Aus der Klinik für Hämatologie, Hämostaseologie, Onkologie und Stammzelltransplantation der Medizinischen Hochschule Hannover
Bedeutung von präleukämischen DNMT3A Mutationen für den Krankheitsverlauf der
akuten myeloischen Leukämie
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Sabrina Klesse aus Bielefeld
Hannover 2017
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 18.09.2018 Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Professor Dr. med. Christopher Baum Wissenschaftliche Betreuung: Prof.‘in Dr. med. Felicitas Thol
1. Referent: Prof. Dr. med. Kais Hussein 2. Referent: PD Dr. rer. Nat. Michael Morgan Tag der mündlichen Prüfung: 18.09.2018 Prüfungsausschluss
Vorsitz: Prof. Dr. med. Philipp Beerbaum 1. Prüfer: Prof.‘in Dr. rer. nat. Hildegard Büning 2. Prüfer: Prof. Dr. med. Dietrich Peest
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
1.1 Definition und Symptome der akuten myeloischen Leukämie ... 1
1.2 Epidemiologie, Ursachen und Risikofaktoren ... 2
1.2.1 Häufigkeiten und Überleben ... 2
Mortalität und 5 Jahres-Überlebensrate ... 2
1.2.2 Ursachen und Risikofaktoren der AML ... 3
Risikofaktoren durch genetische Veränderungen der Keimbahn ... 3
1.3 Diagnose, Klassifikationen und Risikostratifikation der AML ... 4
1.3.1 Diagnose ... 4
1.3.2 Klassifikation ... 4
1.3.3 Risikostratifikation ... 6
1.4 Pathogenese der AML... 8
1.5 Veränderung auf zytogenetischer und molekularer Ebene als Teil der Pathogenese .. 8
1.5.1 Aberrationen auf zytogenetischer Ebene ... 8
1.5.2 Mutationen auf molekulargenetischer Ebene ... 9
1.6 Therapie und Prognose... 19
1.6.1 Therapie... 19
1.7 Zielsetzung der Arbeit ... 23
2. Patienten, Material und Methoden ... 26
2.1 Patientenkohorte ... 26
2.2 Material ... 27
Allgemeine Chemikalien ... 27
Kleinmaterialien ... 27
Enzyme und biologische Substanzen ... 28
Kits und spezielle Chemikalien ... 29
2.3 Methoden ... 29
2.3.1 Zellsortierung von CD3 positiven Zellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen 29 2.3.2 DNA Isolation aus Vollblut oder Knochenmark ... 31
2.3.3 Amplifikation ... 32
2.3.4 DNA Isolation aus Haarfollikeln ... 33
2.3.5 Molekulare Analyse mittels Sanger Sequenzierung ... 33
2.3.6 Molekulare Analyse mittels Next Generation Sequencing ... 36
2.4 Bioinformatische Auswertung ... 45
2.5 Statistische Auswertung ... 47
3. Ergebnisse... 48
3.1 Charakterisierung der Studienkohorte anhand des Mutationsstatus' ... 48
3.2 Klinische Patientencharakteristika abhängig vom Mutationsstatus in T-Zellen ... 49
3.3 Korrelation zwischen der Allelfrequenz in mononukleären Zellen und in T-Zellen bei Diagnosestellung ... 53
3.4 Untersuchung von germline DNA aus Haarfollikeln als Nachweis der somatischen Akquisition der DNMT3A Mutation ... 54
3.5 Assoziation zwischen der Präsenz von DNMT3A Mutationen in T-Zellen und den molekularen Patientencharakteristika ... 56
3.6 Einfluss des Mutationsstatus für das Ansprechen auf Chemotherapie ... 64
3.7 Zusammenhang des DNMT3A positiven Mutationsstatus in T-Zellen mit klonaler Hämatopoese unbestimmten Potenzials (CHIP) vor Diagnosestellung ... 71
3.8 Einfluss des Mutationsstatus in T-Zellen auf das Rezidivrisiko ... 73
3.9 Die Rolle der Stammzelltransplantation als Postremissionstherapie bei Patienten mit lymphomyeloischer klonaler Hämatopoese ... 78
4. Diskussion ... 80
4.1 Die Rolle von DNMT3A Mutationen in der Leukämogenese und als präleukämische Läsion im Rahmen von klonaler Hämatopoese unbestimmten Potenzials (CHIP) ... 80
4.2 Charakterisierung von Patienten mit lymphomyeloischer klonaler Hämatopoese bei Erstdiagnose ... 82
4.3 Lymphomyeloische klonale Hämatopoese als Marker für präleukämische klonale Hämatopoese unbestimmten Potenzials ... 84
4.4 Therapieansprechen bei Patienten mit lymphomyeloischer klonaler Hämatopoese ... 85
4.5 Auswirkung auf den Krankheitsverlauf und das Rezidivrisiko ... 86
4.6 Effektivität der Stammzelltransplantation zur Elimination des präleukämischen Klons im Sinne der Vorbeugung von Rezidiven ... 88
4.7 Klonale Hämatopoese unbestimmten Potenzials als Risikofaktor für therapieassoziierte Myeloproliferative Neoplasien ... 89
4.8 Klinische und therapeutische Konsequenzen resultierend aus dem Nachweis von lymphomyeloischer klonaler Hämatopoese bei Diagnosestellung ... 90
4.9 Ausblick ... 91
5. Zusammenfassung ... 93
6. Literaturverzeichnis ... 96
7. Abkürzungsverzeichnis ... 106
8. Geräteliste ... 111 Publikationen
Lebenslauf Danksagung
1. Einleitung
1.1 Definition und Symptome der akuten myeloischen Leukämie
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine maligne Erkrankung des hämatopoetischen Systems, bei der es durch Akkumulation somatisch erworbener Genmutationen zum Teil in Kombination mit zytogenetischen Aberrationen zu Veränderungen des Proliferations- und Differenzierungsverhaltens der hämatopoetischen Vorläuferzellen kommt. Während die Stammzellen im Normalfall gleichermaßen zur Blutbildung beitragen, kommt es in Folge von Mutationen zu klonaler Proliferation, weshalb die Blutbildung zum größten Teil von der veränderten Stammzelle ausgeht. Es kommt zu einer massiven Anreicherung von Zellen mit Ausreifungsstörungen (Blasten), die die physiologische Hämatopoese verdrängt. (1) Die klinische Präsentation einer AML ist vielfältig und abhängig vom Grad der hämatopoetischen Insuffizienz sowie von der betroffenen Zelllinie. Typische Anzeichen sind unspezifische Allgemeinsymptome, wie vermehrte Müdigkeit, diffuse Schmerzen und Gewichtsverlust.(2) Bei Zytopenie der Erythrozyten stehen hauptsächlich Symptome der Anämie im Vordergrund. Dazu zählen Verschlechterung der körperlichen Belastbarkeit, Blässe, Belastungsdyspnoe und Schwindel. Erhöhte Blutungsneigung, die sich vorwiegend an Schleimhäuten manifestiert, Hämatombildung sowie Auftreten von Petechien, typischerweise an den Unterschenkeln, kann auf eine Thrombozytopenie zurückzuführen sein. Darüber hinaus kann eine erhöhte Anfälligkeit für Infekte, die protrahiert oder schwerwiegend verlaufen, aufgrund einer Suppression der Leukozytenbildung, insbesondere der Granulozyten, bestehen. Selten kann es entgegengesetzt dazu auch zu einer Hyperleukozytose mit mehr als 100.000 Leukozyten pro µl kommen, die die Blutviskosität steigert und somit zu Störungen der zerebralen Mikrozirkulation führt.(3) Blasten können sich in verschiedensten Geweben ansammeln und dort unterschiedliche Symptome verursachen. Beispielsweise können Knochenschmerzen aufgrund der Blasteninfiltration des Knochenmarks auftreten, aber auch Infiltration der Haut, des zentralen Nervensystems, des Zahnfleisches oder der Milz und Leber sind möglich. (2)
1.2 Epidemiologie, Ursachen und Risikofaktoren
1.2.1 Häufigkeiten und Überleben Inzidenz
Die AML ist die häufigste akute Leukämie im Erwachsenenalter. Im Durchschnitt liegt die Inzidenz für alle Altersgruppen bei 4,1/100.000 Erkrankungen pro Jahr. Allerdings steigt sie mit zunehmendem Alter deutlich von 1,9/100.000 der Altersgruppe <65 Jahre auf 19,1/100.000 in der Altersgruppe der >65-jährigen an, sodass die AML mit einem medianen Erkrankungsalter von 67 Jahren eine Erkrankung des höheren Alters ist.
