Durchflusszytometrische Analyse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Spezifische Färbung von somatischen Zellen durch DNA-Fluoreszenzfarbstoffe

Prinzip

Durch die apokrine Sekretion der Ziegenmilch werden zytoplasmatische Partikel (ZP) in die Milch abgegeben. Diese Partikel haben die Größe von Milchleukozyten (5-30 µm), sind zum größten Teil kernlos, einige enthalten jedoch Kernbruchstücke mit RNA. Daher musste einerseits die Lage dieser Partikel in einem Dotplot geklärt werden und andererseits eine Methode entwickelt werden, um ZP und andere nicht DNA enthaltende Milchbestandteile von der weiteren Analyse der Zellen auszuschließen. Durch die Verwendung der DNA-spezifischen Farbstoffe DRAQ5^™ und Acridinorange sollte die Möglichkeit überprüft werden, somatische Milchzellen in einem Dotplot identifizieren und selektiv betrachten zu können.

Probenvorbereitung und Messung

100 µl der ZSM wurden in FACS-Röhrchen pipettiert, in denen schon 200 µl Sheath vorgelegt waren. Anschließend erfolgte die Zugabe von 1 µl des DNA-spezifischen Farbstoffes DRAQ5^™ bzw. von 40 µl Acridinorange. Die Proben wurden zehn Minuten lang im Kühlschrank inkubiert. Es wurden jeweils zuerst Negativkontrollen durchgeführt. Dazu wurde eine Probe ohne DRAQ5™ bzw. Acridinorange

gemessen. In Kanal 4 (DRAQ5™) bzw. in Kanal 1 (Acridinorange) wurde auf eventuelles Vorhandensein von Streulicht geachtet. Die Proben wurden so lange im Durchflusszytometer gemessen bis, sofern vorhanden, in der Region der DNA enthaltenden Zellen 5000 Events erfasst waren.

Auswertung von DRAQ5™ gefärbten Proben

Zunächst wurden in der Darstellung FSC/SSC alle Messereignisse, die ihrer Größe nach keine Zellen sein konnten, von der weiteren Auswertung ausgeschlossen. Im Punktediagramm waren dies diejenigen Messereignisse, die kleiner als 250 relative Achseneinheiten waren. Die um diese Ereignisse gezeichnete Region wird als R1 bezeichnet. Alle gemessenen Partikel außer R1 wurden dann in einem SSC/FL4-Dotplot dargestellt. Der Farbstoff DRAQ5^™ fluoresziert in FL3 und FL4 und stellt DNA enthaltende Zellen weit rechts im Dotplot dar. Kernlose und RNA enthaltende Partikel bilden eine getrennte Wolke (Abbildung 3-7). Tabelle 3-9 zeigt ein Beispiel zur Auswertung der Anteile an somatischen Zellen und DNA-negativen Partikeln.

A B R1 = Region 1 (Zelltrümmer und Debris)

A Vorwärts- (FSC) gegen Seitwärtsstreulicht (SSC): Darstellung aller gemessenen Partikel.

B FL4/SSC Darstellung: links befinden sich die nicht angefärbten, nicht DNA enthaltenden Partikel, rechts die Zellen, die den Farbstoff DRAQ5^™ aufgenommen haben und somit DNA enthalten. Der Debris, also Partikel die kleiner waren als 250 relative Achseneinheiten, wurde nicht mit berücksichtigt.

