Kulturelle sowie 16S rDNA basierte Untersuchungen der aeroben und anaeroben Keimflora des equinen Uterus
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von MAREIKE TÄTE
aus Bremen
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Burkhard Meinecke Institut für Reproduktionsbiologie
1. Gutachter: Prof. Dr. Burkhard Meinecke 2. Gutachter: Prof. Dr. Heinrich Bollwein
Tag der mündlichen Prüfung: 28.10.2011
Diese Arbeit wurde durch die Stiftung Gestüt Fährhof gefördert
Philipp und meinen Eltern
Inhalt
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Der Genitaltrakt der Stute ... 3
2.1.1 Anatomie und Ontogenese ... 3
2.1.2 Histologie des Uterus ... 4
2.1.3 Uterine Abwehrmechanismen ... 5
2.1.3.1 Resistente und empfängliche Stuten ... 8
2.1.3.2 Mögliche Ursachen der Empfänglichkeit von Stuten gegenüber Endometritiden ... 9
2.1.4 Altersabhängige Veränderungen ... 10
2.1.5 Zyklusabhängige Veränderungen ... 12
2.2 Endometritis ... 14
2.2.1 Infektiöse Endometritis ... 14
2.2.1.1 Endometritis und Nachweis aerober Bakterien ... 15
2.2.1.2 Endometritis und Nachweis anaerober Bakterien ... 20
2.2.1.3 Pathogenitätsmechanismen ... 21
2.2.2 Nicht infektiöse Endometritis... 26
2.3 Nachweis von Bakterien ... 27
2.3.1 Probenentnahme ... 27
2.3.2 Kulturabhängiger Nachweis ... 31
2.3.3 Kulturunabhängiger Nachweis ... 31
2.3.4 Aussagekraft bakteriologischer Ergebnisse ... 33
2.4 Exfoliative Endometriumzytologie ... 34
2.5 Physiologische Keimflora ... 36
2.6 Mikrobielle Flora des Genitaltraktes der Stute ... 37
2.6.1 Bakterienflora des Vestibulums, der Vagina und der Zervix ... 37
2.6.2 Bakterienflora des Uterus ... 40
3 Material und Methode ... 45
3.1 Versuchsaufbau ... 45
3.2 Probanden ... 47
3.3 Gynäkologische Untersuchung ... 47
3.4 Versuchsgruppeneinteilung... 50
3.5 Probenentnahme ... 51
3.5.1 Probenentnahme bei Fohlen ... 52
3.5.2 Probenentnahme bei zweijährigen und älteren Stuten ... 55
3.5.3 Entnahmetechnik für die bakteriologische Untersuchung ... 56
3.5.4 Entnahmetechnik für die zytologische Untersuchung ... 56
3.6 Prüfung der Probenentnahme bezüglich Kontaminationen ... 57
3.7 Probenentnahme für den Vergleich der Entnahmetechniken ... 58
3.8 Probenaufbereitung und Auswertung ... 58
3.8.1 Probenaufbereitung und Auswertung der bakteriologischen Untersuchung ... 58
3.8.2 Probenaufbereitung und Auswertung der exfoliativen Endometriumzytologie ... 61
3.9 Molekularbiologische Untersuchungen ... 62
3.9.1 Nukleinsäure-Extraktion ... 62
3.9.2 Partielle Amplifikation des 16S rDNA Gens ... 63
3.9.3 Agarosegelelektrophorese ... 64
3.9.4 PCR-Produktaufreinigung ... 64
3.9.5 Sequenzierung der PCR-Produkte ... 64
3.9.6 Auswertung der Sequenzen ... 66
3.9.7 Taxonomische Einordnung ... 67
3.10 Statistische Auswertung ... 68
4 Ergebnisse ... 70
4.1 Angaben zum Stutenkollektiv und der gynäkologischen Untersuchung ... 70
4.2 Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchungen ... 71
4.2.1 Fakultativ pathogene Bakterienarten ... 72
4.2.2 Apathogene Bakterienarten ... 73
4.2.3 Aerobe und anaerobe Bakterien ... 74
4.2.4 Stärke des Keimgehaltes ... 75
4.3 Bakteriologische Ergebnisse in Bezug zu den Versuchsgruppen ... 76
4.3.1 Fohlen ... 76
4.3.2 Maidenstuten ... 77
4.3.3 Stuten, die resorbiert haben, und güste sowie umrossende Stuten ... 77
4.3.4 Klinisch auffällige Stuten ... 78
4.3.5 Versuchsgruppen vergleichend ... 79
4.4 Ergebnisse der Exfoliativzytologie ... 82
4.5 Zytologische Ergebnisse in Bezug zu den Versuchsgruppen ... 84
4.6 Bakteriologische Befunde in Zusammenhang mit zytologischen Befunden ... 85
4.7 Bakteriologische und zytologische Befunde in Zusammenhang mit den Versuchsgruppen ... 86
4.8 Bakteriologische und zytologische Befunde in Zusammenhang mit gynäkologischer Untersuchung sowie Anamnese ... 87
4.8.1 Vulva-Befundkategorie und Bakteriologie und Zytologie ... 87
4.8.2 Zyklusstand und Bakteriologie und Zytologie ... 88
4.8.3 Vulva-Befundkategorie in Zusammenhang mit dem Alter der Stuten ... 89
4.9 Ergebnis der Prüfung der Probenentnahme bezüglich Kontaminationen ... 90
4.10 Vergleich der Entnahmetechniken ... 91
4.11 Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchungen ... 92
4.11.1 Molekularbiologische Differenzierung ausgewählter Bakterienisolate .. 92
4.11.2 Bestimmung der Nukleinsäuresequenz ... 95
4.11.3 Genbankabgleich der Nukleinsäuresequenzen ... 96
4.11.4 Taxonomische Einordnung der molekularbiologisch nicht bestimmbaren Bakterienisolate ... 100
5 Diskussion ... 105
5.1 Diskussion der Methodik ... 105
5.2 Bakteriologische und zytologische Untersuchungen ... 108
5.2.1 Fohlen und Maidenstuten ... 108
5.2.2 Anamnestisch auffällige Stuten ... 114
5.2.3 Klinisch auffällige Stuten ... 116
5.3 Molekularbiologische Untersuchungen ... 119
5.4 Weitere Untersuchungen ... 124
5.5 Ausblick und Fazit für die Praxis ... 129
6 Zusammenfassung ... 131
7 Summary ... 133
8 Literaturverzeichnis ... 135
9 Anhang ... 158
9.1 Laborgeräte ... 158
9.2 Verbrauchsmaterialien ... 158
9.3 Chemikalien ... 159
9.4 Puffer und Lösungen ... 160
9.5 Nährmedien ... 160
9.6 Tabellenverzeichnis ... 162
9.7 Abbildungsverzeichnis ... 163
9.8 DNA Sequenzen ... 166
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
BLAST Basic Local Alignment Search Tool BU Bakteriologische Untersuchung bp engl.: base pair(s) (Basenpaare)
bzw. beziehungsweise
ca. circa
°C Grad Celsius
CEM engl.: contagious equine metritis (kontagiöse equine Metritis)
cm Zentimeter
dest. destillata
DNA engl.: deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTPs Desoxyribonukleosid-Triphosphate
ddNTPs Didesoxyribonukleosid-Triphosphate E. coli Escherichia coli
engl. englisch
et al. lat.: et alii (und andere)
Fa. Firma
g Erdbeschleunigung
HPLC-Wasser engl.: High Performance Liquid Chromatography
(Wasser für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) Ig Immunglobulin
K Kapseltyp
Kap. Kapitel
lat. lateinisch
LAVES Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
Lsg. Lösung
MHz Megahertz
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
µl Mikroliter n Probenzahl
NCBI National Center for Biotechnology Information
nm Nanometer
Nr. Nummer
p Signifikanz
PCR engl.: polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion)
PG Prostaglandin
PVP Polyvinylpyrrolidon
rDNA engl.: ribosomal deoxyribonucleic acid (ribosomale Desoxyribonukleinsäure)
rpm engl.: rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) s Sekunde
s. siehe
Sc. Streptococcus
SDS Sodium-Dodecyl-Sulfat (engl. Natriumdodecylsulfat)
sp. Spezies
ssp. Subspezies
Tab. Tabelle
TAE Tris-Acetat-Ethylendiamintetraessigsäure
Taq Thermus aquaticus
Tris Tri-(Hydroxymethyl-) Aminomethan
UV Ultraviolett
VBNC engl.: viable but not culturable (lebensfähig aber nicht kultivierbar)
z. B. zum Beispiel
ZU Zytologische Untersuchung
1 1 Einleitung
Bakterielle Endometritiden sind bei der Stute die häufigste Ursache von Fertilitätsstörungen und ein Hauptgrund für wirtschaftliche Verluste in der kommerziellen Pferdezucht (MERKT 1957, CAUSEY 2006). Bei der Diagnose von Endometritiden ist neben der klinisch gynäkologischen Untersuchung die bakteriologische Untersuchung von Endometriumtupfern die Standardmethode. Da der gesunde Uterus laut Fachliteratur lediglich nach der Geburt sowie nach der Bedeckung physiologisch Bakterien aufweist, werden in Endometriumtupferproben nachgewiesene Bakterien stets als pathologische oder kontaminationsbedingte transiente Besiedler des Uterus gewertet (WOOLCOCK 1980, TILLMANN et al.
