Wellenleitermikroskopie : eine neue Methode zur Kraftmessung in biologischen Systemen

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Wellenleitermikroskopie

Eine neue Methode zur Kraftmessung

in biologischen Systemen

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften

(Dr. rer. nat.)

vorgelegt von

Karl-Friedrich Giebel

Universit¨at Konstanz

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Physik

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Titelbild:

Symbolische Abbildung einer keimenden Pilzspore auf einem Wellenleiter.

Dissertation der Universität Konstanz Tag der mündlichen Prüfung: 17. Juli 2003 1. Referent: Prof. Dr. Paul Leiderer

2. Referent: Prof. Dr. Martin Bastmeyer, Universit¨at Jena 3. Referent: Prof. Dr. Peter Nielaba

Autor: Karl-Friedrich Giebel

Ver¨oﬀentlicht im Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) (www.ub.uni-konstanz.de/kops)

Copyright c 2003 by Karl-Friedrich Giebel.

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Abstract

In this thesis a new microscopy method is introduced to investigate biological forces, the Waveguide Microscopy (WLM). This optical technique allows to measure forces occuring on substrates in a sub-nanonewton range with microscopic lateral resolution. The core of the method are thin planar waveguides, which are elastically deformable and which are used as substrate. If a local force is applied on such a waveguide, its thickness and therefore its optical resonance frequency changes. By measuring the shift of the optical resonances the local thickness can be obtained; and with the knowledge of the elastic properties of the waveguide the normal force exerted on the substrate can be calculated.

In the first part of this work three different optical setups and the waveguide substrates are characterised regarding sensitivity, lateral resolution and mechanical stability. It turns out that the preparation of the planar waveguides is the crucial point of the method. Waveguides comprised of a soft rubber film between two metal layers on a substrate, which are also long- time stable against culture media and biological preparation can be obtained. This offers the possibility of in situmeasurements on biological cells. The force sensitivity of the waveguides is better than 20 nN, and the lateral resolution smaller than 3µm.

In the second part of this thesis biological experiments with spores of funghi and adhering cells are presented. Both classes of experiments show not only the applicability of the method to the corresponding force range, but are also relevant in the particular fields of research. In the case of the spores of funghiColletotrichum graminicolaa correlation between the osmotic potential and the capability of leaf penetration could be demonstrated. Besides the influence of different mutants and transformants has been investigated. In particular time-resolved measurement show theWLM as an attractive technique to measure biological forces.

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Inhaltsverzeichnis

Einleitung 3

1 Grundlagen 5

1.1 Kr¨afte in biologischen Systemen . . . 5

1.1.1 Appressorienbildung bei Pilzsporen . . . 5

1.1.2 Zelladh¨asion . . . 11

1.2 Grundlagen der Wellenleiteroptik . . . 13

1.2.1 Entstehungsbedingungen der Wellenleitermoden . . . 15

1.2.2 Modenbreite und Lauﬂ¨ange . . . 18

1.3 Polymere . . . 18

1.3.1 Was sind Polymere? . . . 19

1.3.2 Mechanische Eigenschaften von Polymeren . . . 20

2 Experimenteller Aufbau und Wellenleiter–Pr¨aparation 22 2.1 Anforderungen an die Methode . . . 22

2.2 Das abbildende Wellenleitermikroskop . . . 24

2.3 Das Linienfokus–WLM . . . 27

2.3.1 Resonanzanregung im Strichfokus . . . 27

2.4 Das Punktfokus–WLM . . . 31

2.5 Pr¨aparation der Wellenleiter-Schichtsysteme . . . 32

2.5.1 Pr¨aparationsschritte . . . 35

2.5.2 Quervernetzen des Polymers . . . 36

2.5.3 Einﬂuß des Glimmens und der Aufdampfparameter . . . 38

2.6 Verwendete Software . . . 39

2.7 Typischer Versuchsablauf . . . 39

3 Das Wellenleitermikroskop 42 3.1 Lokale Schichtdicke des lichtleitenden Polymerﬁlms . . . 42

3.2 Mechanische Eigenschaften des Wellenleiters . . . 44

3.2.1 Deformation durch Gasdruck . . . 44

3.2.2 Deformation durch Glasfaser . . . 46

3.2.3 Krafteichung der Wellenleiter . . . 47

3.2.4 Kraftantwort und Relaxation . . . 48

3.3 Optische Eigenschaften der Wellenleitermikroskopie . . . 49

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INHALTSVERZEICHNIS

3.3.1 Laterale Auflösung und Abbildungsqualität . . . 50

3.3.2 Einﬂuß der Polarisation . . . 52

3.4 Methoden der Bildauswertung . . . 52

3.5 Zusammenfassung der methodischen Experimente . . . 56

4 Ergebnisse und Diskussion der biologischen Experimente 58 4.1 Kraftmessungen an Pilzsporen . . . 58

4.1.1 Probenpr¨aparation und Versuchsablauf . . . 60

4.1.2 Dynamik der Keimung und erreichter Enddruck . . . 61

4.1.3 Vergleichsmessungen verschiedener Mutanten . . . 64

4.1.4 Einﬂuß des osmotischen Potentials . . . 66

4.2 Kraftmessungen an Zellen . . . 74

5 Ausblick 77

Zusammenfassung 80

Anhang A: Auswertesoftware f¨ur Wellenleitermikroskopie 82 Anhang B: Numerische Simulationen dielektrischer Schichtsysteme 87

Anhang C: Reinigung der Glassubstrate 89

Literaturverzeichnis 89

Danksagung 94

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Einleitung

Die traditionellen Naturwissenschaften Physik, Biologie und Chemie sind in ihrer jüngeren Ent- wicklung zunehmend davon geprägt, daß erst interdisziplinäre Ansätze zu Lösungen aktueller Probleme führen. So ist biologische Forschung ohne die Hilfestellung der Chemie heute nicht mehr denkbar; in manchen Bereichen der Physik gilt dies ebenfalls – man denke an Polymer- oder Oberflächenphysik. Lange Tradition hat der Einsatz physikalischer Methoden in der Bio- logie; das historisch prominenteste Beispiel ist hier sicherlich das Mikroskop, das – methodisch und technisch vielfach weiterentwickelt – auch heute noch zu den wichtigsten Hilfsmitteln gehört.

In dem Maße, in dem in den vergangenen Jahren neue Meßverfahren für kleinste Längen- skalen, wie die Raster-Kraftmikroskopie, entwickelt wurden, arbeitet man daran, diese auch in der Biologie verfügbar zu machen. Ein vorrangiges Ziel ist hierbei, zelluläre Vorgänge untersuchen zu können. Insbesondere im Bereich mechanischer Wechselwirkungen zwischen einer Zelle und ihrer Umgebung können hier vollkommen neue Einblicke gewonnen werden, wie das folgende Beispiel verdeutlicht: Eine Zelle, aufpräpariert auf eine Matrix von Mikronadeln, de- formiert diese während ihrer Bewegungen. Abseits jeder biochemischen Methode lassen sich durch dieses vergleichsweise anschauliche Experiment eine Reihe von Fragestellungen untersuchen. Neben der reinen Kraftmessung, wie sie im Laufe der folgenden Kapitel noch eine zentrale Rolle spielen wird, lassen sich aus der Kraftdichteverteilung Rückschlüsse auf die innere Struktur der Zelle ziehen; es läßt sich durch chemische Modifikation der Nadeloberfläche die Art der Adhäsionsbindung untersuchen; die Dynamik der Kraftentwicklung kann aufgelöst werden. Da es sich bei adhäsionsvermitteltem Zellwachstum und bei Zellmigration um zentrale Eigenschaften lebender Mikroorganismen handelt, die in vielen – gerade auch angewandten – Bereichen eine Rolle spielen, sind durch dieses Experiment, das an verschiedenen Zellarten durchgeführt wurde, wichtige Größen zugänglich, die ein Verständnis der zugrundeliegenden Vorgänge ermöglichen.

Ein populäres Anwendungsgebiet ist hier die Erforschung der neuronalen Regeneration. Vie- le Anstrengungen werden unternommen, um die Frage zu klären, warum zelluläre Regeneration – beispielsweise nach Verletzungen – im zentralen Nervensystem nicht möglich zu sein scheint.

Der Zelladhäsion könnte hierbei eine entscheidende Bedeutung zufallen. Sollte es möglich sein, die beim Zellwachstum auftretenden Kräfte zu messen, könnte die Frage, welche Proteine diese Adhäsion vermitteln, näher untersucht werden. Der Anstoß zu dieser Methodik gab denn auch eine Kooperation zwischen zwei Arbeitsgruppen für Physik und für Neurobiologie.

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Einleitung

Einen Mittelpunkt der Arbeit bilden daher Untersuchungen, die diesem Feld zuzurech- nen sind. Da das Ziel ist, der Biologie eine Methode zur Messung kleinster Kräfte auf mikroskopischer Längenskala zur Verfügung zu stellen, kann diese Methode – die Wellenleiter- Kraftmikroskopie – in Folge aber auch für die Charakterisierung unterschiedlichster Systeme verwendet werden; neben den bereits angesprochenen Zelladhäsionskräften werden in dieser Arbeit vor allem Messungen an Pilzsporen vorgestellt. Nach gängiger Auffassung können Spo- ren zwei unterschiedliche Wege bei der Infektion eines Wirtes gehen: die Schädigung der zu infizierenden Struktur, beispielsweise eines Pflanzenblattes, durch biochemisch-enzymatische Prozesse oder durch mechanische Druckwirkung. Welche Kräfte hierbei wirken können, sieht man am bekannten Beispiel des Pilzes, der durch eine Asphaltdecke zu brechen imstande ist.

