Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2009
© 2009 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany
ISBN 978-3-941703-09-4
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net
www.dvg.net
Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Eutergesundheit von Ziegen sowie
durchflusszytometrische Differenzierung capriner Milchzellen
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Annika Boulaaba, geborene Schieffer Wuppertal
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Günter Klein
Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Günter Klein
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Martina Hoedemaker, Ph. D.
Klinik für Rinder
Tag der mündlichen Prüfung: 06. Mai 2009
Meiner Familie
Teilergebnisse dieser Arbeit wurden an folgender Stelle veröffentlicht:
A. BOULAABA, G. KLEIN (2008):
Entwicklung einer durchflusszytometrischen Schnellmethode zur Differenzierung somatischer Zellen aus Ziegenmilch.
In: 49. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebensmittelhygiene“ der DVG, Garmisch- Partenkirchen 29.09.-02.10.2008, Sonderausgabe Amtstierärztlicher Dienst, 207
Inhaltsverzeichnis
Annika Boulaaba
Untersuchungen zur Eutergesundheit von Ziegen sowie durchflusszytometrische Differenzierung capriner Milchzellen
1 EINLEITUNG... 1
2 LITERATURÜBERSICHT ... 3
2.1 Umfang und Bedeutung der Ziegenhaltung ... 3
2.2 Anatomie und Physiologie der laktierenden Milchdrüse... 4
2.3 Abwehrfunktionen der Milchdrüse... 5
2.3.1 Zitzenbarriere und Abwehrfunktionen des Milchdrüsenepithels ... 5
2.3.2 Zelluläre und humorale Abwehrmechanismen ... 5
2.4 Mastitis... 6
2.4.1 Definition der Mastitis bei Ziegen und Kühen ... 6
2.4.2 Verlaufsformen der Mastitis... 8
2.4.3 Euterpathogene Keime in Ziegenmilch... 9
2.4.4 Diagnostik von Mastitiden ... 12
2.5 Somatische Zellen in der Ziegenmilch ... 17
2.5.1 Ermittlung des Gehaltes an somatischen Zellen in Ziegenmilch ... 17
2.5.2 Bestimmung eines Grenzwertes für eutergesunde Hälften ... 20
2.5.3 Beeinflussung des Zellgehaltes durch nicht-infektiöse Ursachen... 23
2.5.4 Herkunft und Funktion der somatischen Zellen ... 24
2.5.5 Morphologie somatischer Zellen... 26
2.5.6 Das Differentialzellbild in Blut und Milch der Ziege... 27
2.5.7 Vorteile der Zelldifferenzierung in der Mastitisdiagnostik ... 29
2.6 Erkenntnisse zu zytoplasmatischen Partikeln ... 30
2.7 Ermittlung von Differentialzellbildern durch lichtmikroskopische Methoden ... 31
2.7.1 Färbungen zur lichtmikroskopischen Differenzierung von somatischen Zellen ... 31
2.7.2 Herstellung der Milchausstriche für die Lichtmikroskopie... 33
2.8 Durchflusszytometrische Zelldifferenzierung ... 35
2.8.1 Prinzip der Durchflusszytometrie... 35
2.8.2 Differenzierung mit Hilfe monoklonaler Antikörper ... 36
2.8.3 Differenzierung mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen ... 42
2.8.4 Methodik der Zellgewinnung für die Durchflusszytometrie ... 44
2.8.5 Durchflusszytometrisch bestimmte Zelldifferentialbilder... 46
2.9 Vitalitätsbestimmung von Milchzellen ... 46
2.10 Zusammenfassende Auswertung der Literaturübersicht... 47
3 MATERIAL UND METHODEN... 49
3.1 Betriebe………49
3.1.1 Betrieb A ... 49
3.1.2 Betrieb B ... 49
3.1.3. Betrieb C ... 50
3.2 Material ... 51
3.2.1 Medien, Puffer, Lösungen ... 51
3.2.2 Antikörper... 53
3.2.3 Fluoreszenzfarbstoffe... 56
3.2.4 Technische Geräte ... 57
3.3 Methoden... 58
3.3.1 Entnahme der Blutproben ... 58
3.3.2 Gewinnung von Blutleukozyten ... 58
3.3.3 Entnahme der Milchproben ... 59
3.3.4 Analyse der Milchproben... 61
3.3.5 Gewinnung somatischer Zellen aus Ziegenmilch ... 65
3.3.6 Prinzip der Durchflusszytometrie... 66
3.3.7 Charakterisierung von Zellen durch Membranimmunfluoreszenz ... 68
3.3.8 Durchflusszytometrische Analyse mit Fluoreszenzfarbstoffen ... 75
3.3.9 Mikroskopische Beurteilung ... 83
3.4 Übersicht zum Versuchsaufbau ... 86
3.5 Statistische Auswertungen... 88
4 ERGEBNISSE ... 90
4.1 Untersuchungen zu Mastitiserregern und Zellgehalt in Hälftengemelksproben . ... 90
4.1.1 Bakteriologische Befunde... 90
4.1.2 Untersuchungen bezüglich des Gehaltes an somatischen Zellen in Ziegenmilch... 95
4.1.3 Vergleich der Zellzahlergebnisse mit dem Ergebnis des Schalm-Test... 109
4.2 Bestimmung des Gehaltes an zytoplasmatischen Partikeln... 110
4.3 Bestimmung der Parameter elektrische Leitfähigkeit und NAGase-Aktivität in Ziegenmilch... 113
4.3.1 Elektrische Leitfähigkeit der Ziegenmilch ... 113
4.3.2 NAGase-Aktivität in Ziegenmilch ... 116
4.4 Korrelationen der untersuchten Parameter ... 119
4.5 Voruntersuchungen zur Zuordnung einzelner Zellpopulationen in einem durchflusszytometrischen Dotplot ... 121
4.5.1 Überprüfung der Bindung ausgewählter Antikörper an caprine Leukozyten... ... 121
4.5.2 Zuordnung einzelner Wolken in einem Dotplot unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen... 123
4.5.3 Spezifische Färbung von somatischen Zellen durch den DNA-
Fluoreszenzfarbstoff DRAQ5™... 133
4.5.4 Überprüfung der Selektivität von DRAQ5™ für somatische Zellen ... 135
4.5.5 Einsatz des DNA-Farbstoffes DRAQ5™ in Kombination mit SYTO®13 ... 138
4.5.6 Darstellung toter Zellen in mit SYTO®13 versetzten Proben ... 142
4.5.7 Spezifische Färbung von somatischen Zellen durch den Fluoreszenzfarbstoff Acridinorange... 148
4.5.8 Entwicklung einer Maske zur schnellen Differenzierung von somatischen Zellen aus Ziegenmilch ... 151
4.5.9 DNA-negative Partikel in Zellsuspensionen aus Kuhmilch ... 153
4.6 Bestimmung von Präzision und Wiederholbarkeit der Schnellmethoden ... 155
4.6.1 Präzision und Wiederholbarkeit der SYTO®13-Schnellmethode ... 156
4.6.2 Präzision und Wiederholbarkeit der TO-PRO®-3-Schnellmethode ... 157
4.7 Übereinstimmung der Ergebnisse von mikroskopischer Differenzierung und Schnellmethoden ... 158
4.7.1 Genereller Vergleich der verschiedenen Methoden ... 159
4.7.2 Vergleich der Methoden in verschiedenen Zellzahlklassen... 162
4.8 Bewertung der Ergebnisse der durchflusszytometrischen und mikroskopischen Schnellmethoden unter Berücksichtigung der Eutergesundheit... 168
4.8.1 Entzündungsparameter ... 169
4.8.2 Zelldifferentialbilder unter Berücksichtigung des mikrobiologischen Befundes ... 170
4.8.3 Aussagekraft der durchflusszytometrischen und mikroskopischen Differentialzellbilder ... 175
4.8.4 Abhängigkeit benachbarter Hälften ... 176
4.9 Verlaufsuntersuchungen von Zelldifferentialbildern ... 178
4.9.1 Verlaufsuntersuchung der Zelldifferentialbilder von Ziegen mit negativem bakteriologischen Euterbefund... 178
4.9.2 Verlaufsuntersuchung von Differentialzellbildern aus Euterhälften mit Mastitiserregern... 181
4.10 Anteile vitaler und toter Zellen in Ziegenmilch ... 183
5 DISKUSSION ... 186
5.1 Untersuchungen zu Mastitiserregern und Zellgehalt in Hälftengemelksproben . ... 187
5.1.1 Bakteriologische Befunde... 187
5.1.2 Untersuchungen bezüglich des Gehaltes an somatischen Zellen ... 191
5.1.3 Vergleich der Zellzahlergebnisse mit dem Ergebnis des Schalm-Test... 197
5.2 Bestimmung des Gehaltes an zytoplasmatischen Partikeln... 199
5.3 Bestimmung der Parameter elektrische Leitfähigkeit und NAGase-Aktivität in Ziegenmilch... 200
5.3.1 Elektrische Leitfähigkeit der Ziegenmilch ... 200
5.3.2 NAGase-Aktivität in Ziegenmilch ... 202
5.4 Betrachtung der Grenzwertproblematik für den Gehalt an somatischen Zellen
in Hälftengemelken ... 204
5.5 Voruntersuchungen zur Zuordnung einzelner Zellpopulationen in einem durchflusszytometrischen Dotplot ... 206
5.5.1 Überprüfung der Bindung ausgewählter Antikörper an caprine Leukozyten... ... 206
5.5.2 Zuordnung einzelner Wolken in einem Dotplot unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen... 208
5.5.3 Spezifische Färbung von somatischen Zellen durch den DNA- Fluoreszenzfarbstoff DRAQ5™... 213
5.5.4 Überprüfung der Selektivität von DRAQ5™ für somatische Zellen ... 213
5.5.5 Einsatz des DNA-Farbstoffes DRAQ5™ in Kombination mit SYTO®13 ... 214
5.5.6 Position von caprinen und bovinen Makrophagen in einem Dotplot... 215
5.5.7 Darstellung toter Zellen in mit SYTO®13 versetzten Proben ... 219
5.5.8 Spezifische Färbung von somatischen Zellen durch den Fluoreszenzfarbstoff Acridinorange... 220
5.5.9 Entwicklung einer Maske zur schnellen Differenzierung von somatischen Zellen aus Ziegenmilch ... 221
5.6 Bestimmung von Präzision und Wiederholbarkeit der Schnellmethoden ... 224
5.7 Übereinstimmung der Ergebnisse von mikroskopischer Differenzierung und Schnellmethoden ... 224
5.7.1 Genereller Vergleich der verschiedenen Methoden ... 224
5.7.2 Vergleich der Methoden in verschiedenen Zellzahlklassen... 225
5.7.3 Differentialzellbilder ... 226
5.8 Bewertung der Ergebnisse der durchflusszytometrischen- und mikroskopischen Schnellmethoden unter Berücksichtigung der Eutergesundheit... 228
5.8.1 Entzündungsparameter ... 228
5.8.2 Zelldifferentialbilder unter Berücksichtigung des mikrobiologischen Befundes ... 229
5.8.3 Aussagekraft der durchflusszytometrischen und mikroskopischen Differentialzellbilder ... 230
5.8.4 Abhängigkeit benachbarter Hälften ... 231
5.9 Verlaufsuntersuchungen von Zelldifferentialbildern ... 231
5.10 Anteile vitaler und toter Zellen in Ziegenmilch ... 232
6 SCHLUSSFOLGERUNG ... 234
7 ZUSAMMENFASSUNG ... 235
8 SUMMERY ... 239
9 ANHANG... 242
9.1 Material ... 242
9.1.1 Geräte ... 242
9.1.2 Glasartikel und Verbrauchsmaterialien... 244
9.1.3 Reagenzien ... 247
9.1.4 Medien, Puffer, Lösungen ... 250
9.2 Abbildungsverzeichnis ... 251
9.3 Tabellenverzeichnis ... 254
9.4 Abkürzungsverzeichnis ... 258
10 LITERATURVERZEICHNIS ... 261
11 DANKSAGUNG ... 284
1 Einleitung
Der Konsum von Ziegenmilch und Produkten aus Ziegenmilch hat in den letzten Jahren in Deutschland an Bedeutung gewonnen. Produkte mit großer Nachfrage wie z.B. Ziegenweichkäse, werden zu einem großen Anteil aus den Nachbarstaaten Niederlande und Frankreich importiert. In den Niederlanden stieg die Anzahl der Ziegenbestände vom Jahr 2000 bis 2005 um 63 % an, aber auch in Deutschland konnte ein Anstieg der Bestände um 21 % verzeichnet werden. In der BRD wurden im Jahr 2006 ca. 35.000 Tonnen Ziegenmilch produziert. Vor allem Bio-Ziegenmilch und Bio-Ziegenmilchprodukte haben bei den Verbrauchern einen hohen Stellenwert.