1982, HINRICHS et al. 1988, HANDLER 2005). Die Annahme, dass der gesunde Uterus der Stute steril ist, wurde vorbehaltlos akzeptiert, obwohl es kaum Studien gibt, die diese Ansicht belegen. Es ist schwer nachzuvollziehen, wie diese Annahme entstanden ist und zur allgemeinen Lehrmeinung werden konnte, da fast alle Studien zum bakteriologischen Keimgehalt des Uterus an infertilen Stuten erfolgten und dabei in der Regel nur die fakultativ pathogenen, nicht aber die apathogenen Bakterien berücksichtigt wurden. Lediglich SCOTT et al. (1971), RICKETTS und MACKINTOSH (1987) sowie NASH et al. (2010) zweifelten die Annahme des sterilen Uterus an und vermuteten, dass der Nachweis von Bakterien aus dem Uterus ohne weitere Entzündungsanzeichen ein Hinweis auf eine ständige bakterielle Besiedlung des Uterus ist.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den equinen Uterus von Fohlen und gesunden adulten Stuten auf das Vorkommen einer physiologischen bakteriellen Besiedlung zu untersuchen. Hierzu wurden sowohl von Fohlen als auch von klinisch geschlechts- gesunden Maidenstuten Uterustupferproben auf aerobe, mikroaerophile sowie anaerobe Bakterien untersucht. Die parallele Entnahme und Bewertung einer zytologischen Probe erlaubte die sichere Feststellung eines reaktionsfreien
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Endometriums, so dass eventuell nachgewiesene Bakterien tatsächlich als physiologische Besiedler der Gebärmutter eingestuft werden konnten.
Des Weiteren wurde das mikrobielle Keimspektrum anamnestisch sowie gynäkologisch auffälliger Stuten analysiert. Dies erfolgte durch die parallele Untersuchung und Bewertung bakteriologischer und zytologischer Proben von Stuten, die resorbiert haben, güsten Stuten, umrossenden Stuten sowie von klinisch auffälligen Stuten.
Um nähere Informationen über die apathogenen und anaeroben Bakterien des Uterus zu erhalten, wurden die in der Mikrobiologie isolierten apathogenen sowie anaeroben Bakterien molekularbiologisch untersucht und über ihre 16S rDNA Sequenz identifiziert.
Um aussagekräftige bakteriologische Ergebnisse zu gewährleisten, wurde im Vorfeld der Vorgang der Probenentnahme und der Probenverarbeitung auf mögliche Kontaminationsquellen geprüft.
3 2 Literaturübersicht
2.1 Der Genitaltrakt der Stute
2.1.1 Anatomie und Ontogenese
Die weiblichen Geschlechtsorgane setzen sich aus den Ovarien, den Eileitern, dem Uterus, der Vagina, dem Vestibulum vaginae, der Vulva und der Klitoris zusammen.
Während die Eileiter, der Uterus und die Vagina embryonal aus den paarigen Müllerschen Gängen entstehen, geht das Vestibulum vaginae aus dem Sinus urogenitalis hervor (SCHNORR u. KRESSIN 2001). An der Verschmelzungsstelle der Müllerschen Gänge mit dem Sinus urogenitalis ist bei Maidenstuten eine unvollständige Trennwand, das Hymen, ausgebildet (BARTMANN et al. 2002).
Der Uterus der Stute ist ein Uterus bicornis und beginnt kaudal mit der 60-70 mm langen Cervix uteri. Sie dient als Verschluss- und Schutzeinrichtung und bildet den Canalis cervicalis, der mit dem trichterförmigen Ostium uteri internum in den Uterus mündet. Das Ostium uteri externum wird von der deutlich in die Vagina vorspringenden Portio vaginalis aufgenommen. Die Schleimhaut des Canalis cervicalis weist Längsfalten auf und aufgrund ihrer kräftigen Wandmuskulatur sowie ihres derben Bindegewebes lässt sich die Zervix von rektal gut palpieren. Im Gegensatz zu anderen Haussäugetieren besitzt die Zervix beim Pferd keine besonderen Verschlussvorrichtungen und ist auch im geschlossenen Zustand für geeignete Instrumente passierbar. Der Uterus weist einen großen und geräumigen, etwa 250 mm langen Corpus uteri auf, der von der Becken- in die Bauchhöhle hineinragt. Die beiden ebenfalls etwa 250 mm langen, schlauchförmigen Cornua uteri divergieren ventral konvex durchgebogen vom Uteruskörper nach kranial, wo sie mit ihren stumpfen Enden die Eileiter erreichen. In Position gehalten werden der
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Uteruskörper und die Uterushörner von dem flächig ausgedehnten Mesometrium (BARTMANN et al. 2002, LEISER 1999).
2.1.2 Histologie des Uterus
Der Uterus weist einen typischen Schichtenaufbau aus Endometrium (Tunica mucosa), Myometrium (Tunica muscularis) und Perimetrium (Tunica serosa) auf (KENNEY 1978).
Das luminale Endometrium wird in die Lamina epithelialis und die Lamina propia unterteilt. Bei der Lamina epithelialis handelt es sich um ein einschichtiges, hochprismatisches Oberflächenepithel, von dem weniger als die Hälfte der Zellen Zilien tragen (KENNEY 1978). Die Lamina propia ist aus proliferationsaktivem, spinozellulärem Bindegewebe aufgebaut, welches zahlreiche tubulär verzweigte Uterindrüsen und Gefäße einschließt. Subepithelial ist das Bindegewebe reich an spezifischen und unspezifischen Immunzellen wie Makrophagen, Lymphozyten, Plasmazellen und Mastzellen (LEISER 1990, LIEBICH 2004). Die endometriale Oberfläche formt 12 bis 15 longitudinale Schleimhautfalten. Im Querschnitt bildet der Uterus durch diese Falten radial angeordnete Bereiche, die jeweils von 2 aktiven endometrialen Oberflächen umgeben werden. Das uterine Lumen besteht also, besonders deutlich ausgeprägt zwischen den aneinanderliegenden Schleimhautfalten, lediglich aus kapillaren Spalten (KENNEY 1978).
Dem Endometrium schließt sich ohne Submucosa das Myometrium an. Es besteht aus einer inneren, sehr kräftigen, zirkulär angeordneten Schicht glatter Muskulatur, einer mittleren gefäßführenden Bindegewebsschicht und einer äußeren, schwächeren, longitudinal verlaufenden Schicht glatter Muskulatur (BARTMANN et al. 2002, LIEBICH 2004).
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Peripher bildet der auf den Uterus übertretende Bauchfellüberzug als Perimetrium den Abschluss der Uteruswand (LEISER 1999).
Bei der Cervix uteri ist die Tunica mucosa in Primärfalten gelegt, welche wiederum mit Sekundär- und Tertiärfalten besetzt sind. Die hohen Zervikalfalten gehen nach kranial in die flacher werdenden Längsfalten des Uterus über. Die Tunica mucosa der Zervix setzt sich neben Becherzellen und Flimmerzellen vor allem aus muzinogenen Zellen zusammen, was es ihr ermöglicht, relativ große Mengen von flüssigem bis viskösem Sekret zu produzieren. Das Bindegewebe ihrer Lamina propia ist zell- und faserreich sowie von derber Konsistenz und auch ihr Myometrium ist sehr kräftig ausgebildet (LEISER 1990, LIEBICH 2004). Nach Angaben von KLEINEN (2006) macht der bindegewebige Anteil der Cervix uteri beim Pferd 44,3 % aus. KLEINEN (2006) erklärte diesen hohen Bindegewebsanteil mit der Notwen- digkeit eines festen Schlusses der Zervix bei der Stute, die ja eine relativ kurze Zervix ohne weitere Verschlusseinrichtungen besitzt.
2.1.3 Uterine Abwehrmechanismen
Die Abwehrmechanismen des Uterus bestehen aus komplexen Interaktionen zwischen anatomischen, immunologischen und physikalischen Komponenten.
Als anatomische Barrieren wirken die eng aneinander liegenden Labien der Vulva, der Hymenalring, der vor allem während des Diöstrus aufgrund des Musculus constrictor vestibulae eine Sphinkterfunktion hat, und die Zervix. Im Östrus öffnet sich die Zervix, produziert Mukus und ermöglicht so einen nach kaudal gerichteten reinigenden Sekretstrom, während sie im Diöstrus aufgrund der Kontraktion der glatten Muskulatur und des zähen Zervikalmukus als Verschluss fungiert (TILLMANN et al. 1982). HINRICHS et al. (1988) und KLEIN et al. (2009) wiesen entlang der kaudokranialen Achse des Genitaltraktes am Übergang vom Vestibulum zur Vagina die größte Reduktion der bakteriellen Besiedlung nach. Sie leiteten daraus ab, dass
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vor allem der Hymenalring der Stute einen unspezifischen Schutz vor aufsteigenden bakteriellen Kontaminationen bietet. Bei Defekten der anatomischen Barrieren können paarungsunabhängig Keime über die Vagina in den Uterus aufsteigen und eine chronische Endometritis etablieren (HURTGEN 2006).
