellen Arbeit die Ergänzung der rekurrenten genetischen Aberrationen der WHO-Klassifikation um weitere drei Subgruppen vorgeschlagen, mit dem Ziel einer vollständig genetischen Klassifikation der AML [134]. In dieser Arbeit wurden 1540 AML-Patienten mittels next generation sequencing (NGS) untersucht. Insgesamt konnten 5234 Mutationen in 76 Genen oder genomischen Regionen identfiziert werden. Die Zusammensetzung der Co-mutationen erlaubte die Identifizierung von drei zusätzlichen AML-Subgruppen, nämlich die Gruppe mit Veränderungen in den Chromatinspliceosome-Genen, mit Tumor protein p53 (TP53)-Aneuploidie und Isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2)-Mutationen. Tabelle 3 zeigt die vorgeschlagene genetische Klassifikation der AML aus elf genetisch definierten Subgruppen, mit deren Hilfe bereits 80 % von 1540 untersuchten AML- Patienten auf dem Boden genetischer Veränderungen klassifiziert werden konnten.

- 9 - Tabelle 3: Vorgeschlagene genetische Klassifikation der AML [134]

AML: Akute myeloische Leukämie, CBFB: Core binding factor beta, CEBPA: CCAAT/enhancer binding protein alpha, DEK: DEK proto-oncogene, EVI1: Ecotropic viral integration site 1, GATA2:

GATA binding protein 2, inv: Inversion, IDH2: Isocitrate dehydrogenase 2, MECOM: MDS1 and EVI1 complex locus protein EVI1, MYH11: Myosin heavy chain 11, NPM1: Nucleophosmin 1, NUP214:

Nucleoporin 214, p: Kurzer Arm eines Chromosoms, PML: Promyelocytic leukemia gene, q: Langer Arm eines Chromosoms, RARA: Retinoic acid receptor alpha, RBM15: RNA binding motif protein 15, RPN1: Proteasome regulatory particle base subunit RPN1, RUNX1: Runt related transcription factor 1, RUNX1T1: RUNX1 translocation partner 1, t: Translokation, TP53: Tumor protein p53, mit Bindestrich verbundene Gennamen: Fusionsgene

AML mit mutiertem NPM1

AML mit mutiertem Chromatin, RNA-splicing Genen oder beidem AML mit mutiertem TP53, chromosomaler Aneuploidie oder beidem AML mit inv(16)(p13.1q22) oder t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11 AML mit biallelisch mutiertem CEBPA

AML mit t(15;17)(q22;q12); PML-RARA AML mit t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1 AML mit MLL-Fusionsgenen; t(x;11)(x;q23)

AML mit inv(3)(q21q26.2) oder t(3;3)(q21;q26.2); GATA2, MECOM(EVI1)

AML mit IDH2-R172 Mutationen und keiner anderen klassendefinierenden Läsion AML mit t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214

1.2.4 Chromosomale Aberrationen

Ca. 55 % aller AML-Patienten weisen chromosomale Aberrationen auf [41, 66, 120].

Diese zytogenetischen Veränderungen in den myeloischen Blasten der AML- Patienten unterscheiden sich in ihrer Ausprägung und Entstehung. So gibt es eine Vielzahl struktureller als auch nummerischer Chromosomenaberrationen. Die strukturellen Chromosomenaberrationen finden sich charakteristischerweise bei Patienten mit de novo AML, treten altersabhängig auf [159, 160] und sind auch in der WHO-Klassifikation (Tabelle 2) als rekurrente chromosomale Aberrationen enthalten. Nummerische Chromosomenaberrationen wie die Trisomie 21 werden in der WHO-Klassifikation ebenfalls abgebildet. Insbesondere die rekurrenten chromosomalen Veränderungen sind gemeinsam mit dem Alter bei

- 10 - Diagnosestellung die wichtigsten und aussagekräftigsten, prognostischen Marker der AML im Erwachsenenalter [63, 122].

Grundsätzlich werden bei den rekurrenten chromosomalen Aberrationen balancierte von unbalancierten Translokationen unterschieden. Viele dieser Translokationen führen durch die Umstellungen von Genen zur Formation von sogenannten Fusionsgenen [114, 118]: Diese enthalten zum einen Genabschnitte, die für Transkriptionsfaktoren codieren, welche wiederum für die myeloische Differenzierung unerlässlich sind. Zum anderen sind solche Genabschnitte betroffen, die im Stande sind, mit sogenannten Co-repressoren zu interagieren. Das entstandene Fusionsprotein behält die DNA-Bindungsstellen des ursprünglichen Transkriptionsfaktors bei und besitzt zusätzlich die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit Co-repressoren. Auf diese Weise fällt die Transkription des Zielgens weg (silencing), das für die normale myeloische Entwicklung unverzichtbar ist. Dieser Mechanismus trifft aber weder für alle rekurrenten chromosomalen Aberrationen der AML zu, noch führt er alleine zur Entwicklung der AML. Zum tatsächlichen Ausbruch der AML wird ein Zusammenspiel mit anderen genetischen und epigenetischen Veränderungen im Sinne der mehrstufigen Leukämogenese vorausgesetzt.

Anhand der Zytogenetik lassen sich drei Risikogruppen definieren, die mit einem unterschiedlichen Therapieansprechen, Rezidivrisiko und Gesamtüberleben assoziiert sind: Niedrig-, Intermediär- und Hochrisikogruppe. Mit wachsenden Erkenntnissen auf dem Gebiet der Molekulargenetik wurde diese Einteilung um rekurrente molekulargenetische Befunde erweitert. Diese Form der Risikostratifizierung wurde wie bereits erwähnt in der aktuellen WHO-Klassifikation als auch in den Empfehlungen des European LeukemiaNet [39] angewendet und wird in Tabelle 4 abgebildet.