Die Frage, welches jedoch der dominierende Mechanismus ist, wird seit langem intensiv disku- tiert. Da viele Schädlinge beim Anbau von Nutzpflanzen eine erhebliche Bedeutung besitzen, sind diese Fragen nicht nur für die Grandlagenforschung interessant, sondern besitzen darüber hinaus auch wirtschaftliche Relevanz.

Bei derWellenleiter-Kraftmikroskopie, die für die speziellen Erfordernisse biologischer Ex- perimente im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt wurde, handelt es sich um eine mi- kroskopoptische Methode, die mithilfe spezieller Meßsubstrate – flexibler, planarer Wellenleiter – hochsensitive Kraftmessungen ermöglicht. Insbesondere die Variabilität des Einsatzbereiches und die Möglichkeit von in-situ-Messungen am lebenden Organismus machen das Verfahren für den biologischen Einsatz interessant.

Die folgende Arbeit gliedert sich in einen methodisch-physikalischen und einen experimentell- biologischen Teil. Während in Kap. 1 die theoretischen Voraussetzungen für das Verständnis der Methode und der biologischen Systeme geschaffen werden, behandelt Kap. 2 die Versuchsauf- bauten, die für die Messungen konzipiert wurden. Es folgt die Darstellung der Experimente zur notwendigen Charakterisierung der Wellenleiter-Kraftmikroskopie sowie der speziell entwickelten Meßsubstrate (Kap. 3) und schließlich die der biologischen Versuche selbst (Kap. 4).

Ein Ausblick auf zuk¨unftige Vorhaben und die Zusammenfassung der Ergebnisse schließen die Arbeit ab.

Teile dieser Arbeit wurden ver¨oﬀentlicht:

• K.–F. Giebel, S. Herminghaus, M. Riedel, P. Leiderer, U. Weiland, M. Bastmeyer,Imaging of Cell/Substrate Contacts of Living Cells with Surface Plasmon Resonance Microscopy, Biophysical Journal 76(1999) 509

• C. Bechinger, K.-F. Giebel, M. Schnell, P. Leiderer, H. B. Deising, M. Bastmeyer,Optical Measurement of Invasive Forces Exerted by Appressoria of a Plant Pathogenic Fungus, Science285 (1999) 1896

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Kapitel 1

Grundlagen

Im ersten Abschnitt diese Kapitels werden die Grundlagen f¨ur das Verst¨andnis der beiden untersuchten biologischen Systeme,

1. Sporen des pﬂanzenpathogenen Pilzes Colletotrichum graminicolaund 2. Oligodrendrocyten des Goldﬁsches

gelegt und erläutert, warum die Kenntnis der Kraftwirkung auf Oberflächen in diesem Zusam- menhang interessant ist. Über alternative Methoden, die zur Kraftmessung eingesetzt wurden, wird ein Überblick gegeben. Da die vorliegende Arbeit eine optische Resonanzmethode zur Kraftabbildung einsetzt, die speziell zur Messung dieser Art Kräfte entwickelt wurde, stellt der zweite Abschnitt relevante Grundlagen der Optik, insbesondere Wellenleiterresonanzen vor.

Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten zweidimensionalen Wellenleiter besitzen eine ela- stische Polymerzwischenschicht, die sie zur Messung von Kr¨aften geeignet machen. Der dritte Abschnitt behandelt daher die daf¨ur wichtigen Eigenschaften von Polymeren.

1.1 Kr¨ afte in biologischen Systemen

1.1.1 Appressorienbildung bei Pilzsporen

In Landwirtschaft und Medizin gleichermaßen gefürchtet sind Infektionen durch Pilzsporen, da sie sowohl bei Nutzpflanzen, bei Tieren und Menschen auftreten können. Um an die Nähr- stoffe im Inneren der Wirts-Pflanzenzellen zu gelangen, muß die keimende Pilzspore deren Zellwand durchdringen. Zur Überwindung dieser Barriere haben Pilze erstaunlich viele invasive Strategien entwickelt, die seit Jahren Gegenstand intensiver Forschung sind. Neben der Grundlagenforschung verspricht man sich hieraus auch mögliche Wege, Pflanzenkrankheiten zu kontrollieren [Men96]. Bei der Infektion wird die Zellmembran entweder durch Sekretion zerset- zender,lysischer Enzyme, durch mechanische Krafteinwirkung oder durch deren Kombination

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uberwunden. Ein wichtiger Weg der Infektion ist das Eindringen in die Pﬂanze, d.h. die Pe- netration, die bei bestimmten Pilzen durch den Aufbau eines außergew¨ohnlich hohen Drucks in sogenannten Appressorien erfolgt. Zur Messung dieses Druckes bieten sich physikalische Methoden an.

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KAPITEL 1. GRUNDLAGEN

Infektionsvorgang

Im folgenden wird der Infektionsvorgang der PilzeColletotrichum graminicola, einem Patho- gen der Maispflanze und Magnaporte grisea, einem Pathogen der Reispflanze, beschrieben (siehe [Men96, How91, How96, Eba98]). Der Infektionsvorgang beider Arten hat große Ähn- lichkeiten, da jedoch Magnaporte grisea die am besten untersuchte Art ist, wird diese, wenn nicht anders erwähnt als Beispiel herangezogen. Die experimentellen Arbeiten haben zwar teilweise an beiden Arten stattgefunden; die im Ergebnisteil vorgestellten Messungen beschränken sich jedoch aufgrund der umfangreicheren Ergebnisse aufColletotrichum graminicola.

Eine Pilzspore, die im trockenen Zustand auf dem Blatt der zu infizierenden Pflanze oder dem Substrat zu liegen kommt, beginnt in feuchter Umgebung zu keimen; d.h. sie bildet schlauchförmige Strukuren, sogenannte Keimschläuche oder Hyphen aus. Deren vorderes En- de, der Apex, sucht eine geeignete Adsorptionsstelle und adhäriert dort. Das Spitzenwachstum der Hyphen wurde bereits 1892 von Reinhardt in [Rei92] beschrieben. Die Adhäsion der Keim- schläuche wird zunächst passiv durch die hydrophobe Wechselwirkung vermittelt, des weiteren sind vermutlich Glycoproteine beteiligt. Im Falle von C. graminicola ist das Enzym Cutinase in der extrazellulären Matrix (ECM), die die Sporen und Keimschläuche bedeckt, vorhanden und trägt zur Adhäsion bei [Men96].

Ist auf diese Weise eine geeignete Position gefunden, stoppt das Wachstum der Hyphe und es bildet sich ein extrem fest haftender Adhäsionsring, der sich sogar durch Ultraschallbehand- lung nicht ablösen läßt [How96]. Nun bildet sich das Appressorium aus, indem das vordere Ende des Keimschlauchs durch Bildung einer Wand abgetrennt wird und das Innere dieser Zelle mit Melanin ausgekleidet wird. Das Melanin ist ein schwarzes Farbpigment, das einerseits die Zell- wand verstärkt, um höhere Drucke auszuhalten und andererseits die Porengröße der Zellwand von 1-2 nm auf <1 nm reduziert [How91]. Durch die Melaninschicht k¨onnen Wasser-, nicht aber größere Moleküle, dringen. In Abb. 1.1 ist links das Bild einer Spore vonC. graminicola abgebildet, in dem neben der Spore dunkel auch das Appressorium zu sehen ist (Pfeil). Die rechte Abbildung zeigt schematisch den Infektionsvorgang.

Die Melaninschicht des Appressoriums, die nur auf der Kontaktfläche zum Substrat fehlt, ist ein wichtiger Bestandteil des Penetrationsvorgangs. Im Innern des Appressoriums (vgl. Schema in Abb. 1.1) werden Osmolyten (es wurden über 3-molare Glycerolkonzentrationen nachgewie- sen [Jon97, Men96]) eingelagert, so daß vermehrt Wasser in die Zelle eindringt. Dadurch baut sich ein sehr hoher osmotischer Druck im Innern auf, der bis zu 80 bar betragen kann.

Schließlich ist der Druck so hoch, daß ihm die Pflanzenzellwand nicht mehr standhält und eine Penetrationshyphe in die Pflanze eindringt. In Abb. 1.2 ist ein Kryoschnitt durch ein M.

grisea-Appressorium gezeigt, dessen Penetrationshyphe durch eine Cellophanmembran dringt.

Nach dem Eindringen in die Pﬂanzenzelle bildet sich am Ende der Hyphe ein Infektionsvesikel, durch den der Pilz das Pathogen in die darunterliegenden epidermalen Zellen schleusen kann.

Biologische Fragestellungen

Aus biologischer Sicht ist nun eine der wichtigsten Fragen, welchen Anteil die mechanische Kraftwirkung, verursacht durch intrazellul¨aren Druck, an der Infektion besitzt. Nach einem

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1.1. KR ¨AFTE IN BIOLOGISCHEN SYSTEMEN

Abbildung 1.1:

Links: Mikroskopaufnahme einer

”bananenf¨ormigen“ Colletotrichum graminicola-Spore.

Der dunkle Fleck rechts von der Spore (Pfeil) ist das Appressorium, das mit einer 100 nm dicken Melaninschicht (schwarze Farbpigmente) ausgekleidet ist. Der horizontale Balken entspricht einer Länge von 10µm. Rechts: Querschnitt durch die Pilzspore auf einer Pflan- zenzelle während des Keim- und Penetrationsvorgangs. Das Appressorium bringt durch Osmose genug Kraft auf, um eine Pflanzenzellwand zu durchdringen [Bec99].

Modell von Wessels [Wes93] hat der hydrostatische Druck im Innern der Hyphe in einer nied- rigen Ausprägung die Aufgabe, das Spitzenwachstum zu unterstützen, indem enzymgefüllte Vesikel in diesen Bereich transportiert werden und die Zellmembran dort erweitern. In seiner höheren Ausprägung ermöglicht dieser Hyphendruck die Penetration der Wirtspflanze und un- terstützt möglicherweise gleichzeitig ablaufende biochemische Prozesse, die zur Auflösung der Zellwand führen. In der Vergangenheit sind zur Untersuchung dieser und ähnlicher Fragen eine Reihe von Meßverfahren entwickelt worden, die von Bastmeyeret al.in einem Übersichtsartikel beschrieben sind [Bas02].