Zu den wichtigsten immunologischen Abwehrkomponenten des Uterus zählen Immunglobuline, neutrophile Granulozyten und das Komplementsystem. Bakterien und anderes antigenetisches Material führen im Uterus zu einem schnellen Influx von neutrophilen Granulozyten und zu einer Freisetzung von chemotaktischen Mediatoren wie Komplementproteinen, Leukotrienen und Prostaglandinen, welche wiederum eine Migration von neutrophilen Granulozyten und Immunglobulinen in das Uteruslumen fördern (WATSON et al. 1987). Eine wichtige Rolle bei der Phagozytose von Antigenen spielt die Opsonisierung. Die Opsonine, vor allem Immunglobuline und Komplementproteine, erhöhen die Bindung von Antigenen an die Zellmembran der Phagozygoten und beschleunigen so den Prozess der Phagozytose (ASBURY und LYLE 1993). Eine Akkumulation von Flüssigkeit im Uterus führt zu einer Inaktivierung von Komplementproteinen, was wiederum zu einer verminderten Phagozytoseleistung führt (TROEDSSON 1999). Das equine Endometrium wird als Teil des „mucosa-associated lymphoid tissue“ betrachtet, das auch im Gastrointestinal- und Respirationstrakt vorkommt (WIDDERS et al. 1985). Es enthält Immunzellen wie z. B. die Langerhans-Zellen, die Antigene erkennen und präsentieren können, B-Lymphozyten, die Antikörper produzieren und über spezielle Zellen an die Schleimhautoberfläche abgeben können, und T-Lymphozyten. Von den in Uterussekreten nachgewiesenen Immunglobulinen IgG, IgA und IgM ist das IgG aufgrund seiner wichtigen Rolle bei der Opsonisierung das bedeutendste Immunglobulin im Uterus (WATSON 1988).
Zu den physikalischen Komponenten der uterinen Abwehrmechanismen zählt unter anderem die myometriale Kontraktion. Intrauterine bakterielle Infusionen führen am Uterus von Stuten zu einer erhöhten myometrialen Aktivität. TROEDSSON et al.
vermuteten (1993a), dass die von den neutrophilen Granulozyten freigesetzten
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Prostaglandine für die Zunahme der myometrialen Aktivität während einer Infektion verantwortlich sind. In einer nachfolgenden Studie konnte dieselbe Arbeitsgruppe nachweisen, dass sowohl PGF2α und PGE2 als auch Oxytocin eine verstärkte myometriale Aktivität hervorrufen (TROEDSSON et al. 1995). Neben der zervikalen Dilatation und der myometrialen Kontraktion ist auch die lymphatische Drainage für die uterine clearance wichtig. Lymphgefäße und Lymphknoten sorgen im Uterus für den Abfluss von überschüssiger Flüssigkeit aus der Submukosa und dem Lumen (LEBLANC et al. 1995).
Zilientragende Endometriumzellen mit einer Zilienschlagfrequenz von etwa 13 Schlägen pro Sekunde und der Nachweis von Mukus auf der endometrialen Oberfläche führten zu der Hypothese, dass der equine Uterus einen mukoziliaren Apparat, wie er im Respirationstrakt vorkommt, als zusätzlichen Abwehr- mechanismus gegen Infektionen besitzt (CAUSEY 2007). In den Atemwegen entfernt der gerichtete Transport des Bronchialschleims nicht nur potentielle Pathogene, sondern auch Zelldebris. Im Gegensatz zu dem mukoziliaren Apparat des Respirationstraktes interferiert der Mukus im Uterus allerdings nicht mit Luft, sondern mit einem flüssigen Milieu (CAUSEY et al. 2000, CAUSEY 2007). Die zwischen den auf die Zervikalfalten übergehenden Uterusfalten gelegenen länglichen kapillaren Spalten (KENNEY 1978) könnten als eine Art Führung für mukoziliäre Ströme fungieren (CAUSEY 2007). Für eine optimale Funktion des mukoziliaren Apparates ist auch die Beschaffenheit des Mukus wichtig. Veränderungen der Elastizität und Viskosität können mit seiner Fähigkeit, Partikel aufzunehmen und über längere Strecken zu transportieren, interferieren. Wenn der Mukus in freier Flüssigkeit gelöst wird, kommt es zu einer Abnahme der Viskosität und umgekehrt können zähe Sekrete eine zu hohe Viskosität erzeugen (CAUSEY 2007). Während bei akuten und subakuten Endometritiden die Mukusproduktion verstärkt ist, haben Stuten mit chronischen Entzündungen eine Zunahme der Viskosität des Mukus. Auch die an der Endometritis beteiligte Bakterienart kann die Beschaffenheit des Mukus beeinflussen (LEBLANC et al. 2007). Der Mukus verhindert außerdem, dass Bakterien sich an Zellrezeptoren binden (CAUSEY 2006).
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Zu den wichtigsten Abwehrmechanismen hochentwickelter Organismen zählen neben den anatomischen und chemisch-physikalischen Barrieren sowie dem Immunsystem auch die individuelle wirtseigene Keimflora der Haut, der Schleim- häute und der nach außen offenen Körperhöhlen (MAYR 2002). Da die meisten Autoren in der Literatur jedoch davon ausgehen, dass der Uterus steril ist (SPARKS et al. 1977, TILLMANN et al. 1982, HANDLER 2005, PAETZ 2009), liegen keine Angaben über eine mögliche Beteiligung einer physiologischen Keimflora an der Keimabwehr des Uterus vor.
2.1.3.1 Resistente und empfängliche Stuten
Anhand ihrer Fähigkeit, experimentelle bakterielle Infektionen des Uterus innerhalb von 96 Stunden selbständig und erfolgreich zu bekämpfen, können Stuten in resistent oder empfänglich gegenüber einer persistierenden Endometritis eingeordnet werden (TROEDSSON und LIU 1991a). Bereits 1969 haben Untersuchungen von PETERSEN et al. ergeben, dass nach einer intrauterinen Verabreichung von Streptococcus zooepidemicus-Suspensionen güste und multipare Stuten häufiger eine persistierende Endometritis entwickeln als Maidenstuten. Auch HUGHES und LOY (1969) stellten bei ihren Untersuchungen eine hohe Resistenz von jungen Stuten gegenüber einer künstlichen bakteriellen Infektion fest. ASBURY und LYLE (1993) merkten an, dass ein Versagen der uterinen Abwehrmechanismen den Prozess der uterinen clearance meistens jedoch nur verlangsamt und die Empfänglichkeit gegenüber einer Endometritis keinen absoluten Status einer Zuchtstute darstellt. Empfängliche Stuten haben eine Tendenz zur Akkumulation von Flüssigkeit im Uterus. Bei Untersuchungen von TROEDSSON und LIU (1991a) akkumulierte bei empfänglichen Stuten nach einer bakteriellen Infektion sechsmal so viel Flüssigkeit im Uterus wie bei resistenten Stuten.
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2.1.3.2 Mögliche Ursachen der Empfänglichkeit von Stuten gegenüber Endometritiden
In verschiedenen Studien wurde untersucht, ob bestimmte Defekte der Abwehrmechanismen des Uterus für die Emdometritisempfänglichkeit von Stuten verantwortlich sein können.
LIU et al. (1986) fanden heraus, dass sich die Anzahl der neutrophilen Granulozyten im Uterus nach einer Infektion bei resistenten und empfänglichen Stuten nicht unterscheidet. Die Hypothese, dass empfängliche Stuten einen Defekt bei der Freisetzung von Opsoninen haben (ASBURY et al. 1984), konnte durch spätere Studien widerlegt werden (BROWN et al. 1985a). Auch die ursprüngliche Annahme, dass empfängliche Stuten zu wenig Immunglobuline im Uterus haben, wurde durch die Arbeitsgruppe von ASBURY et al. (1980) widerlegt, die bei empfänglichen Stuten sogar höhere Antikörperkonzentrationen nachwies als bei resistenten Stuten.
KATILA (1996) stellte abschließend fest, dass es bisher keinen schlüssigen Beweis für eine immunologische Fehlfunktion bei empfänglichen Stuten gibt.
Eine verzögerte mechanische clearance empfänglicher Stuten konnten TROEDSSON und LIU (1991b) bei dem Vergleich von empfänglichen mit resistenten Stuten hinsichtlich der Eliminierung eines nicht-antigenen Markers aus dem Uterus feststellen. TROEDSSON et al. (1993a) wiesen bei resistenten Stuten eine höhere Frequenz, höhere Intensität und längere Dauer der myometrialen Aktivität als bei empfänglichen Stuten nach. Obwohl die myometriale Aktivität vor allem bei älteren und multiparen Stuten reduziert ist, können auch Maidenstuten mit guter myometrialer Aktivität endometritisempfänglich sein. Verschiedene Autoren (LEBLANC 2003, MALSCHITZKY et al. 2006) gehen davon aus, dass bei diesen Stuten eine Fehlfunktion der Zervix, die mit einem zu frühen Verschluss einhergeht, die Hauptursache für persistierende Endometritiden darstellt. 1994 stellten LEBLANC et al. folgende Hypothese für die Pathogenese der Endometritis auf: Wenn der Uterus nicht gereinigt ist, bevor sich die Zervix schließt, sorgt bei resistenten Stuten
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das Lymphsystem für den Abtransport von Entzündungsprodukten. Bei empfänglichen Stuten verbleiben Entzündungsprodukte im Uteruslumen und führen dann zu weiteren entzündlichen Vorgängen sowie zu einer Irritation des Endometriums (LEBLANC et al. 1994). Verglichen mit resistenten Stuten ist bei empfänglichen Stuten die lymphatische Drainage geringer ausgeprägt (LEBLANC et al. 1995). Laut KATILA (1996) bieten Defekte in der mechanischen Drainage des Uterus bisher die besten Erklärungen für die Empfänglichkeit von Stuten gegenüber Uterusinfektionen.
Einige Studien sind der Hypothese gefolgt, dass bei empfänglichen Stuten Störungen der mukoziliaren clearance vorliegen. Empfängliche Stuten weisen zum Beispiel eine reduzierte Anzahl uteriner Längsfalten auf und häufig findet man bei ihnen auch Epitheldefekte sowie eine verminderte Anzahl von Zilien (BRACHER et al. 1992, CAUSEY 2007). Die Annahme, dass beim Pferd ein mukoziliarer Apparat vorkommt und dass Störungen des Mukusflusses an der Pathogenese von persistierenden Infektionen beteiligt sind, erscheint schlüssig, doch bisher gibt es dafür keine ausreichenden Beweise (CAUSEY 2007).