- 11 - Tabelle 4: Einteilung in genetische Risikogruppen von Patienten mit AML in Abhängigkeit von Therapieansprechen, Rezidivrisiko und Gesamtüberleben gemäß Empfehlungen des European LeukemiaNet (ELN) [39]

ABL1: ABL proto-oncogene 1, non-receptor tyrosine kinase, AML: Akute myeloische Leukämie, APL:

Akute Promyelozyten Leukämie, ASXL1: Additional sex combs like 1, BCR: Breakpoint cluster region, CBFB: Core binding factor beta, CEBPA: CCAAT/enhancer binding protein alpha, DEK: DEK proto-oncogene, EVI1: Ecotropic viral integration site 1, FLT3: FMS-like tyrosine kinase 3, GATA2:

GATA binding protein 2, KMT2A: Histone-lysine N-methyltransferase 2A, inv: Inversion, MECOM:

MDS1 and EVI1 complex locus protein EVI1, MKL1: MKL/megakaryoblastic leukemia 1, MLLT3:

MLLT3 super elongation complex subunit, MYH11: Myosin heavy chain 11, NPM1: Nucleophosmin 1, NUP214: Nucleoporin 214, p: Kurzer Arm eines Chromosoms, q: Langer Arm eines Chromosoms, RARA: Retinoic acid receptor alpha, RUNX1: Runt related transcription factor 1, RUNX1T: RUNX1 translocation partner 1, TP53: Tumor protein p53, t: Translokation, mit Bindestrich verbundene Gennamen: Fusionsgene

FLT3-ITD^niedrig: Niedrige allelic ratio (< 0.5), FLT3-ITD^hoch: Hohe allelic ratio (≥ 0.5). Allelic ratio: Durch quantitative Fragmentanalyse ermittelter Quotient aus Fläche unter der Kurve von FLT3-ITD und Fläche unter der Kurve von FLT3-WT mit statistisch-prognostischer Aussagekraft

Genetische Risikogruppe

Zugrundeliegende zyto- und molekulargenetische Befunde

Günstig t(8;21)(q22;q22.1); RUNX1-RUNX1T1

inv(16)(p13.1q22), t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11 Mutiertes NPM1 ohne FLT3-ITD oder mit FLT3-ITD^niedrig Biallelisch mutiertes CEBPA

Intermediär Mutiertes NPM1 und FLT3-ITD^hoch

Wildtyp NPM1 ohne FLT3-ITD oder mit FLT3-ITD^niedrig (ohne ungünstige genetische Läsionen)

t(9;11)(p21.3;q23.3); MLLT3-KMT2A

Zytogenetische Abnormalitäten, die nicht als günstig oder ungünstig klassifiziert werden

Ungünstig t(6;9)(p23;q34.1); DEK-NUP214 t(v;11q23.3); KMT2A umgeordnet

Fortsetzung Tabelle 4 auf Seite 12

- 12 - Fortsetzung Tabelle 4

t(9;22)(q34.1;q11.2); BCR-ABL1 inv(3)(q21.3q26.2) oder

t(3;3)(q21.3;q26.2); GATA2,MECOM(EVI1)

−5 or del(5q); −7; −17/abn(17p)

Komplexer Karyotyp, monosomaler Karyotyp Wildtyp NPM1 and FLT3-ITD^hoch

Mutiertes RUNX1 Mutiertes ASXL1 Mutiertes TP53

1.2.5 Molekulargenetische und epigenetische Veränderungen

AML-assoziierte molekulargenetische Mutationen treten entweder somatisch, d.h.

erworben auf, oder in Form von angeborenen Keimbahnmutationen. Bei den meisten der molekulargenetischen Veränderungen, die zur Entstehung der AML beitragen, handelt es sich um somatische Mutationen. AML-assoziierte Keimbahnmutationen wie z. B. CEBPA, RUNX1, Ankyrin Repeat Domain 26 (ANKRD26), DEAD-Box Helicase 41 (DDX41), ETS Variant 6 (ETV6) und GATA binding protein 2 (GATA2) sind dagegen seltener und werden nach der aktuellen WHO-Klassifikation erstmals eigenständig unter „myeloische Neoplasien mit Keimbahnprädispositionen“ klassifiziert.

Nach neuesten Erkenntnissen treten AML-assoziierte, somatische Genmutationen mit zunehmenden Alter häufiger auf und können eine klonale Hämatopoese ohne Ausbildung eines krankhaften Phänotyps bedingen. Dieser prämaligne Zustand ist jedoch mit einem erhöhten Risiko für hämatologische Neoplasien sowie einer erhöhten Gesamtmortalität assoziiert, woraus die Autoren schlussfolgerten, dass es sich bei den teils rekurrenten Genmutationen um frühe Ereignisse in der Entwicklung einer klonalen hämatopoetischen Expansion handelt [61, 83, 200], die prognostisch und therapeutisch von Bedeutung sein könnten [62].

- 13 - Molekulargenetische Aberrationen können prinzipiell bei jedem AML-Subtyp vorkommen. Allerdings ist ihre Prävalenz signifikant höher innerhalb der Gruppe der zytogenetisch normalen AML-Patienten (CN-AML), bei denen keine zytogenetisch fassbaren chromosomalen Veränderungen nachgewiesen werden konnten [41]. Bei diesen CN-AML-Patienten, die ca. 40-49 % [123] aller erwachsenen AML-Patienten ausmachen, wurden in den letzten Jahren viele solcher somatischen, molekularen Aberrationen identifiziert. Zu den wichtigsten zählen NPM1, CEBPA, RUNX1, FLT3, IDH1, IDH2, Wilms tumor 1 (WT1), Tet methylcytosine dioxygenase 2 (TET2), DNA methyltransferase 3 alpha (DNMT3A) sowie Additional sex combs like 1 (ASXL1) [40]. Die klinische Bedeutung dieser erworbenen genetischen Mutationen hat aufgrund des Nachweises ihrer prognostischen Eigenschaften aber auch im Hinblick auf mögliche genotypspezifische zielgerichtete Therapieansätze in den letzten Jahren stark an Stellenwert hinzugewonnen. Denn die AML-Patienten mit molekulargenetischen Veränderungen zeigen, analog zu den chromosomalen Aberrationen, je nach Mutation unterschiedliche prognostische Eigenschaften [123, 155]. So gibt es Unterschiede im Therapieansprechen, dem Rezidivrisiko und dem Gesamtüberleben. Bisher sind allerdings nur die molekularen Marker NPM1 sowie CEBPA als eigenständige Entität und RUNX1 als vorläufige Entität in der aktuellen WHO-Klassifikation der AML berücksichtigt worden [8].