Vom Innendruck der Hyphe kann nicht ohne weiteres auf die Kraftwirkung bei der Pene- tration geschlossen werden, da sich hier die Charakteristik der Pilz-Zellwand, die von vielen Faktoren abh¨angt, auswirkt. Die bisher angewandten Methoden lassen sich daher auch zwei Klassen zuordnen: Messungen des Turgordrucks und Messungen der wirkenden Kr¨afte. Einen Uberblick ¨¨ uber die verschiedenen Verfahren gibt Abb. 1.3.

Bisherige Methoden zur Kraftmessung

Die Methoden zur Messung des Turgordrucks (linke Hälfte der Abbildung) umfassen die Plas- molyse (a), die Schmelzpunkt-Osmometrie (b) und die direkte Druckmessung mittels Mikro- pipette (c). Bei der Plasmolyse wird der Pilz einer hohen Osmolytkonzentration ausgesetzt, was zu einem der drei dargestellten Ergebnisse führt: Plasmolyse tritt auf, wenn der Osmo- lyt durch die Zellwand, nicht aber durch die Plasmamembran diffundieren kann. In der Folge lösen sich die beiden Membranen voneinander. Sind die osmotisch aktiven extrazellulären Mo- leküle zu groß für die Poren der Zellwand, diffundiert Wassser aus der Zelle heraus, was zum Kollaps und der sogenanntenCytorrhyse führt. Bei undurchlässiger Zellwand kann das Phäno-

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Abbildung 1.2: Kryoschnitt

Appressorium mit Penetrationshyphe eines M. grisea, Kryoschnitt (aus [How91a]).

men Kavitation – Gasblasen im Zytoplasma – auftreten. Experimente mit Polyethylenglykol (PEG) verschiedener Molekülgröße als Osmolyt können nun Rückschlüsse auf die Porengröße der Zellwand und über das osmotische Potential den Turgordruck geben (u.a. [Dix99]).

Bei der Schmelzpunkt-Osmometrie nutzt man Zusammenhang zwischen der Schmelzpunkt- verschiebung von Eiskristallen aus Zytoplasma bei veränderter Osmolyt-Konzentration. Der Schmelzpunkt läßt sich mit einer Genauigkeit von 0.01-0.02 K bestimmen, was einer Kon- zentration von 5-10 mmol kg⁻¹ entspricht [Mon96]. Die mithilfe dieser Methode gewonnenen Ergebnisse sind allerdings wenig verläßlich, wie andere Messungen am gleichen System zeigen [How91]. Insbesondere bei melanisierten Zellwänden ist zudem eine exakte Charakterisierung des Schmelzvorgangs kaum möglich.

Die unter (c) gezeigte Methode stellt die einzige direkte Druckmessung dar: Mit einer

ölgefüllten Mikropipette wird die Zellwand des Appressoriums perforiert, wobei ein Teil des Zytosols in die Pipette strömt. Der Druck, der nötig ist, um das Zytosol in die Zelle zurück- zupumpen, sollte dem Innendruck entsprechen.

Die Methoden zur Messung der Kraftwirkung (rechte H¨alfte der Abbildung) umfassen eben-

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a

b

c

d

e

f

g

Abbildung 1.3: Methoden zur Messung des Turgordrucks und seiner Kraftwir- kung

Links: Messungen zur Bestimmung des Turgordrucks. (a) Plasmolyse.(b) Schmelzpunkt- Osmometrie. (c) Direkte Druckmessung. Rechts: Messungen zur Bestimmung der Kraft- wirkung. (d) Agar Penetration. (e) Membran Penetration. (f ) Dehnungsmessung. (g) Wellenleiter-Mikroskopie. Weitere Erkl¨arungen siehe Text; aus [Bas02]

falls indirekte, (Agar- (a) und Membran-Penetration (b)), und direkte Verfahren, (Dehungs- messung(c)) sowie das Thema der vorliegenden Arbeit, die Wellenleiter-Kraftmikroskopie(d).

Die Härte von Wachstumsmedium, das durch Agar-Gel verfestigt wurde, kann mithilfe geeigneter Verfahren gemessen und dazu benutzt werden, das Penetrationsvermögen von Pilzen zu bestimmen. Money hat im Rahmen mehrerer Arbeiten anSaprolegnia ferax gezeigt, daß der Turgordruck die Ursache für das invasive Verhalten der Spore ist (u.a. [Mon95]). Die Methode ist ebenfalls an Humanpathogenen zum Einsatz gekommen, aufgrund der geringen Agarhärte (0.1 MPa bei 8% (w/v) Agar) zur Messung an Planzenpathogenen jedoch wenig geeignet.

Penetrationsversuche an k¨unstlichen Membranen, wie sie bereits vor ¨uber hundert Jah- ren von Miyoshi vorgenommen wurden [Miy95], liefern hingegen eher brauchbare Ergebnisse.

W¨ahrend damals Goldfolien zum Einsatz kamen, die zur Kraft-Kalibrierung mit einer Nadel durchstoßen wurden, werden entsprechende Experimente heute mit Kevlar- und Mylarfolien durchgef¨uhrt, deren mechanische Eigenschaften genau bekannt sind [How91]. Auf diese Mes-

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sungen wird noch in Abschnitt 4.1.4 bezug genommen.

Eine direkte Messung der Kraftwirkung des Appressoriums wird von Johnset al.beschrieben [Joh99]. Ein Siliziumbalken mit aufgedampftem elektro-resistivem Element stellt ein miniatu- risiertes Dehnungsmeßger¨at dar. Die Vorrichtung wird so positioniert, daß Hyphen von A.

bisexualis bei ihrem Wachstumsvorgang den Balken leicht deformieren. Mithilfe des gemessenen elektrischen Widerstands kann die Kraft mit einer Genauigkeit von 1µN bestimmt werden.

BeiA. bisexualis konnte auf diese Weise an großen vegetativen Hyphen eine Kraft von 107µN gemessen werden. Die zitierten Arbeiten von Money et al. legen allerdings nahe, daß Hyphen typischer Gr¨oße eine Kraftwirkung im Bereich von 12µN entfalten, so daß anzunehmen ist, daß die reine Wachstumskraft der Hyphen nicht f¨ur das invasive Verhalten alleine verantwortlich ist.

Bei der Infektion durch pflanzen- und humanpathogene Pilze ist daher weiterhin die Frage offen, welchen Anteil die Kraft gegenüber der enzymatischen Einwirkung auf die Wirtspflanze besitzt. Um die invasiven Kräfte unmittelbar messen zu können, kann nur eine Methode eingesetzt werden, die der Hyphe eine zu penetrierende Oberfläche anbietet, an der sie äquivalent dem natürlichen Fall adhärieren kann. Unter anderem ergibt sich daraus die Anforderung, daß ortsauflösende Messungen möglich sein müssen, da die Kraftverteilung unterhalb des Appres- soriums ebenfalls untersucht werden müßte.

Potential der Wellenleitermikroskopie

Mit der Wellenleiter-Kraftmikroskopie (WLM), die in der vorliegenden Arbeit beschrieben wird, ist eine Methode entwickelt worden, die eine Reihe dieser Anforderungen erf¨ullen kann.

Im folgenden werden einige Aspekte derWLM in einen Kontext zu den bisher bekannten Methoden gesetzt.

Absolute Kraftmessung Bisherige Versuche, diesen Innendruck im Appressorium mithilfe von Mikropipetten zu messen, scheiterten daran, daß die Appressorien bei Verletzung ihrer Wand zerplatzten. Dies verdeutlicht ihren hohen Innendruck. Nur durch eine indirekte Methode der Erhöhung des osmotischen Drucks im extrazellulären Bereich (d.h. außerhalb der Pilzspore) konnte dieser für Zellen ungewöhnlich hohe Druck abgeschätzt werden [How91].

Die in dieser Arbeit entwickelte Methode der Wellenleiterkraftmikroskopie ist geeignet, die absolute Kraft der Appressorien auf einer inerten Oberﬂ¨ache zu messen.

Zeitlicher Verlauf des Druckaufbaus In den bisherigen Experimenten war es nicht m¨oglich,in situden Druckaufbau in einem Appressorium zu verfolgen. Mit dem in dieser Arbeit entwickelten Verfahren kann der Aufbau des Drucks zeitlich verfolgt werden, in Abh¨angigkeit des umgebenden osmotischen Drucks.

Trennung zwischen biologischer Degradation und Appressoriendruck bei In- fektion Bei der Infizierung von Pflanzenblättern werden zusätzlich zur rein mechanischen Kraftwirkung der Penetration Enzyme freigesetzt, die die Zellwand degradieren und somit die Penetration beschleunigen [How91]. Um in Laborexperimenten den Einfluß der Chemie auf

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den Penetrationsvorgang vom rein physikalischen hydrostatischen Druck des Appressoriums zu trennen, sind Oberflächen geeignet, die bezüglich dieser Enzyme inert sind.

Einfluß der Signale der Substratoberfläche auf die Appressorienbildung Si- gnale, die die Appressorienbildung induzieren, sind Kalium- und Calcium-Ionen, Einfachzucker, Acrolein, pH- sowie Temperaturgradienten; ihre Bedeutung ist jedoch bisher unklar. Die Haupt- signale, die die zu infizierende Oberfläche liefert, sind Hydrophobizität, verursacht beispielsweise durch Wachse [Lee93], Härte, bestimmte biochemische Komponenten der Pflanzenober- fläche und ihre topographischen Eigenschaften [Men96].