2.1.4 Altersabhängige Veränderungen
Die Geschlechtsorgane von juvenilen Tieren sind von geringerer Größe und geringerem Gewicht als die von adulten Tieren. Sie lassen erkennen, dass sie ihre spätere Funktion noch nicht aufgenommen haben. Ihre Schleimhaut weist eine hellere Färbung auf und die Bänder des Aufhängeapparates sind dünn, zum Teil sogar durchsichtig, und enthalten sehr feine nur wenig geschlängelte Blutgefäße. Der Uterus ist symmetrisch und ebenso wie die Zervix von weicher Konsistenz. Die Schleimhautfaltung der Zervix zeigt bereits ihre arttypische Struktur, ist aber zierlicher und weniger deutlich ausgeprägt (SEIFERLE 1933). Bei Untersuchungen am Genitaltrakt eines Kalbes stellte SEIFERLE 1933 fest, dass der Zervikalkanal für seine Schere immer leicht passierbar und mehr oder weniger weit offen war.
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Der Genitaltrakt von geschlechtsreifen Tieren ist in seiner Gesamtheit beträchtlich größer. Die Wandungen sind dicker, die Zervix ist von fester Beschaffenheit und die Schleimhäute zeigen eine intensivere Färbung. Der Geschlechtsapparat ist voll funktionstüchtig und unterliegt den zyklussynchronen Veränderungen (LEISER 1999, SEIFERLE 1933). Untersuchungen an Stuten zeigen, dass die Wandung der Zervix mit zunehmendem Alter immer dicker wird. So stellte RÖBER 1914 bei einer jungen Maidenstute eine Wanddicke von 1,5 cm und bei einer zwanzigjährigen Stute von 3,5 cm fest. Weitere Veränderungen der Geschlechtsorgane vollziehen sich während und im Anschluss an eine Trächtigkeit.
Das mikroskopische Bild des juvenilen equinen Uterus zeigt einen einheitlichen Aufbau. Die typischen Schichten der Uteruswand sind durch eine gleichmäßige Verteilung der Gewebeelemente noch nicht deutlich ausgebildet. Das Bindegewebe ist noch recht locker und gleichmäßig verteilt, es sind relativ wenig Uterindrüsen vorhanden, die Muskulatur ist nur spärlich ausgebildet und es ist kein deutliches Stratum vasculare vorhanden. Das geschilderte histologische Bild der Uteruswand erklärt sich aus der bisherigen Funktionslosigkeit des Organs (SEIFERLE 1933). Das Zervixepithel von juvenilen Rindern besteht vor allem aus Basalzellen und Zylinderzellen, während zilientragende Zellen nur sehr selten vorkommen. Bei adulten Tieren weist das Epithel mehr als zehnmal so viele Zilienzellen auf (WROBEL 1971).
Ein deutlicher Unterschied zwischen Juvenilen und Adulten zeigt sich bei dem Vorkommen von Abwehrzellen im Uterus. WIDDERS et al. (1985) konnten im Epithel des Genitaltraktes von juvenilen Stuten keinerlei Plasmazellen und Immunglobuline feststellen. In der Lamina propia war der Unterschied dann nicht mehr ganz so eindeutig, lediglich das Vorkommen von IgM war bei juvenilen Stuten deutlich reduziert. Beim Kalb sind in der Zervix auch die Mastzellen nur selten darzustellen (WROBEL 1971). WIDDERS et al. (1985) und WROBEL (1971) erklärten das verminderte Vorkommen von Immunzellen bei juvenilen Tieren mit dem fehlenden stimulierenden Einfluss von antigenetischem Material.
12 2.1.5 Zyklusabhängige Veränderungen
Mit einem Alter von 291 bis 408 Tagen erreichen im Frühjahr geborene Stuten die Geschlechtsreife (BROWN-DOUGLAS et al. 2004). Stuten zählen zu den saisonal- polyöstrischen Tieren und ihr Sexualzyklus weist eine Länge von 18 bis 22 Tagen auf. Die verschiedenen Phasen des Sexualzyklus spiegeln sich in makroskopischen und mikroskopischen zyklischen Veränderungen der Genitalorgane wider, die durch die Steroide Östrogen und Progesteron beeinflusst werden. Eine Ausnahme stellen die Ovarien dar, deren Funktionen durch Gonadotropine reguliert werden.
Makroskopisch sind vor allem die zyklischen Veränderungen an der Zervix und dem Uterus auffällig. Mit beginnendem Östrus wird die Zervix unter Östrogeneinfluss weicher und die Portio vaginalis senkt sich auf den Vaginalboden. Sie ist für 3 oder mehr Finger passierbar, ödematisiert und ihre Schleimhaut ist hyperämisch. Durch die vermehrte Produktion von dünnflüssigem Schleim im Östrus erscheint die Schleimhaut der Vagina und der Zervix feucht glänzend. Unter Progesteroneinfluss im Diöstrus stellt sich die Zervix durch einen hohen Muskeltonus gut abgrenzbar dar.
Der äußere Muttermund ist verschlossen und der nur in geringen Mengen sezernierte, hochvisköse Schleim zeigt eine typische Graufärbung. Die Schleimhäute der Vagina und der Zervix sind blass und trocken.
Auch die Uteruswand zeigt unter Östrogeneinfluss eine deutliche Ödematisierung, wodurch im Ultraschall das Erscheinungsbild einer „Radspeichenstruktur“ entsteht.
Im Diöstrus geht unter Progesteroneinfluss das Ödem zurück und der Uterus stellt sich homogen dar (KAINER 1993, HANDLER und AURICH 2005).
Die mikroskopischen zyklussynchronen Veränderungen betreffen vor allem das Endometrium, an dem 3 Funktionsphasen unterschieden werden können. Die unter Östrogeneinfluss stehende Proliferationsphase (Präöstrus, Östrus, Postöstrus, ca. 8 Tage) ist durch vermehrte Epithelzellanzahl, zunehmende Epithelhöhe, Stromaödem und gestreckte Schlauchdrüsen gekennzeichnet. Um den Ovulationszeitpunkt herum sezernieren die Epithelzellen vermehrt dünnflüssigen Mukus. Unter Progesteron-
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dominanz geht das Endometrium in die Sekretionsphase (früher und mittlerer Diöstrus, ca. 9 Tage) über. Während die Epithelien in dieser Phase an Höhe verlieren und das Stromaödem zurückgeht, sind die Lumina der Uterindrüsen erweitert, mit Sekret gefüllt und geben ein mukoides Sekret ab. Während der Involutionsphase (später Diöstrus, ca. 4 Tage) sind die inaktiven Uterindrüsen stark gewunden und die Epithelien flach (BRUNCKHORST u. SCHOON 1990, KENNEY 1978, SCHOON et al. 1992).
Es gilt als gesicherte Erkenntnis, dass Stuten unter Progesterondominanz empfänglicher für Uterusinfektionen sind als Stuten unter Östrogeneinfluss.
Auf immunologischer Ebene bestehen Unterschiede im Vorkommen von Abwehrzellen im Genitaltrakt. Während des Östrus haben neutrophile Granulozyten die Tendenz, in kleinen Kapillaren der Uteruswand zu akkumulieren (KENNEY 1978).
Auch können sie im Östrus extravaskulär sowohl in der Propia als auch im luminalen Epithel nachgewiesen werden (BRUNCKHORST und SCHOON 1990). WASHBURN et al. (1982) stellten in ihren Untersuchungen fest, dass die Phagozytosekapazität der zirkulierenden neutrophilen Granulozyten, im Gegensatz zu ihrer Anzahl, jedoch unabhängig vom Zyklus ist. Anders sieht die Situation allerdings nach einer experimentellen bakteriellen Infektion aus. Die zirkulierenden neutrophilen Granulozyten von mit Östrogen behandelten Stuten zeigen dann eine bessere phagozytotische Aktivität als die von mit Progesteron behandelten oder ovariektomierten Stuten (WASHBURN et al. 1982). Plasmazellen kommen beim Pferd im gesamten Genitaltrakt vor. Ein Einfluss des Zyklus auf ihre Anzahl kann allerdings nicht festgestellt werden (WATSON u. STROKES 1988). Im Zervikalgewebe kommt es im Östrus zu einer verstärkten Infiltration mit eosinophilen Granulozyten und Mastzellen (HUCHZERMEYER 2003).
Wenn man die physikalischen Abwehrkomponenten des Uterus betrachtet, wird der Einfluss von Östrogen und Progesteron auf die uterinen Abwehrmechanismen deutlicher. Unter Östrogeneinfluss ist die Zervix geöffnet, während sie unter Progesteroneinfluss geschlossen ist. Die myometrialen Kontraktionen des Uterus variieren auch zyklusabhängig. Während die Frequenz immer gleich bleibt, ist die
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Aktivitätsdauer im Diöstrus länger und die Intensität im Östrus höher (TROEDSSON et al. 1993b). Außerdem zeigen Uterusepithelzellen von Stuten, die mit Östrogen behandelt wurden, eine geringere Adhäsion von Bakterien als Epithelzellen von unbehandelten Stuten (WATSON et al. 1988).
2.2 Endometritis
Als Endometritis werden, unabhängig von ihrer Ätiologie, entzündliche Ver- änderungen des Endometriums bezeichnet, bei denen das Vorkommen von freien Entzündungszellen über das physiologische Maß einer im endometrialen Zyklus stets auftretenden Infiltration hinausgeht. Die entzündlichen Veränderungen lassen sich histopathologisch anhand der vorherrschenden Zelltypen, der Lokalisationen im Endometrium sowie der Verteilung und dem Grad der Infiltration charakterisieren (SCHOON et al. 1992).