NPM1

NPM1 ist ein ubiquitär vorliegendes Phosphoprotein, das hauptsächlich im Zellkern liegt und durchgehend zwischen Zellkern und Zytoplasma pendelt. Es ist unter anderem an kritischen Zellprozessen wie dem Aufbau und Transport von Ribosomen, der Regulation der Zentrosomenduplikation während der Mitose, der Zellproliferation, der DNA-Reparatur sowie an der Regulation von Tumorsuppressoren wie TP53 und Alternate reading frame (ARF) beteiligt [46, 47].

NPM1-Mutationen sind die häufigsten nachweisbaren Mutationen bei erwachsenen AML-Patienten: So weisen 25-30 % erwachsener AML-Patienten Mutationen von NPM1 auf [46, 47], von denen ungefähr 85 % wiederum zytogenetisch normal sind [100]. Insgesamt können bei 45-64 % der Patienten mit CN-AML NPM1-Mutationen nachgewiesen werden [113]. Die genauen Pathomechanismen sind nicht abschließend geklärt. Es wird vermutet, dass durch die NPM1-Mutation unter

- 14 - anderem die Pendelaktivität von NPM1 zwischen Zellkern und Zytoplasma verloren geht und eine zytoplasmatische Fehllokalisation zum Ausfall kritischer Zellfunktionen führt [47]. Interessanterweise treten NPM1-Mutationen häufig mit weiteren AML-assoziierten Genmutationen auf wie FLT3, DNMT3A, IDH1, IDH2 und Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog (NRAS) [100]. Prinzipiell weisen AML-Patienten mit alleiniger NPM1-Mutation eine günstige Prognose auf (siehe Tabelle 4). Je nach Ausprägung einer eventuell simultan vorliegenden FLT3-ITD- Mutation kann sich die Prognose allerdings ändern. Da die überwiegende Mehrzahl bekannter NPM1-Mutationen spezifisch und fast ausschließlich auf die AML beschränkt sind, de novo auftreten, und bestimmte immunphänotypische sowie klinische Charakteristika aufweisen, bildet die AML mit NPM1-Mutation eine eigene Entität. Zusätzlich dient sie als geeignetes Ziel zur Bestimmung der minimalen Resterkrankung (MRD, minimal residual disease) unter Chemotherapie, indem Patientenproben quantitativ auf residuelle maligne Zellen untersucht werden.

CEBPA

CEBPA (syn. CEBP-α) ist als Transkriptionsfaktor in kritische Zellprozesse wie Genexpressions- und Zellproliferationsregulation involviert. In der Hämatopoese ist die Expression von CEBPA auf die myelomonozytären Zellen beschränkt und wird während der Granulozytendifferenzierung hochreguliert [97]. CEBPA-Mutationen können bei ca. 15 % aller AML-Patienten nachgewiesen werden [132, 167] und treten vor allem an zwei Stellen auf: Durch N-terminale Frameshift-Mutationen wird eine verkürzte CEBPA-Isoform translatiert, die die Funktion des gesamten Proteins inhibiert. C-terminale Mutationen treten entweder als In-frame-Insertionen oder Deletionen auf und betreffen die DNA-Bindungsdomäne oder die basische Leucin- Zipper-Domäne; hierdurch wird die DNA-Bindung oder Dimerisation gestört.

Man unterscheidet drei Mutationsmuster von CEBPA bei AML-Patienten [97]:

1) AML mit Nachweis einer CEBPA-Mutation auf einem Allel (CEBPA single mutation, CEBPAsm, 50 % aller AML mit CEBPA-Mutation), 2) AML mit Nachweis von zwei CEBPA-Mutationen (CEBPA double mutation, CEBPAdm), 3) AML mit homozygoter CEBPA-Mutation aufgrund des Verlusts von Heterozygotie.

Es konnte zwischenzeitlich gezeigt werden, dass nur AML-Patienten mit CEBPAdm, d.h. biallelischer Mutation eine charakteristische Entität mit günstiger Prognose

- 15 - darstellen [65]. Daher hat auch nur die biallelische Mutation von CEBPA zuletzt Einzug in die WHO-Klassifikation der AML sowie auch in die ELN- Risikostratifizierung gehalten. Die prognostische Bedeutung von CEBPAsm ist abhängig von den konkurrierenden Mutationen wie NPM1 und FLT3-ITD [40].

RUNX1

RUNX1 ist ein Transkriptionsfaktor und Teil der DNA-bindenden α-Untereinheit eines core binding factors (CBF), der wiederum als heterodimerer Komplex an core- enhancer Elemente bindet [97]. RUNX1 kann somit die Genexpression von Zielgenen durch Einfluss interagierender Transkriptionsfaktoren und Co-faktoren sowohl aktivieren als auch inhibieren [157]. Funktionell kontrolliert RUNX1 die Expression seiner Zielgene und beeinflusst auf diese Weise die hämatopoetische Differenzierung, den Aufbau von Ribosomen, die Zellzyklusregulation und Signalkaskaden von Tumor protein 53 (p53) und Transforming growth factor β (TGFβ). RUNX1 ist eines der am häufigsten dysregulierten Gene bei der AML. Bei diesen AML-assoziierten Veränderungen von RUNX1 unterscheidet man chromosomale Translokationen, Amplifikationen und intragenische Mutationen.

Intragenische Mutationen von RUNX1 treten bei ca. 10 % der erwachsenen de novo AML-Patienten und bei ca. 16 % der Patienten mit CN-AML auf [40, 169]. Deutlich häufigere RUNX1-Mutationen weisen Patienten mit der AML FAB M0 auf, bei denen bis zu 46 % RUNX1-Mutationen haben können [56]. RUNX1-Mutationen sind mit distinkten genetischen und klinischen Eigenschaften assoziiert, daher wurden sie 2016 als vorläufige Entität der aktuellen WHO-Klassifikation der AML aufgenommen.