Durch Variation der Substratoberfläche und anschließender Kraftmessung kann der Einfluß dieser Parameter unabhängig gemessen werden.

Bedeutung des Melanins bei der Infektion Da neben den sogenannten Wildtypen auch Mutanten (durch natürliche Prozesse) und Transformanten (gentechnisch veränderte Typen) der Pilzsporen hergestellt werden können, die keine Melaninwände im Appressorium erzeugen, kann die Bedeutung des Melanins für den Pentrationsvorgang untersucht werden.

Mutanten ohne Melanin sind weder in der Lage, melanisierte Appressorien zu bilden, noch wirken sie pathogen. Erst durch Zugabe von geeigneten Melaninvorstufen wird die melanisierte Appressorienbildung und die pathogene Wirkung wieder hergestellt [Men96]. Dies zeigt sich auch darin, daß nichtmelanisierte Appressorien bei der Punktierung mit einer Mikropipette nicht zerplatzen [How91] und keine Penetrationshyphen ausbilden k¨onnen [Ras89].

In den in dieser Arbeit durchgef¨uhrten Experimenten kann durch Verwendung von nichtme- lanisierten Mutanten der Einﬂuß des Melanins auf die direkte Kraftwirkung gemessen werden.

Eine weitere wichtige Komponente der Zellwand ist das Chitin, das eines der hauptsächlich strukturgebenden Polymere ist. Der Einfluß des Chitins auf die Stabilität der Appressorien von C. graminicola wird durch Verwendung von genetisch transformierten Typen in [Wer02]

untersucht. An diesen Transformanten k¨onnen ebenfalls Kraftmessungen durchgef¨uhrt werden.

1.1.2 Zelladh¨asion

Wie eingangs erwähnt, ist das zweite biologische System, an dem Kraftmessungen mit der hier vorgestellten Methode durchgeführt werden, der Goldfisch-Fibroblast. Hierbei handelt es sich um verhältnismäßig leicht zu kultivierende Zellen des Bindegewebes, die in der Lage sind, selektiv Verbindungen zu einem Substrat aufzubauen und wieder zu lösen. Dieses Verhalten wird als Zell-Matrix-Adhäsion bezeichnet und ist von fundamentaler Bedeutung bei Wachs- tum und Migration der Zelle. Es ist daher nicht verwunderlich, daß diese Adhäsion Gegenstand intensiver Forschung ist, da insbesondere in der medizinischen Forschung das Verständnis des Zellwachstums Voraussetzung ist für Untersuchungen von Wundheilung, Tumorwachstum und neuronaler Regeneration. Die Bedeutung der Zelladhäsion ist insbesondere in der Implantati- onstechnik offensichtlich.

Die bei der Zelladh¨asion auftretenden Kr¨afte sind seit einiger Zeit Gegenstand der For- schung. Zu ihrer Messung wurden bisher verschiedenste Methoden entwickelt, von denen einige in Tabelle 1.1 zusammengefaßt sind.

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Mechanik der Zellmigration

Die gerichtete Bewegung eines wachsenden bzw. migrierenden Fibroblasten hat nach dem Mo- dell von DiMilla [DiM94] ihre Ursache in einem kontinuierlichen Umbau von Aktinfasern im Innern der Zelle (s. Abb. 1.4). Während in Wachstumsrichtung Aktinfilamente auf- und im hinteren Bereich der Zelle abgebaut werden, vermitteln Adhäsionsmoleküle der Zellmembran, die an diese Filamente angekoppelt sind, die Adhäsion zur extrazellulären Matrix. Bei den Mo- lekülen handelt es sich um transmembrane Glycoproteine wie Integrin, die zu Liganden der extrazellulären Matrix (Kollagen, Laminin, Fibronektin) Verbindungen ausbilden können. Die dabei auftretenden Zugspannungen werden auf das Zytoskelett übertragen und führen zu einer Vorwärtsbewegung der Zelle.

Abbildung 1.4:Wachstums- bewegung der Zelle Nach DiMilla [DiM94] bildet die Zelle an ihrem vor- deren Ende ein Lamellipodi- um, indem in Wachtumsrich- tung Aktinfilamente auf- und am hinteren Ende der Zel- le abgebaut werden. Integrin- rezeptoren in der Zellmem- bran vermitteln die Adhäsi- on zur extrazellulären Ma- trix und können über ange- koppelte Aktinfilamente Zug- spannungen auf das Zytoske- lett übertragen, die in einer Vorwärtsbewegung der Zelle resultieren.

Bedeutung der Adh¨asionskr¨afte

Den Adhäsionskräften fällt somit eine maßgebliche Rolle bei der Zellbewegung zu. Dies wird bereits dadurch deutlich, daß ein Überleben der Zellen in Kultur kaum mehr möglich ist, wenn ihnen keine Möglichkeit des Adhärierens angeboten wird. In der Literatur finden sich eine Reihe von Untersuchungen über die Reaktion von Zellen auf unterschiedlich adhäsive Oberflächen;

in der Regel durch chemische oder mechanische Modifikation (z.B. [Bur95]). Es liegt daher nahe, die Adhäsion als Wachstumsfaktor auch quantitativ zu untersuchen. In der Tat sind dazu bereits viele Arbeiten geleistet worden; der folgende Abschnitt und die Tabelle 1.1 geben hierüber einen Überblick .

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1.2. GRUNDLAGEN DER WELLENLEITEROPTIK

Analog zu den Methoden der Pilzkraftmessungen des vorigen Abschnitts können auch hier direkte und indirekte Kraftmessungen unterschieden werden. Zu den indirekten gehören das Abspülen mittels eines Flüssigkeitsstrahles und anschließendem Zählen der verbliebenen Zellen ([Rub81] u.a.); diese Messungen gehören zu den ersten, bei denen unterschiedliche Beschichtungen verglichen wurden. Das Ablösen der Zellen durch Zentrifugieren ermöglicht die genauere Bestimmung der dazu nötigen Kräfte (Thoumine et al. [Tho96]).

Direkte Messungen der Kräfte bedienen sich häufig Cantilevern von Kraftmikroskopen.

Yamamoto [Yam98] oder Sagvolden [Sag99] haben auf diese Weise die Ablösekräfte von Fi- broblasten, bzw. Krebszellen bestimmt. Ganze Arrays von Cantilevern dienten Galbraith und Sheetz [Gal97] zur Vermessung von Fibroblasten. Da hier nicht dieAblösekräfte gemessen werden, sondern die Kräfte, die beim Wachstum der Zellen auftreten. Die Fibroblasten bewegen sich dabei über das Array hinweg und verschieben die Spitzen lateral.

Eine weitere Gruppe von Kraftmessungen nutzt Meßsubstrate, die - zumindest was deren präparativen Aufbau betrifft - denen in der vorliegenden Arbeit verwendeten ähnlich sind. Es handelt sich um flexible Silikonoberflächen, auf denen die Zellen präpariert werden. Zugspan- nungen, die auf das Substrat ausgeübt werden, führen zu Faltenwurf der Oberfläche. Harris et al. konnten daraus mit entsprechenden Modellen des Polymerverbunds die Kraftdichten er- rechnen [Har80]. Erweitert wurde diese Methode von Jacobsen, der Latex-Kügelchen in das Substrat einbrachte, um die auftretenden Kräfte besser visualisieren und quantifizieren zu können [Lee94].

Tabelle 1.1 gibt über die angesprochenen Arbeiten einen Überblick und stellte typische Meßergebnisse vor. Es wird deutlich, daß – abhängig vom jeweiligen System, aber auch von der Methode – die gemessenen Werte um mehrere Größenordnungen variieren können; um verläßliche Angaben über Adhäsionskräfte machen zu können, muß die gewählte Methode aber sensitiv bis in den unteren Nanonewtonbereich sein.

Ein weiterer interessanter Aspekt ist, daß alle Methoden lediglich Scherkräfte, die tangential zur Substratoberfläche wirken, untersuchen. Wie aus dem vorigen Abschnitt bekannt ist, treten aber gerade bei adhäsionsvermitteltem Wachstum Normalkräfte auf, die hier vernachlässigt werden. Wie im nächsten Abschnitt gezeigt wird, kann die Wellenleiterkraftmikroskopie diese Lücke schließen und hochauflösende Kraftmessungen ermöglichen.

1.2 Grundlagen der Wellenleiteroptik

Physikalische Grundlage der Wellenleiterkraftmikroskopie ist die Lichtleitung in planaren Wel- lenleitern (vgl. Abb. 1.5). Das planare Schichtsystem besitzt eine deformierbare Zwischen- schicht, in der das Licht geführt wird. Die Charakteristik der Lichtleitung wird durch die De- formation dieser Schicht beeinflußt. Sind nun die beteiligten Parameter optische Eigenschaften des Schichtsystems und mechanische Eigenschaften des Wellenleiters bekannt, dann kann von der Charakteristik der Lichtleitung wieder rückgeschlossen werden auf die Deformation und damit auf die wirkende Kraft. In den nächsten beiden Abschnitten werden daher einerseits die Entstehung resonanter Eigenschwingungen und andererseits die mechanischen Eigenschaften des Wellenleiters, bzw. des in diesem Zusammenhang wichtigsten Teils, der Polymerschicht,

(18)

Zellart Methode Messwert Autoren

Gewebezellen Abl¨osen (0.1–10µN)/µm² [Opa87]

Am¨oben Abl¨osen 0.1–1 nN/µm² [Opa87]

Lymphocyten Abl¨osen ≤0.5 nN/µm² [Sun92]

Epithelzellen Zentrifugieren ≥100 nN [Tho96]

Fibroblasten Abl¨osen 300–400 nN [Yam98]

Krebszellen Abl¨osen 19–204 nN [Sag99]

Fibroblasten Cantileverarray 0.79–3.91 nN/µm² [Gal97]

Fibroblasten Faltenwurf 200 nN [Har80]

Keratocyten K¨ugelchen 25 nN [Lee94]

Keratocyten Glasnadel 45–60 nN [Oli95]

Fibroblasten Faltenwurf 20–25 nN [Bur97]

Fibroblasten Faltenwurf 300-500 nN [Bur97]

Fibroblasten Nadelarray 10-50 nN [Tan03]

Tabelle 1.1: Zusammenstellung verschiedener Veröffentlichungen zu Zelladhäsionskraft- messungen

beschrieben.