Entzündliche Veränderungen des Endometriums werden als Hauptursache für Fruchtbarkeitsstörungen bei der Stute angesehen (LEIDL et al. 1976). Eine durch TRAUB-DARGATZ et al. (1991) durchgeführte Befragung von 1149 Pferdetierärzten in den USA ergab, dass in Abhängigkeit vom Praxistyp, der Mitarbeiteranzahl sowie der Praxislage die Endometritis der dritt- bis fünfthäufigste Grund ist, weshalb adulte Pferde dort dem Tierarzt vorgestellt werden.
2.2.1 Infektiöse Endometritis
Es kommt zu Uterusinfektionen, wenn nach dem Eindringen von Erregern die uterinen Selbstreinigungsmechanismen versagen, wie es bei endometritis- empfänglichen Stuten der Fall ist, oder die Pathogenität der Erreger sowie der Infektionsdruck sehr hoch sind.
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Zu den möglichen Erregern einer Endometritis zählen Bakterien, Hefen und Pilze, wobei den Bakterien die größte Bedeutung zukommt. Hefen und Pilze werden vermehrt nach antibiotischen Behandlungen in Uterustupfern nachgewiesen (DASCANIO et al. 2001). Bei Versuchen von BLUE (1983) konnten bei 3 zuvor geschlechtsgesunden Stuten nach einer Penicillin-Behandlung und einer Manipulation des Uterus zweimal Aspergillus fumigatus und einmal Candida albicans nachgewiesen werden. Im Gastrointestinaltrakt kann es durch den Einsatz von Antibiotika zu einer Enteritis kommen, wenn die physiologische Keimflora aus dem Gleichgewicht gerät. Warum es im Uterus, der nach den meisten Literaturangaben steril ist, nach einer antibiotischen Behandlung vermehrt zu Pilz- und Hefeinfektionen kommt, ist noch unklar. Es wird vermutet, dass es vaginal zu einer Verschiebung der Keimflora zu Gunsten der Pilze und Hefen kommt und diese dann durch Bedeckungen oder Manipulationen in den Uterus gelangen und dort bei empfänglichen Stuten eine Endometritis verursachen (DASCANIO et al. 2001).
2.2.1.1 Endometritis und Nachweis aerober Bakterien
Bei Bakterien wird zwischen apathogenen, fakultativ pathogenen und obligat pathogenen Bakterien unterschieden.
Apathogene Bakterien des Uterus
Zu den im Uterus vorkommenden aeroben apathogenen Bakterien zählen Acinetobacter ssp., Actinobacillus ssp., Aerococcus ssp., α-hämolysierende Streptokokken, anhämolysierende Streptokokken, coryneforme Bakterien, Enterococcus ssp., Enterobacter ssp., E. coli, koagulasenegative Staphylokokken, Pasteurella ssp., Proteus ssp., Staphylococcus intermedius, Staphylococcus epidermidis (MERKT et al. 1987, ALBIHIN et al. 2003, KLEIN et al. 2009). Sie sind primär nicht dazu in der Lage, eine Infektion auszulösen, können aber zusammen mit
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fakultativ pathogenen Bakterien im Rahmen einer Endometritis nachgewiesen werden.
Fakultativ pathogene Bakterien des Uterus
Fakultativ pathogene Bakterien können bei Organismen mit einer Abwehrschwäche oder bei sehr hoher Keimdichte zu einer Infektion führen, während sie bei gesunden Organismen keine Auswirkung zeigen. Der Nachweis von fakultativ pathogenen Bakterien muss daher stets im Zusammenhang mit den klinischen Symptomen, der Intensität der Besiedlung sowie dem Vorkommen der Bakterien in Rein- oder Mischkultur bewertet werden (LEIDL et al. 1976). Die Wahrscheinlichkeit, dass Bakterien zu Uterusinfektionen führen können, ist bei dichten Reinkulturen größer als bei wenigen Bakterienkolonien in Mischkultur (TILLMANN et al. 1982, NIELSEN 2005). Beim Pferd werden in der Regel folgende aerobe Bakterienarten bzw. - gruppen den fakultativ pathogenen Bakterien des Uterus zugeordnet (LEIDL et al.
1976, RICKETTS 1981, TILLMANN et al. 1982, MERKT et al. 1987, ALBIHIN et al.
2003, KLEIN et al. 2009):
○ β-hämolysierende Streptokokken
○ E. coli variatio hämolytica
○ Klebsiella pneumoniae
○ Pseudomonas aeruginosa
○ Staphylococcus aureus
○ Taylorella equigenitalis
Seltener werden auch Proteus ssp. und Enterobacter aerogenes (RICKETTS 1981), nicht hämolysierende E. coli und Bordetella bronchiseptica (MERKT et al. 1987) sowie Actinobacillus equuli und Corynebacterium equi (TILLMANN et al. 1982) genannt.
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Die größte Bedeutung als Krankheitserreger haben die β-hämolysierenden Streptokokken, die für mehr als 50 % der bakteriellen Uterusinfektionen verantwortlich sind (MERKT et al. 1987, NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008).
Streptococcus equi ssp. zooepidemicus ist dabei die häufigste Ursache der Endometritis bei der Stute (MERKT et al. 1987, NIELSEN 2005). Aber auch die ebenfalls zu den β-hämolysierenden Streptokokken zählende Bakterienart Streptococcus dysgalactiae ssp. equisimilis wird gelegentlich im Rahmen der Endometritisdiagnostik in Uterustupferproben nachgewiesen. Das Verhältnis von Streptococcus equi ssp. zooepidemicus zu Streptococcus dysgalactiae ssp.
equisimilis beträgt dabei etwa 9 zu 1 (BOCKLISCH et al. 1988, PLAGEMANN 1988).
Bei 83,7 % der in Reinkultur nachgewiesenen β-hämolysierenden Streptokokken konnten TILLMANN et al. (1982) auch zytologisch eine entzündliche Reaktion des Endometriums feststellen. Klinisch auffällig ist bei Endometritiden durch β- hämolysierende Streptokokken vor allem die massive Produktion von wässrigem Exsudat, welches sich im Ultraschallbild gut darstellen lässt (DIMOCK und EDWARDS 1928, LEBLANC et al. 2007).
Während einige Autoren nur hämolysierende E. coli den fakultativ pathogenen Bakterien zuordnen (LEIDL et al. 1976), stufen andere Autoren auch ein auf der Agarplatte dominierendes Wachstum nicht hämolysierender E. coli (ALBIHIN et al.
2003, NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008) oder jegliches Wachstum nicht hämolysierender E. coli als fakultativ pathogen ein (TILLMANN et al. 1982, HUCHZERMEYER 2003, RIDDLE et al. 2007). Häufig wird auch gar nicht zwischen hämolysierenden und nicht hämolysierenden E. coli unterschieden. Bei den Studien, in denen eine Unterscheidung vorgenommen wurde, liegt der Anteil der hämolysierenden E. coli an den nachgewiesenen E. coli bei etwa 2 bis 6 % (ALBIHIN et al. 2003, FRONTOSO et al. 2008, NEUBERG 2009). Je nach äußeren Umständen, der Entnahmetechnik sowie dem Anteil fertiler und infertiler Stuten variiert der Anteil von E. coli an der Gesamtzahl der nachgewiesenen fakultativ pathogenen Bakterien. Bei den jährlichen Herbstuntersuchungen von Vollblutstuten von 1961 bis 1985 wurde in 11 % der 2118 Tupferproben mit fakultativ pathogenem
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Keimgehalt hämolysierende oder nicht hämolysierende E. coli nachgewiesen (MERKT et al 1987). NIELSEN (2005) und RIDDLE et al. (2007) erhielten mit 14 bzw. 15 % ähnliche Werte. Bei den Untersuchungen von ALBIHIN et al. von 2003 kamen nicht hämolysierende E. coli als häufigster Keim mit einen Anteil von mehr als 50 % vor. ALBIHIN et al. (2003) konnten außerdem eine signifikante Korrelation zwischen dem Nachweis nicht hämolysierender E. coli und wiederholtem symptomlosen Umrossen nachweisen. TILLMANN et al. (1982) stellten hingegen fest, dass nur 21,3 % der in Reinkultur nachgewiesenen hämolysierenden sowie nicht hämolysierenden E. coli-Isolate auch eine entzündliche Reaktion des Endometriums auslösten. Auch WAELCHLI et al. (1993) konnten bei in Reinkultur isolierten hämolysierenden sowie nicht hämolysierenden E. coli nur in 12,5 % der Fälle gleichzeitig eine positive zytologische Untersuchung nachweisen. Die Bedeutung von hämolysierenden sowie nicht hämolysierenden E. coli als Endometritiserreger ist demnach noch nicht vollständig geklärt. Klinisch gehen E. coli-Endometritiden häufig mit einem zähen Entzündungsexsudat einher (LEBLANC et al. 2007).
Klebsiella pneumoniae hat einen Anteil von 0 bis 11 % an der Gesamtheit der fakultativ pathogenen Bakterien des Uterus (MERKT et al. 1987, ALBIHIN et al.
2003, NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008). Bei den Untersuchungen von TILLMANN et al. (1982) induzierten sie, wenn sie als Reinkultur vorlagen, in 85,9 % der Fälle eine entzündliche Veränderung des Endometriums. Klebsiella pneumoniae- Endometritiden gehen bei der Stute meistens mit einem trüben, zähen sowie schleimigen Entzündungsexsudat im Uteruslumen einher (DIMOCK und EDWARDS 1928, WOOLCOCK 1980).