Abbildung 3-7: Auswertung der Messung einer mit DRAQ5™ gefärbten Probe

Tabelle 3-9: Auswertung der Anteile DNA⁺-Zellen in der Färbung mit DRAQ5™

Region Events Events [%]

links 3397 37,15

rechts 5748 62,85

% = Anteil der Zellen in einem Quadranten an allen ausgewerteten Zellen

Auswertung von Acridinorange gefärbten Proben

Zunächst wurden in der Darstellung FSC/SSC alle Messereignisse, die ihrer Größe nach keine Zellen sein konnten, von der weiteren Auswertung ausgeschlossen. Im Punktediagramm waren dies diejenigen Messereignisse, die kleiner als 250 relative Achseneinheiten waren. Die Region, die um diese Ereignisse gezeichnet wurde, wird als R1 bezeichnet. Alle gemessenen Partikel außerhalb R1 wurden dann in einem SSC/FL1-Dotplot dargestellt (Abbildung 3-8). Acridinorange fluoresziert in FL1 und FL2. Zellen die DNA enthalten, werden weit rechts im Dotplot dargestellt. Kernlose und RNA enthaltende Partikel bilden eine getrennte Wolke. Tabelle 3-10 zeigt ein Beispiel zur Auswertung der Anteile an somatischen Zellen und DNA negativen Partikeln.

A B R1 = Region 1 (Zelltrümmer und Debris)

A Vorwärts- (FSC) gegen Seitwärtsstreulicht (SSC): Darstellung aller gemessenen Partikel.

B FL1/SSC Darstellung: links befinden sich die nicht angefärbten, DNA negativen Partikel, rechts die Zellen, die den Farbstoff Acridinorange aufgenommen haben und somit DNA enthalten. Der Debris, also Partikel die kleiner waren als 250 relative Achseneinheiten, wurde nicht mit berücksichtigt.

Abbildung 3-8: Auswertung der Messung einer mit Acridinorange gefärbten Probe

Tabelle 3-10: Auswertung der Anteile DNA⁺-Zellen in der Färbung mit Acridinorange

Region Events Events [%]

links 2132 37,81

rechts 3506 62,19

% = Anteil der Zellen in einem Quadranten an allen ausgewerteten Zellen

Milchzelldifferenzierung anhand von Morphologie und Fluoreszenz

Prinzip

Das im Folgenden als Schnellmethode beschriebene Verfahren wurde von KÖSS (2004) für Kuhmilch entwickelt. Das Zellsediment wird in Trägerflüssigkeit aufgenommen und ein Fluoreszenzfarbstoff zugegeben. Dieser Farbstoff interkaliert

mit Nukleinsäuren. In der Darstellung SSC/Fluoreszenz sind dann unterschiedliche Wolken erkennbar, die einzelnen Leukozytenpopulationen zugeordnet werden können. Die nachfolgend beschriebene Methode ist eine Modifikation der von KÖSS (2004) beschriebenen Vorgehensweise.

Durchführung

Falcon-Röhrchen wurden mit 50 ml Milch befüllt und 15 Minuten bei 800 x g ohne Bremse bei 4 °C zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgegossen und die Proben auf Zellstofftüchern mit der Öffnung nach unten gelagert. Das am Rand verbliebene Fett wurde gründlich mit Zellstoff entfernt. Nun wurde das Zellpellet vom Boden gelöst, in dem die Probenröhrchen über Röhrchenständer aus Draht gezogen wurden, wodurch das Röhrchen starken Schwingungen ausgesetzt wurde.

Anschließend wurden die Röhrchen mit 30 ml kalter PBS aufgefüllt und bei 4 °C erneut zentrifugiert (600 x g, mit Bremse). Wiederum wurde der Überstand abgegossen und die Röhrchen umgedreht auf Papiertüchern gelagert. Die Zellpellets wurden mit 500 µl Nährmedium aufgenommen und in ER überführt. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte im Hematology Analyzer. Die erwünschte Arbeitskonzentration von ca. 2 x 10⁶ Zellen/ml wurde durch Verdünnen der ZSM mit PBS erreicht.

Probenvorbereitung

100 µl der ZSM wurden in FACS-Röhrchen pipettiert, in denen schon 200 µl Sheath vorgelegt waren. Je nach Versuch wurden die Fluoreszenzfarbstoffe TO-PRO^®-3, PI und SYTO^®13 eingesetzt. Vor dem Messen im FACSCalibur^™ inkubierten die Proben 10 min im Kühlschrank.