Abbildung 1.5: Planarer Wellenleiter

Eingekoppeltes Licht propa- giert aufgrund von Total- reﬂexion an zwei planaren Fl¨achen (

”zig-zag mode“).

Diese Lichtleitung in einem Wellenleiter kommt allgemein dadurch zustande, daß ein höher- brechender Kern von einem niedrigerbrechenden Mantel umgeben ist. Das führt dazu, daß Licht, das sich innerhalb des Kerns ausbreitet, oberhalb eines bestimmten Winkels (Grenzwin- kel der Totalreflexion) nicht mehr aus dem Kern austreten kann. Bei parallelen Grenzflächen entstehen zusätzlich dazu Randbedingungen für resonante Eigenschwingungen, die Wellenlei- termoden, die sich innerhalb des Wellenleiters ausbreiten. Wie bei allen Resonanzphänomenen führt dieser kollektive Zustand dazu, daß die Feldstärke innerhalb des Resonators stark an- steigt und auf diesen lokalisiert ist. Das bekannteste Beispiel für den technischen Einsatz dieses Phänomens ist sicher die Glasfasertechnik. Insbesondere, wenn die Glasfaser mit einer Reonanzfrequenz betrieben wird, ist es möglich, Licht nahezu verlustfrei über hunderte von Kilometern zur Nachrichtenübertragung zu leiten.

(19)

1.2.1 Entstehungsbedingungen der Wellenleitermoden

Während die Ausbreitung von Licht bei Glasfaserleitung im Bild der geometrischen Optik noch anschaulich ist, muß zum Verständnis der Modenanregung das wellenoptische Bild herangezogen werden. Da der Wellenleiter in x-, sowie y-Richtung translationsinvariant ist, können diese Komponenten der Wellenvektoren kontinuierliche Werte annehmen. Für die Normalen- richtung des Schichtsystems gilt dagegen die Randbedingung 0 ≤ z ≤ d, die dazu f¨uhrt, daß die z-Komponente des Wellenvektors nur quantisiert vorkommen kann. Eine resonante Eigenschwingung kann dann entstehen, wenn die Dicke d der Schicht, in der Lichtausbreitung möglich ist, ein ganzzahliges Vielfaches m der halben Wellenlängeλz/2in z-Richtung ist:

d+λz·Φ_θ,p,s

2π =m·λz

2 , (1.1)

mit Schreibweise der Komponenten des Wellenvektors

kzd+ Φθ,p,s=m·π (1.2)

Der SummandΦ_θ,p,s berücksichtigt bereits einen eventuellen Phasensprung an der Grenz- fläche zu einem optisch dichteren Medium, wie es der in unseren Versuchen verwendete metalli- sche Wellenleiter darstellt. Die z-Komponentekzdes Wellenvektors ergibt sich, wie in Abb. 1.6 schematisch dargestellt, geometrisch aus dem Einfallswinkel θdurch kz =kcosθ.

Abbildung 1.6: Strahlen- geometrie im Wellenleiter Das Schichtsystem besteht aus drei Schichten mit den unterschiedlichen Brechungs- indizes n₁ und n₂. Die beiden Grenzflächen im Abstand d führen zu einer Quantisie- rung des z-Vektors der propa- gierenden Welle

k

_z

n

₁

n

₂

k d θ x

z y

Da der PhasensprungΦ_θ,p,s abhängig ist von WinkelΘsowie der Polarisationsrichtung des einfallenden Lichts [Bor91], ergibt sich für p-polarisiertes Licht (elektrischer Feldvektor parallel zur Einfallsebene) eine andere Resonanzbedingung als für s-polarisiertes Licht (Feldvektor senkrecht zur Einfallsebene).

Aus Gleichung 1.2 kann bereits der Zusammenhang zwischen Einfallswinkel und Reso- nanzminimum abgelesen werden, der dazu benutzt wird, die Meßwerte in Deformation des Wellenleiters und damit in eine Kraft umzurechnen.

Das Brechungsverhalten des Lichts an einer Grenzﬂ¨ache (einfallende Seite i, transmittie- rende Seite t), das durch das Snellius-Gesetz beschrieben wird

(20)

nisinθi =ntsinθt, (1.3)

l¨aßt sich aus den f¨ur die Wellenoptik grundlegenden Maxwell-Gleichungen in Materie

divB = 0 (1.4)

rotE+1 c

∂B

∂t = 0 (1.5)

divD = 4πρ (1.6)

rotH−1 c

∂D

∂t = 4π

c j (1.7)

herleiten ([Hec89] u.a.), indem als zusätzliche Randbedingung die Stetigkeit der Normal- komponenten vonE- undB-Feld gesetzt wird. Lösung der Maxwell-Gleichungen für eine ebene Welle an einer Grenzfläche sind die Fresnel-Gleichungen (1.8 ff.), die die Amplitudenverhält- nisse zwischen einfallender (i), reflektierter (r) und transmittierter (t) Welle für p-() und s-Polarisation (⊥) angeben.

r ≡ Er

Ei

=

√tcosθi− √icosθt

√tcosθi+√

icosθt

(1.8)

t≡ Et

Ei

= 1−r (1.9)

r_⊥≡ Er

Ei

⊥

=

√icosθi− √tcosθt

√icosθi+√

tcosθt

(1.10)

t⊥≡ Et

Ei

⊥

= 1−r⊥. (1.11)

Die optischen Eigenschaften der beteiligten Schichten werden durch die Dielektrizitätskon- stanteniundtbeschrieben, die im allgemeinen komplexwertig sind und mit dem Brechungs- index über die Maxwell-Relation n ≡ √i zusammenhängen. Insbesondere bei Metall spielt der Imaginärteil der Dielektrizitätskonstanten eine Rolle, da er die Absorption aufgrund der endlichen ohmschen Leitfähigkeit beschreibt. Die Fresnel-Gleichungen können dazu benutzt werden, die Intensität des transmittierten und reflektierten Lichts zu berechnen. Üblicherweise wird dazu der Transfermatrix-Formalismus eingesetzt, der sowohl in kommerziell erhältlichen Programmpaketen als auch in der von M. Ochmann entwickelten Simulationssoftware eingesetzt wird [Och99]. Hierzu sei auch auf Anhang B verwiesen. Das Programm von M. Ochmann bildet die Grundlage für die hier durchgeführten numerischen Berechnungen und Simulationen.

Mit Hilfe dieses Werkzeuges ist es nun möglich, die Anregung von Eigenschwingungen innerhalb des Schichtsystems anhand der reflektierten Intensität zu erfassen. Diese Intensität

(21)

Abbildung 1.7: Reflekti- vität eines Wellenleiters Numerische Simulation eines Schichtsystems Glas/- Al(5nm)/PDMS(2µm)/- Al(5nm) in Abhängigkeit des Licht-Einfallswinkels.

Bei zunehmender Dicke der PDMS-Zwischenschicht verdichtet sich die Folge der Resonanzen. Die Reﬂekti- vit¨at ist hier auf 1 normiert.

Abbildung 1.8: Dicken- abh¨angigkeit

Numerische Simulationen der Resonanzwinkel-Positionen bei Variation der Dicke der lichtleitenden Zwi- schenschicht; ansonsten wurde das Schichtsystem aus Abb. 1.7 angenommen.

Bei zunehmender Dicke werden zus¨atzliche Minima sichtbar, die sich dann zu gr¨oßeren Winkeln verschieben. Die durchgezogenen Linien entsprechen dem p-polarisiertem, die gestri- chelten dem s-polarisiertem Licht.

sollte als Funktion des Licht-Einfallswinkels und der Dicke der dielektrischen Zwischenschicht Resonanzabsorption zeigen. In der Tat zeigt die entsprechende Simulation ein interferenztypi- sches Muster (vgl. Abb. 1.7); in der gezeigten Abbildung wurde eine Schichtdicke von 2µm Poly-Dimethylsiloxan angenommen. Charakteristisch ist hier die abnehmende Breite der Re- sonanzen mit zunehmendem Modenindex. Wie zu erwarten, liegen bei dickerer lichtleitender Zwischenschicht die Resonanzen enger beisammen. In Abb. 1.8 schließlich ist die Position der Resonanzminima gegen die Dicke der Zwischenschicht aufgetragen. Da mehrere Resonanzen auftreten, liegen hier viele Kurven ¨ubereinander; es ist zu erkennen, daß mit zunehmender Dicke

(22)

weitere Resonanzen von kleinen Winkeln her erscheinen und zu größeren Winkeln sich verschieben. Aus den beiden hier gezeigten Abbildungen wird deutlich, daß es für besonders sensitive Dickenmessungen aufgrund der großen Steigung in diesem Bereich zwar nützlich sein kann, ein Resonanzminimum bei kleinen Einfallswinkeln zur Bestimmung zu nutzen, es andererseits sich hier um relativ breite Resonanzen handelt, die entsprechend schwierig zu lokalisieren sind. Auf diesen Aspekt wird in Kap. 3 eingegangen.