Der Anteil von Pseudomonas aeruginosa an den fakultativ pathogenen Bakterien liegt bei 6 bis 9 % (MERKT et al. 1987, NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008).
Klinisch treten Infektionen des Uterus mit Pseudomonas aeruginosa vor allem durch ein zähes, milchiges, weiß bis gelbgrünes Entzündungsexsudat in Erscheinung (DIMOCK und EDWARDS 1928, WOOLCOCK 1980).
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Staphylococcus aureus zählt zu den Plasmakoagulase-positiven Staphylokokken und macht 0 bis 5 % der fakultativ pathogenen Bakterien aus (MERKT et al. 1987, ALBIHIN et al. 2003, NIELSEN 2005, FRONTOSO et al. 2008). Einer der Hauptpathogenitätsfaktoren von Staphylococcus aureus ist die Biofilmbildung.
Taylorella equigenitalis ist der Erreger der meldepflichtigen kontagiösen equinen Metritis (contagious equine metritis, CEM). Es handelt sich bei der CEM um eine primäre Deckinfektion, die erstmals 1977 bei Vollblütern in Irland und Großbritannien nachgewiesen wurde (CROWHURST 1977, TIMONEY et al. 1977). Klinisch äußert sich die Erkrankung bei der Stute meistens als Endometritis und Vaginitis mit mukopurulentem Ausfluss, während sie beim Hengst in der Regel symptomlos verläuft (SELBITZ 2002, AURICH 2005). Begünstigt durch die hohe Infektiosität des Erregers, das Vorkommen latent infizierter Tiere beider Geschlechter sowie dem vermehrten internationalen Transport von Pferden kam es in den darauf folgenden Jahren zu einer weltweiten Verbreitung der Erkrankung. Durch die routinemäßige Untersuchung von Zuchttieren vor der Decksaison sowie Import- und Exportbestimmungen von Pferden und Tiefgefriersperma konnte die Erkrankung jedoch zurückgedrängt werden (TIMONEY und POWELL 1988, TIMONEY 1996).
Vereinzelt gibt es seitdem neue Krankheitsausbrüche, wobei meistens nur Einzeltiere oder kleine Gruppen betroffen sind (COOKE und PARKER 2003, KRISTULA und SMITH 2004).
Die Mehrzahl der als Endometritiserreger in Frage kommenden Bakterien sind demnach Opportunisten, die sowohl extragenitale Lokalisationen als auch die kaudalen Genitalorgane besiedeln. Der Fokus der Ursachenforschung der Endometritis liegt daher vermehrt auf prädisponierenden Faktoren, wie zum Beispiel einem mangelhaften Schamschluss oder anderen Defiziten im Bereich der uterinen Abwehrmechanismen (s. Kap. 2.1.3).
20 Obligat pathogene Bakterien des Uterus
Obligat pathogene Bakterien führen auch bei einem gesunden Organismus zu einer Erkrankung. Nach POHL et al. (1977) kommen sie im Genitaltrakt der Stute nicht vor.
ALLEN und NEWCOMBE (1979) sowie RICKETTS (1981) zählen allerdings die im Genitaltrakt vorkommenden Taylorella equigenitalis, einige Kapseltypen von Klebsiella pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa, die alle Erreger venerischer Infektionen sind, zu den obligat pathogenen Bakterien. Von anderen Autoren werden sie dagegen den fakultativ pathogenen Bakterien zugeordnet (LEIDL et al. 1976, TILLMANN et al. 1982).
2.2.1.2 Endometritis und Nachweis anaerober Bakterien
Die Kenntnisse über die Rolle anaerober Bakterien bei Genitalinfektionen in der Veterinärmedizin sind noch unzureichend, obwohl ihre Bedeutung für die Humanmedizin nachgewiesen ist (SZEMERÉDI et al. 2003). In der Routinediagnostik von Uterustupferproben ist der Nachweis anaerober Keime nicht mit eingeschlossen.
RICKETTS und MACKINTOSH (1987) haben 347 Proben aus dem Uterus von Stuten auf anaerobe Bakterien untersucht. In 119 (47 %) der 251 ungeschützten Tupfer, in 23 (32 %) der 84 geschützten Tupfer und in 7 (58 %) der 12 Uterusspülproben konnten sie anaerobe Bakterien nachweisen. Am häufigsten handelte es sich um Bacteroides fragilis, gefolgt von Fusobacterium mortiferum, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus ssp. und Clostridium perfringens. Die Autoren vermuteten, dass es sich bei Clostridium perfringens und Bacteroides fragilis um fakultativ pathogene Bakterien handelt, da ihr Nachweis in 39 % bzw. 30 % der Fälle mit positiven zytologischen Ergebnissen einherging. Das bei den 41 mit in die Untersuchung eingeschlossenen Maidenstuten in 21 (51 %) Proben anaerobe Bakterien nachgewiesen wurden, während die zytologische Untersuchung stets negativ ausfiel, führte zu der Annahme, dass der Uterus
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anaerobe Bakterien als ständige Oberflächenkommensalen aufweist. Von den 41 Proben der Maidenstuten wurden 29 mit ungeschützten Tupfern und 12 mit geschützten Tupfern entnommen. Von welchen Tupfern die 21 positiven Proben stammen, wurde jedoch nicht aufgeführt (RICKETTS und MACKINTOSH 1987).
Auch bei einer 1997 von LANGONI et al. durchgeführten Studie an 580 güsten Stuten konnte Bacteroides fragilis als häufigster anaerober Keim festgestellt werden.
Da der Nachweis von anaeroben Bakterien in 78,8 % der Fälle auch mit zytologischen Befunden einherging, vermuteten LANGONI et al. (1997) eine klinische Relevanz anaerober Bakterien. Von SZEMERÉDI et al. (2003) aus Ungarn liegen neuere Erkenntnisse über Bacteroides ureolyticus vor. Dieser Erreger wurde dort bei Stuten mit Uterusinfektionen und einer deutlichen Verringerung der Geburtenrate nachgewiesen. Es ist bekannt, dass Bacteroides ureolyticus die kaudalen Genitalorgane besiedelt und auch bereits beim Menschen bei Genitalinfektionen aus dem Gebärmutterbereich isoliert wurde (WOOLEY et al.
1992). Sowohl in der bakteriologischen Untersuchung als auch in der klinischen Symptomatik ähnelt er Taylorella equigenitalis (FODOR et al. 1995, SZEMERÉDI et al. 2003).
Es ist also davon auszugehen, dass Clostridium perfringens, Bacteroides fragilis sowie Bacteroides ureolyticus zu den fakultativ pathogenen Bakterien des Uterus zu zählen sind. Ob weitere anaerobe Bakterien beim Endometritisgeschehen der Stute eine Rolle spielen, ist allerdings noch nicht bekannt.
2.2.1.3 Pathogenitätsmechanismen
Im Rahmen einer Besiedlung des Uterus mit Bakterien kommt es zu komplexen Interaktionen zwischen dem Endometrium und den Bakterien. Die fakultativ pathogenen Bakterien des Uterus haben unterschiedliche Virulenzfaktoren und unterschiedliche Strategien, um die Immunantwort des Wirtes zu umgehen. Daraus resultieren spezifische Wirt-Pathogen-Interaktionen, die zu unterschiedlichen klinischen Symptomen und Laborbefunden führen. Neuere Studien weisen darauf
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hin, dass die Biofilmbildung von Bakterien ein sehr wichtiger Pathogenitätsfaktor ist, der in der Humanmedizin eine zunehmend größere Bedeutung hat (HALL- STOODLEY und STOODLEY 2009).
Bakterielle Biofilme
Bakterielle Biofilme sind definiert als strukturierte Bakterienzellkolonien, die von einer selbstproduzierten polymeren Matrix umgeben sind und einer lebenden oder inerten Oberfläche anhaften (COSTERTON et al. 1999). Biofilme kommen sowohl in der Natur als auch auf dem menschlichen Körper vor. Sie wachsen langsam und bestehen in der Regel aus verschiedenen Bakterienarten, die in den meisten Fällen ein Bestandteil der Normalflora sind. Aerobe und anaerobe Zonen können im Abstand von wenigen hundert Mikrometern vorkommen, so dass in Biofilmen auch aerobe und anaerobe Bakterien direkt nebeneinander leben können. Innerhalb eines Biofilms können Bakterien mit Hilfe von Autoinducern, wie zum Beispiel dem Acyl- Homoserinlakton, bestimmte genetische Programme aktivieren. Dieses als „quorum sensing“ bezeichnete Kommunikationssystem dient der Steuerung wichtiger Vorgänge der Biofilmbildung und des fertigen Biofilms (FUGUA et al. 1994, SZEWZYK und SZEWZYK 2003). Die Biofilmbildung beginnt mit der Anlagerung von Mikrokolonien an eine Oberfläche. Während dieser Anlagerungsphase der Bakterien kommt es zur Aktivierung bestimmter Gene und die Produktion der extrazellulären Matrix beginnt. Nach einer bestimmten Zeit differenzieren die Mikrokolonien zu echten Biofilmen. Die Oberflächen werden von den Biofilmen zunächst flächig besiedelt, später bilden sie auch mehrschichtige, heterogene Strukturen. Es stellt sich ein Gleichgewicht zwischen Erweiterung und Abbau des Biofilms ein. Koordiniert durch das „quorum sensing“ kommt es immer wieder zum Ablösen größerer Bakterienansammlungen, die versuchen, neue Oberflächen zu besiedeln (COSTERTON et al. 1999). Eine der wichtigsten Eigenschaften von bakteriellen Biofilmen ist ihre Resistenz gegenüber antibakteriellen Substanzen und bestimmten Komponenten des Immunsystems (DRENKARD 2003). Wahrscheinlich sind mehrere Mechanismen für diese erhöhte Resistenz verantwortlich. Eine Theorie besagt, dass
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die Penetration beeinträchtigt ist und antibakterielle Substanzen und Immunglobuline nur schwer durch die extrazelluläre Matrix zu den Bakterienzellen vordringen können (COSTERTON et al. 1999). Laut einer weiteren Hypothese ist an bestimmten Stellen des Biofilms das Nährstoffangebot limitiert und die Bakterienzellen zeigen dort einen reduzierten Stoffwechsel und langsame Wachstumsraten auf. Sie gehen zum Teil in einen totalen Ruhezustand (VBNC – „viable but not culturable“) über. Diese Bakterien sind wenig empfindlich gegenüber antibakteriellen Substanzen (STEWART 2002, SZEWZYK und SZEWZYK 2003). Eine dritte Theorie geht davon aus, dass es innerhalb eines Biofilms so genannte „Persister-Zellen“ gibt, die in der Anwesenheit von antimikrobiellen Substanzen weder wachsen noch sterben (BROOUN et al.