Auswertung

Die von KÖSS (2004) entwickelte Maske zur Differenzierung von somatischen Zellen aus Kuhmilch wurde auf die Eignung des Einsatzes für caprine Milchzellen überprüft.

Das Ergebnis dieser Überprüfung wird in Kapitel 4.5.2 beschrieben.

Anpassung der Schnellmethode an Ziegenmilch

Prinzip

Das Zellsediment wird in die Trägerflüssigkeit aufgenommen und zwei Fluoreszenzfarbstoffe werden zugegeben. Diese Farbstoffe interkalieren mit Nukleinsäuren. Die zugesetzten DNA-Farbstoffe DRAQ5™ und Acridinorange machen eine Differenzierung zwischen DNA^-- und DNA⁺-Zellen möglich. In Kombination mit TO-PRO^®-3 und SYTO^®13stellen sich die Leukozyten als Wolken dar, deren prozentuale Anteile ausgewertet werden können.

Durchführung

Es wurden Falcon-Röhrchen mit 40 ml Milch befüllt und mit kalter PBS auf 50 ml aufgefüllt. Die Röhrchen wurden 15 Minuten bei 800 x g ohne Bremse bei 4 °C zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgegossen und die Proben auf Zellstoff mit der Öffnung nach unten gelagert. Das am Rand verbliebene Fett wurde grob mit Zellstoff entfernt. Nun wurde das Zellpellet mit 1000 µl PBS vom Boden gelöst und in neue Falcon-Röhrchen überführt. Die alten Röhrchen wurden verworfen. Anschließend wurden die Röhrchen mit 30 ml kalter PBS aufgefüllt und bei 4 °C erneut zentrifugiert (600 x g, mit Bremse). Wiederum wurde der Überstand abgegossen und die Röhrchen umgedreht auf Papiertüchern gelagert. Die Zellpellets wurden mit 500 µl Nährmedium aufgenommen und in ER überführt. Die Zellzahl wurde im Hematology Analyzer bestimmt. Die erwünschte Arbeitskonzentration von ca. 2 x 10⁶ Zellen/ml wurde durch Verdünnen der ZSM mit PBS erreicht.

Probenvorbereitung

100 µl der ZSM wurden in FACS-Röhrchen pipettiert, in denen schon 200 µl Sheath vorgelegt waren. Dann wurde jeweils DRAQ5™ gemeinsam mit SYTO^®13 sowie Acridinorange zusammen mit TO-PRO^®-3 in den in Kapitel 3.2.3 beschriebenen Mengen in die Röhrchen gegeben. Vor dem Messen im FACS inkubierten die Proben 10 min im Kühlschrank.

Auswertung

Basierend auf den Voruntersuchungen ergaben sich zwei Masken für die Auswertung. Diese sind in Kapitel 4.5.8 beschrieben.

Durchflusszytometrische Beurteilung der Zellvitalität

Prinzip

Zellen, die geschädigt und/oder abgestorben sind, weisen Defekte in der Zellmembran auf. Außerdem weisen sie im Vergleich zu gesunden Zellen Veränderungen in der Größe und der Komplexität auf. Fluorochrome, die durch defekte Zellmembranen in das Zellinnere gelangen und dort mit der DNA interkalieren, eignen sich zum Anfärben dieser Zellen. Beispiele für diese Farbstoffe sind die Fluorochrome TO-PRO^®-3 und Propidiumiodid (PI). TO-PRO^®-3 Signale werden nach Anregung durch den Diodenlaser (λ = 635 nm) hauptsächlich in FL4 registriert. In Zellen mit intakter Membran können diese Farbstoffe nicht eindringen und daher werden sie in diesen Detektoren nicht registriert. Tote, kernhaltige Zellen mit Membrandefekten können also erkannt und von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Nach KÖSS (2004) und KLEINSCHMIDT (2007) eignet sich auch SYTO^®13, das ursprünglich als Vitalfarbstoff entwickelt wurde, zur Bestimmung vitaler und toter Zellen.