1.2.2 Modenbreite und Lauﬂ¨ange

Die innerhalb des WL angeregte Wellenleitermode besitzt aufgrund von ohmscher Dämpfung und Streuung nur eine begrenzte Lebensdauer und zerfällt mit einer charakteristischen Halb- wertsbreite. Die Lebensdauer entspricht einer Lauflänge, die wiederum für mikroskopische An- wendungen von Bedeutung ist, da sie das Auflösungsvermögen der Methode begrenzt. Sie soll daher mithilfe der Frequenz-Zeit-Unschärferelation

∆τ∆ω = 1 (1.12)

⇔∆τ = 1

c∆k₀ (1.13)

abgeschätzt werden, wobei∆τ die Lebensdauer der Moden,ω die Frequenz undcdie Lichtge- schwindigkeit im Dielektrikum bedeuten. In der Zeit ∆τ legt das Licht die mittlere Lauflänge Ly zurück, so daß folgt:

Ly = c∆τ (1.14)

= 1

∆k0 (1.15)

Aus dem geometrischen Wellenleitermodell des Abschnitts 1.2.1 kann nun f¨ur kleine Winkel der Zusammenhang zwischen Wellenvektor∆k und Resonanzbreite∆Θ zu

∆k=k₀cos(Θ)∆Θ (1.16)

angenommen werden, woraus sich der Zusammenhang zwischen Resonanzbreite und Lauﬂ¨ange ergibt:

Ly = 1

∆k = 1

k0cos(Θ)∆Θ . (1.17)

1.3 Polymere

Der wichtigste Teil der Wellenleiter ist die flexible, lichtleitende Zwischenschicht, die aus einem visko-elastischen Polymer besteht. Von ihren mechanischen Eigenschaften hängt ab, in welchem Maße der Wellenleiter auf äußere Kräfte reagiert.

(23)

1.3. POLYMERE

1.3.1 Was sind Polymere?

Polymere sind kettenförmige Makromoleküle, die aus Monomeren ihrer Grundeinheit aufgebaut sind. Als Beispiel ist in Abb. 1.9 a das Monomer des Polydimethylsiloxans (PDMS) dargestellt, das in dieser Arbeit verwendet wurde. Die Bindung jedes Monomers hat bezüglich der nächsten Bindung einen festen Winkel, den sogenannten Valenzwinkel. Dieser ist jedoch räumlich frei um die Valenzbindung drehbar (siehe Abb. 1.9). Dies ermöglicht, daß die Polymerkette eine große Zahl an Konformationen einnehmen kann, die sich energetisch wenig unterscheiden. Dies führt zu den besonderen Eigenschaften der Polymere, wie z.B. ihrer hohen Flexibilität und die Gummielastizität.

Abbildung 1.9:

Links: Monomer des Po- lydimethylsiloxans (PDMS).

Rechts: der Valenzwinkel zwischen zwei Monomeren ist nahezu starr; um die Valenz- bindung sind freie Drehungen m¨oglich. Dies verursacht die Flexibilit¨at der Polymerkette.

Wenn einzelne Monomere mehr als zwei funktionelle Gruppen besitzen, können Verzwei- gungen zwischen den Ketten geknüpft werden, d. h. das Polymer wird vernetzt. Dies geschieht durch Erzeugung von Radikalen, beispielsweise durch UV-Bestrahlung oder durch chemische Reaktionen. In der vorliegenden Arbeit wurden diese beiden Methoden verwendet, um die vis- koelastischen Eigenschaften der Polymerschicht zu beeinflussen. In Abb. 1.10 ist schematisch eine Ansammlung von Kettenmolekülen dargestellt. Links sind die Polymere verschlauft, rechts sind sie durch chemische Bindung vernetzt.

Abbildung 1.10:

Verschlaufung (links) und Vernetzung (rechts) von Ket- tenmolek¨ulen (aus [IFF91]).

(24)

1.3.2 Mechanische Eigenschaften von Polymeren

Die Reaktionen von Festkörpern und Flüssigkeiten - also auch von Polymeren - auf äuße- re mechanische Kräfte bzw. Spannungen (Kraft/Flächeneinheit) bewegen sich zwischen zwei Extrema: ideal elastisches und ideal viskoses Verhalten. Reale Körper weisen immer beide An- teile auf [Eli72]. Unter ideal elastischem Verhalten versteht man, daß ein unter einer Kraft deformierter Körper nach dessen Entfernen

”sofort“ in den Ausgangszustand ohne bleibende Verformung zur¨uckkehrt; das beinhaltet, daß die Zeitdauer der Kraftwirkung keine Rolle spielt.

Außerdem besteht f¨ur kleine Deformationen ein linearer Zusammenhang zwischen mechanischer Spannung und Deformation, d. h. es gilt ein Hookesches Gesetz.

Viskose Substanzen dagegen verformen sich durch mechanische Spannungen irreversibel.

Ideal viskose Körper oder sogenannte Newtonsche Flüssigkeiten wie z. B. Wasser fließen durch ihr eigenes Gewicht. Dabei ist die Verformungsgeschwindigkeit proportional zur auftretenden mechanischen Spannung, nicht aber (wie im elastischen Fall) zur Verformung selbst.

Bei Polymeren treten beide Eigenschaften auf, so daß man von viskoelastischem Verhalten spricht.

Elastizität Bei der Dehnung von vielen Festkörpern (z. B. Metallen) tritt eine rücktrei- bende Kraft auf, die energetischer Natur ist. Bei der Verformung werden die interatomaren Abstände des Kristalgitters geändert, wozu große Kräfte erforderlich sind. Die zugehörigen Elastizitätsmodule sind groß und die Körper kühlen sich beim Ausdehnen ab. Die reversiblen Deformationen sind auf kleine Ausdehnungsfaktoren begrenzt.

Im Vegleich dazu zeigen Polymere einen anderen Elastizitätstyp, die sogenannte Entropie- oder Gummielastizität. Beim Ausüben einer mechanischen Spannung auf einen Polymerkörper können die einzelnen Kettenmonomere sich gegeneinander drehen, ohne ihre Bindungslänge zu ändern. Dies führt bei einer Dehnung dazu, daß der sonst bevorzugte verknäulte Zustand gestreckt wird. Diese Streckung ist mit einer Entropieabnahme verbunden. Die rücktreibende Kraft ist im Fall von Polymeren also vorwiegend entropischer Natur und hat zur Folge, daß die E-Module um Größenordnungen kleiner sind und sich die Polymere beim Dehnen erwärmen.

Bei Polymeren, die in diesem Zusammenhang auch Elastomere genannt werden, kann man hohe reversible Verformungen beobachten. Dazu müssen die Polymere schwach vernetzt sein und sich oberhalb ihrer Glastemperatur befinden. Sind die Deformationen jedoch zu groß, dann ist das Verhalten nicht mehr ideal elastisch. Nach dem Entfernen einer Last bleiben die Körper etwas verformt.

Retardation von Polymeren - Kalter Fluß Bei Polymeren wird der Effekt beobachtet, daß es bei einer konstanten Spannung eine Zunahme an Deformation geben kann. Häufig findet man z. B., daß bei der Entfernung einer Belastung nur ein langsamer Rückgang der Deformation auftritt, wobei die Probe u. U. wieder in den Ausgangszustand zurückkehrt. Dieses Kriechen oder Nachfließen des Materials wird auch als

”kalter Fluß“ bezeichnet [Eli72] und wird auch an den in dieser Arbeit untersuchten Wellenleitern beobachtet (siehe Kap. 3.8).

Da die Probe mehr oder weniger wieder in ihren Ausgangszustand zurückkehrt, ist nach [Eli72] das im folgenden beschriebene Modell mit einer verzögerten Elastizität (im Gegen- satz zu einem Modell, das durch viskosen Fluß bestimmt ist) geeignet, dieses Verhalten zu

(25)

1.3. POLYMERE

beschreiben. Dabei werden ein elastisches Element (Hookesche Feder) und ein Newtonsches Reibungselement parallel geschaltet. Das Kriechen wird als eine Deformation unter konstanter Spannung aufgefaßt und die einzelnen Beiträge von Elastizität und Viskosität addiert:

σ=σe+ση =G·γ+η·(dγ/dt)

wobeiσ,σe undση die Gesamtspannung, die Spannung des Hookschen Elements bzw. des viskosen Elements, G den Elastizitätsmodul, η die Viskosität und γ die Auslenkung bezeichnet. Integriert man diese Gleichung bei konstanter Spannung σ₀ und setzt τ = η/G als die Retardationszeit, dann ergibt sich folgender exponentieller Rückgang der Auslenkung:

γ = (σ₀/G)·[1−exp(−t/τ)] (1.18)

Dieser Zusammenhang wird f¨ur die verwendeten Wellenleiter in Kap 3.8 best¨atigt.

(26)

Kapitel 2

Experimenteller Aufbau und Wellenleiter–Pr¨ aparation

Im Rahmen dieser Arbeit wurden einerseits verschiedene Aufbauten zur Durchführung der biologischen Versuche sowie zur Vermessung von Wellenleitereigenschaften realisiert, andererseits dafür nötige neuartige Substrate entwickelt, die sich dazu eignen, Kräfte in biologischen Systemen zu vermessen. Im vorliegenden Kapitel werden nach einer Zusammenfassung der Anforderungen an die Methode drei verschiedene Typen von Wellenleitermikroskopen vorgestellt, die wahlweise den Orts– oder den k–Raum abbilden; ein 2D–Ortsraum–Aufbau, ein 1D–Orts–1D–k–Raum–Aufbau, sowie ein rein den Fourierraum abbildendes Mikroskop.

Weiter werden die zur Pr¨aparation der Wellenleiter n¨otigen Schritte sowie die bei Ablauf des Experiments und Auswertung der Daten verwendete Software vorgestellt. Der letzte Abschnitt beschreibt einen typischen Versuchsablauf an einem biologischen System.