2000, HALL-STOODLEY et al. 2004). Dieses Phänomen entsteht nicht durch limitierte Nährstoffangebote, sondern durch Aktivierung bestimmter Gene innerhalb des Biofilms (COSTERTON et al. 1999). Der Biofilm als Lebensform hat sich so gut bewährt, dass die überwiegende Zahl der Bakterien in Form von Biofilmen lebt (HALL-STOODLEY et al. 2004).
Die klinische Bedeutung von Biofilmen wird häufig unterschätzt. So sind zum Beispiel beim Menschen wahrscheinlich in mehr als 60 % der bakteriellen Infektionen biofilmproduzierende Bakterien beteiligt (FUX et al. 2005). Wenn das Gleichgewicht innerhalb eines Biofilms gestört ist, können sich fakultativ pathogene Bakterien verstärkt vermehren und eine Infektion auslösen. Auch aus dem Biofilm abgelöste, freie fakultativ pathogene Bakterien können zu wiederkehrenden Infektionen und Symptomen führen (COSTERTON et al. 1999).
Typisch für Infektionen mit biofilmproduzierenden Bakterien sind chronische Erkrankungen mit wiederkehrenden Symptomen. Antimikrobielle Substanzen können zwar die freien Bakterien und die durch sie verursachten Symptome beseitigen, sind aber nicht dazu in der Lage, den Biofilm selber abzutöten. Es kommt in Folge der Entstehung von Biofilmen daher typischerweise auch nach antibiotischen Behandlungen zu erneuten Krankheitsausbrüchen (COSTERTON et al. 1999).
Biofilme werden in der Humanmedizin mit einer Reihe von Erkrankungen in
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Verbindung gebracht. Dazu zählen zum Beispiel die Endokarditis, Periodontitis, Prostatitis, Otitis media und Urethritis (COSTERTON et al. 1999, DRENKARD 2003).
Obwohl über das Vorkommen von Biofilmen bei Tieren bisher wenige Studien vorliegen, wird davon ausgegangen, dass sie auch hier häufig für zahlreiche Krankheiten, wie zum Beispiel Pneumonien, Enteritiden, Mastitiden und Wundinfektionen, verantwortlich sind (CLUTTERBUCK et al. 2007). Vermutlich spielt die Biofilmbildung auch im Rahmen der chronischen Endometritis bei der Stute eine wichtige Rolle (CAUSEY 2006, LEBLANC 2010). Zu den biofilmbildenden Bakterien, die regelmäßig aus dem Uterus der Stute isoliert werden, zählen Pseudomonas aeruginosa und E. coli (LEBLANC 2010).
Der Nachweis von Bakterien aus Biofilmen im Uterus stellt sich allerdings schwierig dar. Biofilminfektionen gehen in der Regel nicht mit der Produktion von wässrigem Entzündungsexsudat einher, so dass es schwierig ist, mit Uteruskulturtupfern bakterienenthaltendes Untersuchungsmaterial zu gewinnen. Manchmal sind auch nur bestimmte Bereiche des Uterus von der Biofilmbildung betroffen, die dann nicht zwangsläufig bei der Probenentnahme mit erfasst werden (LEBLANC 2010).
Außerdem können sich die entnommenen Bakterien auch in der Ruhephase befinden, in der sie zwar lebensfähig aber nicht kultivierbar sind (SARDESSAI 2005).
Virulenzfaktoren einiger Endometritiserreger
Ein wichtiger Pathogenitätsmechanismus von Bakterien ist die Adhäsion am befallenen Gewebe, um dadurch bestimmte Abwehrmechanismen des Wirtes zu umgehen. Die β-hämolysierenden Streptokokken haften durch fibronectinbindende Proteine an den endometrialen Epithelzellen (LINDMARK et al. 1996). Mittels einer Hyaluronsäurekapsel können sie der Phagozytose entgehen, da Hyaluronsäure als Bestandteil des normalen Wirtsgewebes keine Abwehrreaktion hervorruft (WIBAWAN et al. 1999). Einen weiteren Schutz vor der Phagozytose erreichen sie durch Antigenvariation und antiphagozytotische M-Proteine, welche die Aktivierung des Komplementsystems und die Funktion der Immunglobuline beeinträchtigen
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(WITTENBRINK et al. 2008). Außerdem setzen sie Streptokinasen, Superantigene und weitere Toxine frei, die zu einer Irritation des Endometriums sowie einer nachfolgenden starken Produktion von Entzündungsexsudat führen (CAUSEY 2006).
Entzündliches Sekret, dass im Uteruslumen verbleibt, führt zu einer zusätzlichen Behinderung des Komplementsystems (ASBURY et al. 1984).
Mit über 250 verschiedenen Serotypen ist E. coli ein sehr variantenreiches Bakterium, dass beim Menschen sowohl als harmloser Oberflächenkommensale als auch als primäre Ursache von urogenitalen Infektionen in Erscheinung tritt (KASPER et al. 2004). Für Endometritis induzierende E. coli wird bei der Stute eine in vitro Hämolyse auf Blutagar als ein wichtiges Pathogenitätsmerkmal gewertet. Die Hämolyse gilt dabei als Indikator für die Sezernierung zellschädigender bakterieller Produkte (WITTENBRINK et al. 2008). Bei Untersuchungen von E. coli-Isolaten, die im Uterus infertiler Stuten nachgewiesen wurden, konnte aber nur bei sehr wenigen Isolaten eine Hämolyse festgestellt werden (ALBIHIN et al. 2003, FRONTOSO et al.
2008, NEUBERG 2009). Viele Isolate von E. coli haben in vitro und in vivo die Fähigkeit, einen Biofilm zu bilden. In der Humanmedizin sind chronische Harnwegsinfektionen mit biofilmproduzierenden E. coli ein bekanntes Problem. Die E. coli-Bakterien schützen dabei sich selbst und andere Bakterien durch den Biofilm vor dem Immunsystem des Wirtes (EMODY et al. 2003, SOTO et al. 2006). Die Bindung von E. coli an Wirtszellen erfolgt mittels Fimbrien. Als weitere Virulenzfaktoren sind Endo-, Entero- und Cytotoxine für die Pathogenität von E. coli ausschlaggebend (SELBITZ 2002).
Klebsiella pneumoniae kann sich mit Hilfe von Fimbrien und einer Polysaccharidkapsel an endometriale Epithelzellen heften (FAVRE-BONTE et al.
1999). Die Kapsel wirkt zusätzlich als Barriere gegen Immunglobuline sowie Bestandteile des Komplementsystems und bietet dadurch einen Schutz vor der Phagozytose (DOMENICO et al. 1994). Die meisten klinisch bedeutsamen Klebsiella pneumoniae-Isolate sind bekapselt. Es lassen sich 77 verschiedene Kapseltypen unterscheiden (ØRSKOV 1984), wobei nur die Kapseltypen K1, K2, K5 und K7
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ursächlich mit der Endometritis bei der Stute in Verbindung gebracht werden (PLATT et al. 1976, SELBITZ 2002). Ein wichtiger Virulenzfaktor ist die Stärke der Bekapselung. Bei Versuchen von KIKUCHI et al. (1987) führten stark bekapselte Arten von Klebsiella pneumoniae Kapseltyp1 zu einer mittelgradigen bis hochgradigen Endometritis, schwach bekapselte Arten führten in der Hälfte der Fälle zu einer geringgradigen Endometritis und nicht bekapselte Arten konnten keine Endometritis induzieren. Ein weiterer Virulenzfaktor ist die Invasivität von Klebsiella pneumoniae. Untersuchungen von SAHLY et al. (2000) haben gezeigt, dass Klebsiella pneumoniae in humanen Epithelzellen der Harnblase, der Lunge und des Darmes invadieren kann (SAHLY et al. 2000, CORTES et al. 2002). Dies könnte die beim Menschen wiederkehrenden Harnwegsinfektionen durch Klebsiella pneumoniae sowie deren Resistenz gegen antibiotische Behandlungen erklären (SAHLY et al.
2000).
Durch die Bildung eines Biofilms kann sich Pseudomonas aeruginosa vor vielen Abwehrmechanismen des Wirtes schützen. Die Biofilmbildung führt häufig zu persistierenden Infektionen sowie zu einer hohen Resistenz des Erregers gegen viele antimikrobiell wirksame Substanzen (DRENKARD 2003, LEBLANC 2010). Die Adhäsion an Epithelzellen des Uterus erfolgt bei Pseudomonas aeruginosa durch Fimbrien, die an Oberflächenrezeptoren der Wirtszellen binden. Weitere Virulenzfaktoren sind Endotoxine, Exotoxine wie das Exotoxin A und Enzyme wie Hämolysine und Proteasen (SELBITZ 2002).