Produkte aus Ziegenmilch, wie Käse und Quark, finden nicht nur in
„Feinschmeckerkreisen“ großen Anklang. Insbesondere gilt sie als Alternative für Kuhmilchallergiker und wird von Erwachsenen und Kindern häufig aus gesundheitlichen Gründen verzehrt.
Zur Herstellung von Ziegenmilchprodukten muss die Ziegenmilch bestimmte Anforderungen in ihrer Zusammensetzung und mikrobiologischen Beschaffenheit erfüllen. Im Gegensatz zu Kuhmilch sind diese Anforderungen zum Teil noch nicht gesetzlich geregelt, z. B. gibt es keine Grenzwerte für den Gehalt an somatischen Zellen. Zahlreiche wissenschaftliche Studien weisen bezüglich des Gehaltes an somatischen Zellen in Ziegenmilch zum Teil erhebliche Unterschiede auf. Bei Kühen wird die Anzahl somatischer Zellen in der Milch heute weltweit als Schlüsselparameter zur Kategorisierung der Eutergesundheit verwendet.
Differentialzellbilder aus Kuhmilch können Hinweise auf Mastitiden geben, da sich das Verhältnis der einzelnen Zellarten wie z.B. polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN), Lymphozyten (LYM) und Makrophagen (MAK) zueinander ändert. Derartige, hauptsächlich mikroskopisch untersuchte, zytologische Reaktionen sind schon in sehr frühen Stadien einer Mastitis nachweisbar. Für Ziegenmilch gibt es keine routinemäßige Untersuchung von Zelldifferentialbildern, da die Färbung und Differenzierung von Zellen mittels mikroskopischer Methoden aufgrund der in der Ziegenmilch vorhandenen zytoplasmatischen Partikel (ZP) sehr zeit- und arbeitsintensiv ist.
Ziel dieser Arbeit war zum einen die Ermittlung eventueller Zusammenhänge zwischen dem Gehalt an somatischen Zellen und anderen Eutergesundheitsparametern (Leitfähigkeit und NAGase-Aktivität) sowie dem mikrobiologischem Euterbefund. Zum anderen sollte eine Methode zur Differenzierung der somatischen Zellen aus Ziegenmilch in dem Durchflusszytometer FACSCalibur™ erarbeitet werden. Auf diese Weise sollte die Untersuchung der Zusammensetzung einzelner Populationen von somatischen Zellen in Ziegenmilch vereinfacht werden. Insbesondere sollten auch die ZP hinsichtlich ihrer Anzahl pro ml Milch und ihrer Lage in einem durchflusszytometrischen Dotplot analysiert werden.
Der direkte Vergleich von durchflusszytometrisch bestimmten und mikroskopisch ermittelten Zelldifferentialbildern fand unter besonderer Berücksichtigung der Eutergesundheit der beprobten Ziegen statt.
Insbesondere für die gesundheitlich empfindlicheren Konsumenten von Ziegenmilch ist es wichtig, dass einwandfreie Milch gesunder Tiere produziert wird. Außerdem gehören auch bei der Ziege Euterentzündungen zu den ökonomisch bedeutsamsten Erkrankungen. Sämtliche in der vorliegenden Arbeit vorgenommenen Untersuchungen dienten dem Ziel, die Eutergesundheit von Ziegen besser einschätzen zu können.
2 Literaturübersicht
2.1 Umfang und Bedeutung der Ziegenhaltung
Der Hauptanteil der Ziegenmilch in Europa wird in den Mittelmeerländern produziert.
Auf europäischer Ebene sind nur sehr wenige statistische Daten über die Ziegenhaltung und Zucht verfügbar. Zudem werden in den Statistiken Schafe und Ziegen meist zusammengefasst. Im Jahr 2001 gab es rund 102,5 Mio. Ziegen und Schafe in der EU (DOPPELBAUER 2002). In Deutschland stieg die Zahl der Ziegenbestände seit dem Jahr 2000 um 21,4 % auf 170.000 Bestände im Jahr 2005 an, in den Niederlanden konnte sogar ein Wachstum um 63 % verzeichnet werden (HOFER 2007). Allerdings können solche Zahlen für Deutschland nur geschätzt werden, da Ziegen seit 1977 nicht mehr in den Agrarstatistiken vermerkt werden.
Auch über die Menge an erzeugter Ziegenmilch liegen in Deutschland keine genauen Zahlen vor, da es nur wenige Ziegenmilch verarbeitende Molkereien gibt und der überwiegende Teil in Hofkäsereien verarbeitet und ab Hof oder über Wochenmärkte vermarktet wird.
Obwohl Ziegen hauptsächlich zur Milchgewinnung gehalten werden, dienen sie auch zur Erzeugung von Ziegenlammfleisch (Burenziegen) und zur Wollgewinnung (Angoraziegen). Weltweit gibt es ca. 130 Ziegenrassen. In Niedersachsen werden vorwiegend die Bunte Deutsche Edelziege (44 %) und die Weiße Deutsche Edelziege (28 %) zur Milchgewinnung gehalten (LANDESVERBAND NIEDERSÄCHSISCHER ZIEGENZÜCHTER E.V. 2008).
Weltweit gesehen ernähren sich mehr Menschen von Ziegenmilch als von der Milch anderer Tierarten. Patienten mit Kuhmilchallergie, die vor allem durch das Molkeprotein ß- Laktoglobulin hervorgerufen wird, tolerieren häufig Ziegenmilch.
Beobachtungen in den USA ergaben, dass 40 - 100 % der Kuhmilchallergiker Ziegenmilch gut vertragen und diese insbesondere als Säuglingsersatznahrung große Vorteile gegenüber Kuh- und Sojamilchprodukten bringen kann (PARK 1994).
2.2 Anatomie und Physiologie der laktierenden Milchdrüse
Die Milchdrüse der Ziege ist eine modifizierte exokrine, tubuloalveolär zusammengesetzte Schweißdrüse (BRAGULLA u. KÖNIG 1999). Sie wird wie bei allen Wiederkäuern Euter (Uber) genannt, und besteht bei der Ziege aus zwei Mammarkomplexen, die bilateral symmetrisch an der ventralen Rumpfwand gelegen sind. Eine Milchdrüseneinheit besteht aus Drüsenkörper (Corpus mammae) und Zitze (Papilla mammae). In den Bindegewebszügen (Septa interlobularia), die mit dem Drüsenparenchym zusammen den Mammarkomplex bilden, finden sich neben den spezifischen Zellkomponenten des Bindegewebes auch Abwehrzellen des Immunsystems, wie Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen. In den Drüsenalveolen, den kleinsten morphologischen Einheiten des Drüsenparenchyms, wird die Milch gebildet und sezerniert (HABERMEHL 1996; BRAGULLA u. KÖNIG 1999).
Die Kolostralmilchphase der Ziege ist mit 4 - 5 Tagen vergleichbar mit derjenigen der Milchkuh. Reife Milch kann ab dem zehnten Tag gewonnen werden, bei der Kuh hingegen erst ab dem sechzehnten Tag (LÖHLE u. ZASTROW 1989; MIELKE 1994).
Die Dauer der Laktationsperiode beträgt bei der Ziege ca. 200 - 250 Tage, variiert aber abhängig von der Rasse. Die Milchleistung hängt von vielen Faktoren wie z.B.
Klima, Gesundheitszustand, Laktationsnummer und Rasse ab. Durchschnittlich geben Bunte Deutsche Edelziegen 750 kg Milch in 280 bis 300 Melktagen, die Weiße Deutsche Edelziege gibt 900 kg in 280 Melktagen (GALL 2001; SAMBRAUS 2001).