IDH1/2

IDH1 und IDH2 gehören zu einer Familie von Enzymen, die an der zellulären Energiegewinnung im Rahmen des oxidativen Decarboxylierungszyklus beteiligt sind. Dabei katalysieren sie die Umwandlung von Isocitrat zu α-Ketoglutarat. IDH1 befindet sich auf zellulärer Ebene zytoplasmatisch in den Peroxisomen, während IDH2 in den Mitochondrien lokalisiert ist [143, 184, 195]. Genmutationen finden sich bei IDH1 fast immer im Codon R132, bei IDH2 sind überwiegend Codon R140 und R172 von Mutationen betroffen [40]. Diese Genmutationen treten bei ca. 20 % aller

- 16 - AML-Patienten auf und führen zur Bildung des Metaboliten 2-Hydroxyglutarat, das leukämogene, epigenetische Effekte hat. Die prognostische Bedeutung der IDH1/2- Mutationen unterscheidet sich je nach betroffenem Gen, Mutationstyp und koexistenten zytogenetischen Aberrationen [40]. Aktuelle Daten legen nahe, dass IDH2-Mutationen eine distinkte Gruppe darstellen [134].

WT1

WT1 ist ein Transkriptionsfaktor, der spezifische Genloci bindet und deren Expression reguliert. Namensstiftend war, dass Mutationen dieses Gens bei 15 % der Patienten mit Wilms-Tumor gefunden werden konnten. Somatische Mutationen von WT1 können aber auch bei 6-15 % aller Patienten mit de novo CN-AML gefunden werden, die in Form von heterozygoten Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs), Deletionen und Insertionen auftreten und vor allem die Exons 1, 7 und 9 betreffen [16, 40, 141]. Diese Mutationen führen typischerweise zu verfrühten Stopcodons und Frameshift-Mutationen [135], was wiederum zu einem Funktionsverlust und zur Expression eines trunkierten Proteins führen kann.

Allerdings sind auch Überexpressionen von WT1 bei Patienten mit AML beobachtet worden, sodass auch eine onkogene Rolle diskutiert wird [113, 131]. Die prognostische Rolle von WT1 ist aufgrund der publizierten Daten nicht eindeutig geklärt.

Dennoch gelten WT1-Mutationen bei de novo AML-Patienten mit einem jungen Alter, schlechterem Gesamtüberleben und rezidivfreiem Überleben sowie Chemotherapieresistenz assoziiert; Co-mutationen mit FLT3-ITD oder CEBPA sind häufig [141].

TET2

TET-Proteine sind Eisen- und α-Ketoglutarat abhängige Proteine, die die DNA durch Konversion von 5-Methylcytosin (5mC) zu 5-Hydroxymethylcytosin demethylieren [81, 93]. Mutationen von TET2 auf 4q24 sind für 30-50 % der MDS- Patienten und Patienten mit myeloproliferativen Syndromen beschrieben. Ca. 30 % der Patienten mit sekundärer AML weisen TET2-Mutationen auf. Patienten mit de novo AML weisen in ca. 7-23 % Mutationen von TET2 auf [30, 58, 129]. Bislang konnte keine Assoziation von TET2-Mutationen mit anderen Genmutationen

- 17 - gefunden werden, vielmehr treten TET2-Mutationen fast nie mit IDH-Mutationen auf. Die Genmutationen von TET2 führen zu einer gestörten Hydroxylierung von 5mC, sodass Zielgene hypermethyliert und somit untranskribiert bleiben. Wie durch Mausmodelle demonstriert werden konnte, entwickelten Mäuse mit Knockdown von Tet2 myeloische Erkrankungen wie die chronische myelomonozytäre Leukämie (CMML) und MDS [109]. Dennoch ist die prognostische Bedeutung von TET2- Mutationen bei AML-Patienten nicht abschließend geklärt. Wenige Studien zeigten einen prognostisch ungünstigen Effekt von TET2-Mutation bei AML-Patienten [1, 32, 136], wohingegen einige Studien an größeren AML-Kohorten keinen Einfluss von TET2-Mutationen auf Therapieansprechen und Gesamtüberleben zeigten [21, 58, 107].

DNMT3A

Die Familie der DNA-Methyltransferasen (DNMTs) umfasst unter anderem DNMT3A, einem Enzym, das der DNA de novo Methylgruppen am 5.

Kohlenstoffatom der Cytosinbase von CpG-Dinukleotiden (5'-Desoxycytidin- Phosphorsäure-Desoxyguanosin-3') anfügen kann. Mutationen von DNMT3A sind bei ca. 22-33 % der AML-Patienten nachweisbar [10, 107, 198] und betreffen vor allem Codon R882, wodurch die Methylierungsfunktion von DNMT3A ausfällt. Diese Mutationen finden sich vor allem bei CN-AML-Patienten und sind mit Mutationen von FLT3-ITD, IDH1/2, NPM1 [40, 55, 148, 198] und RUNX1 [170] assoziiert.

Während die Studie an der bislang größten Patientenkohorte von über 1700 AML- Patienten keinen signifikanten Einfluss von DNMT3A-Mutationen auf das ereignisfreie Überleben (EFS), das rezidivfreie Überleben (RFS) oder das Gesamtüberleben (OS) zeigten [55], belegten neuere Studien, dass Mutationen von DNMT3A signifikant mit einem verringerten OS und RFS assoziiert sind [146].

DNMT3A-Mutationen werden daher im Kontext koexistenter Genmutationen als prognostisch ungünstige Marker betrachtet.

ASXL1

ASXL1 ist ein nukleäres, Chromatin bindendes Protein und übernimmt epigenetische Regulationsfunktionen. ASXL1-Mutationen können in einer Vielzahl hämatologischer Neoplasien wie myeloproliferativen Neoplasien (MPN), MDS,

- 18 - CMML sowie der AML gefunden werden. Die höchste Inzidenz weist dabei die CMML mit fast 45 % auf [60]. ASXL1 ist dagegen bei der sekundären AML in ca.