2.2.2 Nicht infektiöse Endometritis
Zu den Ursachen einer nicht infektiösen Endometritis zählen unter anderem Urinansammlungen, eine Pneumovagina, Spermaexpositionen, immunologische Reaktionen auf Fremdproteine und intrauterine Infusionen mit irritierenden Substanzen (RIDDLE et al. 2007).
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Die persistierende besamungsinduzierte Endometritis ist ein Sonderfall der chronischen Endometritis. Durch eine Paarung oder künstliche Besamung kommt es zur Übertragung von Samen und Bakterien in das Uteruslumen. Spermatozoen sind beim Pferd hochpotente Auslöser einer Entzündung des Endometriums, so dass es zu einer physiologischen transienten postkoitalen Endometritis kommt. Sie dauert etwa 48 bis 72 Stunden und dient der Beseitigung von überflüssigem Sperma, Bakterien, Zelltrümmern und anderen Kontaminanten aus dem Uteruslumen. Wenn uterine Abwehrmechanismen defekt sind, entsteht aus der physiologischen postkoitalen Endometritis die persistierende besamungsinduzierte Endometritis. Die Rolle der Bakterien ist dabei noch nicht vollständig geklärt. Zwar werden sie postkoital auch häufiger nachgewiesen, aber der ursprüngliche entzündungs- auslösende Stimulus wird den Spermatozoen zugesprochen (WATSON 2000, TROEDSSON 2006, NASH et al. 2008). Im Gegensatz zu der chronischen infektiösen Endometritis, die in der Regel antibiotisch behandelt wird, dient die Behandlung der persistierenden besamungsinduzierten Endometritis insbesondere der Unterstützung der uterinen Abwehrmechanismen.
2.3 Nachweis von Bakterien
2.3.1 Probenentnahme
Von großer Bedeutung für die Endometritisdiagnostik ist die strikt intrauterine Probenentnahme, da verschiedene Studien gezeigt haben, dass eine zervikal entnommene Probe nicht den intrauterinen Zustand widerspiegelt (NEWCOMBE 1978, KLEIN et al. 2009). Bei Stuten können intrauterine Proben zu jedem Zeitpunkt des Zyklus genommen werden, da die Zervix auch im Diöstrus passierbar ist. Von den meisten Autoren wird aber eine Probenentnahme im Östrus empfohlen (ALLEN und NEWCOMBE 1979, RICKETTS 1981, WINGFIELD DIGBY und RICKETTS 1982, NIELSEN 2005). Die Zervix ist in dieser Zyklusphase leichter passierbar und
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die endometriale Sekretion sorgt für eine ausreichende Benetzung der Entnahmegeräte mit Untersuchungsmaterial. Außerdem ist bei einer Probenentnahme im Diöstrus das Risiko einer iatrogenen Infektion erhöht, da die Infektionsabwehr unter Progesteroneinfluss herabgesetzt ist.
Uterustupfer
Um eine Kontamination des Tupfers mit Keimen aus Vestibulum, Vagina oder Zervix zu vermeiden, werden geschützte Tupfersysteme empfohlen. (ALLEN und NEWCOMBE 1979, BLANCHARD et al. 1981, RICKETTS 1981). Es stehen zur kontaminationsarmen Probenentnahme inzwischen kommerziell erhältliche doppelt geschützte Tupfersysteme zur Verfügung, bei denen der eigentliche Tupfer durch 2 Kunststoffhüllen geschützt ist. Zur Entnahme wird hierbei die äußere Hülle in den Zervikalkanal eingeführt, dann die innere Hülle in das Uteruslumen vorgeführt und erst danach der Tupfer nach kranial vorgeschoben. Das Entfernen erfolgt in umgekehrter Reihenfolge.
Das Einführen des Tupfers kann entweder mittels Spreizspekulum und Zervixfasszange oder transvaginal mit einer handschuhgeschützten Hand erfolgen.
Bei der Probenentnahme mittels Spekulum wird unter optischer Kontrolle die Zervix ventral mit der Zervixfasszange fixiert. Durch Zug an der Zervixfasszange wird der Zervikalkanal gestreckt und der Tupfer kann leichter eingeführt werden. MERKT et al. (1987) hielten den Einsatz der Zervixfasszange vor allem bei Stuten im Diöstrus mit geschlossener Zervix für wichtig. Bei der manuellen transvaginalen Proben- entnahme wird der Tupfer unter der handschuhgeschützten Hand vaginal eingeführt, die Zervix mittels Zeigefinger passiert und der Tupfer nach kranial in den Uterus vorgeschoben. Diese Entnahmetechnik ist jedoch häufiger von Kontaminationen mit Bakterien aus den kaudalen Abschnitten der Genitalorgane betroffen (WAELCHLI et al. 1992, HANDLER 2005). WAELCHLI et al. (1992) verglichen die Kontamination von Uterustupfern mit vulvovestibulären Bakterien bei der Entnahme mittels Spekulum mit der manuellen transvaginalen Entnahme. Sie applizierten dafür
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Streptomycin-resistente E. coli-Stämme, die nicht im Genitaltrakt von Stuten vorkommen, als Marker in den vulvovestibulären Bereich. Bei den Tupferproben, die manuell transvaginal entnommen wurden, konnten signifikant häufiger die Marker- Bakterien nachgewiesen werden als bei den Proben, die mittels Spekulum entnommen wurden. Eine Kontamination mit den Marker-Bakterien konnte aber auch bei den mit Spekulum entnommenen Proben nicht vollständig ausgeschlossen werden. Zu bedenken ist hierbei, dass WAELCHLI et al. (1992) die Versuche mit einfach geschützten und nicht mit doppelt geschützten Systemen durchgeführt haben.
In der Fachliteratur wird demzufolge eine Probenentnahme mit doppelt geschützten Tupfersystemen mit Hilfe eines Spekulums und einer Zervixfasszange empfohlen (WAELCHLI et al. 1992, HANDLER 2005). Laut der Gesellschaft für Pferdemedizin (Rundschreiben 1998) ist jedoch die transvaginale manuelle Entnahmetechnik ein international übliches Verfahren und die Verwendung eines Spekulums bei der Tupferentnahme nicht zwingend notwendig.
Bei der Probenentnahme für molekularbiologische Untersuchungen muss zusätzlich beachtet werden, dass die kommerziell erhältlichen Uterustupfer zwar steril sind, aber trotzdem inaktivierte bakterielle DNA enthalten können, die mit den molekularbiologischen Methoden erfasst werden kann. Die Tupfer müssen also einer zusätzlichen DNA-zerstörenden Behandlung, wie zum Beispiel einer UV- Bestrahlung, unterzogen werden.
Uterusspülung
Bei der Uterusspülung mit geringem Volumen werden 50 bis 60 ml einer sterilen Kochsalzlösung durch einen Uteruskatheter in das Uteruslumen instilliert. Die Einführung des Katheters geschieht dabei transvaginal durch eine handschuhgeschützte Hand. Von rektal erfolgt eine Massage des Uterus, um die Lösung gleichmäßig zu verteilen. Anschließend wird die Flüssigkeit entweder der
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Schwerkraft folgend oder durch Aspiration zurückgewonnen und zentrifugiert. Das dadurch gewonnene Sediment kann dann für die bakteriologische und zytologische Untersuchung genutzt werden. Als Vorteile dieser Technik gelten die Materialgewinnung von einer größeren Fläche des Endometriums und die Konzentration der Mikroorganismen während der Zentrifugation. Bei Versuchen von BALL et al. (1988) konnten bei normalen und bei subfertilen Stuten durch Uterusspülungen mit geringem Volumen signifikant häufiger Bakterien nachgewiesen werden als bei der Tupferentnahme. LEBLANC et al. untersuchten 2007 Uterusspülproben von 308 subfertilen Stuten. Sie konnten in 282 (70 %) Proben Bakterien nachweisen, wobei E. coli, gefolgt von den β-hämolysierenden Streptokokken, am häufigsten isoliert wurde. Verglichen mit den Ergebnissen von 498 untersuchten Tupferproben aus der Praxis von LeBlanc waren das etwa doppelt so viele positive Ergebnisse und E. coli konnte signifikant häufiger nachgewiesen werden. Von den 282 positiven Uterusspülproben wiesen aber nur 86 (30 %) auch eine positive zytologische Untersuchung auf. Wurde die Anwesenheit von Neutrophilen als einziges Anzeichen einer Entzündung gewertet, waren 196 (70 %) der von LEBLANC et al. (2007) untersuchten 282 positiven Proben falsch positiv oder enthielten Bakterien, die als Oberflächenkommensalen den Uterus besiedeln.
Wenn aber das Vorkommen von Debris in der Zytologie und ein trübes Aussehen des Effluxes mit als Entzündungsanzeichen gewertet wurden, reduzierte sich die Anzahl falsch positiver Resultate auf nur noch 11 %. LEBLANC et al. (2007) räumten selber ein, dass es bei der Uterusspülung zu Kontaminationen kommen kann, da es sich um ein ungeschütztes Entnahmesystem handelt, das transvaginal manuell eingeführt wird. Es lässt sich also nicht eindeutig sagen, ob es sich bei der Uterusspülung um eine sehr sensitive Methode handelt oder ob die vielen positiven Proben und der häufige Nachweis von E. coli teilweise auch als Kontaminationen gewertet werden müssen.