Etwa 1/3 aller AML Patienten sind über 75 Jahre alt. (4,5) Zwar tritt die AML auch im Kindesalter auf, repräsentiert dort nach der akuten lymphatischen Leukämie allerdings nur die zweithäufigste Gruppe der Leukämien mit 17%. (6)
Mortalität und 5 Jahres-Überlebensrate
Die Zahl der an einer akuten myeloischen Leukämie verstorbenen Menschen aller Altersgruppen lag, laut des Surveillance, Epidemiology and End Result Program des National Cancer Institutes der USA, bei 2,8/100.000 Einwohner pro Jahr in den Jahren 2009-2013. Hier ist ein Anstieg der Mortalität im höheren Alter zu verzeichnen (5,7%
der 35-44-jährigen vs. 23% der 65-74-jährigen). (4) Für die höhere Mortalitätsrate älterer Patienten gibt es verschiedene Gründe. Neben der höheren Inzidenz der AML können zum einen die Therapiemöglichkeiten durch den funktionellen Status und Komorbiditäten stark eingeschränkt sein. Zum anderen wird ein schlechteres Ansprechen auf Chemotherapien beobachtet, da leukämische Blasten bei älteren Patienten eine erhöhte Expression des Multidrugresistance-1 (MDR1) Gens zeigen und daher weniger in Apoptose gehen.(7)
Ähnliche Beobachtungen können für die 5-Jahres-Überlebensrate angestellt werden, die im Durchschnitt bei 26,6% liegt. Die Spannweite beträgt dabei ein Überleben von 53,5% der Erkrankten <45 Jahre bis zu einer Überlebensrate von 1,8% der >75- jährigen fünf Jahre nach Diagnosestellung. (4)
1.2.2 Ursachen und Risikofaktoren der AML
Risikofaktoren durch genetische Veränderungen der Keimbahn
Die AML tritt in der Regel sporadisch auf und ist auf Akkumulation somatisch erworbener Mutationen zurückzuführen. Sie kann dabei ohne vorbestehende Erkrankung, also de novo oder sekundär, beispielsweise als Folge eines myelodysplastischen Syndroms entstehen. Nur in seltenen Fällen kommt es zu familiären Erkrankungen mit vererbbaren Mutationen in der Keimbahn. (2)
Eine genetische Aberration, für die ein etwa 15-fach erhöhtes Risiko für eine Erkrankung an einer AML besteht, ist die Trisomie 21. Dabei entwickeln die Betroffenen meist innerhalb der ersten zwei Lebensjahre eine Megakaryoblastenleukämie, die häufig mit einer Mutation im GATA1- Transkriptionsfaktor einhergeht. (8,9) Andere Mutationen mit erhöhter Inzidenz einer AML sind Mutationen im CCAAT/enhancer binding protein alpha (10), der NAD(P)H- Quinone-Oxidoreduktase 1 (11) oder im G-CSF-Rezeptor Gen. (12)
Seltene angeborene Syndrome, die mit dem Verlust der DNA Reparaturfunktion einhergehen, wie das Li-Fraumeni- oder Wiscott Aldrich- Syndrom, sowie die Fanconi Anämie,(13) als auch die Aplastische Anämie als Beispiel für ein erworbenes Syndrom (14) zeigen ebenfalls höhere Inzidenzen einer AML im jungen Alter.
Risikofaktoren durch extern einwirkende Noxen
Die häufigsten bekannten Risikofaktoren für die Entwicklung einer AML sind Chemotherapie und die Exposition von ionisierender Strahlung.
Chemotherapien können für die jeweilige Substanz typische Aberrationen auslösen und somit eine AML induzieren. Vor allem Topoisomerase II-Inhibitoren, die mit einer Latenz von drei Jahren zu Aberrationen auf dem MLL 11q23 Gen führen, und Alkylantien, die ein Risiko für die Entwicklung von Monosomien der Chromosomen 5 und 7 haben, sind vor dem Hintergrund identifiziert worden. (15)
Ionisierende Strahlung, unabhängig davon ob es eine berufliche Exposition, eine iatrogene Anwendung oder eine Verstrahlung im Rahmen einer Atomkatastrophe wie in Tschernobyl 1986 gab, erhöht die Inzidenz einer akuten myeloischen Leukämie. (16)
Ein weiterer, in einigen Fällen als Berufserkrankung anerkannter Risikofaktor, ist eine Exposition des organischen Lösungsmittel Benzol. (17) Parallel hierzu kann auch bei Rauchern zum einen eine erhöhte Inzidenz, aber auch eine niedrigere Remissionsrate beobachtet werden. Mitverantwortlich hierfür wird ebenfalls das anteilig im Zigarettenrauch befindliche Benzol gemacht.(18)
1.3 Diagnose, Klassifikationen und Risikostratifikation der AML
1.3.1 Diagnose
Besteht der Verdacht auf eine AML, erfolgen verschiedene diagnostische Schritte zur Sicherung der Diagnose. Mittels Knochenmarksausstrichen, zytochemischer und immunphänotypischer Untersuchungen werden die Blasten anhand ihrer Linienzugehörigkeit und ihrer Oberflächenstruktur charakterisiert (2).
Die unreifen, sich ungehindert vermehrenden Blasten, können sich neben dem Knochenmark auch in das periphere Blut oder in andere Körpergewebe, wie die in Kapitel 1.1 genannten, ausbreiten. Daher ist für die Diagnose einer AML ein Anteil von
≥ 20% der myeloischen Linie entstammenden Blasten im Knochenmark oder peripheren Blut gefordert. Eine Ausnahme hiervon stellt der zytogenetische Nachweis von den in Kapitel 1.5.1 beschriebenen typischen balancierten Translokationen dar, für die auch bei niedrigeren Blastenanteilen die Diagnose als gesichert angesehen wird. (19)
1.3.2 Klassifikation
Die akute myeloische Leukämie kann viele unterschiedliche Erscheinungsformen, abhängig von der Art der betroffenen Reifungsstufe haben. Daher wurde die AML früher mittels der French-American-British- Klassifikation (FAB-Klassifikation) in neun Subgruppen (M0-M7) eingeteilt. Diese basieren vorwiegend auf morphologischen Unterschieden und spiegeln die Heterogenität der Erkrankung wieder. (20) Die Einteilung in eine nach FAB definierten Subgruppe hat, mit Ausnahme der Promyelozytenleukämie (M3), keine prognostische Aussagekraft oder Einfluss auf die Therapieentscheidung. (21)
Diese rein morphologische Einteilung wurde 2008 durch eine WHO-Klassifikation abgelöst, die die neuen Erkenntnisse der zytogenetischen und molekulargenetischen Pathogenese wiederspiegelt. Dabei werden Aberrationen, wie beispielsweise t(15;17), t(8;21), inv(16;16)-t(16;16), t(6;9), inv(3;3)-t(3;3) sowie CEBPA und NPM1 Mutationen berücksichtigt. Auch die ehemalige FAB Einteilung findet sich unter dem Punkt nicht weiter spezifizierte AML wieder. (22) Durch die weitere Überarbeitung und den Einschluss von molekulargenetischen Veränderungen können mehr als zwei Drittel aller Patienten mit AML entsprechend der WHO Klassifikation 2016 eingeordnet werden.(23)
Tabelle 1. Auszug aus der WHO-Klassifikation der myeloischen Neoplasien und akuten Leukämien von 2016(24)
AML mit wiederkehrenden zytogenetischen Aberrationen
➢ AML mit t(8;21)(q22;q22), RUNX1-RUNX1T1 unabhängig von
Blastenanzahl in PB oder KM
➢ AML mit inv(16)(p13.1;q22) oder t(16;16)(p13.1;q22), CBFb/MYH11
➢ akute Promyelozyten-Leukämie mit t(15;17)(q22;q12), PML/RARA
➢ AML mit t(9;11)(p22;q23), MLLT3-KMT2A alle weiteren AML-
Subtypen:
≥ 20% Blasten in PB oder KM
➢ AML mit t(6;9)(p23;q34), DEK-NUP214
➢ AML mit inv(3)(q21;q26.2) oder t(3;3)(q21;q26.2), GATA2, MECOM
➢ AML (megakaryoblastisch) mit t(1;22)(p13;q13), RBM15-MKL1
➢ Provisorische Entität: AML mit BCR-ABL1
➢ AML mit mutiertem NPM1
➢ AML mit biallelischer Mutation von CEBPA
➢ Provisorische Entität: AML mit mutiertem RUNX1
AML mit myelodysplasie-assoziierten Veränderungen Therapieassoziierte AML
AML, nicht weiter spezifiziert (NOS)
➢ mit minimaler Differenzierung (ehemals M0)
➢ ohne Ausreifung (ehemals M1)
➢ mit Ausreifung (ehemals M2)
➢ akute myelomonozytäre Leukämie (ehemals M4)
➢ akute monoblastische und monozytäre Leukämie (ehemals M5)
➢ rein erythroide Leukämie (ehemals M6)
➢ akute Megakaryoblasten-Leukämie (ehemals M7)
➢ akute Basophilen-Leukämie
➢ akute Panmyelosis mit Myelofibrose Myeloisches Sarkom
Myeloische Proliferation, assoziiert mit Down-Syndrom
➢ transiente, abnormale Myelopoiese
➢ AML, assoziiert mit Down-Syndrom
Blastische plasmazytoide dendritische Zell-Neoplasien
Molekulargenetische Läsionen geraten immer mehr in den Fokus der Leukämogenese. Studien konnten zeigen, dass unter Einbeziehung von einer Vielzahl molekularer Parameter mehr Patienten entsprechend eines Mutationsmusters adäquat eingeteilt werden konnten. Daher gibt es zunehmend Bestrebungen, eine neue rein auf Driver-Mutationen basierende Einteilung vorzunehmen, wie beispielsweise im Vorschlag des Cancer Genome Project. (25)
1.3.3 Risikostratifikation