Probenvorbereitung und Messung

Jeweils 50 µl der auf Eis gelagerten ZSB (5 x 10⁶ Zellen/ml) wurden mit 125 µl PBS und 25 µl eines PI-Sheath Gemisches (4 µg PI/ ml) in FACS-Röhrchen pipettiert. Von der ebenfalls auf Eis gelagerten ZSM (5 x 10⁶ Zellen/ml) wurden ebenfalls 50 µl abgenommen und gemeinsam mit 100 µl PBS und 20 µl SYTO^®13 in ein FACS- Röhrchen pipettiert. Wurde der Farbstoff TO-PRO^®-3 zur Anfärbung verwendet, so betrug das Volumen der ZSB bzw. der ZSM ebenfalls 50 µl. Zur ZSB wurden 140 µl PBS und 10 µl TO-PRO^®-3 in ein FACS Röhrchen gegeben, bei der ZSM waren es 130 µl PBS und 20 µl TO-PRO^®-3. Die FACS Röhrchen wurden vor dem Messen 10

Minuten im Kühlschrank inkubiert. Pro Probe wurden 10.000 zelluläre Ereignisse gemessen.

Auswertung

In der Darstellung FSC/SSC wurden zunächst Messereignisse, die ihrer Größe nach keine Zellen sein konnten, von der weiteren Auswertung ausgeschlossen. Im Punktediagramm waren dies diejenigen Messereignisse, die kleiner als 250 relative Achseneinheiten waren. Anschließend wurde das Signal des Farbstoffes in einem Histogramm dargestellt. Mit Hilfe von Gates und der Statistikfunktion von CellquestPro^® konnte nun der Anteil der farbstoffnegativen und der fluoreszierenden, also farbstoffpositiven Zellen bestimmt werden. In Abbildung 3-9 ist der Auswertungsgang für eine Milchprobe, gefärbt mit SYTO^®13 und TO-PRO^®-3, dargestellt. Tabelle 3-11 zeigt die Histogramm Statistiken für beide Farbstoffe.

A B C

D E F Abbildung 3-9: Beschriftung siehe folgende Seite

A Vorwärts-(FSC)- gegen Seitwärtsstreulicht (SSC): Darstellung aller gemessenen Partikel.

B Vorwärts-(FSC)- gegen Seitwärtsstreulicht (SSC): Darstellung aller gemessenen Partikel und Ausschluss des Debris, also von Partikeln, die kleiner waren als 250 relative Achseneinheiten.

C FL1/SSC Darstellung: Lage der vitalen Zellen links und der toten Zellen rechts der Markierung in der Fluoreszenz durch SYTO^®13.

D FL4/SSC Darstellung: Lage der vitalen, nicht angefärbten Zellen und der toten Zellen, die den Farbstoff TO-PRO^®-3 aufgenommen haben.

E FL1/SSC-Histogramm: mit der zugehörigen Statistik (Tabelle 3-11) konnte die Vitalität der Zellen in % bestimmt werden: M1 = vitale Zellen, M2 = tote, kernhaltige Zellen.

F FL4/SSC-Histogramm: mit der zugehörigen Statistik (Tabelle 3-11) konnte die Vitalität der Zellen in % bestimmt werden: M1 = vitale Zellen, M2 = tote, kernhaltige Zellen

Abbildung 3-9: Auswertung der Vitalitätsmessung einer Probe

Tabelle 3-11: Histogramm Statistik zu FL1 (SYTO^®13) und FL4 (TO-PRO^®-3) Marker Farbstoff (FL) Events Events [%] M1 = vitale Zellen, M2 = tote, kernhaltige Zellen

% = Anteil der Zellen in einem Quadranten an allen ausgewerteten Zellen FL = Fluoreszenzkanal