Als Involution der Milchdrüse wird die Rückbildung des Euters bezeichnet, die Drüsenepithelzellen verlieren dann ihre Fähigkeit Milch zu sezernieren. Gemolkene Tiere werden in der Regel im Winter trocken gestellt. Hier spricht man von einer ausgelösten Involution. Im Gegensatz zu Schafen (32 d) und Pferden dauert die Involution bei der Ziege mit ca. 100 Tagen verhältnismäßig lange (LEE u.
LASCELLES 1969; GEYER et al. 1986).
Ziegenmilch besteht nach SCHLIMME und BUCHHEIM (1999) zu 86,8 % aus Wasser. Fett (4,5 %) und Laktose (4,1 %) machen die Hauptinhaltsstoffe aus, gefolgt von Proteinen (2,9 %) und Asche (0,8 %).
2.3 Abwehrfunktionen der Milchdrüse
Die Infektionsabwehr in der Milchdrüse erfolgt durch das spezifische und unspezifische Immunsystem sowie durch die lokalen Abwehrmechanismen im Euter.
2.3.1 Zitzenbarriere und Abwehrfunktionen des Milchdrüsenepithels Die Epithel- und Zitzenbarrieren bilden die erste Stufe der lokalen Immunabwehr. Es folgen dann die zellulären und humoralen Abwehrmechanismen (CRAVEN u.
WILLIAMS 1985). Während der Trockenstehphase wird der Strichkanal durch eine Agglomeration des Zitzenkanalkeratins verstärkt. Dieses bildet durch bakterizide Fettsäuren und Lipide einen Schutz gegen Mikroorganismen. Der Zitzensphinkter verschließt den Strichkanal. Eine Fürstenbergsche Rosette, die beim Rind die örtliche Abwehr unterstützt, gibt es bei der Ziege nicht.
Das nach außen gerichtete Wachstum des Epithels und die physiologische Hyperkeratose (intensive Verhornung), insbesondere an der Strichkanalmündung, bedingen die primäre Schutzfunktion.
Das Epithel der Milchgänge ist Bestandteil der Blut-Milch-Schranke. Diese ermöglicht die Invasion von Lymphozyten, Granulozyten und Makrophagen in die Milchdrüse.
Der regelmäßig erfolgende, nach außen gerichtete Milchentzug hat einen reinigenden Effekt und unterstützt die Aufgaben des Milchdrüsenepithels (MICHEL u.
SCHULZ 1987).
2.3.2 Zelluläre und humorale Abwehrmechanismen
Hierzu gehören die Lymphozyten, die polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) sowie die Makrophagen. Sie kommen in den Bindegeweben der Milchzisterne, der Milchgänge und des Parenchyms der Milchdrüse sowie in der Milch selbst vor. Als humorale Abwehrfunktionen der Milchdrüse werden das Lactoperoxidase-Thiocyanat-Wasserstoffperoxidat-System, die Immunglobuline, das Lactoferrin und das Komplementsystem bezeichnet (MIELKE 1994).
2.4 Mastitis
Als Mastitis wird die Entzündung des Euters bezeichnet. Sie hat vielfältige Ursachen.
Meistens ist die Entzündung durch die Infektion mit einem pathogenen Mikroorganismus bedingt, aber auch Verletzungen und Allergien können ein Auslöser sein (MENZIES u. RAMANOON 2001). Euterentzündungen gehören zu den ökonomisch bedeutsamsten Erkrankungen der Ziegen. Es können große finanzielle Verluste durch die Verminderung der Milchleistung, Produktionsausfälle bei der Milchverarbeitung sowie durch frühzeitige Abgänge infolge nicht reparabler Euterveränderungen entstehen (WINTER 2002). Mastitiden können außerdem erhebliche Schmerzen, Leiden und Schäden bei den Tieren auslösen. Daher ist auch der Tierschutz zu beachten (HACKBARTH u. LÜCKERT 2000).
Die European Food Safty Organisation (EFSA) weist auf die mögliche Gefahr der Übertragung transmissibler spongiformer Enzephalopathien (TSE) durch mastitiskranke Ziegen hin (EFSA 2005). Bei diesen Tieren ist die Blut-Milch- Schranke stark gestört, so dass potenziell infiziertes Blut in die Milch gelangen kann.
Die Infektiösität des Blutes konnte bei BSE oder Scrapie infizierten Schafen durch Blutübertragungen festgestellt werden (HOUSTON et al. 2000; HUNTER et al. 2002) und wird auch für Ziegen angenommen.
Bei Vorliegen einer Entzündung des Euters steigt auch die Anzahl der Immunzellen in der Milch stark an. Es scheint möglich, dass hierdurch auch PrPSc (Scrapie- Prionprotein) durch die Blut-Milch-Schranke in das Euter gelangen kann (FRANSCINI et al. 2006). Nur durch das konsequente Ausschließen mastitiskranker Tiere von der Milchgewinnung kann das Risiko einer potenziellen TSE-Kontamination minimiert werden.
2.4.1 Definition der Mastitis bei Ziegen und Kühen
Die Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft (DVG 2002) definierte für Milchkühe vier Kategorien der Eutergesundheit, um eine orientierende Einordnung zu ermöglichen. Hierzu werden Viertelanfangsgemelke zytobakteriologisch untersucht.
Als Grenzwert für die Höhe an somatischen Zellen wurden 100.000 Zellen/ml Milch
festgelegt. Als Mastitiserreger gelten v. a. Bakterien, aber auch Hefen und Pilze können ursächlich beteiligt sein (TOLLE 1975). Bei Ziegen wird außerdem ein fördernder Einfluss der viralen Caprinen Arthritis-Enzephalitis (CAE)- Infektion auf eine bakterielle Entzündung des Euters diskutiert (PHELPS u. SMITH 1993; NORD u. ADNOY 1997).
Die Kategorisierung für Kühe wurde von der DVG (2002) wie folgt vorgeschlagen:
Normale Sekretion: Gesunde Euterviertel zeigen keine äußerlichen pathologischen Veränderungen und ihre Milch weist keine euterpathogenen Mikroorganismen sowie einen normalen Zellgehalt auf.
Latente Infektion: Eine latente Infektion liegt vor, wenn sich die Zellzahl in der Norm bewegt, jedoch Mastitiserreger nachgewiesen werden.
Unspezifische Mastitis: Werden keine Mastitiserreger nachgewiesen, aber eine erhöhte Zellzahl, so spricht man von einer unspezifischen Mastitis.
Mastitis: Werden gleichzeitig Mastitiserreger und erhöhte Zellzahlen in Viertelanfangsgemelken festgestellt, handelt es sich um eine Mastitis.
Grundsätzlich lassen sich diese vier Kategorien auch bei Hälftenanfangsgemelken von Ziegen anwenden, aber für Kuhmilch gültige Werte der somatischen Zellzahl lassen sich nicht ohne Einschränkung auf Ziegenmilch übertragen. Da die Zellzahl bei einer intramammären Infektion auch bei Ziegen signifikant erhöht ist, gilt sie ebenso wie bei Kühen als Indikator für die Eutergesundheit (LERONDELLE et al.
1992; HARMON 1994; BOSCOS et al. 1996; MCDOUGALL et al. 2001a; SANCHEZ et al. 2001; MCDOUGALL et al. 2002; LUENGO et al. 2004). Allerdings weist auch die Milch von gesunden Ziegen im Vergleich zum Rind höhere Gehalte an somatischen Zellen auf. Für das gesunde Ziegeneuter werden Werte von 3,7 x 105 Zellen/ml (SIERRA et al. 1999) bis zu 1 x 106 Zellen/ml Milch (FAHR et al.
1999) angegeben.
2.4.2 Verlaufsformen der Mastitis
Euterentzündungen treten in unterschiedlichen Verlaufsformen und in Verbindung mit verschiedenartigen klinischen Symptomen auf (HAMANN u. FEHLINGS 2002).
QUINLIVAN (1968) entwickelte ein Klassifikationssystem für Mastitiden bei Schafen, das auch heute noch bei kleinen Wiederkäuern angewendet wird (MENZIES u.
RAMANOON 2001):
Subklinische Mastitis : Eine Entzündung des Euters ohne äußerlich erkennbare Symptome. Sie wird bei Milchkühen bei erhöhter Zellzahl und dem Nachweis von Mastitiserregern diagnostiziert. Bei kleinen Wiederkäuern ist die Definition nicht eindeutig, da es für gesunde Euterhälften keinen Grenzwert der somatischen Zellzahl gibt.
Akute und chronische klinische Mastitis: Eine geringgradige klinische Mastitis liegt beim Auftreten von Flocken in der Milch, insbesondere im Vorgemelk, ohne zusätzliche klinische Symptome des Euters vor. Eine mittel- bis hochgradige klinische Mastitis besteht bei offensichtlichen Entzündungssymptomen des Euters wie erhöhte Temperatur, Schmerzen und Schwellung. Die Milch ist makroskopisch verändert und die Tiere zeigen häufig Fieber. Eine chronische Mastitis ist durch ein nicht zur Ausheilung gekommenes langfristiges Erkrankungsgeschehen gekennzeichnet. Betroffene Euterhälften neigen zur Atrophie oder weisen zeitlebens anomale klinische oder subklinische Befunde auf.
Perakute Mastitis: Ziegen mit perakuter Mastitis zeigen dass klinische Bild eines schwer erkrankten Tieres mit Depression, Fieber und häufig folgender Hypothermie, Anorexie sowie einer geschwollenen, verfärbten Milchdrüse. Überlebende Tiere weisen häufig starke Gewebsnekrosen auf, die nach einiger Zeit zum Verlust der betroffenen Euterhälfte führen.
2.4.3 Euterpathogene Keime in Ziegenmilch
Mastitisrelevante Erreger werden aufgrund der unterschiedlichen zellulären Reaktion eines Euters auf die Infektion mit pathogenen Keimen in "minor pathogens" und
"major pathogens" unterteilt. Koagulasenegative Staphylokokken (KNS), Mikrokokken und Corynebakterien werden als "minor pathogens", Staphylococcus (S.) aureus, Streptococcus (Sc.) agalactiae, Sc. dysgalactiae, Sc. uberis und die coliformen Keime werden als "major pathogens" bezeichnet (GRIFFIN et al. 1977).