Prognostische Faktoren können in patientenassoziierte und krankheitsassoziierte Risikofaktoren unterteilt werden. Negative prognostische Faktoren, wie höheres Alter, schlechte körperliche Verfassung und Begleitumstände, sind patientenassoziiert und weisen auf ein schlechteres Therapieansprechen sowie eine geringere Therapieverträglichkeit hin. (26) Krankheitsassoziierte Risikofaktoren stellen die Anzahl der weißen Blutzellen, ein vorangegangenes myelodysplastisches Syndrom oder eine Chemotherapie für eine andere Neoplasie dar.(27) Außerdem lässt die Art der zytogenetischen und molekulargenetischen Aberrationen ebenfalls eine Einteilung in günstig, intermediär und ungünstig hinsichtlich der Risikostratifizierung zu. (27) Während der Karyotyp den stärksten prognostischen Faktor für das Überleben und das Ansprechen auf Therapie darstellt (28), werden von den molekulargenetischen
Mutationen bislang nur NPM1, FLT3 und CEBPA Mutationen für die Risikostratifizierung herangezogen. (19)
Tabelle 2. Auszug aus der European LeukemiaNet (ELN) Klassifikation zur Korrelation zwischen zytogenetischen und molekulargenetischen Aberrationen im Hinblick auf klinische Daten (29)
Genetische Gruppe Subgruppe
günstig t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1
Inv(16)(p1.1q22) oder t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11 NPM1 Mutation ohne FLT3-ITD (normaler Karyotyp) oder FLT3 mit niedriger Ratio
Biallelische CEPBA Mutation
Intermediär NPM1 und FLT3-ITD Mutation mit hoher Ratio
NPM1 Wildtyp ohne FLT3-ITD Mutation oder niedriger FLT3- ITD Ratio (bei fehlenden ungünstigen genetischen Aberrationen
t(9;11)(q22;q23); MLLT3-KMT2A
Zytogenetische Aberrationen, die weder als günstig noch als ungünstig klassifiziert werden
ungünstig Inv(3)(q21q26.2) oder t(3;3)(q21;q26.2); GATA2, MECOM(EVI1)
t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214 t(v;11q23.3)KMT2ARearrangement
NPM1 Wildtyp und FLT3-ITD mit hoher Ratio RUNX1 Mutation
ASXL1 Mutation TP53 Mutation
-5 oder del(5q), -7; abn(17p);
komplexer Karyotyp, monosomaler Karyotyp
1.4 Pathogenese der AML
Onkogene können hämatopoetische Zellen in verschiedenen Differenzierungsstadien beeinflussen und sie in leukämische Stammzellen transformieren (LSC).(30) Bereits bevor die Erkrankung zu klinisch fassbaren Symptomen führt, kann die klonale Expansion der LSCs nachweisbar sein. (31) Dieser präleukämische Klon löst zunächst keine Erkrankung aus und kann bei Patienten in Remission weiterhin nachweisbar sein. (32) Werden sequenziell weitere Mutationen auf molekularer und zytogenetischer Ebene in Genen, die für die Proliferation und Differenzierung der hämatopoetischen Stammzellen entscheidend sind, erworben, führt dies zur Ausbildung des Phänotyps der akuten myeloischen Leukämie.
Bislang gibt es zwei Theorien, die evaluieren, inwiefern die leukämische Stammzelle direkt den Ursprung der Erkrankung darstellt, oder ob sich Mutationen auch erst in späteren Differenzierungsformen der normalen Reifestadien manifestieren können.
(33) Verschiedene Arbeitsgruppen wie Goardon et al., Heuser et al. und Krivtsov et al.
konnten zeigen, dass Progenitorzellen Stammzelleigenschaften erwerben und sich so zur leukämischen Stammzelle entwickeln.(34-36)
1.5 Veränderung auf zytogenetischer und molekularer Ebene als Teil der Pathogenese
1.5.1 Aberrationen auf zytogenetischer Ebene
Zytogenetische Aberrationen bei akuter myeloischer Leukämie sind bereits lange bekannt. Über 200 strukturelle und numerische Chromosomenaberrationen wurden bereits beschrieben. (28) Der Karyotyp ist ein wichtiges Mittel zur Abschätzung der Prognose. (37) Die Häufigkeit der verschiedenen Karyotypen ist vom Erkrankungsalter abhängig. (38) Die genaue Einteilung in prognostische Gruppen wird im Kapitel 1.3.3 beschrieben.
Die AML lässt sich anhand der zytogenetischen Veränderungen in drei Gruppen einteilen. In der ersten Gruppe werden die Karyotypen mit balancierten chromosomalen Veränderungen zusammengefasst, die bei etwa 20% der AML Patienten nachweisbar sind. Hierbei handelt es sich um eine Gruppe struktureller
Chromosomenveränderungen, die vorwiegend Inversionen, Translokationen und Isochromosomen umfassen. Zu den Häufigsten zählen t(8;21) RUNX1-RUNX1T1, t(15;17) PML-RARα, inv(16;16) oder t(16;16) CBFβ-MYH11 und 11q23 MLL- Anomalien sowie t(9;11) MLLT3-KMT2A, t(6;9) DEK-NUP214 und t(1;22) RBM15- MKL1. (28) Der Bruchpunkt der Translokationen liegt häufig im Bereich von Genen, die für Transkriptionsfaktoren der Hämatopoese codieren, wodurch ein in gesunden Zellen nicht nachweisbares Fusionsgen entsteht. (39)
Die zweite Gruppe umfasst Aberrationen unbalancierter Karyotypen, die sich durch den Verlust oder Hinzugewinn von genetischem Material kennzeichnen. Vorwiegend kommt es in den Regionen 5q, 7q und 17p zum Gewinn und in den Regionen 8q, 11q und 21q zum Verlust von genetischem Material. (40) Treten dabei drei oder mehr chromosomale Veränderungen auf, spricht man von einem komplex aberranten Karyotyp, wovon etwa 10-12% der AML Patienten betroffen sind. (41)
Der letzten Gruppe werden Patienten mit normalem Karyotyp (CN-AML) zugeordnet.
Nur bei 55% der AML Patienten lassen sich chromosomale Aberrationen feststellen.
Bei dem Rest der Patienten ist die Aberration auf Genebene lokalisiert, was die zunehmende Bedeutung der molekularen Analyse verdeutlicht. (28)
1.5.2 Mutationen auf molekulargenetischer Ebene
Vorwiegend im Falle der CN-AML, aber auch bei Patienten mit zytogenetischen Aberrationen, dient die Erhebung molekulargenetischer Marker nicht nur der besseren Charakterisierung der Erkrankung, sondern auch der Einstufung des Risikos für frühe Rezidive oder höherer Mortalität sowie des Erkrankungsverlaufs. Davon können generelle Therapieentscheidungen beeinflusst werden oder es kommen genspezifische „Target“-Therapien, die sich oft noch in klinischen Studien befinden, zur Anwendung. (42)
Es gibt eine Reihe von Genmutationen, deren gehäuftes Auftreten bei AML Patienten beschrieben ist. Zu den wesentlichen genverändernden Mechanismen zählen der Erwerb eines Proliferationsvorteils sowie ein Block der Zelldifferenzierung. Die Steigerung der Proliferation kann beispielsweise durch eine Aktivierung von Signaltransduktionskaskaden (Rezeptortyrosinkinasen) oder durch die Hemmung der Apoptose vermittelt sein. Zu einem Reifungsblock der Stammzellen kommt es durch
Aberrationen der Transkriptionsfaktorgene, die sonst für eine normale Stammzelldifferenzierung verantwortlich sind. Ein anderer, durch Genmutationen verursachter Mechanismus, kann die epigenetische Dysregulation darstellen, die Veränderungen im Chromatin, in Histonkomplexen oder dem Methylierungsmuster bewirken. Durch Regulation des Chromatins oder posttranslationalen Histonmodifikationen kann die gesamte Transkriptionsaktivität größerer Genabschnitte beeinflusst werden, während eine Methylierung der Promotorregion die Expression des nachgeschalteten Gens moduliert. (43)
Nach The Cancer Genome Atlas (TCGA) können die Mutationen in folgende funktionelle Kategorien eingeteilt werden:
Tabelle 3. Vorschlag einer Einteilung der AML in Abhängigkeit des Genmutationsstatus in molekulargenetische Subgruppen(44)
Mutationskategorie Mutationen Mutationsfrequenz
Transkriptionsfaktorfusionen PML-RARα, MYH11-CBFβ, RUNX1RUNX1T1, PICALM- MLLT10
18%
Myeloische
Transkriptionsfaktor Mutationen
CEBPA, RUNX1 22%
NPM1 Mutationen NPM1 27%
Tumorsupressorgen Mutation
TP53, WT1, PHF6 16%
Mutation in Genen der DNA Methylierung
TET1, TET2, IDH1, IDH2, DNMT3A, DNMT3B, DNMT1
44%
Mutation in Genen der Signaltransduktion
FLT3, KIT, KRAS/NRAS, PTPs, andere Tyrosinkinasen
59%
Mutation in Chromatin- modifizierende Genen
ASXL1, EZH2, KDM6A MLL-X Fusion, MLL-PTD, NUP98- NSD1
30%
Mutation in Cohesin- Komplex Genen
STAG2, SMC1A, SMC3, RAD21 13%
Mutation in Spliceosom- Komplex Genen
U2AF1, SRSF2, SF3B1 14%
Es sind Mutationen in einer Vielzahl von Genen bekannt, die zur Leukämogenese beitragen, allerdings sind die meisten von ihnen nur sehr selten mutiert. Daher werden im folgenden Abschnitt ausschließlich häufig mutierte Gene thematisiert, für die die Mitwirkung in der Leukämogenese gezeigt werden konnte.