30 % der Fälle, bei der de novo AML nur in ca. 3-5 % mutiert [60]. Die Mutationen von ASXL1 betreffen überwiegend Exon 12 und führen als Frameshift-Mutationen und Nonsense-Mutationen zu trunkierten Proteinen [2]. Während ASXL1- Mutationen mit Mutationen von IDH1/2, TET2 und vor allem RUNX1 assoziiert sind [57, 147], treten sie interessanterweise fast nicht mit Mutationen von NPM1, DNMT3A, FLT3-ITD und FLT3-TKD auf [29, 156]. Männliche und ältere AML- Patienten sind deutlich häufiger von ASXL1-Mutationen betroffen. AML-Patienten mit ASXL1-Mutationen wiesen in Studien ein verringertes OS sowie ein kürzeres EFS auf [156].

Die Rolle der Epigenetik gewann in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung beim Verständnis pathogenetischer Zusammenhänge im Rahmen der AML. Im Gegensatz zur Genetik befasst sie sich mit den Mechanismen, die die Expression und damit Funktion eines Gens steuern [130]. Nach heutigem Stand der Forschung werden epigenetische Informationen unter anderem von zwei wichtigen Regulationsmechanismen vermittelt. Dazu zählen DNA-Methylierung bzw.

Hydroxymethylierung sowie Modifikationen von Histonen [20, 48, 130, 138]. Zwar kann die Rolle der Epigenetik in der Leukämogenese der AML noch nicht gänzlich überblickt werden, doch konnten Studien unzählige auffällige epigenetische Veränderungen bei AML-Patienten nachweisen. In erster Linie die DNA- Methylierung, welche Einfluss auf die Regulation der Transkription hat. Während die Hypomethylierung eines Gens die Gentranskription ermöglicht und in der Leukämogenese der AML keine Rolle zu spielen schien [137], führt die Hypermethylierung eines Gens zur Inaktivierung der Gentranskription. Mittlerweile wurden nicht nur viele hypermethylierte Gene bei AML-Patienten gefunden [4, 45, 69, 79, 80, 116, 139, 161, 183], sondern auch unterschiedliche aberrante Methylierungsmuster von Promotorregionen, die sich bestimmten AML-Subgruppen zuordnen ließen [5, 26] und darüber hinaus eine Vorhersage über das klinische Gesamtüberleben ermöglichten [51]. Mittlerweile stehen beispielsweise die verhältnismäßig gut verträglichen hypomethylierenden Substanzen Azacitidin und

- 19 - Decitabine als gängige Substanzen in der Therapie älterer Patienten, die nicht für intensivierte Standardchemotherapie geeignet sind, zur Verfügung.

1.2.6 Therapie der AML

Die aktuellen Therapieempfehlungen der AML (ausgenommen akute Promyelozyten Leukämie (APL)) richten sich zunächst nach Therapiefähigkeit und Alter des Patienten, wobei zu überprüfen ist, ob der Patient für eine intensive Chemotherapie in Frage kommt [39]. Parallel sollten unter anderem zytogenetische und molekulargenetische Untersuchungen erfolgen und eine Risikostratifikation in Zusammenschau der Befunde gemäß der Klassifikation der European LeukemiaNet (siehe Tabelle 4) erfolgen.

Auf Grundlage klinischer sowie genetischer Befunde sollte anschließend das passende Therapieregime gewählt werden. Prinzipiell unterscheidet man in der AML-Therapie verschieden Therapiephasen. Durch die Induktionstherapie wird eine komplette Remission (CR) der Erkrankung angestrebt, die anschließend durch die Postremissionstherapie aufrechterhalten werden soll.

Induktionstherapie

Die Induktionstherapie umfasst aktuell das sogenanntes „7+3 Regime“, in welchem drei Tage Anthrazyklin (Daunorubicin, Idarubicin oder Mitoxantron) und sieben Tage kontinuierlich Cytarabin verabreicht werden.

Hiermit kann eine CR bei 60-80 % jüngerer Erwachsener und bei 40-60 % Erwachsener über 60 Jahre erreicht werden.

Im Falle einer ausbleibenden CR nach 1-2 Induktionszyklen gilt der Patient als primär refraktär (RD) und es erfolgen spezifische Salvage-Chemotherapieregime, auf die im Folgenden nicht weiter eingegangen wird. Diejenigen Patienten, die für eine Induktionstherapie nicht geeignet sind (z. B. ältere Patienten > 65 Jahre mit multiplen Komorbiditäten, geringem Therapiewunsch und ungünstiger Prognose) können in palliativer Intention adaptierte Therapieregime (Azacitidin, Decitabine oder niedrig dosiertes Cytarabin) erhalten.

- 20 - Postremissionstherapie

Wird eine CR erreicht, ist eine Konsolidierungstherapie notwendig, um die CR aufrechtzuerhalten. Hierzu erhalten AML-Patienten je nach Alter und genetischer Risikostratifikation unterschiedliche Therapieregime:

Jüngere AML-Patienten (18-60 bzw. 65 Jahre) der günstigen Risikogruppe werden mit 2-4 Zyklen Cytarabin konsolidiert.

AML-Patienten der intermediären Risikogruppe erhalten in Abhängigkeit ihres Alter und Komorbidität eine allogene Stammzelltransplantation (HSCT) eines passenden verwandten Spenders (MRD) oder 2-4 Zyklen Cytarabin. Alternativ kommt auch eine Hochdosistherapie mit bis zu vier Zyklen Cytarabin mit autologer HSCT in Frage.

Bei Vorliegen einer ungünstigen Risikogruppe erhalten sie dagegen direkt eine allogene HSCT eines passenden nicht-verwandten Spenders (MUD), sofern Alter und Allgemeinzustand dies zulassen.

Ältere AML-Patienten (> 70 bzw. 75 Jahre) der günstigen Risikogruppe erhalten 2-3 Zyklen Cytarabin.

Für ältere AML-Patienten der intermediären oder ungünstigen Risikogruppe liegen keine etablierten Therapieschemata vor. Hier sollten allogene HSCT erwogen werden.