Ziegen haben jedoch selten Euterinfektionen, die durch gramnegative Keime hervorgerufen werden (POUTREL u. LERONDELLE 1983; HUNTER 1984; EAST et al. 1987; RYAN u. GREENWOOD 1990; CONTRERAS et al. 1995). Da der Anteil an neutrophilen Granulozyten in Ziegenmilch im Vergleich zur Kuhmilch wesentlich höher ist, könnte dies zu einer erhöhten Resistenz des Ziegeneuters gegenüber diesen Keimen führen (HÖHN 2006). Tabelle 2-1 zeigt eine Übersicht der von verschiedenen Autoren gefundenen Keime in Ziegenmilch.
Die prozentualen Anteile von bakteriologisch auffälligen Tieren in den Herden variieren stark. So fanden SANCHEZ et al. (2001) und LUENGO et al. (2004) nicht einmal 10 % infizierte Tiere in spanischen Herden. Im Gegensatz dazu stehen Untersuchungen von KALOGRIDOU-VASSILIADOU et al. (1992) mit 81,4 % bakteriologisch positiven Ziegen in Griechenland. Studien in Deutschland ergaben 20 % bakteriologisch positive Proben in sächsischen und thüringischen Herden (FAHR et al. 1999) und 31,7 % positive Befunde in ökologisch gehaltenen Herden in Bayern (HÖHN 2006). In der Schweiz konnten bei Untersuchungen von drei Herden zwischen 57,4 % und 82,5 % eutergesunde Ziegen festgestellt werden (SCHAEREN u. MAURER 2006).
Der Einfluss einer Caprinen Arthritis-Enzephalitis (CAE)-Infektion auf eine bakterielle Entzündung des Euters wird diskutiert. Es ist bekannt, dass eine derartige Virusinfektion das Euter pathologisch verändern kann (PHELPS u. SMITH 1993).
NORD und ADNOY (1997) konnten allerdings keine Korrelation zwischen CAE- seropositiven Ziegen und einer Mastitis feststellen.
Tabelle 2-1: Bakteriologische Befunde in Ziegenmilch Land n Art der
Milchprobe
Diagnostizierte Keime und
Anteile [%] Autor(en) Vereinigte
Staaten von Amerika
2911 Hälften- gemelke
S. aureus: 11,0 Streptococcus spp.: 4,1 E. coli: 1,6
Pseudomonas spp.: 1,2 KNS: 38,2
WHITE und HINCKLEY
(1999)
Deutschland 224 Gesamt- gemelke
S. aureus: 1,5 Sc. dysgalactiae: 4,4 Sc. uberis: 4,4 E. coli: 4,9 KNS: 1,5
SCHÜPPEL und SCHWOPE
(1999)
Italien 60 Tankmilch
S. aureus: 43,0 aus 74 isolierten KNS Stämmen:
S. caprae: 38,0 S. chromogenes: 9,0 S. xylosus: 9,0 S. epidermidis: 7,0
FOSCHINO et al.
(2002)
Israel 1000 Hälften- gemelke
S. aureus: 3,8 S. caprae: 16,7 S. chromogenes: 4,1 S. xylosus: 1,3 S. epidermidis: 9,5 S. simulans: 6,6
Nicht identifizierte KNS: 5,3
LEITNER et al.
(2004b)
Deutschland 1356 Hälften- gemelke
S. aureus: 8,6 S. epidermidis: 25,9 S. caprae: 7,7 S. simulans: 5,1 S. xylosus: 3,1 Sc. dysgalactiae: 0,7 Aerococcus viridans: 3,3
HÖHN (2006)
Schweiz 2152 Hälften- gemelke
S. aureus: 0,6 KNS: 17,3
Corynebacterium bovis: 5,3
SCHAEREN und MAURER
(2006) KNS = Koagulasenegative Staphylokokken
S. = Staphylococcus Sc. = Streptococcus E. = Escherichia
Die bei Ziegen am häufigsten vorkommende Mastitisform ist die subklinische Euterentzündung (POUTREL et al. 1997; CONTRERAS et al. 1999). Zu einem großen Anteil lassen sich Staphylokokken isolieren (RYAN u. GREENWOOD 1990;
ZENG u. ESCOBAR 1996; POUTREL et al. 1997; FAHR et al. 1999; SANCHEZ et al. 1999; MCDOUGALL u. VOERMANS 2002), wobei der größte Anteil durch die KNS gebildet wird (DULIN et al. 1983b; HINCKLEY et al. 1985). Untersuchungen von DEINHOFER und PERNTHANER (1995) zeigen, dass sich bei subklinischen Mastitiden zu 17,6 % S. aureus und zu 82,4 % KNS isolieren ließen. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen auch FOSCHINO et al. (2002). KNS finden sich auf der Zitzenhaut und im Strichkanal von Eutern gesunder Ziegen (RYAN u. GREENWOOD 1990), werden aber bei einer subklinischen Mastitis auch aus der Zitzenzisterne isoliert (MAISI u. RIIPINEN 1991).
Bei klinischen, chronischen und akuten Euterentzündungen der Ziege kommt S. aureus am häufigsten vor (DEBUYSER et al. 1987). In Fällen von klinischer Mastitis bei Schafen und Ziegen konnten MENZIES und RAMANOON (2001) in 80,0 % der Fälle S. aureus isolieren. Ein wesentliches Reservoir ist das infizierte Euter. Die Übertragung erfolgt daher meist über unzulängliche Melkhygiene (HARMON 1994; WHITE u. HINCKLEY 1999). Aufgrund der Antibiotikaresistenz des Keimes können die Tiere oft nicht erfolgreich therapiert werden. Mit niedrigerer Prävalenz werden bei klinischen Mastitiden der Ziege Streptococcus spp. isoliert (CONTRERAS et al. 1995). Sc. agalactiae und Sc. dysgalactiae werden ebenfalls häufig durch mangelhafte Melkhygiene übertragen und führen dann zu chronischer Mastitis mit zum Teil deutlichen Euterveränderungen (HARMON 1994; WHITE u.
HINCKLEY 1999).
Perakute Mastitiden werden in der Literatur eher selten beschrieben. AMEH et al.
(1994) berichten über den Fall einer durch E. coli hervorgerufenen gangränösen Mastitis. Solche perakuten Verläufe können gelegentlich auch durch S. aureus, Pasteurella spp. und Pseudomonas aeruginosa hervorgerufen werden (MENZIES u.
RAMANOON 2001).
Eine durch "major pathogens" hervorgerufene Mastitis führt zu einer deutlichen zellulären Antwort des Euters (Zellzahlen > 1,0 x 106 Zellen/ml; Tabelle 2-4).
Außerdem kommt es häufig zu veränderter Milchzusammensetzung und eventuell auch zu sichtbaren klinischen Symptomen. Bei einer Euterinfektion mit "minor pathogens" ist die Zellzahl tendenziell geringer erhöht als bei einer Infektion mit
"major pathogens". Klinische Ausprägungen zeigen sich nur selten (GRIFFIN et al.
1977; LERONDELLE u. POUTREL 1984; HARMON 1994).
Euterinfektionen sind meist unilateral ausgeprägt (RYAN u. GREENWOOD 1990;
CONTRERAS et al. 1995; SANCHEZ et al. 1999). Entstehung und Ausmaß sind abhängig von der Infektionsdosis und vom Immunstatus der Ziege (DULIN et al.
1983b; HINCKLEY et al. 1985). Als weitere beeinflussende Faktoren einer intramammären Infektion nennt HARMON (1994) Ernährungszustand, Laktationsstadium und Alter (Laktationszahl) eines Tieres. Tiere ab der fünften Laktation haben eine höhere Anfälligkeit für Mastitiden als solche mit einer niedrigeren Laktationszahl (MCDOUGALL et al. 2002). Die Anfälligkeit für eine Euterentzündung ist bei Ziegen im ersten und letzten Drittel der Laktation (LERONDELLE u. POUTREL 1984; EAST et al. 1987) und bei multiparen Tieren (BOSCOS et al. 1996) erhöht. Bei Mastitiden, die durch KNS hervor gerufenen wurden, konnte festgestellt werden, dass ihr Anteil im Verlauf einer Laktation steigt (KALOGRIDOU-VASSILIADOU et al. 1991; FOSCHINO et al. 2002). Vor allem KNS wurden über die gesamte Laktationsperiode und auch in der Trockenstehphase bei persistierenden Infektionen nachgewiesen (LERONDELLE u. POUTREL 1984;
MAISI u. RIIPINEN 1991; CONTRERAS et al. 1997).
2.4.4 Diagnostik von Mastitiden
Es gibt viele Parameter, die sich in der Milch in Zusammenhang mit einer Mastitis ändern (GRABOWSKI 2000). Für die Diagnostik von Euterentzündungen bei Ziegen sind im Gegensatz zu den für Kühe etablierten Methoden einige Besonderheiten zu beachten, die nachfolgend näher erläutert werden. Außerdem werden im Folgenden
die routinemäßig häufig angewendeten, sowie die in eigenen Untersuchungen verwendeten Verfahren erläutert.
Zellgehalt
Da in der Ziegenmilch neben den zu zählenden somatischen Zellen auch sogenannte zytoplasmatische Partikel (ZP) vorkommen, gibt es einige Einschränkungen bei der Auswahl von Methoden zur Zellzahlmessung. Da die ZP zu einem überwiegenden Teil keine DNA enthalten (WOODING et al. 1970; MIELKE 1994), sind grundsätzlich alle DNA-spezifischen Zählmethoden geeignet. In der Literatur werden die fluoreszenzoptische Methode (Fossomatic®), die direkte mikroskopische Zählung (DMZZ) nach einer Färbung des Milchausstriches mit Pyronin-Y-Methylgrün (PYMG), der California-Mastitis-Test (CMT oder SCHALM- Test) und das DeLaval Zellzahl-Messgerät DCC® als DNA-spezifische Methoden empfohlen (DULIN et al. 1982b; DROKE et al. 1993; PAAPE u. CAPUCO 1997;
BERRY u. BROUGHAN 2007). Die Bestimmung der somatischen Zellzahl durch die DNA unspezifische Methode des Coulter Counters führt durch das Miterfassen der ZP zu erhöhten Werten, die nicht der tatsächlichen Zellzahl des untersuchten Ziegeneuters entsprechen (PAAPE u. CAPUCO 1997).