Nucleophosmin-Gen (NPM1)
Alterationen des Nucleophosmin-Gens stellen mit 27% die häufigsten Mutationen der AML bei Erwachsenen dar. (45) Die Mutation ist charakteristisch für de novo AML, da sie nur sehr selten in anderen myeloproliferativen Erkrankung nachgewiesen werden kann. Typisch sind Frameshift Mutationen durch verschiedene Insertionen von vier Basen am C-Terminus des Proteins, die schwerpunkmäßig mit 45-60% bei der CN- AML vorkommen.(46) Das Gen codiert ein nukleäres Phosphoprotein, das unter anderem eine Transportfunktion zwischen Nukleus und Zytoplasma übernimmt und somit in vielfältiger Weise an wichtigen Stoffwechselprozessen der Zelle beteiligt ist.
Analysen der Mutationsprofile haben ergeben, dass NPM1 Mutationen häufig zusammen mit DNMT3A oder FLT3 Mutationen auftreten. Das hat vor allem in Bezug auf FLT3 Komutationen starke prognostische Bedeutung. Viele Studien konnten zeigen, dass Patienten mit normalem Karyotyp, die eine NPM1 mutiert/FLT3 Wildtyp Konstellation zeigten, eine deutlich bessere Prognose hatten. Die Kombination aus mutiertem NPM1 und unmutiertem FLT3 macht etwa 20-25% der Patienten in der Gruppe der CN-AML und 10-15% erwachsenen Patienten mit AML aus und hat somit große therapeutische Relevanz. (47) Bei älteren Patienten, die intensiv therapiert werden, stellt NPM1 einen wichtigen prädiktiven Marker dar: die Patienten zeigen hohe Remissionsraten und ein längeres rezidivfreies- und Gesamtüberleben. (48)
Mutation in Genen der Signaltransduktion Fms-related Tyrosinkinase 3 Gen (FLT3)
Etwa 20% aller adulten Patienten tragen eine Mutation im FLT3 Gen, womit es zu den am häufigsten mutierten Genen der AML zählt. Es ist auf Chromosom 13q12 lokalisiert und codiert für eine Rezeptortyrosinkinase, die vorwiegend in frühen hämatopoetischen Zellen exprimiert ist. Eine Mutation in diesem Gen führt zu einer Überaktivität der Kinase, was zur massiven Steigerung der Zellproliferation führt. (43) Dabei treten hauptsächlich zwei Mutationstypen auf: Insertionen (interne Tandemduplikationen) von drei bis 400 Basen in der Juxtamembrandomäne (FLT3- ITD), die bei 25-35% der Patienten mit CN-AML vorkommen und Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäne (FLT3-TKD), die in etwa 7% der Fälle mutiert ist. (48) Beide Mutationen zeigen zwar Ähnlichkeiten in der Art der Signaltransduktion, jedoch sind auch einige wesentliche Unterschiede feststellbar, was die Diskrepanzen im klinischen Phänotyp von ITD und TKD Mutationen erklären könnte. (49)
Vorwiegend kommen FLT3 Mutationen bei Patienten mit normalem Karyotyp vor.
Dennoch zeigt sich bei Patienten mit aberrantem Karyotyp eine Häufung der Mutation zum einen bei der t(6;9) (70% FLT3 mutiert) und zum anderen bei der Promyelozytenleukämie, die zu 30% eine FLT3 Mutation zeigen. (50,51)
Die Prognose von CN-AML Patienten mit FLT3 Mutation ist signifikant schlechter als die von CN-AML Patienten mit FLT3 Wildtyp, was vor allem auf ITD Mutationen zutrifft.
Außerdem scheint das Verhältnis zwischen mutiertem und Wildtyp Gen eine Rolle zu spielen, da besonders hohe Allelfrequenzen der Mutation für ein schlechteres Behandlungsergebnis verantwortlich sind. (52)
Myeloische Transkriptionsfaktoren
CCAAT/enhance binding protein α (CEBPA)
10-15% der Patienten mit CN-AML haben eine oder mehrere Mutationen im CCAAT/enhancer binding protein α (CEBPA), welches einen wesentlichen Transkriptionsfaktor der Hämatopoese darstellt. Aber auch bei aberranten Karyotypen mit 9q Deletionen sind vermehrt CEBPA Mutationen zu beobachten. (53) Es können im Wesentlichen zwei unterschiedliche Mutationstypen in dem Basic Leucin Zipper (bZIP) Transkriptionsfaktor unterschieden werden. Einerseits führen Frameshift Mutationen im N-Terminus zur Verkürzung des Proteins und beeinflussen somit die
aktivierende Domäne, andererseits führen Insertionen und Deletionen im C-Terminus der Leucin Zipper-Domäne zur Verminderung der DNA-Bindungsfähigkeit und der Dimerisationsaktivität.(54)
Zwei Drittel der Patienten tragen Mutationen sowohl im N- als auch im C-Terminus des CEBPA Gens und sind somit biallelisch mutiert. Mit 90% der biallelisch mutierten Patienten ist dabei die überwiegende Mehrheit compound heterozygot, was bedeutet, dass die Mutation im C-Terminus auf dem ersten und die N-Terminale Mutation auf dem zweiten Allel lokalisiert ist. Die Minderheit ist homozygot für eine der beiden Mutationen, was vor allem auf den Mechanismus einer uniparentalen Disomie zurückzuführen ist. Die Patienten des übrigen Drittels tragen nur eine CEBPA Mutation. (52)
CEBPA Mutationen werden entsprechend der Datenlage aus diversen Studien als prognostisch günstiger Parameter betrachtet, vergleichbar mit der günstigen Prognose von NPM1 mutierten/FLT3 Wildtyp Patienten. (53) Neuere Forschungsergebnisse beschränken die Aussage allerdings ausschließlich auf biallelisch mutierte Patienten.
Einzelne CEPBA Mutationen sind demnach prognostisch wie der CEBPA Wildtyp zu werten.(55)
Runt-related transcription factor 1 (RUNX1)
Durch Dimerisation mit dem Transkriptionsfaktor CBFB wirkt RUNX1 regulierend auf die normale Stammzelldifferenzierung. Der Transkriptionsfaktor kann einerseits, wie im Kapitel ‚zytogenetische Aberrationen‘ beschrieben, durch eine chromosomale Translokation oder durch eine Mutation der Runt-Domäne des Gens fehlreguliert sein.
(53) Durch Punktmutationen kommt es zum Verlust der normalen Transkriptionsfaktoraktivität, wodurch die Differenzierung beeinträchtigt und Apoptosemechanismen blockiert werden. (56)
Bei 13% der vorwiegend älteren Patienten mit normalem Karyotyp oder mit chromosomalen Aberrationen, wie Trisomie 13 oder 21, sind RUNX1 Mutationen zu finden. Des Weiteren zeigen Patienten häufig ein gering differenziertes Zellbild, das in der FAB Klassifikation M0 entspricht. (52)
Hinsichtlich der prognostischen Relevanz ist die RUNX1 Mutation assoziiert mit geringeren Remissionsraten sowie kürzerem rezidivfreiem- und Gesamtüberleben.
(57). In der aktuellen WHO-Klassifikation von 2016 wurde erstmals die AML mit RUNX1 Mutation als provisorische Kategorie aufgenommen.
Mutation in Genen der DNA Methylierung
Epigenetische Modifikation ist ein wichtiger Prozess zur Regulation der Chromatinstabilität, der zellulären Differenzierung, des genomischen Imprintings und der Transkriptionsfaktoraktivität. Eine Stellschraube zur Regulation stellt die DNA Methylierung dar, die ebenfalls über zentrale Mechanismen der Stammzellproliferation und -differenzierung gesteuert werden. (58) Aberrante DNA Methylierung konnte als Teil der Tumorpathogenese identifiziert werden. Hauptsächlich ist eine globale Hypomethylierung charakteristisch. Lokal kommt es jedoch auch zur Hypermethylierung von CpG Inseln, die die regulatorische Funktion der Expression nachgeschalteter Gene, wie etwa von Tumorsuppressorgenen, übernehmen. (59,60) DNA Methyltransferase 3A (DNMT3A)
In den letzten Jahren wurde die Rolle des DNA Methyltransferasegens in der Leukämogenese intensiv erforscht. Neben NPM1 und FLT3 ist die DNMT3A Mutation eine der häufigsten molekulargenetischen Aberrationen bei der AML. (25) Die meisten Studien, inklusive die Arbeit unserer Arbeitsgruppe, zeigen DNMT3A Mutationen bei etwa 20% der AML Patienten, während eine Studie des Cancer Genome Atlas eine Häufigkeit von 26% beschreibt. (45,59). Aus klinischer Sicht treten DNMT3A Mutationen signifikant häufiger bei älteren als bei jüngeren Patienten auf.(61)
Das DNMT3A Gen codiert für eine DNA Methyltransferase, die die Methylierung eines Cytosins in Cytosin-Guanin Dinukleotidinseln (CpG-Inseln) katalysiert. Die Methylierung der CpG-Inseln resultiert in einer verminderten Expression des nachgeschalteten Gens. (62). Das Protein bildet nicht nur Homotetramere sowie durch Dimerisation mit DNMT-like (DNMT3L) funktionell aktive Heterotetramere. DNMT3L ist selbst enzymatisch inaktiv, verstärkt aber die enzymatische Aktivität des DNMT3A Proteins. (62)
Mit 60% aller Mutationen ist die Stelle R882 am häufigsten von Punktmutationen betroffen, sodass hier von einem Hotspot gesprochen werden kann. Dabei findet ein Austausch des Arginins an dieser Stelle häufig zu Histidin (R882H) und zu geringerem Anteil zu Cystein (R882C) statt. Nur selten treten an der Stelle R882 andere Mutationen, wie R882P oder R882S, auf. Typischerweise liegt die DNMT3A Mutation heterozygot vor.(61)
Der genaue Mechanismus von DNMT3A Mutationen, speziell die R882 Region betreffend, ist noch nicht hinreichend geklärt. In Studien konnte bislang gezeigt werden, dass DNMT3A Mutationen weder den Gesamtanteil von 5-Methylcytosin noch das globale Methylierungsmuster beeinflussen. Jedoch konnten Hypomethylierungen auf lokaler Genebene bei mutiertem DNMT3A nachgewiesen werden.(59) Durch Mutationen am Hotspot entsteht ein verändertes Protein mit dominant-negativer Aktivität gegenüber dem Wildtyp Allel, sodass die Leistung der DNA Methyltransferase um bis zu 80% reduziert wird.(62,63) Im hämatopoetischen System kommt es zu einem Differenzierungsstopp sowie einer erhöhten Rate an Selbsterneuerung der Zellen. (64,65) Neuere Arbeiten von Ley et al. konnten zeigen, dass Hypomethylierung bei DNMT3A mutierten Patienten als frühes Ereignis in der Leukämogenese angesehen werden kann, während Hypermethylierung sekundär als Konsequenz eines AML Progresses aufgrund von schneller Zellproliferation auftritt. (66)
Über die prognostische Aussagekraft herrschte lange eine gespaltene Datenlage.