Neuere Therapeutika in der AML-Therapie

Mittlerweile sind Therapieformen möglich und heutzutage schon im Einsatz, die darauf abzielen, den deregulierten Signalkaskaden aufgrund der genetischen Aberrationen im Rahmen der AML entgegenzuwirken [37, 87]. Da diese Art der

„targeted therapy“ zahlreiche unterschiedliche Ansatzpunkte bietet, gibt es viele dieser neueren Substanzen, die alleine oder in Kombination mit der Standardchemotherapie, vielversprechende Ergebnisse liefern. So konnte z. B. im Rahmen der RATIFY-Studie (Phase III) gezeigt werden, dass durch die Kombination des Multi-Kinase-Inhibitors Midostaurin mit Standardchemotherapie bei FLT3-mutierten de novo AML-Patienten ein besseres Gesamtüberleben erzielt werden kann als durch die aktuelle Standardchemotherapie alleine [171]. 2017 wurde daher Midostaurin in Kombination mit Standardchemotherapie (Induktions-

- 21 - sowie Konsolidierungstherapie) bei FLT3-mutierten AML-Patienten sowohl in Europa als auch in den USA zugelassen. Außerdem stehen bereits für Patienten mit rezidivierter oder refraktärer AML und gleichzeitiger IDH1/2-Mutationen die vielversprechenden IDH-Inhibitoren Ivosidenib (IDH1-Mutation) und Enasidenib (IDH2-Mutation) zur Verfügung. Die Zulassung beschränkt sich aktuell noch auf die USA und obige Indikation, wobei eine Zulassung in Europa sowie eine Ausweitung der Indikationen zu erwarten ist.

1.2.7 Submikroskopische Läsionen und Deletionen von 3p14.1-p13 Neben den bereits beschrieben chromosomalen und molekulargenetischen Veränderungen konnten in den letzten Jahren durch technische Neuerungen wie SNP- und Microarrays auch submikroskopische genetische Läsionen bei AML- Patienten identifiziert werden [27, 142, 187]. Hierzu zählen unter anderem SNP und Kopienzahlalterationen (CNA, copy number alterations) wie Deletionen, Amplifikationen sowie uniparenterale Disomien (UPD). Diese genetischen Veränderungen könnten für die genetisch sehr heterogene Erkrankung AML, neue pathogenetische und prognostische Erkenntnisse bringen [173]. Insbesondere uniparenterale Disomien, die bei beinahe jedem fünften AML-Patienten nachgewiesen werden konnten [142], können pathogenetisch relevante Ereignisse sein.

Deletionen von 3p14.1-p13

In den Vorarbeiten zu dieser Arbeit konnten bei AML-Patienten mit normalem Karyotyp mittels hoch-auflösender SNP-Analysen bei 33 der mit einem 500k- Microarray analysierten 67 Patientenproben 96 sogenannte CNA‘s, die durch das Vorliegen mehrerer Allele eines Gens auf demselben Chromosom ausgezeichnet sind, festgestellt werden. Von diesen 67 Patientenproben wiesen 27 einen genomischen Verlust auf, der sich insgesamt auf über 70 Regionen erstreckte und der teilweise einen Verlust mehrerer Regionen bewirkte. Bei sechs der Patienten mit CN-AML wurden CNA’s in Form von Deletionen in der Region 3p14.1-p13 aufgedeckt, wobei sich die minimally altered region (MAR) auf eine Größe von 2 Mb begrenzen ließ. In dieser Region waren die acht proteincodierenden Gene G-protein

- 22 - coupled receptor 27 (GPR27), Prokineticin 2 (PROK2), Eukaryotic translation initiation factor 4E family member 3 (EIFE3), H/ACA Ribonucleoprotein Assembly Factor (SHQ1), RING1 and YY1 binding protein (RYBP), Glycosyltransferase 8 domain-containing protein 4 (GLT8D4), Protein phosphatase 4, regulatory subunit 2 (PPP4R2) und Forkhead box P1 (FOXP1) sowie eine microRNA (miR-1284) enthalten. Eine Übersicht der betroffenen Region auf 3p14.1-p13 zeigt Abbildung 3.

Abbildung 3: Darstellung eines Ausschnitts der Region p13 des Chromosoms 3 mit den darin enthaltenen Genen FOXP1, GPR27, PROK2, EIFE3, RYBP, SHQ1, GLT8D4, PPP4R2 sowie der microRNA miR-1284

EIFE3: Eukaryotic translation initiation factor 4E family member 3, FOXP1: Forkhead box P1, GLT8D4: Glycosyltransferase 8 domain-containing protein 4, GPR27: G-protein coupled receptor 27, MIR1284: Eigenname, p: Kurzer Arm eines Chromosoms, PPP4R2:

Protein phosphatase 4, regulatory subunit 2, PROK2: Prokineticin 2, q: Langer Arm eines Chromosoms, RYBP: RING1 and YY1 binding protein, SHQ1: Eigenname, H/ACA Ribonucleoprotein Assembly Factor

Insgesamt sind nur wenige Daten zu den Genen dieser Deletionsregion vorhanden;

im Folgenden wird die Funktion und Bedeutung dieser Gene kurz dargestellt.

Die Gene der Region 3p14.1-p13

Wie in murinen Knockdown-Modellen von Gpr27 mittels viral transduzierter small hairpin RNA (shRNA, Ad-shGpr27) gezeigt werden konnte, ist Gpr27 ein G-Protein gekoppelter Rezeptor (GPCR), der eine positive Regulatorfunktion auf die endogene Insulinsekretion besitzt [101].

PROK2 spielt wahrscheinlich vorwiegend eine Rolle in der neuroendokrinen Hormonregulation, da Mäuse mit Prok2-Knockdown eine GnRH-Defizienz zeigten

- 23 - [115]. Die genaue Funktion von SHQ1 ist noch ungeklärt, doch scheint das Protein ein zur Ribosomenanlagerung notwendiger Assembly-factor für H/ACA Ribonukleoproteine (RNPs = ribonucleoproteins) zu sein, die wiederum als kleine nicht codierende, nukleoläre Ribonukleinsäuren an der Biogenese von Ribosomen, dem pre-mRNA-Splicing und der Telomer-Aufrechterhaltung beteiligt sind [185].