Prescott und Breed
Die Methode von Prescott und Breed aus dem Jahr 1910 wird als Referenzmethode sowohl für Kuh- als auch für Ziegenmilch angesehen. Es werden 0,01 ml Milch auf einer Fläche von 1 cm2 auf einem Objektträger ausgestrichen, fixiert, entfettet und mit Methylenblau gefärbt. Anschließend werden mindestens 400 Zellen mikroskopisch gezählt. Mit Hilfe der Anzahl der ausgezählten Banden wird der Zellgehalt pro ml errechnet. Die Entscheidung, ob ein gefärbtes Objekt eine Zelle ist, ist subjektiv (TOLLE et al. 1971; HEESCHEN 1975; KITCHEN 1981; IDF 1984).
Nach DULIN et al. (1982b) und PAAPE et al. (2001) führt die Anwendung von Methylenblau bei Ziegenmilchausstrichen zu erhöhten Zellwerten, die durch das Miterfassen der ZP bedingt sind. Die FOOD AND DRUG ADMINISTRATION (FDA 2001) empfiehlt daher für Ziegenmilch Pyronin-Y-Methylgrün (PYMG) anstelle von
Methylenblau anzuwenden. In den USA ist die Färbung der Zellen mit PYMG als Referenzmethode vorgeschrieben (HAENLEIN u. HINCKLEY 1995; HAENLEIN 2002). Sie sollte als einzige Methode zur Herstellung von Ziegenmilch- Standardreferenzen (Beispielsweise für die Fossomatic®) genutzt werden (ZENG et al. 1999).
Fossomatic®
Die in der Praxis für Kuhmilch übliche Methode zur Zellzählung ist die Anwendung des Gerätes Fossomatic®. Dieses System beinhaltet ein fluoreszenzoptisches Verfahren, bei dem Milchproben mit Ethidiumbromid versetzt werden.
Ethidiumbromid verbindet sich mit der DNA der Zellkerne zu einem Komplex, der nach Anregung durch eine Xenonlampe stark fluoresziert. Die Fluoreszenz jedes einzelnen Zellkerns wird gezählt und somit quantitativ erfasst. Zellzahlwerte aus Ziegenmilch von mit Kuhmilch kalibrierten Fossomaticgeräten wiesen um 24,5 % höhere Ergebnisse auf als bei gleichen Messungen von mit Ziegenmilch kalibrierten Geräten (ZENG et al. 1999). Durch Proben mit hohen Zellgehalten kann es zu Verschleppungen innerhalb des Gerätes kommen. Nachfolgende Proben könnten kontaminiert werden und somit höhere Zellgehalte aufweisen (HILLERTON et al.
2004).
DeLaval Zellzahl-Messgerät DCC®
Das DCC® ist ein tragbares, batteriebetriebenes Zellzahlmessgerät. Das Gerät beruht ebenfalls auf einem DNA-spezifischen, fluoreszenzoptischen Prinzip. Jeweils 60 μl jeder Milchprobe werden in zum Gerät zugehörige Kassetten aufgezogen und vermischen sich dort mit allen für die Messung notwendigen Chemikalien. Der Messbereich beträgt 10.000 bis 4.000.000 Zellen/ml, wobei mit einem Variationskoeffizienten zwischen 7 und 12 % gearbeitet wird. 82 % der Proben mit einem Zellgehalt zwischen 100.000 und 2.500.000 haben einen Variationskoeffizienten von kleiner als 10 % (DELAVAL 2003; HAMANN et al. 2004;
LIND et al. 2005; RØNTVED et al. 2005). Der „optimale“ Messbereich beginnt bei einem Zellgehalt von 100.000 Zellen/ml, in niedrigeren Zellzahlbereichen steigt der
Variationskoeffizient an (SULZER 2005). BERRY und BROUGHAN (2007) beschreiben das DCC® als eine gute DNA-spezifische Methode zur Ermittlung des Zellgehaltes in Ziegenmilch. Die von HILLERTON et al. (2004) beschriebenen Verschleppungseffekte von Zellen treten nicht auf, da jede Probe in einer eigenen Kassette aufgezogen wird.
California-Mastitis-Test
Der California-Mastitis-Test (CMT), auch als Schalm-Test bezeichnet, wurde von SCHALM und NOORLANDER (1957) als indirekte Zellzählmethode in Kalifornien entwickelt. Das Agens Alkyl-Aryl-Sulfonat wird gemeinsam mit der zu untersuchenden Milch auf eine Plastikplatte mit Vertiefungen gegeben. Zur Durchführung des Testes können sowohl Hälftengemelke, Herdensammelmilch als auch Tankmilch benutzt werden. Durch Vermischung der Milch mit dem Agens kann durch Schlierenbildung auf die Anzahl der Zellen in der Milch geschlossen werden.
Als Beurteilungsschlüssel für Ziegenmilch empfahlen SCHALM et al. (1971) eine Skala von 0 (negativ) über T (Trace) bis zu 3 (stark positiv). Der Schalm-Test ist aufgrund seiner einfachen Handhabung eine gute und preisgünstige Hilfe in der Bewertung von Ziegenmilch (CONTRERAS et al. 1996; GALINA et al. 1996;
MCDOUGALL et al. 2001b).
Elektrische Leitfähigkeit
Die elektrische Leitfähigkeit (eLf) der Milch hängt von der Konzentration und der Beweglichkeit der dissoziierten Ionen (v. a. Chlorid-, Kalium- und Natrium- Ionen) ab.
Milch aus eutergesunden Hälften weist eine höhere Kalium-Ionen-Konzentration und einen niedrigeren Gehalt an Natrium- und Chlorid-Ionen als das Blut auf. Die Blut- Euterschranke hält dieses Konzentrationsgefälle aufrecht.
Während einer Euterentzündung wird diese Barriere durchlässiger, was zur Folge hat, dass sich die Ionen-Konzentrationen der Milch denen des Blutes angleichen und somit die Leitfähigkeit ansteigt. Allerdings sollte dieser Parameter wegen seiner
hohen Variabilität nur in Kombination mit weiteren Einflussgrößen zur Mastitisdiagnostik herangezogen werden (HAMANN u. ZECCONI 1998).
Die Bestimmung der eLf kann mit Handgeräten („Cow side test“) oder durch Sensoren in der Melkmaschine erfolgen (SCHULTZE 1985). Kühe mit gesunden Eutervierteln weisen einen physiologischen Bereich von 4,8 - 6,2 mS/cm auf (HAMANN u. FEHLINGS 2002).
Für Ziegen und Schafe gibt es nur wenige Aussagen (BARTH 2003). Die Autoren ermittelten an 45 Milchziegen Werte zwischen 6,7 und 7,9 mS/cm. Durch gleichzeitig durchgeführte Zellzahlmessungen und Bestimmung der Milchinhaltsstoffe konnte gezeigt werden, dass eine Änderung der eLf eher auf eine veränderte Milchzusammensetzung als auf eine Erhöhung der Zellzahl hinweist. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen SHARMA und ROY (1977) (6,6 – 7,3 mS/cm), niedrigere Werte mit 5,18 mS/cm in der frühen-, und 6,26 mS/cm in der späten Laktation konnten YING et al. (2002) feststellen.
PARK (1991) weist auf den möglichen Einfluss der Ziegenrasse auf die ermittelten Werte hin. Bei Französisch-Alpinen (Alpine chamoisée) Tieren wurden niedrigere Werte festgestellt als bei Anglo-Nubischen Ziegen. Der Autor definierte einen Schwellenwert von 7,04 mS/cm, um durch Messung der eLf nicht normale Ziegenmilch von der Milch gesunder Tiere abzugrenzen.
N-Acetyl-β-D-Glucosaminidase (NAGase)
Die NAGase ist ein intra- und extrazellulär wirksames lysosomales Enzym, das überwiegend von epithelialen Zellen und polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN) freigesetzt wird (MATTILA et al. 1986; NAGAHATA et al. 1987;
KRÖMKER et al. 1999). Durch Hydrolyse von Glykosaminoglykanen der Zellwände grampositiver Bakterien können diese zerstört werden (STRIKER et al. 1987;
KRÖMKER et al. 1999).
Im Rahmen von Infektionen bei Kühen konnte eine gesteigerte Aktivität in der Milch nachgewiesen werden (MATTILA u. SANDHOLM 1985; SCHÜTTEL 1999;
GRABOWSKI 2000). Beobachtungen ergaben einen bis zu zehnfachen Anstieg der
Aktivität des Enzyms, sowie eine enge Korrelation mit dem Zellgehalt (SCHULTZE 1985). Somit kann die Aussagefähigkeit der NAGase bei Kühen der des Zellgehaltes gleichgestellt werden (HAMANN et al. 1999). Ein Vorteil dieses Indikators ist außerdem seine Unabhängigkeit von Allgemeinerkrankungen (KRÖMKER et al.
1999).
Bei Ziegen wurde die NAGase-Messung bisher erst selten durchgeführt. LEITNER et al. (2004a) konnten bei Untersuchungen von zehn Herden eine signifikante Korrelation der NAGase-Aktivität mit dem bakteriologischen Status der Euterhälften feststellen. Die Messung der NAGase erfolgt fluoreszenzoptisch im Mikrotiterplattenverfahren. Als Referenzbereich für die Aktivität dieses Enzyms in Kuhmilch gelten 1,1 bis 2,8 nmol x ml -1 x min - 1 (SCHÜTTEL 1999). In Ziegenmilch entspricht ein Wert von 100 einer Enzym-Abgabe von 5 µmol x l - 1 x min - 1 bei 25 °C.