Mittlerweile konnten jedoch viele Studien inklusive der Arbeit unserer Arbeitsgruppe eine ungünstige Prognose von DNMT3A Mutationen auf das rezidivfreie Überleben und das Gesamtüberleben zeigen. (42,59) Die prognostischen Aussagen sind abhängig von Alter und Lokalisation der Mutation. Während für junge Patienten (<60 Jahre) das schlechtere Outcome vor allem für Mutationen nachweisbar war, die nicht an der R882 Stelle lokalisiert waren, zeigten bei älteren Patienten (>60 Jahre) Mutationen am Hotspot die Assoziation mit schlechterem Gesamtüberleben. (67)
Isocitrat Dehydrogenase 1 und 2 (IDH1/2)
Die Isocitrat Dehydrogenase ist ein Schlüsselenzym des Citratzyklus, das die Reaktion von Isocitrat zu α-Ketoglutarat katalysiert. Damit spielt das Enzym eine entscheidende Rolle im Zellstoffwechsel durch die Produktion von NADPH für den Lipid- und Nukleotidstoffwechsel. (68)
Mutationen in der zytosolischen Isocitrat-Dehydrogenase 1 betreffen die Arminosäure Arginin an Stelle 132, während in der mitochondrialen Isoform IDH2 Punktmutationen an den Stellen R140 oder R172 zu finden sind. Die missense Mutationen führen zu einer Reduktion des Stoffwechselproduktes α-Ketoglutarat und gleichzeitig, durch ein gain of function, zur Bildung von 2-Hydroxyglutarat, das akkumuliert und unter anderem die TET2 methylcytosine dioxygenase Aktivität inhibiert. (69) Es kommt durch
die TET2 Hemmung zu einer DNA-Hypermethylierung von Transkriptionsfaktoren, die für die Zelldifferenzierung von entscheidender Bedeutung sind. (70) Typischerweise liegt die Mutation heterozygot vor, da ein Wildtypallel notwendig zur Aufrechterhaltung des weiteren Zellstoffwechsels ist.(71)
Mit einem Auftreten bei 16% der Patienten ist IDH ein häufig mutiertes Gen bei AML.
(52) Es ist allerdings nicht spezifisch, da Mutationen ebenfalls bei anderen myeloproliferativen Neoplasien sowie in soliden Tumoren, wie beispielsweise Hirntumoren, Chondrosarkomen oder kolorektalen Neoplasien nachweisbar sind. (72- 74). Trotz unklarer Datenlage gibt es Hinweise darauf, dass das Outcome von der Lokalisation der Mutation abhängig sein könnte. So scheinen IDH2 R172 Mutationen im Gegensatz zu R140 Mutationen einen größeren Einfluss auf die metabolische Aktivität zu haben. (25) Außerdem zeigt eine Arbeit unserer Arbeitsgruppe, dass IDH1 R132 Mutationen keinen Effekt auf den Krankheitsverlauf zeigen, während andere Polymorphismen im Gen möglicherweise zu einem schlechteren Behandungsergebnis führen. (75)
Ten-Eleven Translocation Methylcytosin Dioxygenase 2 (TET2)
Das Eisen- und α-Ketoglutarat-abhängige Enzym katalysiert die Reaktion von 5- Methylcytosin zu Hydroxymethylcytosin, das eine wichtige Rolle in der Demethylierung von DNA spielt. (76) Im Fall der im TET2 Gen auftretenden Deletionen, missense oder nonsense Mutationen bleiben Gene, die entscheidend für die Aufrechterhaltung der normalen Zellfunktion sind, hypermethyliert und werden somit nicht transkribiert.
Der Anteil der TET2 mutierten AML Patienten variiert zwischen 7% und 23%. (76) Außer in der AML finden sich auch in einigen anderen hämatologischen Neoplasien TET Mutationen, vor allem in der chronisch myelomonozytären Leukämie (CMML), bei der etwa 50% der Patienten die Mutation tragen. (76) Auch in Erkrankungen der lymphatischen Zelllinie ist das Auftreten von TET2 Mutationen beschreiben. (77,78) Bezüglich der prognostischen Bedeutung herrscht keine klare Datenlage. Für Patienten mit nach European LeukemiaNet günstigem Risiko konnten in einer Studie schlechtere Remissionsraten und kürzeres rezidivfreies Überleben gezeigt werden.
(79) Außerdem scheint das Outcome für Patienten mit TET2 Mutation und NPM1
Wildtyp/FLT3 Wildtyp Mutationsstatus ebenfalls schlechter zu sein. (80) Andere Studien konnten jedoch keine prognostischen Unterschiede belegen. (81)
Zusammenwirken der molekulargenetischen Veränderungen in der Leukämogenese Bei 96% der Patienten lässt sich mindestens eine, bei 86% sogar mindestens zwei Mutationen nachweisen, die der Zelle einen Wachstumsvorteil verschaffen (Driver- Mutationen) (25). Im Durchschnitt liegt die Zahl der im codierenden Bereich liegenden Mutationen (SNV) pro Patient bei 13, von denen fünf in rekurrent mutierten Genen liegen. Insgesamt ist damit die Zahl der durchschnittlichen Mutationen pro Patient deutlich niedriger als die in soliden Tumoren. (45) Die Erkrankung entwickelt sich über einen Zeitraum mit mehreren Mutationsereignissen hinweg, was sich in der Zusammensetzung von nebeneinander existierenden Klonen mit unterschiedlichem Mutationsprofil wiederspiegelt und unter dem Begriff „klonale Evolution“
zusammengefasst wird.(45,82)
Untersuchungen der Koexistenz aus verschiedenen Subklonen bei AML-Patienten werden analysiert, um ein Muster der klonalen Evolution herausarbeiten zu können.
Ein Mittel, um die Reihenfolge der mutagenen Ereignisse zu bestimmen, ist die Messung der Allelfrequenzen aller Komutationen. (83) Diese weisen darauf hin, dass Mutationen in Genen der epigenetischen Regulation, wie beispielsweise DNMT3A, ASXL1, IDH1/2 und TET2 frühe Ereignisse darstellen und allein keine akute myeloische Leukämie auslösen, da sie ausnahmslos nur im Kontext mit anderen Mutationen vorkommen. Es kommt aber mit dem Erwerb dieser Mutationen schon zu einer präleukämischen Stammzelle mit klonaler Hämatopoese, die als erster Schritt in der Leukämogenese betrachtet werden. Erst mit Akquisition weiterer genetischer Veränderungen kommt es zur Ausbildung eines leukämischen Phänotyps. (25,84,85) Spätere Mutationen der Leukämogenese stellen Tyrosinkinaserezeptor Mutationen, wie FLT3 Mutationen dar. Häufig haben diese Patienten mehrere Mutationen von Genen, die für Rezeptortyrosinkinasen codieren. Ebenfalls im späteren Verlauf der Leukämogenese folgt auf eine frühe Mutation im DNMT3A, IDH1 oder NRAS Gen häufig eine Mutation im NPM1 Gen.(45,86)
Analysen der Mutationsprofile haben ergeben, dass bestimmte Mutationen häufig zusammen auftreten, wie zum Beispiel NPM1 und DNMT3A Mutationen sowie NPM1 und FLT3 Mutationen. Gegensätzlich dazu schließen sich jedoch auch einige
Mutationen aus. So treten zum Beispiel die Genmutationen NPM1, RUNX1, IDH1/2 und CEBPA nie gemeinsam mit Fusionsproteinen von Transkriptionsfaktoren auf. (45) Für die Mutationen, die zu Transkriptionsfaktorfusionen führen, konnte bereits gezeigt werden, dass es sich hierbei um wichtige krankheitsauslösende Ereignisse handelt.