2.1 Anforderungen an die Methode

Versuche an biologischen Systemen mit neuen physikalischen Methoden stehen im Spannungs- feld zwischen den Anforderungen an den Umgang mit

”lebenden Proben“ und den Erfor- dernissen, die die Präparation von hochsensitiven Meßsubstraten mit sich bringen. Einerseits müssen die Umgebungsbedingungen des Präparats so gestaltet werden, daß die Meßgrößen (hier Adhäsions– und Penetrationskräfte) nicht beeinflußt werden, andererseits sind typische

”nicht sterile“ Pr¨aparationsmethoden der Physik wenig f¨ur diese Anforderungen geeignet, die Kulturmedien, Brutschranklagerung, etc. erforderlich machen.

Aus biologischer Sicht müssen folgende Parameter bei der Durchführung der Versuche kontrolliert werden können:

– Zusammensetzung des Kulturmediums – Lichtst¨arke, Temperatur

– Sterilit¨at

(27)

2.1. ANFORDERUNGEN AN DIE METHODE

– chemische und topographische Eigenschaften der Substratoberﬂ¨ache

Insbesondere gilt dies für die im Experiment teilweise verwendeten Fisch-Zellkulturen, bei denen eine Reihe von Vorarbeiten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden müssen; ge- ringere Ansprüche an die Umgebungsbedingungen stellen hingegen die untersuchten Pilzsporen.

Ziel der Messungen ist es, die Kraftwirkung von einzelnen Unterstrukturen des biologischen Pr¨aparates zu messen. Zur Interpretation der Ergebnisse ist es daher notwendig, gleichzeitig mit den Bildern desWLM auch lichtmikroskopische Aufnahmen am gleichen Ort zu machen.

Dies stellt einige physikalisch-technische Anforderungen an das zu entwickelnde Mikroskop:

– Der gesamte Wellenleiteraufbau muß an ein Lichtmikroskop angeschlossen werden k¨onnen und damit stark miniaturisiert sein.

– Die Fokusebenen von Licht- und Wellenleitermikroskop m¨ussen aufeinanderliegen und lokal korrelierbar sein, um die gleichen Strukturen abbilden zu k¨onnen.

– Aufgrund der für Zellmikroskopie notwendigen hohen Vergrößerung und des daraus re- sultierenden kleinen Bildausschnitts muß das Meßsubstrat in der x-y-Ebene verschiebbar sein; realisiert wird dies durch die Verwendung eines Kreuztisches für die Mikroskopie.

– Um Resonanzkurven durchfahren und dabei lokale Zuordnung leisten zu können, darf sich der aufgenommene Bildausschnitt des Wellenleiterbildes weder bei der Winkelverstellung noch bei längeren Beobachtungsdauern verändern.

– Zur Kultivierung der biologischen Systeme muß ein Substrat gewählt werden, das einerseits Adhäsion und Wachstum ermöglicht, andererseits als Deckschicht des Wellenleiters geeignet ist. Es zeigt sich, daß damit bereits eine wesentliche Einschränkung auf bestimmte Metalle verbunden ist.

Die zu entwickelnden Wellenleiter müssen einerseits optisch und mechanisch homogen sein, andererseits sollen die mechanischen Eigenschaften durch den Herstellungsprozeß variiert werden können. Da sich die Kraftwirkungen von Pilzsporen und Zellen um mindestens drei Größenordnungen unterscheiden, muß die Kraftantwort des WL auf die zu erwartende Kraft angepaßt werden. Dies geschieht durch die gezielte Beeinflussung der verwendeten Materialien (Polymere, Metallschichten) während ihrer Präparation.

Eine zusätzliche Anforderung der biologischen Proben an das Metall-Polymer-Metall–- Schichtsystem ist, daß ihre Deckschicht Adhäsion und Wachstum ermöglicht. Neben der Ver- wendung geeigneter Metalle kann dies auch erreicht werden, indem die Oberfläche mit spezi- fischen adhäsionsvermittelnden Molekülen beschichtet wird.

Im folgenden werden drei verschiedene Bauformen von WL-Mikroskopen beschrieben, die im Rahmen dieser Arbeit entstanden sind und mit denen vergleichbare Proben charakterisiert werden konnten. Diese drei unterschiedlichen WL-Mikroskope wurden entwickelt, da der zuerst

(28)

KAPITEL 2. EXPERIMENTELLER AUFBAU UND WELLENLEITER–PR ¨APARATION

konstruierte abbildende Versuchsaufbau (Kap. 2.2) zwar zusammen mit dem lichtmikroskopischen Bild unmittelbare Informationen über die untersuchten Strukturen liefern kann, aber in bezug auf die Abbildungsqualität systembedingte Mängel hat. Aus diesem Grund hat es sich als vorteilhaft erwiesen, zusätzlich die in 2.3 und 2.4 vorgestellten Aufbauten zu verwenden, die über einen anderen Bildentstehungsvorgang verfügen. Jede der Bauformen bietet charakteristische Vorzüge, die abhängig vom durchzuführenden Experiment ausgenutzt werden können und auf die in Kapitel 3 im Detail eingegangen wird. Vergleichsmessungen an allen Bauformen ermöglichen Untersuchungen der Grenzen der WLM.

Die drei verschiedenen WL–Mikroskope unterscheiden sich im optischen Strahlengang und der Bildentstehung, was sich in den im weiteren Verlauf verwendeten Bezeichungen

”Abbilden- des WLM“ – analog zu dem den Ortsraum abbildenden Mikroskop –,

”Linienfokus–WLM“ – das eine Orts- und eine Dimension des k-Raumes abbildet – sowie

”Punktfokus–WLM“ – das zwei Dimensionen des k-Raumes abbildet – ausdr¨uckt.

2.2 Das abbildende Wellenleitermikroskop

Der Aufbau des abbildenden Wellenleitermikroskopes mit variablem Einfallswinkel orientiert sich an einem Aufbau zur Anregung von Oberﬂ¨achenplasmonen, der sogenanntenKretschmann–

Konfiguration. Dieser wurde erstmals von [Kre71] beschrieben und besteht aus einem Glaspris- ma zur Einkopplung des anregenden Lichtes, auf dessen Hypotenuse die lichtleitende Schicht aufgebracht ist, sowie in unserem Fall aus zwei beweglichen Armen für Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang, die sich kreisförmig um eine Achse in Hypotenusenebene des Pris- mas drehen können. Durch eine entsprechende Mechanik ist gewährleistet, daß sich der Arm des Abbildungsstrahlengangs entsprechend dem des Beleuchtungsstrahlengangs bewegt. Ge- nau genommen könnte bei Resonanzwinkeln unterhalb des Grenzwinkels der Totalreflexion im Gegensatz zum Kretschmann–Aufbau auf das Prisma verzichtet werden; aus Gründen der Abbildungsqualität wurde es jedoch ebenfalls verwendet.

In Abbildung 2.1 ist der Aufbau des realisierten WL–Mikroskops dargestellt. Eine Laserdi- ode ¹ der Wellenlänge 670nm (LD) erzeugt über ein Linsensystem (BE) einen aufgeweiteten, parallelen Laserstrahl, der auf einen Spiegel trifft. Dieser Spiegel kann durch einen Schrittmo- tor um eine in seiner Ebene liegende Achse rotiert werden, so daß der Strahl um einen exakt bekannten Winkel abgelenkt wird. Eine nachfolgende Teleskopoptik (L₁ und L₂,f₁= 50mm, f2 = 40mm) in Verbindung mit einem Polarisator (P) hat zur Folge, daß der aufgeweitete Laserstrahl in p-Polarisation eine feste Stelle auf dem Wellenleiter unter verschiedenen Winkeln beleuchtet.

Im Unterschied zur ursprünglichen Kretschmann-Konfiguration wird der Wellenleiter nicht direkt auf das Prisma präpariert, sondern auf ein Mikroskopiedeckglas, das mit Immersionsöl optisch an das Prisma angekoppelt wird. Das hat den Vorteil, daß die biologische Probe auf dem Deckglas separat präpariert werden kann und erst vor Beginn der Messungen in das Mi- kroskop eingebracht wird. Beim Immersionsöl muß darauf geachtet werden, daß es den gleichen Brechungsindex besitzt wie das für Prisma und Deckglas verwendete Glas, da sich innerhalb

110 mW, Fa. Laser 2000

(29)

2.2. DAS ABBILDENDE WELLENLEITERMIKROSKOP

Abbildung 2.1: Aufbau des abbildenden Wellenleitermikroskops

Das monochromatische Licht einer Laserdiode (LD) wird durch eine Optik (BE) aufge- weitet und parallelisiert und von einem rotierbarem Spiegel durch Teleskop (L1, L2) und Polarisator (P) auf die Hypotenusenseite des Prismas geleitet, auf der die zu untersuchende Probe liegt. Das reﬂektierte Licht wird mit einer Mikroskopoptik (L3 und L4) auf die CCD–Kamera abgebildet. Oberhalb der Probe ist schematisch das Licht–Mikroskop zu sehen (L5).

des Spaltes sonst ebenfalls Resonanzen in Form von st¨orenden Newtonschen Ringen ausbilden.

Da die Metallschicht zwischen Glas und Polymer sehr dünn (5-8 nm) und damit deutlich kleiner als die Abklinglänge des Feldes gewählt wird, kann dieses bei erfüllter Resonanzbedin- gung (s. Kap. 1.2) Wellenleitermoden anregen. Eine Resonanz manifestiert sich darin, daß das Licht an dieser Stelle nicht total reflektiert wird. Im Bild auf der CCD–Kamera, das durch den Abbildungsstrahlengang der Linsen L3 und L42 erzeugt wird, ist es dunkel. Durch den Hell–

Dunkelkontrast an verschiedenen Stellen erhält man die Tiefe der Resonanz. Bei Variation des Einfallswinkels verändern sich die Helligkeitsverhältnisse entsprechend der Resonanzbedingun- gen.