In Milch aus nicht infizierten Euterhälften wurden NAGase Werte von 13,6 ± 2,7 (0,68 µmol x l - 1 x min - 1), in mit KNS infizierten Hälften deutlich höhere Werte von 37,9 ± 4,5 (1,90 µmol x l - 1 x min - 1) nachgewiesen (LEITNER et al. 2004a). In einer weiteren Studie dieser Autoren konnten bei Ziegen, die mit KNS oder S. aureus infiziert waren, mit 59,2 ± 5,3 µmol (2,96 x l - 1 x min - 1) noch deutlich höhere Werte erhoben werden (LEITNER et al 2004b).
2.5 Somatische Zellen in der Ziegenmilch
Als somatische, also „körpereigene“ Zellen werden die aus dem Blut und dem Bindegewebe des Euters stammenden Leukozyten und Epithelzellen bezeichnet.
Zusammen bilden sie die Gesamtzellzahl in der Milch.
2.5.1 Ermittlung des Gehaltes an somatischen Zellen in Ziegenmilch Zwischen der DMZZ von PYMG gefärbten Ausstrichen und der fluoreszenzoptischen Zählung mittels Fossomatic® wurden von DULIN et al. (1982b) sowie ZENG et al.
(1999) keine signifikanten Unterschiede ermittelt. Mit Kuhmilchstandards kalibrierte Fossomatic® Geräte können allerdings bis zu 26,5 % höhere Zellwerte aufweisen als
mit Ziegenmilch kalibrierte Geräte (ZENG et al. 1999). BERRY und BROUGHAN (2007) fanden signifikant positive Korrelationen zwischen der DMZZ mit PYMG und dem DCC®. Mit dem DCC® untersuchte Milchproben wiesen im arithmetischen Mittel Zellzahlen von 7,9 x 105 Zellen/ml auf, bei mit DMZZ untersuchten Proben betrug es 6,7 x 105 Zellen/ml. Tabelle 2-2 gibt einen Überblick zu den von verschiedenen Autoren verwendeten Methoden zur Bestimmung des Gehaltes an somatischen Zellen in Ziegenmilch und den ermittelten Zellgehalten.
Tabelle 2-2: Mit DNA-spezifischen Methoden bestimmte Zellzahlmittelwerte Land Zellzahlmittelwert
/ml Milch Mittelwert Verwendete
Methode Autor(en) Österreich 8,3 x 105 arithmetisch DEUTZ et al.
(1990)
Spanien 4,6 x 105 geometrisch CONTRERAS
et al. (1996) 10,0 x 105 keine
Angabe FAHR (1999)
Deutschland
7,8 x 105 geometrisch Fossomatic
HÖHN (2006) 5,6 x 105 -
41,4 x 105 geometrisch DULIN et al.
(1983b) Vereinigte
Staaten von
Amerika 6,0 x 105 keine
Angabe ZENG et al.
(1999) Deutschland 1,9 x 105 geometrisch
DMZZ mit PYMG
HÖHN (2006) Polen 4,8 x 105 geometrisch DMZZ WINNICKA et
al. (1999a) Großbritannien 7,9 x 105 arithmetisch DCC® BERRY und
BROUGHAN (2007) DMZZ = Direkte mikroskopische Zellzählung
PYMG = Pyronin-Y-Methylgrün DCC® = DeLaval Zellzahl-Messgerät
Durch den CMT ließen sich in Untersuchungen deutliche Unterscheidungen zwischen eutergesunden und bakteriell infizierten Tieren treffen. Bei Milchproben aus subklinisch oder klinisch veränderten Eutern war der CMT-Wert höher als bei
Milchproben aus gesunden Eutern (LERONDELLE u. POUTREL 1984; MAISI u.
RIIPINEN 1991; WINTER u. BAUMGARTNER 1999; KOZACINSKI et al. 2002).
Zwischen den Werten aus CMT-Messungen und Fossomatic-Untersuchungen bestand eine deutliche Korrelation (KALOGRIDOU-VASSILIADOU et al. 1992;
PERRIN et al. 1997; WINTER u. BAUMGARTNER 1999). Daher wurden beide Methoden als brauchbar für die Beurteilung des Gesundheitsstatus des Ziegeneuters angesehen (KALOGRIDOU-VASSILIADOU et al. 1992; CONTRERAS et al. 1996;
GONZÁLEZ-RODRÍGUEZ u. CÁRMENES 1996; MCDOUGALL et al. 2001b). In der Zuordnung der SCHALM-Testwerte zu einer Zellzahlhöhe gibt es unterschiedliche Resultate (Tabelle 2-3). Fasst man die SCHALM-Testergebnisse 0 und 1 zusammen, so kann mit einer Sensitivität von 87,6 % und einer Spezifität von 92,7 % eine Milchprobe mit einer Zellzahl von weniger als 7,5 x 105Zellen/ml ermittelt werden (PERRIN et al. 1997).
Tabelle 2-3: CMT-Stufen und ihre prozentuale Verteilung Land n Art der Probe CMT-
Wert
Verteilung
[%] Autor(en) Spanien 369 Einzelgemelke
0 1 2 3
47,0 28,0 21,0 4,0
CONTRERAS et al. (1996) Mexiko 1.046 Einzelgemelke 0-0,5
1-3
44,0 56,0
GALINA et al. (1996) Österreich 129 Hälftengemelke
0 1 2 3
7,0 18,0 36,0 40,0
WINTER und BAUMGARTNER
(1999)
Deutschland 1.507 Tankmilch- und Hälftengemelke
0 1 2 3
27,0 48,0 16,0 11,0
HÖHN (2006)
Schweiz 2.152 Einzelgemelke 0 0,5
1 2 3
49,0 15,0 21,0 7,0 8,0
SCHAEREN und MAURER
(2006) n = Probenanzahl, CMT = California-Mastitis-Test
2.5.2 Bestimmung eines Grenzwertes für eutergesunde Hälften
DOGGWEILER und HESS (1983) ermittelten für Kuhmilch einen Modalwert von 20.000 Zellen/ml Milch und definierten 100.000 Zellen/ml Milch im Viertelanfangsgemelk als oberen Grenzwert für eutergesunde Viertel. Dieser Wert wurde auch von der DVG (2002) anerkannt. Ein gesetzlich festgelegter Grenzwert von 400.000 Zellen/ml Milch für die Tankmilch konnte aufgrund dieser Untersuchungen etabliert werden.
Zur Beurteilung von Einzelgemelkproben aus Ziegenmilch schlug MIELKE (1994) 7,5 x 105Zellen/ml als Grenzwert zur Unterscheidung eutergesunder von euterinfizierten Tieren vor. Nach HÖHN (2006) kann Milch aus gesunden Ziegeneutern Zellzahlen unter diesem Wert aufweisen. CONTRERAS et al. (1996) konnten mit einem Grenzwert von 5,0 x 105 Zellen/ml zu 89,7 % eutergesunde Tiere ausfindig machen. Viel diskutiert wird auch ein Grenzwert von 1 x 106Zellen/ml für Ziegensammelgemelke und teilweise für Hälftengemelke (LERONDELLE u.
POUTREL 1984; HAHN et al. 1992; KALOGRIDOU-VASSILIADOU et al. 1992;
PERRIN et al. 1997). Mit diesem Wert erfassten KALOGRIDOU-VASSILIADOU et al.
(1992) mittels Fossomatic® 80,0 % aller Euterinfektionen die durch Staphylococcus aureus, Streptococcus (Sc.) dysgalactiae und Sc. agalactiae und 45,0 % aller Infektionen die durch KNS verursacht wurden. In der Pasteurized Milk Ordinance (PMO 2003), USA, erfolgte bereits die Festlegung von 1 x 106Zellen/ml Milch als Grenzwert in Ziegentankmilch, die für die Herstellung von „Grade A“ Konsummilch genutzt wird.
Allerdings konnten auch bei Milchproben aus Ziegeneutern, die keine histologischen oder pathologischen Veränderungen aufwiesen, Zellzahlen in Größenordnungen über 1 x 106Zellen/ml ermittelt werden (HINCKLEY et al. 1985; ZENG u. ESCOBAR 1995). Bei einem relativ hohen Prozentsatz der von verschiedenen Forschern untersuchten Milchproben wurde eine Zellzahl über dem diskutierten Wert ohne gleichzeitigen bakteriellen Befund ermittelt (DROKE et al. 1993; ZENG u. ESCOBAR 1995, 1996). Daher wird deutlich, dass eine Differenzierung zwischen gesunden und infizierten Eutern durch alleinige Bestimmung der Zellzahl nur sehr bedingt möglich
ist (WILSON et al. 1995; ZENG u. ESCOBAR 1995; WHITE u. HINCKLEY 1999). In Deutschland sowie in ganz Europa wurde aufgrund dieser Problematik bislang kein Grenzwert für somatische Zellen aus Ziegenmilch gesetzlich etabliert.
Tabelle 2-4 zeigt den Zusammenhang von somatischem Zellgehalt und mikrobiologischem Euterbefund. Es wurden jeweils die geometrischen Mittelwerte der Zellgehalte berechnet.
Tabelle 2-4: Abhängigkeit der somatischen Zellzahl/ml Milch vom bakteriologischen Befund Bakteriologisch positiv Land Proben
-anzahl
Art der Probe
Bakteriologisch
negativ minor pathogens major pathogens Autor(en) Frankreich 181 Hälften-
gemelke 5,2 x 105 10,0 x 105 79,0 x 105 LERONDELLE et al.
(1992)
Griechenland 1.523 Einzel-
gemelke 2,7 x 105 45 % > 10,0 x 105 80 % > 10,0 x 105
KALOGRIDOU- VASSILIADOU et al. (1992)
Österreich 359 Einzel-
gemelke keine Angaben
S. caprae:
8,2 x 105 S. epidermidis:
14,0 x 105
45,0 x 105
DEINHOFER und PERNTHANER
(1993)
Griechenland 186 Einzel- gemelke
1,9 x 105 - 28,0 x 105
4,8 x 105 - 40,0 x 105
18,0 x 105 - 46,0 x 105
BOSCOS et al.
(1996)
Frankreich 5905 Einzel-
gemelke 2,7 x 105 9,3 x 105 24,0 x 105 POUTREL et al.