(82) Daher legen diese Daten den Schluss nahe, dass diese Genmutationen ebenfalls das Potential zur Initiation der AML haben. (45)
Klonale Hämatopoese unbestimmten Potenzials
Gegenstand aktueller Forschung ist die Rolle von klonaler Hämatopoese unbestimmten Potenzials (CHIP) auf die Leukämogenese und den Krankheitsverlauf der akuten myeloischen Leukämie. Definiert wird die klonale Hämatopoese durch somatische Mutationen, die in Blut- oder Knochenmarkzellen gefunden werden, ohne eines morphologischen Korrelats in Form von Blutzelldysplasien. Es handelt sich somit um durch Mutationen klonal expandierter Stammzellen, die bei gesunden Personen nachweisbar sind. (87) Dabei finden sich überwiegend Mutationen in Genen, die eine wichtige Funktion in der epigenetischen Regulation spielen wie DNMT3A, TET2 und ASXL1. (32) Andere Mutationen, deren Nachweis in gesunden Menschen beschrieben wurde, sind JAK2, TP53, PPM1D, SF3B1 und BCORL1. (88) Die Allelfrequenz dieser Mutationen liegt dabei definitionsgemäß über 2%, wodurch die Klonalität belegt wird.
(85) Im Rahmen von Studien konnte gezeigt werden, dass CHIP mit einer Transformationsrate von 0,5-1% pro Jahr zu einem 13-fach erhöhten Risiko für das Auftreten von akuten myeloischen Leukämien aber auch anderen hämatologischen Neoplasien im Vergleich zu Gesunden führt. (32,89) Allerdings gibt es viele Personen, bei denen aus einer somatischen Mutation klonale Hämatopoese resultiert, ohne dass es zu einer malignen Transformation kommt. Folglich handelt es sich bei CHIP um einen Zustand, bei dem die mutierte Stammzelle stärker zur Blutbildung beiträgt als unmutierte Stammzellen, was zu einer höheren Prädisposition für hämatologische Neoplasien aber nicht notwendigerweise zu einer Leukämie führt. (85)
Die klinische Bedeutung von CHIP auf den Erkrankungsverlauf von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie wird intensiv untersucht. Studien ergaben Hinweise auf eine Korrelation zwischen hohen Allelfrequenzen der somatischen Mutation und der Transformationsrate sowie der Gesamtmortalität, sodass ein Zusammenhang vermutet werden kann, der aber weiterer Untersuchung bedarf. (87)
1.6 Therapie und Prognose
1.6.1 Therapie
Unbehandelt führt die akute myeloische Leukämie in einem hohen Prozentsatz der Patienten im Durchschnitt innerhalb von drei bis sechs Monaten zu einem absoluten Knochenmarkversagen und damit zum Tod. (90) Daher ist ein zeitiger Therapiebeginn unmittelbar nach Diagnosestellung entscheidend für bessere Überlebenschancen.
Das Ziel einer kurativen Therapie liegt im Erreichen einer kompletten Remission der Erkrankung (CR) mit Erholung der gesunden Hämatopoese. Demnach werden die Kriterien der kompletten Remission wie folgt definiert:
❖ Reduktion der Blasten im Knochenmark auf <5%
❖ Kein Nachweis von Auer-Stäbchen
❖ Fehlen einer extramedullären Manifestation der Erkrankung
❖ Erholung des peripheren Blutbildes mit >1.000 neutrophilen Granulozyten/µL,
>100.000 Thrombozyten/µL und Unabhängigkeit von Erythrozytenkonzentrattransfusionen (19,91)
Als Rezidiv wird der Anstieg der Blasten auf ≥5%, ein Wiederauftritt von Blasten im Blut oder die Entwicklung einer extramedullären Krankheitsmanifestation bezeichnet.
Um dem vorzubeugen, kommen nach Erreichen der Remission verschiedene Postremissionsstrategien zur Anwendung, die entsprechend des individuellen Risikos für ein Rezidiv ausgewählt werden. (19)
Aufgrund der Entdeckung zahlreicher molekularer Parameter wird heute die molekulare Remission mittels Monitoring der minimalen Resterkrankung (MRD) überwacht. Da dieses Monitoring voraussetzt, dass die überwachte Mutation in Remission nicht nachweisbar ist und im Rezidiv an gleicher Stelle wieder auftritt, eignen sich nicht alle Mutationen für die Untersuchung. In der Praxis werden Mutationen im NPM1 Gen sowie die Kinetik der Core-binding Factor Proteine zur Ermittlung der MRD analysiert. (92,93) Wird im Rahmen der Analysen mittels sehr sensitiver Methoden wie der real time- PCR oder Next Generation Sequencings, ein Anstieg der Allelfrequenz der Mutation gefunden, kann dieses molekulare Rezidiv frühzeitig therapiert werden, bevor es zum Auftreten von schweren klinischen
Symptomen im Rahmen des hämatologischen Rezidivs kommt. (94) Ebenfalls eröffnet die molekulargenetische Analyse neue Therapieoptionen, die spezifischer auf das Mutationsprofil der Patienten ausgerichtet sind. (95)
Induktionstherapie
Die Grundlage der Induktionstherapie besteht aus einer Chemotherapie mit dem Antimetabolit Cytosin-Arabinoid (ARA-C), das durch die Gabe eines Anthrazyklins ergänzt wird. Das Ziel dieser Chemotherapie ist die Reduktion der Tumorlast und somit das Erreichen einer kompletten Remission. Die Zytostatika werden in einem 3+7- Schema verabreicht. Zunächst wird in den ersten drei Tagen ein Anthrazyklin verwendet, das als antibiotisches Zytostatikum die Topoisomerase II inhibiert und Doppelstrangbrüche in der DNA herbeiführt. (96) Am häufigsten kommt dabei 60 mg/m² Daunorubicin zur Anwendung. (97,98) Direkt im Anschluss wird eine Dauerinfusion von 100-200 mg/m² Cytosin-Arabinosid über sieben Tage gegeben, das anstelle des natürlichen Cytosins während der Replikation in die DNA eingebaut wird und somit den Zelltod induziert. Ein weiterer Wirkmechanismus betrifft die Hemmung der DNA Polymerase, wodurch die DNA Replikation und Reparatur gehemmt wird.
Mit zwei Zyklen dieser Chemotherapie wird in 60-80% der Patienten <60 Jahre die komplette Remission erreicht. In der Altersgruppe der >60 Jährigen trifft dies nur noch auf 40-60% zu. (97) Trotz zahlreicher Studien konnte kein anderes Therapiekonzept bessere Remissionsraten erzielen, sodass das 3+7-Schema bereits seit 30 Jahren Anwendung findet. (19)
Konsolidierungstherapie
Nach Erreichen der kompletten Remission durch alleinige Induktionstherapie würde es beim Großteil der Patienten zu einem frühen Rezidiv kommen. Daher ist das Ziel der Konsolidierungstherapie die Senkung des Rezidivrisikos durch Reduktion der verbleibenden Tumorlast, ohne dabei resistente Subklone zu selektieren.
Optionen für die Konsolidierungstherapie stellen die Chemotherapie sowie eine autologe oder allogene Stammzelltransplantation dar. Grundlage für die Wahl der Therapiemethode ist dabei das individuelle Risiko des Patienten für ein Rezidiv, bemessen an den im Kapitel 1.3.3 benannten Kriterien sowie anhand der Erkenntnisse aus der Mutationsdiagnostik. (19) Auch die körperliche Konstitution und die Verfügbarkeit eines passenden Stammzellspenders werden in der Entscheidung
berücksichtigt. (99)
Patienten mit niedrigem Risiko <60 Jahre werden mit hochdosiertem ARA-C therapiert.
Dabei hat sich ein Schema aus 3g/m² Ara-C im zwölfstündigen Abstand an den Tagen eins, drei und fünf bewährt, welches bis zu viermalig durchgeführt wird. (100). Weder die Kombination mit anderen Substanzen noch die Anzahl der Zyklen konnten das Outcome bisher beeinflussen. (101)
Während die autologe Stammzelltransplantation in Studien trotz des größeren antileukämischen Effektes keinen Vorteil hinsichtlich des Gesamtüberlebens im Vergleich zur Chemotherapie zeigte (102), ist die allogene Stammzelltransplantation (allo HSCT) Therapie der ersten Wahl bei Patienten mit schlechter Prognose und hoher Rezidivwahrscheinlichkeit sowie nach Versagen einer konventionellen Chemotherapie. (99,103) Verglichen mit anderen Postremissionstherapien zeichnet sich die allogene SCT durch den stärksten antineoplastischen Effekt aus, der zum einen auf den Auswirkungen der zytoreduktiven Therapie vor einer Transplantation und zum anderen auf dem immunologischen antileukämischen (graft-versus- leukemia) Effekt beruht. (104) Das transplantierte Material wird dabei vorzugsweise von einem Geschwisterspender oder Fremdspender genommen, bei denen möglichst viele oder im besten Fall alle humanen Leukozytenantigene (HLA) übereinstimmen.