RYBP codiert einen repressiven Transkriptionsfaktor, der durch epigenetische Modifikation von Chromatin wichtige Funktion in der Zellidentitäts-, Zellproliferations- und Zelldifferenzierungskontrolle besitzt [64]. Unabhängig von seiner Funktion als Transkriptionsfaktor hemmt RYBP zudem maligne Zellen (in vitro), induziert Apoptose [203] und hat prognostische Bedeutung für unterschiedliche Tumore wie Prostata- [106], Lungen- [182] und Cervixkarzinome [106] sowie das hepatozelluläre Karzinom [190]. GLT8D4, auch GXYLT2 genannt, codiert das Enzym Xylosyltransferase, das für die regelhafte Signaltransduktion des Wachstumsfaktor epidermal growth factor (EGF) notwendig ist [162]. EIF4E3 interagiert als ein eukaryoter Initiationsfaktor für die Translation mit der 5‘-Cap der mRNA und rekrutiert mRNA an die Ribosomen [85]. PPP4R2 bzw. PP4R2 codiert eine Phosphatase, die als Teil eines PP4-Proteinkomplexes für die Reparatur von DNA-Schäden notwendig ist, indem sie bestimmte Schlüsselgene der DNA- Reparatur dephosphoryliert. Es ist im Rahmen der AML mit 3p-Deletionen und komplexem Karyotyp supprimiert und in diesen Fällen potenziell an der Pathogenese der AML beteiligt [33, 70].

FOXP1 in der AML

Die Vorarbeiten zeigten, dass Deletionen der Region 3p14.1-p13 gehäuft bei CN- AML-Patienten vorkommen und die Gene GPR27, PROK2, EIFE3, SHQ1, RYBP, GLT8D4, PPP4R2 und FOXP1 rekurrent deletiert sind [27]. Interessanterweise waren Deletionen von 3p bei der AML bereits bekannt, die spezifische Deletionsregion 3p14.1-p13 war zudem auch bei unterschiedlichen soliden Tumoren zuvor beschrieben worden. Insbesondere dem darin enthaltenen Gen FOXP1 wurde sowohl für solide Tumore als auch für lymphatische Neoplasien wie B-Non-Hodgkin-Lymphome und der ALL eine pathogenetische Rolle zugeordnet.

Vor diesem Hintergrund erschien die fokussierte Untersuchung von FOXP1 als eines der acht bei CN-AML rekurrent deletierten Gene vielversprechend.

- 24 -

1.3 FOXP1

1.3.1 Aufbau und Funktionsweise von FOXP1

Das Forkhead box P1-Gen (FOXP1) liegt auf dem kurzen Arm des Chromosom 3 (71,003,844-71,633,140) und hat insgesamt 23 Splicevarianten, von denen 16 für ein Protein codieren. FOXP1 gehört zu der Gruppe der Forkhead-box-Gene, zu der mehr als 40 humane Gene zählen, die alle eine DNA-bindende Helix, auch Forkhead-Domäne genannt, besitzen [191]. Der Name Forkhead geht auf die gabelförmige Veränderung des Kopfes von Drosophilaembryonen zurück, die eine homozygote Deletion des Forkhead-Gens nachweisen [192]. Es gibt insgesamt vier bekannte FOXP-Proteine: FOXP1, FOXP2, FOXP3 und FOXP4. Diese sind, mit Ausnahme von FOXP3, durch eine DNA-bindende N-terminale Transkriptionsrepressionsdomäne charakterisiert, die sowohl einen C2H2- Zinkfinger als auch ein Leucin-Zipper-Muster umfasst [108, 165]. Funktionell handelt es sich bei FOXP1 um einen Transkriptionsfaktor [165], dessen transkriptionsunterdrückende Funktion durch mindestens zwei Unterdomänen gewährleistet wird, wie murine Daten zeigen [108]: Die Subdomäne 1 enthält den Leucin-Zipper, der sowohl zur Bindung an die DNA als auch zur Transkriptionsunterdrückung dient, und die C2H2-Zinkfingerdomäne, die jedoch nicht essentiell für die Transkriptionsunterdrückung ist. Die Subdomäne 2 zeichnet sich dagegen durch ein Bindungsmuster für ein Co-repressorprotein (C-terminales Bindungsprotein 1) aus, das nach Interaktion ebenfalls die Transkription unterdrückt. Allerdings konnte in Tiermodellen durch gezielte Deletionen der Bindungsstelle für das C-terminale Bindungsprotein 1 gezeigt werden, dass die repressive Funktion des Foxp1-Proteins weiterhin besteht. Somit ist die Subdomäne 2 nicht essenziell für die Funktion von FOXP1 als repressiver Transkriptionsfaktor. Die Bindung von FOXP1 an die DNA erfordert eine Homodimerisation oder eine Heterodimerisation mit FOXP2 oder FOXP4. Diese Dimerisationsfähigkeit wird dabei primär durch die Leucin-Zipper-Domäne gewährleistet und unterscheidet die FOXP-Familie von anderen FOX-Proteinen. Die Deletion einer einzigen Aminosäure innerhalb des Leucin-Zippers führt dabei

- 25 - interessanterweise zu einem vollständigen Verlust der Dimerisationsfähigkeit und somit zur Bindung an die DNA [108]. So geht beispielsweise das IPEX-Syndrom (immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome) auf die Deletion einer einzigen Aminosäure innerhalb des Leucin-Zippers von FOXP3 zurück [88]. Die Dimerisation von FOXP-Proteinen ist somit essenziell für die Funktion als Transkriptionsfaktoren.

Abbildung 4: Struktureller Aufbau des Proteins Forkhead box P1 (FOXP1) einer 677 Aminosäuren (AS) langen Splicevariante FOXP1-001 (ENST00000318789 [34, 43]) mit den charakteristischen Domänen (Glutamin-reich; ZF: Zinkfinger; LZ: Leucin-Zipper; CtBP1-BS:

C-terminalen Bindungsprotein 1 - Bindungsstelle; FHD: Forkhead-Domäne)

Oben ist ein Raster der Aminosäurenzahl (AS), unten die Aminosäureabschnitte der jeweiligen Domäne abgebildet.

1.3.2 Expression und Funktion von FOXP1

Die Gruppe der Forkhead-box-Transkriptionsfaktoren, zu denen FOXP1 gehört, codiert Proteine, die umfangreiche Funktionen in der kardialen, pulmonalen, neuralen, hämatopoetischen Entwicklung und Reifung, aber auch bei Immunreaktionen sowie in der Stammzellerneuerung und Sprachentwicklung haben [50, 73, 102, 104, 105, 121, 163, 165, 188].