(1997)
Spanien 1.304 Hälften-
gemelke 6,5 x 105 10,0 x 105 41,0 x 105 LUENGO et al. (2004)
Deutschland 1.356 Hälften-
gemelke 5,2 x 105 10,0 x 105 43,0 x 105 HÖHN (2006)
2.5.3 Beeinflussung des Zellgehaltes durch nicht-infektiöse Ursachen Im Vergleich zu Kühen kommt es bei Ziegen zu stärkeren Zellzahlschwankungen in der Milch und das Ziegeneuter reagiert empfindlicher auf äußere Einflüsse.
Mehrlingsgeburten, Impfungen, Standplatzgestaltung, Klauenpflege und Azidose infolge übermäßiger Getreidefütterung werden als Zellzahl erhöhende Stressfaktoren in der Literatur genannt (LERONDELLE et al. 1992; CONTRERAS et al. 1996; FAHR et al. 1999; LUENGO et al. 2004). Rassespezifische Unterschiede in der Zellzahlhöhe konnten nicht festgestellt werden (BOSCOS et al. 1996; ZENG u.
ESCOBAR 1996).
Der Gehalt an somatischen Zellen in Ziegenmilch erhöht sich mit fortdauernder Laktation und dem Alter einer Ziege (CONTRERAS et al. 1996; ANONYM 2003;
LUENGO et al. 2004). WINTER und BAUMGARTNER (1999) fanden heraus, dass 95 % der Ziegen im Alter ab sechs Jahren bei Milchuntersuchungen dreifach positive SCHALM-Testergebnisse aufwiesen. Je höher die Laktationszahl einer Ziege, desto höher steigt auch die Zellzahl (WILSON et al. 1995; CONTRERAS et al. 1999). Dies soll zum Beispiel durch die sich verändernde Euterform und die dadurch bedingten melktechnischen Mängel, die das Euter reizen können, verursacht werden (FAHR et al. 1999). Im Gegensatz dazu stehen Untersuchungen von ZENG und ESCOBAR (1995), die eine Erhöhung der Zellzahl mit fortschreitendem Alter der Ziege nicht nachweisen konnten.
Auch der Sexualzyklus einer Ziege hat Einfluss auf den somatischen Zellgehalt. So weisen Ziegen im Östrus eine deutlich höhere Zellzahl auf als im Anöstrus (ZENG u.
ESCOBAR 1995; MCDOUGALL et al. 2001b; MCDOUGALL u. VOERMANS 2002).
Die niedrigsten Zellzahlen werden in der Laktationsmitte erreicht (GALINA et al.
1996; ZENG et al. 1997). Zum Laktationsende vermindert sich die Milchmenge und die Anzahl an somatischen Zellen erhöht sich unabhängig vom Vorkommen einer intramammären bakteriellen Infektion (WILSON et al. 1995; BOSCOS et al. 1996;
ZENG u. ESCOBAR 1996; ZENG et al. 1997; GOMES et al. 2006). Ziegen, die schon zu Laktationsbeginn eine hohe Zellzahl aufwiesen, behalten diese im weiteren Laktationsverlauf bei (FAHR et al. 1999). Zu Laktationsbeginn und Laktationsende
können bei eutergesunden Tieren oftmals mehr als 1,0 x 106 Zellen/ml Milch gezählt werden (GALINA et al. 1996).
Niedrige Zellzahlen werden in den Frühjahrs- und Sommermonaten, Maximalwerte in den Herbst- und Wintermonaten erreicht (DROKE et al. 1993; WILSON et al. 1995;
FAHR et al. 1999; FOSCHINO et al. 2002). Eine Erklärung könnte das synchronisierte Decken und Ablammen in den Ziegenbetrieben sein. Ein Großteil der Tiere, in vielen Herden sogar alle Tiere, werden in den Wintermonaten trocken gestellt (DROKE et al. 1993). Es gibt allerdings auch Zellzahlschwankungen, die sich nicht durch die oben genannten Faktoren erklären lassen (WILSON et al. 1995;
ZENG et al. 1997). Euterinfektionen der einen Euterhälfte scheinen auch den Zellgehalt der anderen, gesunden Hälfte zu beeinflussen (DULIN et al. 1983b; MAISI u. RIIPINEN 1991).
POUTREL et al. (1997) konnten keinen durch vorheriges Reinigen und Dippen des Ziegeneuters hervorgerufenen Effekt auf die Zellzahl feststellen, WINTER und BAUMGARTNER (1999) fanden sogar einen signifikanten Anstieg (p ≤ 0,01) an mehrfach positiven Schalmtest-Ergebnisse bei zuvor gereinigten und gedippten Euterhälften. Bei einigen Arbeiten fand sich eine geringe positive Korrelation (p < 0,05) zwischen der Gesamtkeimzahl und der somatischen Zellzahl in der Tankmilch (KALOGRIDOU-VASSILIADOU et al. 1992; DROKE et al. 1993; ZENG u.
ESCOBAR 1995; SCHNELLHARDT 1998; HÖHN 2006). Andere Arbeiten konnten keinen Zusammenhang zwischen Keimzahl und Zellzahl nachweisen (TIRARD- COLLET et al. 1991; FOSCHINO et al. 2002). Untersuchungen zur Wirksamkeit der Melkhygiene auf das Ziegeneuter sind selten und werden kontrovers diskutiert.
2.5.4 Herkunft und Funktion der somatischen Zellen
Somatische Zellen in der Milch entstammen dem Blut und dem Eutergewebe.
Während die meisten Autoren in der Milch lediglich zwischen Makrophagen, polymorphnukleären neutrophilen Granulozyten (PMN), Lymphozyten und zum Teil Epithelzellen unterscheiden (PAAPE u. KELLER 1985; MILLER et al. 1990;
SANDGREN et al. 1991; GÜRTLER u. SCHWEIGERT 2006) beschreibt MIELKE
(1994) auch noch die speziellen Zellen. Diese kommen vor allem bei Mastitiden vor und bestehen aus Monozyten, basophilen und eosinophilen Granulozyten, Plasmazellen, Epitheloidzellen und Lymphoblasten.
Herkunft der Leukozyten und Epithelzellen
In geringer Zahl sind Makrophagen, Lymphozyten und PMN stets im interstitiellen Bindegewebe vorhanden. Sie entstammen dem intralobulären Kapillarnetz. Die Makrophagen stammen von Histiozyten ab, welche aus dem Milchdrüsengewebe in die Milch einwandern und wiederum von den Blutmonozyten abstammen (MIELKE 1994; GÖBEL u. KASPERS 2006). Lymphozyten entstammen meist direkt dem Blut.
Es gibt aber im Eutergewebe auch lymphoide Zellansammlungen, denen Lymphozyten entstammen können. Im Gegensatz zum Blut finden sich in der Milch nur wenige B-Zellen, dafür aber mehr T- Zellen (CONCHA et al. 1978; MIELKE u.
KOBLENZ 1980a; MIELKE 1994). PMN gelangen durch das Alveolarepithel in die Milch. Bei Schädigungen der Blut-Euter-Schranke durch Mastitiden migrieren sie verstärkt in das Euter (MIELKE 1994). Epithelzellen sind abgeschilferte Zellen aus den Alveolen und dem Ductussystem (SCHALM et al. 1971; JENSEN u. EBERHART 1975).
Funktion der Zellen
Makrophagen sind zu Phagozytose, Pinozytose, Digestion, Katabolismus und Exozytose befähigt. Sie sezernieren Lysozym, Pyrogene und verschiedene Enzyme.
Daher spielen sie eine bedeutende Rolle in der unspezifischen Immunabwehr. In der Milch dienen sie außerdem auch dem Abtransport des Fettes während der Involution der Milchdrüse (MIELKE u. KOBLENZ 1980b).
PMN sind zu amöboider Fortbewegung fähig und können Gewebe durchwandern.
Sie können Bakterien phagozytieren, allerdings sind sie dazu in der Milch nicht so gut befähigt wie im Blut (EDER 1987; MIELKE 1994). Außerdem sind sie in der Lage, durch sauerstoffunabhängige Systeme Mikroorganismen abzutöten (PADGETT u.
HIRSCH 1967). PMN bei Ziegen stellen im Gegensatz zu Kühen und Schafen auch
in uninfizierten Euterhälften immer den Hauptzelltyp dar. PMN der Ziege scheinen schneller in das Euter zu migrieren als dies bei Kühen der Fall ist (PAAPE u.
CAPUCO 1997). Es scheint eine physiologische Regulation dieser Zellen vorzuliegen (MANLONGAT et al. 1998), die somit natürlicherweise einen höheren Zellgehalt der Ziegenmilch bedingt (PAAPE u. CAPUCO 1997). MENZIES und RAMANOON (2001) beschreiben die Hypothese, dass es Unterschiede im Abwehrsystem der Euter von Kühen und Ziegen gibt.
T-Lymphozyten sind für die zellulären Immunreaktionen verantwortlich.
B-Lymphozyten gehören zum humoralen Abwehrsystem, als differenzierte Plasmazellen sezernieren sie Antikörper.
Die sekretorischen Epithelzellen dienen der Milchbildung.
Die ductalen Epithelzellen gehören zum Abwehrsystem des Euters.
2.5.5 Morphologie somatischer Zellen
Die folgende Beschreibung der unterschiedlichen Zellmorphologien basiert hauptsächlich auf licht- und elektronenmikroskopischen Analysen von Milch-, aber auch von Blutleukozyten (SCHÖNBERG 1956; PAAPE et al. 1979; LEE et al. 1980;
MIELKE u. KOBLENZ 1980a; LIEBIG 1993; LUDEWIG 1996).
PMN: Polymorphkernige neutrophile Granulozyten sind an einem intensiv gefärbten, stabförmigen oder gelappten Kern und an kleinen dichten Granula im Zytoplasma zu erkennen. Ihre Größe beträgt 10 - 14 μm. Enthalten sie jedoch Fettvakuolen, können sie einen ähnlichen Umfang wie Makrophagen erreichen.
Eosinophile Granulozyten: Eosinophile Granulozyten haben die gleiche Zellgröße und Kernform wie PMN; sie enthalten jedoch eosinophile Granula, die mit 0,5 - 1,5 μm etwas größer als die neutrophilen Granula sind.