Mithilfe des computergesteuerten Schrittmotors wird unter mehreren hundert Winkeln je ein Bild aufgenommen, so daß sich aus jedem Bildpunkt komplette Resonanzkurven ermitteln lassen. Diese Resonanzkurven k¨onnen nun mithilfe einer Software (s. Anhang A) mit einem Fitverfahren ausgewertet und dadurch in ihrer Position bestimmt werden.

Zusätzlich zur WL-Oberfläche wird das lichtmikroskopische Bild der untersuchten Stelle

¨

uber digitale Bildverarbeitungssysteme³ auf einem Computer digitalisiert, der auch die Steue-

2L3: M Plan Apo 50, Fa. Mitutoyo;L4: Mikroskopokular 10-fach, Fa. Zeiss

3DVS–3000, Fa. Hamamatsu

(30)

rung des Spiegel-Schrittmotors ¨ubernimmt.

Abbildung 2.2 zeigt den zentralen Teil des Laboraufbaus. Insbesondere ist zu erkennen, wie das Experiment in den Kreuztisch des Lichtmikroskopes integriert ist. Am oberen Bildrand sieht man das Objektiv des Lichtmikroskopes, das auf die Hypotenuse des Prismas zeigt. Im Beleuchtungsstrahlengang (linke Seite) ist die Laserdiode, die Specklesscheibe zur Beseitigung der räumlichen Kohärenz und die Ablenkeinheit zu sehen. Der Wellenleiter liegt waagerecht unter dem oberen Objektiv des Lichtmikroskops; unsichtbar darunter befindet sich das Prisma zur Einkopplung des Lichts. Das rechte, schräg liegende Objektiv gehört zur Abbildungsoptik des Wellenleitermikroskops; die zugehörige CCD–Kamera ist nicht mehr im Bild.

Abbildung 2.2: Der Laboraufbau des Abbildenden WLM: Die linke Seite des Scheren- aufbaus enth¨alt die Laserdiode, die Ablenkeinheit und das Linsensystem; die rechte Seite den Abbildungsstrahlengang. Das senkrechte Objektiv am oberen Bildrand geh¨ort zu dem Lichtmikroskop, an dessen Kreuztisch der Aufbau befestigt ist.

Mit dem beschriebenen Aufbau ist es nun möglich, ortsaufgelöst das Resonanzverhalten und damit die Topographie des Wellenleiters zu untersuchen, wie dies in [Her97] prinzipiell vorgestellt wurde. Der Vorteil dieser Methode ist, daß während der Experimente unmittelbar beurteilt werden kann, ob eine Stelle im Wellenleiterbild hält, was sie im Lichtmikroskop

”verspricht“; das heißt, daß das zu untersuchende Objekt unmittelbar lokalisiert, identiﬁziert und mit dem lichtmikroskopischen Bild verglichen werden kann.

(31)

2.3. DAS LINIENFOKUS–WLM

2.3 Das Linienfokus–WLM

Bei Messungen mit dem AbbildendenWLMauf mikroskopischer Längenskala ergeben sich zwei wesentliche Einschränkungen. Da die Gegenstandsebene des Abbildungsstrahlenganges nicht in der Ebene der Oberfläche des Wellenleiters liegt, werden die Bilder in Laufrichtung der Mo- den gestaucht. Daher wird nur die Schnittgerade von Gegenstandsebene und WL–Oberfläche scharf abgebildet, nicht aber die WL–Oberfläche selbst, wie bei einem Mikroskop erforderlich.

Weiterhin haben Wellenleitermoden aufgrund der Dämpfung eine charakteristische Lauflänge (s. Kap. 1.2.2). Sie werden durch den elektrischen Widerstand des Metalls gedämpft und streu- en an Unebenheiten, Oberflächenrauhigkeiten und Verunreinigungen, weshalb sie nach einigen µm wieder austreten und sich mit dem von der Austrittsstelle reflektierten Licht ¨uberlagern.

Dies f¨uhrt zu einem

”Ausschmieren“ des Bildes in Laufrichtung der Moden, wie aus Gleichung 1.17 quantitativ bekannt ist.

Um diese Einschr¨ankungen zu ¨uberwinden, wurde die WL–Mikroskopie dahingehend erweitert, daß in Laufrichtung der WL–Moden die Winkelinformation und senkrecht dazu die Ortsinformation erhalten wird. Dies geschieht mithilfe eines durch Zylinderlinsen erzeugten Strichfokus, der in der Ebene des Wellenleiters liegt.

2.3.1 Resonanzanregung im Strichfokus

Abbildung 2.3:

Funktionsprinzip des Wellenleitermi- kroskops mit fokussiertem Beleuch- tungsstrahlengang. Der fokussierte Lichtkegel deckt einen Winkelbereich der Größe Θ ab. Im reflektierten Licht fehlen die Teilstrahlen, für die die Resonanzbedingung gilt (Θ₁ und Θ₂). Das Kamerabild (CCD) liefert damit einen Bereich des Resonanz- spektrums des Wellenleiters am Ort des Fokus.

Um dieses Prinzip zu nutzen, wurde ein Aufbau konstruiert, bei dem die Wellenleitermoden durch einen fokussierten Laserstrahl angeregt werden. Abbildung 2.3 gibt eine schematische, zweidimensionale Abbildung dieser Idee wieder. Dabei trifft das Licht unter einem Winkelbe- reich Θ, der durch den Öffnungswinkel der Linsefz gegeben ist, auf den Wellenleiter. Licht- strahlen, welche die Resonanzbedingung zur Anregung von Wellenleitermoden erfüllen, fehlen im reflektierten Licht (Θ₁ und Θ₂). Das Kamerabild liefert demnach einen Bereich des Re- sonanzspektrums am Ort des Fokus. In der Praxis erzeugt man einen strichförmigen Fokus auf dem Wellenleiter, so daß das Kamerabild für jeden Ort entlang des Fokus das Resonanz- spektrum zeigt. Orts- und Winkelinformation stehen damit senkrecht aufeinander, wie dies

(32)

in Abb. 2.4, die das Kamerabild des entsprechenden Versuchsaufbaus zeigt, zu erkennen ist [Gra00].

Der Vorteil dieses Anregungsprinzips liegt darin, daß die optische Achse des einfallenden Lichtes senkrecht zur Oberfläche des Meßsubstrates liegen kann. Diese Methode findet sich auch bei W. Hickel und W. Knoll, [Hic91], von denen sie 1991 zur Oberflächenplasmonenmi- kroskopie eingesetzt wurde. R. Lawall und W. Knoll [Law95] übertrugen das Prinzip 1995 auf die Wellenleitermikroskopie, setzten sie jedoch nicht zur Messung von Kräften ein. In Abb.

2.5 ist der von G. Graf realisierte Aufbau zu sehen. Charakteristisch f¨ur den Aufbau ist die Zylinderlinse, die unmittelbar vor der Probe einen Linienfokus erzeugt, der vom Objektiv auf den Wellenleiter abgebildet wird.

Zum Aufbau Der Beleuchtungsstrahlengang besteht aus einer fasergekoppelten sogenannten Pigtail-Laserdiode LD⁴, der Strahlaufweitoptik SA, dem Polarisationsﬁlter P und der Fo- kussieroptik (Zylinderlinse⁵ Z1 und Mikroskopobjektiv⁶ O). Der Polarisator P stellt die p–

Polarisation des anregenden Lichts sicher, d. h. er steht senkrecht zur Achse der Objektiv–

Zylinderlinse. Die Strahlaufweitung SA setzt sich zusammen aus zwei Plankonvexlinsen⁷ f1 und f2, in deren Fokusebene eine Lochblende⁸LB zur Filterung der Ortsfrequenzen angebracht ist. Das vom Wellenleiter reflektierte Laserlicht wird vom Strahlteiler ST in den Abbildungs- strahlengang ausgekoppelt und durchläuft zwei zueinander senkrechtstehende Zylinderlinsen⁹ Z1 und Z2 (Abstand doppelte Brennweite), um die Orts- und Winkelinformationen aus dem parallelen Strahl zu erhalten. Diese werden auf die CCD–Kamera¹⁰abgebildet. Auf diese Weise konnte in den durchgeführten Experimenten ein Strichfokus der Länge 50–120µm einen Win- kelbereich von typischerweise 20-30^◦ auf die Kamera projizieren.

Um ortsaufgelöst Bilder aufnehmen zu können, muß das Meßsubstrat senkrecht zum Li- nienfokus bewegt werden. Durch entsprechende Scanning-Verfahren kann zeilenweise ein Bild zusammengesetzt werden. Dieser Aufbau wird, wie in Kap. 3.3.1 beschrieben, dazu verwendet, die Lauflängeneinflüsse der Methode zu untersuchen, bzw. Vergleichsmessungen zu dem im ersten Abschnitt vorgestellten Aufbau durchzuführen.

4iFlex 1000 der Fa. Point Source

5f= 40 mm

6Zeiss Plan-Neoﬂuar X63 NA= 1,4, ¨Olimmersion

7f= 25 mm undf= 80 mm

8Durchmesser 20µm

9f= 80 mm

10Modell CS 8310 BC der Fa. IDS Imaging

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2.3. DAS LINIENFOKUS–WLM

Resonanzen

n sin x

Abbildung 2.4: Resonanzbild des Linienfokus–WLM

Die Vertikale entspricht dem Ort entlang des Strichfokus, die Horizontale dem Ausfalls- winkel des reﬂektierten Lichtes entsprechend der Gr¨oße nsinθ, (n: Brechungsindex des Mediums zwischen Objektiv und Wellenleiter). Die Lage der Wellenleiterresonanzen des in diesem Fall homogen dicken Filmes ist mit Pfeilen markiert.