Untersuchungen zur Expression von FOXP1-mRNA wiesen unterschiedliche Verteilungsmuster prä- und postnatal auf: Wie Analysen an Mäusen zeigten, weist Foxp1 die höchste Expression in der Entwicklung des embryonalen Vorderdarms, des Gehirns, des Gastrointestinaltrakts, des kardiovaskulären Gewebes und der Lunge [111, 165] auf. Die humane postnatale Expression von FOXP1 ist ebenfalls je nach Gewebe unterschiedlich ausgeprägt [12]. Die höchsten Konzentrationen von FOXP1-mRNA ließen sich in peripheren B- und T-Lymphozyten [89, 110], der

- 26 - Lunge, dem Gehirn, der Milz, in geringeren Konzentrationen aber auch in Herz, Muskel, Niere, Dünndarm und Leber nachweisen [165].

Nach dem bisherigen Stand der Forschung kommt FOXP1 eine Schlüsselrolle als Transkriptionsfaktor in der gewebe- und zellspezifischen Gentranskription während der frühen Entwicklung und dem Erwachsenenalter zu. So ist FOXP1 beispielsweise in die organische Entwicklung der Lunge [165], des Rückenmarks [35] sowie des Herzens [188] involviert. Gezielte Deletionen von Foxp1 bei Mäusen waren bereits im Embryonalstadium aufgrund kardialer Fehlentwicklung letal [188] und zeigten die Bedeutung von Foxp1 für die Entwicklung von neuronalen Strukturen [9, 35, 50, 73, 189]. So deuten Studien darauf hin, dass FOXP1 immunologische Signaltransduktionsprozesse des zentralen Nervensystems unterdrückt [177].

Foxp1 ist aber auch maßgeblich an der B- und T-Zell-Entwicklung beteiligt. So ist Foxp1 in die B-Zell-spezifischen Expression von Recombination activating 1 (Rag1) und Recombination activating 2 (Rag2) involviert, die für die VDJ-Rekombination notwendig sind [73], als unterdrückender Transkriptionsfaktor für die Aufrechterhaltung der Quieszenz von reifen CD8⁺ T-Zellen [50] zuständig und als negativer Regulator der Differenzierung zu CD4⁺ follikulären T-Helfer-Zellen [189]

essenziell. Außerdem spielt FOXP1 eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Differenzierung von Monozyten [163], was insgesamt seine hämatopoetische Bedeutung unterstreicht.

1.3.3 Die kontextabhängige Rolle von FOXP1 in Neoplasien

Neben der Rolle als Regulator der Zellentwicklung ist FOXP1 auch in die Tumorgenese von soliden Tumoren sowie Lymphomen involviert. Basierend auf bisherigen Daten scheint FOXP1 eine bivalente Rolle als Tumorsuppressorgen in einigen soliden Tumoren und als Onkogen in Lymphomen zu spielen [96, 199].

FOXP1 als Tumorsuppressorgen

Seit langem ist bekannt, dass die Region 3p häufig einen Verlust von Heterozygotie bei unterschiedlichen soliden Tumoren wie Nieren-, Lungen-, Brust- und Ösophaguskarzinomen aufweist und möglicherweise ein unbekanntes Tumorsuppressorgen enthält [36, 74, 78, 133, 175, 202]. Als 2001 Banham et al. in der Region 3p14.1 erstmalig den repressiven Transkriptionsfaktor FOXP1 identifizierten, zeigten Expressionsanalysen vor allem bei Gewebeproben

- 27 - epithelialer Tumore wie Magen- und Kolonkarzinome gehäuft komplette Expressionsverluste sowie vermehrte zytoplasmatische Fehllokationen von FOXP1-Protein in Magen-, Kolon-, Prostata- und Endometriumkarzinomen [12]. Auf dem Boden dieser Erkenntnisse sahen die Autoren FOXP1 als potenzielles Tumorsuppressorgen.

Seitdem wurden viele Studien veröffentlicht, deren Ergebnisse eine tumorsuppressive Bedeutung von FOXP1 bei soliden Tumoren von Cervix, Endometrium, Brust, Lunge, Gehirn und Prostata untermauern:

Bei 102 lokal fortgeschrittenen Cervixkarzinomen konnte gezeigt werden, dass unter anderem die Deletion 3p11.2-p14.1 nach kombinierter Radiochemotherapie mit einem schlechten progressionsfreien Überleben (HR 0,27, 95 % CI 0,11-0,66, p = 0,003) assoziiert ist [106]. Als mögliche Schlüsselgene dieser Region wurden bisher die Gene RYBP und Glycogen branching enzyme 1 (GBE1) identifiziert. Auf FOXP1 wurde in dieser Arbeit nicht weiter eingegangen.

Studien an Ovarialkarzinomen zeigten, dass häufig eine verminderte Gesamtexpression von FOXP1 vorliegt und dass eine verminderte nukleäre bzw.

vermehrte zytoplasmatische Lokalisation von FOXP1 mit einem höheren Differenzierungsgrad der Ovarialkarzinome korrelierte [76, 77]. Die nukleäre FOXP1-Expression wurde daher als unabhängiger Risikofaktor beschrieben, der mit Chemoresistenz und der ungünstigen Prognose von Patienten mit Ovarialkarzinom assoziiert war [76]. Jedoch zeigten andere Studien, dass der Knockdown von FOXP1 in Ovarialkarzinomzelllinien unter anderem zu geringerer Zellmigration und besserem Ansprechen auf Chemotherapie führte [31], was wiederum auf eine onkogene Bedeutung von FOXP1 in Ovarialkarzinomen hindeutete.

In Endometriumkarzinomzellen wurde ein Einfluss von FOXP1 auf die KRAS- Signaltransduktion vermutet, wobei geringere FOXP1-Expressionen mit einem höheren Differenzierungsgrad der Endometriumkarzinomzellen korrelierten [119].

In Mammakarzinomen konnte ebenfalls eine Korrelation zwischen einer hohen nukleären FOXP1-Expression und einer besseren Patientenprognose aufgezeigt werden [53]. So wurde weiter vermutet, dass FOXP1 ein Co-regulator des