Basophile Granulozyten: Auch basophile Granulozyten haben einen gelappten Kern, sind mit 9 - 12 μm durchschnittlich aber etwas kleiner als PMN. Ihr Zytoplasma enthält 1,5 μm große basophile Granula, die den Kern überlagern können.
Lymphozyten: Die 5 - 10 μm großen Lymphozyten zeichnen sich durch einen runden bis ovalen Kern mit wenig oder keinem umgebenden Zytoplasma aus. Kern und Zytoplasma sind dichter, d.h. intensiver gefärbt als bei kleinen Monozyten bzw.
Makrophagen. Aktivierte Lymphozyten können bis zu 25 μm groß werden. Obwohl Lymphozyten funktionell eine sehr heterogene Zellpopulation sind, können sie im Ausstrich nicht weitergehend unterteilt werden.
Monozyten: Monozyten sind 12 - 20 μm groß und haben einen runden bis nierenförmigen Kern. Im schwach basophilen Zytoplasma liegen azurophile Granula.
Makrophagen: Makrophagen kommen in einer Größe von 8 - 30 μm vor. Ihr Zellkörper ist 0,5 -10mal größer als der Kern. Das Zytoplasma enthält häufig nicht angefärbte Vakuolen. Der Kern, der in sehr vielfältigen Formen vorkommt, besteht aus diffusem Chromatin und wird daher schwächer angefärbt als der Kern von PMN oder Lymphozyten. Ihre Größe nimmt mit der Menge phagozytierter (Fett-) Partikel zu und kann auch deutlich über 18 μm liegen.
Epithelzellen: Epithelzellen kommen meist als Konglumerate von 4 - 16 Zellen vor.
Ihre Zellkerne sind groß und rund; das Verhältnis zwischen Kern und Zytoplasma beträgt 1:2 - 1:3.
2.5.6 Das Differentialzellbild in Blut und Milch der Ziege
Differentialzellbild des Blutes
Im Blut klinisch gesunder Ziegen kommen 30 - 50 % PMN, 1 - 8 % Eosinophile Granulozyten, < 1 % Basophile Granulozyten, 50 - 70 % Lymphozyten und < 4 % Monozyten vor (KRAFT u. DÜRR 1999). Die Morphologie der Zellen entspricht der Beschreibung in Kapitel 2.5.5 (LIEBIG 1993).
Differentialzellbild in der Milch
DULIN et al. (1983b) untersuchten Zelldifferentialbilder aus Ziegenmilch während einer Laktationsperiode, beginnend mit der zweiten Woche der Laktation. Die PMN
stellten immer die größte Zellpopulation. Zunächst betrugen sie 45 %, gegen Ende der Laktation 74 %. Zu Beginn der Laktation konnten noch 20 % Lymphozyten und 35 % Makrophagen gezählt werden, gegen Ende der Laktation sanken sie auf 9 %, bzw. 15 % ab. ROTA et al. (1993) kamen zu ähnlichen Ergebnissen. Sie untersuchten Zelldifferentialbilder über einen Laktationszeitraum von 210 Tagen. Es konnte ein Anstieg der PMN von 51,6 % auf 69,3 % verzeichnet werden.
Lymphozyten und Makrophagen sanken hingegen von 12,6 % auf 4,8 % bzw. von 20 % auf 14,4 % ab.
WINNICKA et al. (1999a) betrachteten Zellen aus Blut und Milch der Ziege durchflusszytometrisch und teilweise mit Hilfe von Antikörpern. Sie fanden am 63.
Laktationstag in der Milch 85 % PMN und 5 % Lymphozyten. Damit konnten sie ähnliche Werte wie YING et al. (2002) ermitteln (79 % PMN und 22 % Lymphozyten).
SIERRA et al. (1999) diagnostizierten mikroskopisch 74 % der Zellen als PMN und 15 % als Lymphozyten. Außerdem wurden 6,7 % der Zellen den Makrophagen und 5,6 % den Epithelzellen zugeordnet. Aus den Untersuchungen geht außerdem hervor, dass bei Mastitiden der Anteil an PMN zunimmt, Lymphozytenanteile unverändert bleiben und Makrophagen sowie Epithelzellen abnehmen.
RANKL (2004) identifizierte mikroskopisch 55 % der Zellen als PMN, 21,9 % als Makrophagen und 22,1 % als Lymphozyten. Die durch einen Antikörper in der Immunfluoreszenz detektierten Epithelzellen waren mit lediglich 1,0 % am Gesamtzellanteil zu vernachlässigen.
Bemerkenswert sind die bei allen Autoren ermittelten hohen Anteile an PMN (41 % - 87,3 %). So fanden DULIN et al. (1983b) durchschnittlich 73 % PMN in vorwiegend mit KNS infizierten Euterhälften und 51 % dieser Zellen in Proben aus bakteriologisch negativen Euterhälften.
Bei Kühen wird ein derart hoher Anteil an PMN meist nur bei Mastitiden erreicht (MIELKE u. KOBLENZ 1980a). Es gibt zahlreiche Untersuchungen zum Zelldifferentialbild des Rindes, die zum Teil erheblich variieren. Die meisten Autoren konnten in gesunden Eutervierteln PMN Anteile von 3 % bis zu 41 % feststellen (LEE et al. 1980; MIELKE 1994; LEITNER et al. 2000; KÖSS 2004; RANKL 2004).
Tabelle 2-5 gibt eine Übersicht zu den mit verschiedenen Methoden ermittelten Zelldifferentialbildern aus Ziegenmilch.
Tabelle 2-5: Ermittelte Differentialzellbilder aus Ziegenmilch PMN
[%]
MAK [%]
LYM [%]
EPI [%]
NDZ [%]
Angaben zur Laktation
Methode Autor(en) 47,0 35,0 17,0 k. A. k. A. 5. Monat 1) DULIN et al.
(1983b) 52,0 34 14,0 wenig k. A. Keine
Angabe keine Angabe DULIN et al.
(1983a) 87,3 9,9 2,8 k.A. k. A. Tankmilch 1) DROKE et
al. (1993) 60,5 18,3 8,3 k. A. 12,9 2.
Laktation
2) ROTA et al.
(1993) 74,0 4,4 14,9 5,7 0,9 Gesamte
Laktation 3) SIERRA et al. (1999) 85,0 k. A. 5,0 k. A. k. A. 63. d 4) WINNICKA
et al.
(1999a) 41,0 36,0 1,0 k. A. 23,0 Keine
Angabe
5) FAHR et al.
(1999) 79,0 k. A. 22,0 k. A. k. A. Frühe
Laktation keine Angabe YING et al.
(2002) 55,0 21,9 22,1 1,0 k. A. 45. - 85.d,
1. - 6.
Laktation
1) RANKL
(2004)
1) Zytospin, Färbung nach Wright 2) Haematoxilin-Eosin Färbung 3) Zytospin, Färbung modifiziert nach Gallego 4) Durchflusszytometrie
5) Vollmilchausstriche, nach Wright gefärbt
PMN = Polymorphkernige neutrophile Granulozyten, MAK = Makrophagen, LYM = Lymphozyten, EPI = Epithelzellen NDZ = Nicht differenzierbare Zellen, k. A. = keine Angabe
2.5.7 Vorteile der Zelldifferenzierung in der Mastitisdiagnostik
Untersuchungen zum somatischen Zellgehalt von Ziegenmilch machen deutlich, dass eine Differenzierung zwischen gesunden und infizierten Eutern durch alleinige Bestimmung der Zellzahl nur sehr bedingt möglich ist (WILSON et al. 1995; ZENG u.
ESCOBAR 1995; WHITE u. HINCKLEY 1999). Untersuchungen an Kuhmilch zeigten, dass Mastitiden durch die Ermittlung von Zelldifferentialbildern schon in der Initialphase erkannt werden können und Aussagen über den Erfolg antibiotischer Therapien möglich sind (REDELMAN 1997a, b). Obwohl es wesentlich weniger detaillierte Untersuchungen zum Zelldifferentialbild in Ziegenmilch gibt, konnte festgestellt werden, dass sich auch bei Ziegen die Anteile der Zellpopulationen bei einer Infektion und im Verlauf der Laktation ändern (DULIN et al. 1983b; ROTA et al.
1993; SIERRA et al. 1999). Die detaillierte Bestimmung von Zelldifferentialbildern aus Ziegenmilch kann dazu beitragen, die Abgrenzung gesunder zu erkrankten Euterhälften zu vereinfachen.
2.6 Erkenntnisse zu zytoplasmatischen Partikeln
Nach WOODING et al. (1970) wird Ziegenmilch, im Gegensatz zur merokrinen Sekretion der Kuhmilch, apokrin sezerniert. Bedingt durch diese Art der Sekretion sollen bei der Ziege zytoplasmatische Partikel (ZP) von der apikalen Spitze der sekretorischen Epithelzellen in die Milch abgegeben werden. Neuere Veröffentlichungen zeigen, dass der Mechanismus der apokrinen Sekretion noch nicht vollständig geklärt zu sein scheint (NEVEU et al. 2002). Die These der Ablösung der apikalen Spitze der sekretorischen Epithelzellen wird von Histologen abgelehnt. Derzeitige Vorstellungen des Prozesses beruhen eher auf der Annahme einer Abschnürung des freien Endes der Epithelzellen, welche die apikale Membran, den Zellkern und den größten Teil des Zytoplasmas intakt lässt (KUROSUMI 1961;
NEVEU et al. 2002).
Der überwiegende Teil der ZP enthält keinen Kern, dennoch enthalten einige der Partikel Kernfragmente (DULIN et al. 1982b). Inwiefern diese kernhaltigen Partikel Einfluss auf die gemessene Anzahl der totalen somatischen Zellen haben, ist noch unklar (PAAPE u. CAPUCO 1997). Der größte Teil der ZP enthält keine DNA, weist aber Zellorganellen auf (WOODING et al. 1970; DULIN et al. 1982b; MIELKE 1994).
ZP haben einen Durchmesser von ca. 5 µm bis zu 30 µm und besitzen somit eine den Milchleukozyten ähnliche Größe (DULIN et al. 1983b).