(103)
Ist bei einem Patienten aufgrund seines Alters, seiner Begleiterkrankungen oder aufgrund der körperlichen Konstitution die Durchführung einer intensiven Therapie nicht möglich, können palliative Maßnahmen, die auf der bestmöglichen unterstützenden Therapie basieren, angestrebt werden. (26) Als Altersgrenze für eine intensive Therapie wird in der Literatur häufig von 60-70 Jahren ausgegangen, wobei die Grenze in der klinischen Praxis mehr von der Konstitution des Patienten abhängt und variiert werden kann. (105) Es gibt keinen Konsens zur Therapie für diese älteren Patienten mit AML. Neben einer zytoreduktiven Therapie mit Hydroxyurea oder gering dosiertem Cytarabin kommen immer häufiger auch demethylierende Substanzen (Decitabin und Azacitidin) zum Einsatz. Diese Maßnahmen verlängern das Überleben jedoch im Durchschnitt nur um sechs Monate. (106,107)
Neben älteren Patienten ist auch das Erreichen einer kompletten Remission bei sekundären akuten myeloischen Leukämien sowie nach Rezidiv, insbesondere bei Frührezidiven, innerhalb der ersten sechs Monate nach Diagnosestellung, durch die konventionelle Chemotherapie deutlich erschwert. (108)
Spezifische Therapieansätze
Durch ein besseres Verständnis der Pathogenese konnten für verschiedene Mutationskonstellationen spezifische Therapieansätze konzipiert werden, die durch einen zielgerichteten Angriff der leukämischen Blasten ein besseres krankheitsfreies Langzeitüberleben sowie bessere Remissionsraten erreichen sollen. Dabei spielen unter anderem Inhibitoren von Signalwegen, Interaktion mit der epigenetischen Regulation, Inhibition von mutierten Genen oder der Einsatz von Antikörpern eine Rolle. (109)
Einer der ersten Schritte hinsichtlich einer spezifischen Therapie stellte die Klärung der Pathogenese bei AML Patienten mit Promyelozytenleukämie dar, das zum Fusionsprotein PML-RARα führt. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Fusionsprotein mit hoher Affinität an bestimmte DNA Abschnitte bindet und somit zu einer blockierten Transkription von Genen für die Granulozytendifferenzierung führt.
Durch die Verabreichung von All-trans-Retinolsäure (ATRA) und Arsentrioxid in Kombination mit der konventionellen Chemotherapie kann die Prognose der Patienten deutlich gesteigert werden, sodass die Heilungschance heutzutage 97% beträgt. (110- 112)
In der Therapie von Patienten mit FLT3 Mutationen werden verschiedene Tyrosinkinaseinhibitoren getestet. Unspezifische Inhibitoren für Tyrosinkinasen sind Midostaurin, Lestaurtinib, Sunitinib und Sorafenib, während Crenolanib und Quizartinib eine hohe Spezifität für FLT3 zeigen. (113,114) Des Weiteren konnte eine Studie zeigen, dass Patienten mit FLT3-ITD Mutationen mit hoher Allellast deutlich von einer allogenen SCT als Erstlinientherapie profitieren. (115) Auch für Mutationen in den Genen cKit, IDH1 und IDH2 werden Inhibitoren in klinischen Studien getestet.
(ClinicalTrials.gov: NCT02013648; ClinicalTrials.gov: NCT02074839, NCT01915498) Für Patienten mit NPM1 Mutationen besteht derzeit keine Option zielgerichtet zu therapieren. Es gibt allerdings Hinweise darauf, dass Patienten mit NPM1 Mutationen von ATRA Gaben profitieren. (116) Außerdem zeigt sich für transplantierte Patienten mit NPM1 Mutation und FLT3-ITD Wildtyp kein Überlebensvorteil (115), dafür profitieren vor allem ältere Patienten von einer intensiven Chemotherapie. (115,117) Da >80% der AML Blasten CD33 exprimieren, stellt auch eine antikörperbasierte Therapie eine Möglichkeit dar. Nach längerer unklarer Datenlage scheint der CD33- Antikörper Gemtzuzumab vor allem bei älteren Patienten einen signifikanten
Überlebensvorteil zu bewirken. Vor allem Patienten mit CBF AML, bei denen der Anteil der CD33 tragenden Blasten besonders hoch ist, konnten von der Antikörpergabe profitieren. Insgesamt zeigte sich dieser Effekt jedoch nur bei Patienten mit günstiger und intermediärer Risikostratifizierung, nicht jedoch bei Patienten mit ungünstigem Risiko. (118,119)
Kürzlich eröffnete die Einführung von demethylierenden Substanzen eine weitere Möglichkeit der Therapie der AML. Bei den Cytosinanaloga Azacitidin und Decitabin handelt es sich um für Intermediär-II- und Hochrisiko-MDS entwickelte Substanzen.
Azacitidine zeigte bei AML mit Blastenanteilen von >30% eine nominelle, aber statistisch nicht signifikante Verlängerung des Gesamtüberlebens. (120) Inwieweit das Ansprechen auf demethylierende Substanzen von Mutationen, die die DNA Methylierung beeinflussen abhängt, muss weitere Forschung noch zeigen.
1.6.2 Prognose
Nach Erreichen der Remission kann das Risiko für ein Rezidiv auf 50-55% reduziert werden, indem eine suffiziente Postremissionstherapie durchgeführt wird. Aufgrund der trotzdem noch hohen Rezidivrate sowie toxisch und infektionsbedingten Komplikationen beträgt die Langzeitüberlebensrate der unter 60-jährigen nur 45%.
Aufgrund der genannten Komplikationen bei Patienten über 60 liegt hier die Heilungsrate lediglich bei 15-20%.(95)
1.7 Zielsetzung der Arbeit
Frühere Forschungsergebnisse der Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass 23% der untersuchten Patienten, die an einer akuten myeloischen Leukämie mit Mutation im DNMT3A Gen leiden, diese Mutation auch in T-Zellen tragen, was als Hinweis für eine sehr frühe Akquisition in der Leukämogenese zu sehen ist. Daraus resultiert die Überlegung, dass DNMT3A Mutationen, die in T-Zellen nachweisbar sind, in früheren Zellen der hämatopoetischen Differenzierung erworben wurden als DNMT3A Mutationen, die nicht in T-Zellen nachweisbar sind. Die zugrundeliegende Überlegung ist in Abbildung 1 dargelegt.
Abbildung 1. Konzept zur Entstehung von DNMT3A Mutationen in der Leukämogenese
Abkürzungen: HSZ: Hämatopoetische Stammzelle, MLP: lymphatischer Vorläufer , CMP: myeloischer Vorläufer, GMP: granulozytär-monozytärer Vorläufer, MEP: megakaryozytär-erythroider Vorläufer, T: T Lymphozyt, B: B Lymphozyt, NK: Natürliche Killerzelle
Diese Präsenz der Mutation in myeloischen und lymphatischen Zellen wurde als Marker für eine vor der AML bestehende präleukämische lympho-myeloische klonale Hämatopoese (LM-CH) gewertet. Wenn DNMT3A Mutationen bei Patienten während der Remission, jedoch nicht in T-Zellen nachweisbar war, wurde dies als myeloische klonale Hämatopoese (M-CH) bezeichnet.
Klonale Hämatopoese in gesunden Probanden ist derzeit ein wichtiger Gegenstand der Forschung. Eine erhöhte Inzidenz von myeloischen Leukämien bei Patienten mit klonaler Hämatopoese wurde bereits in mehreren Studien gezeigt (32,85). Dennoch ist die Rolle der klonalen Hämatopoese auf den Erkrankungsverlauf von AML Patienten noch wenig charakterisiert. Da DNMT3A eines der am häufigsten veränderten Gene bei klonaler Hämatopoese unbestimmten Potenzials (CHIP) und bei der AML darstellen, wurde diese Mutation zur Beantwortung dieser Fragestellung genutzt.
Vorarbeiten der Arbeitsgruppe konnten keinen Unterschied hinsichtlich des Gesamtüberlebens und des krankheitsfreien Überlebens zwischen DNMT3A mutierten Patienten mit Mutationen in T Zellen (AML mit LM-CH) im Vergleich zu Patienten mit DNMT3A Wildtyp in T-Zellen (M-CH) zeigen.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten diese Patienten weitergehend klinisch und genetisch charakterisiert werden. Dafür sollte nach signifikanten Unterschieden in den
Komutationen bei Erstdiagnose, die auf eine andere Krankheitsentstehung hindeuten können, gesucht werden. Zudem wurden verfügbare Proben aus Remissions- und Rezidivzeitpunkten der Patienten untersucht, um das Therapieansprechen zu evaluieren und den Verlauf der Mutationen vor dem Hintergrund eines LM-CH Klons zu skizzieren. Außerdem wurde im Hinblick auf die Rolle von DNMT3A bei CHIP der Zusammenhang mit lympho-myeloischer klonaler Hämatopoese geprüft. Um genaue Charakterisierungen und Verläufe der molekularen Aberrationen vornehmen zu können, wurden verschiedene Methoden des Next Generation Sequencings der Illumina Plattform verwendet, um Allelfrequenzen möglichst sensitiv erfassen und Allellastveränderungen quantifizieren zu können.
2. Patienten, Material und Methoden
2.1 Patientenkohorte
In die Untersuchung wurden erwachsene Patienten im Alter von 18-87 Jahren mit de novo oder sekundär entstandener AML eingeschlossen, die in der Erstdiagnose eine Mutation im DNA Methyltransferase 3A Gen zeigten. Alle Patienten waren in den multizentrischen Studien AML SHG 0199 (ClinicalTrials Identifier NCT00209833, n=44), AML SHG 0295 (n=14) oder AMLSG Biology and outcome study (n=113) eingeschlossen. Patienten mit zytogenetischen Aberrationen wie PML-RARα beziehungsweise t(15;17) wurden nicht in die genannten Studien eingeschlossen und sind somit nicht in der Patientenkohorte enthalten.
Von 171 Patienten standen entweder Knochenmark (n=97) oder peripheres Blut (n=74) bei Diagnosestellung zur Zellsortierung in CD3 positive und CD3 negative Zellen zur Verfügung. 141 Patienten wurden im Verlauf entsprechend der Studienprotokolle mit einer doppelten Induktions- und einer Konsolidationstherapie intensiv therapiert. Bei weiteren 21 Patienten wurde eine nicht intensive Therapie mit demethylierenden Substanzen oder niedrigdosiertem Cytarabin durchgeführt. Die Behandlung von den verbleibenden elf Patienten ist nicht bekannt.
Diagnostisches Material von 55 Patienten in kompletter Remission stand zur Verfügung, insgesamt wurden 168 Remissionsproben untersucht. Außerdem konnte von 20 Patienten Material zum Zeitpunkt eines Rezidivs analysiert werden. Zum Ausschluss einer Keimbahnmutation wurden 13 aus Haarfollikeln gewonnene DNA Proben untersucht. Darüber hinaus stand für zwei in T Zellen DNMT3A mutierte Patienten Material zur Verfügung, das in der Zeit vor Manifestation der Erkrankung gewonnen wurde.
Die klinischen und hämatologischen Daten der Patienten wurden mit deren Einverständnis in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki aufgezeichnet.
Die wissenschaftliche Analyse der Proben erfolgte nach Zustimmung der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover.
2.2 Material
Allgemeine Chemikalien
Name Hersteller
Ethanol absolute for molecular biology 96%
Isopropanol
Distilled DNAse/RNAse free water PBS Dulbecco w/o Ca2+, w/o Mg2+
Agarose Ultrapure Ethidiumbromid
Natriumhydroxid 8 mM Trizol Reagent
Trichlormethan/Chloroform >99% p.a.
Tri-Natriumcitrat-Dihydrat >99% p.a.
AppliChem Panreac ITW companies, Gatersleben
Sigma Aldrich, St. Louis, USA Life Technologies, Darmstadt Biochrome GmbH, Berlin Biochrome GmbH, Berlin Invitrogen, Carlsbad, USA Carl Roth, Karlsruhe
Life Technologies, Darmstadt Carl Roth, Karlsruhe
Carl Roth, Karlsruhe
Kleinmaterialien
Name Hersteller
50 ml Falcon Tube, Zentrifugenröhrchen 15 ml Falcon Tube, Zentrifugenröhrchen 8er Deckelkette
Adhesive PCR Film
Biosphere Qualitätsspitzen Pipettenspitzen
Erlenmeyer Kolben 250ml Multiplate PCR Plate, 96 well Multiply µ-Strip 0,2ml Kette Reagiergefäße 1,5ml
MicroAmp Optica 96 well Reaction plate 5ml Polystyrul Rundboden Röhrchen mit Sieb
Sarstedt, Nümbrecht Sarstedt, Nümbrecht
Thermo Scientific, Waltham, USA Sarstedt, Nümbrecht
Duran Group, Mainz Bio Rad, München Sarstedt, Nümbrecht Sarstedt, Nümbrecht
Applied Biosystems, Victoria, Australia Applied Biosystem, Victoria, Australia Falcon, Monterrey, Mexiko
Enzyme und biologische Substanzen
Name Hersteller
Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) 10mM
Hotstar Taq DNA Polymerase Oligodesoxyribonukleotide (Primer) PCR Puffer 10x (15nM MgCl2)
PE mouse anti-human CD3 Antikörper IgG2bk-APC-H7 Antikörper
IgG2ak-APC Antikörper IgG1-PE Antikörper IgG1-FITC Antikörper IgG1-PE-Cy7 Antikörper CD34-PE-Cy7 Antikörper CD38-FITC Antikörper CD123-APC Antikörper CD45RA-APC-H7 Antikörper CD2-PE (clone-S5.2),Antikörper CD3-PE (UCHT1)Antikörper CD4-PE (RPA-T4)Antikörper CD7-PE (M-T701)Antikörper CD8-PE (RPA-T8)Antikörper CD10-PE (HI10a)Antikörper CD11b-PE (ICRF44)Antikörper CD14-PE (M5E2)Antikörper CD19-PE (HIB19) Antikörper CD20-PE (L27) Antikörper GPA-PE (GA-R2)Antikörper CD56-PE (B159) Antikörper
Life Technologies, Darmstadt Qiagen, Hilden
Eurofins scientific, Luxemburg Quiagen
BD Biosciences, Heidelberg BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Bioscience, San Jose, USA BD Bioscience, San Jose, USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA BD Pharmingen, Waltham USA
Kits und spezielle Chemikalien
Name Hersteller
1kb DNA Leiter 50x TAE Puffer
5x DNA Loading Dye GelPilot QIAquick Gel Extraction Kit GeneRead Size Selection Kit
PeqGOLD MicroSpin Tissue DNA Kit Qiagen RepliG Mini Kit
Kapa Library Quantification Kit TruSight myeloid Sequencing Panel Illumina Miseq Reagent Kit V3 PhiX Control V3
Qubit dsDNA HS Assay Kit Hepes Solution 1M, BioReagent MACS BSA Stock Solution MACS Rinsing Solution
Qiagen, Hilden Carl Roth, Karlsruhe Qiagen, Hilden Qiagen, Hilden Qiagen, Hilden
Peqlab Biotechnology, Erlangen Qiagen, Hilden
Kapa Biosystems, Wilmington, USA Illumina, San Diego, USA
Illumina, San Diego, USA Illumina, San Diego, USA
Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA
Sigma Life science, St. Louis, USA Milteny Biotec, Auburn, CA
Milteny Biotec, Auburn, CA
2.3 Methoden
2.3.1 Zellsortierung von CD3 positiven Zellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen Nach dem gleichen Protokoll, wie die sortierten CD3 positiven Zellen bei Erstdiagnose aus der bereits vorhandenen Kohorte, wurde von Patienten, die bei Erstdiagnose eine DNMT3A Mutation in den T Zellen zeigten, Follow-up Proben zum Zeitpunkt der vollständigen Remission sortiert.
Für die Probenvorbereitung wurden die Proben aufgetaut und in ein 15ml Falcon Zentrifugenröhrchen in 5ml PBS aufgenommen. Nach einer Zentrifugation von 10 Minuten bei 4°C und 1.200xg wurde der Überstand dekantiert, die Zellen erneut in 300µL PBS aufgenommen und mit 3,5 µL des PE mouse anti-human CD3 Antikörpers gefärbt. Nach einer Inkubation von 23 Minuten bei 4°C erfolgte erneut der gleiche Zentrifugationsschritt. Im Anschluss wurde der PBS Überstand dekantiert, das Zellpellet in 300µL MACS-Puffer resuspendiert und durch ein Sieb gegeben. Der
MACS Puffer setzt sich aus PBS (pH 7,2) und einer 1:20 verdünnten 2mM EDTA/
MACS BSA Stock Lösung zusammen, die erneut im Verhältnis 1:20 mit autoMACS rinsing Solution verdünnt wurde.
Für die Zellsortierung wurde mit einem MoFlo XDP Upgrade Sorter der Firma Beckman Coulter (Brea, CA, USA) verwendet. Die Sortierung der Zellen im Gerät erfolgt anhand des fluoreszierenden Farbstoffes Phycoerythrin (PE), der an einen gegen das T- Zelloberflächenantigen CD3 gerichteten Antikörper gekoppelt ist.
Die Zellsortierung der hämatopoetischen Vorläuferzellen (Progenitoren) erfolgte aus isolierten mononukleären Knochenmarkzellen oder CD34 angereicherten Knochenmarkszellen von ausgewählten Patienten mit und ohne DNMT3A Mutation in T-Zellen.
Die verwendeten monoklonalen Antikörper für die Linien-Färbung waren CD2-PE (clone-S5.2), CD3-PE (UCHT1), CD4-PE (RPA-T4), CD7-PE (M-T701), CD8-PE (RPA-T8), CD10-PE (HI10a), CD11b-PE (ICRF44), CD14-PE (M5E2), CD19-PE (HIB19), CD20-PE (L27), GPA-PE (GA-R2) und CD56-PE (B159). 50.000-100.000 Zellen wurden dafür als Kontrolle abgenommen, die restlichen Zellen wurden separat entsprechend des folgenden Protokolls mit den Antikörpern IgG2bk-APC-H7, IgG2ak- APC, IgG1-PE, IgG1-FITC und IgG1-PE-Cy7 sowie in 1:10 verdünnter Konzentration die Antikörper CD34-PE-Cy7, CD38-FITC, CD123-APC und CD45RA-APC-H7 gefärbt. Das folgende Färbeprotokoll wurde für die Zellsortierung verwendet:
Färbeprotokoll:
Tube
Zellzahl FITC PE APC PE-Cy7 APC-H7
C1 50.000-
100.000
- - - - -
C2 50.000-
100.000
CD45 (5µl)
- - - -
C3 50.000-
100.000
- CD45
(5µl)
- - -
C4 50.000-
100.000
- - CD45
(5µl)
- -
