Die Anfertigung von Milchausstrichen zur Zelldifferenzierung ist schwierig, und es ist nicht möglich, die Qualität von Blutausstrichen zu erreichen (MIELKE u. KOBLENZ 1980a; DULIN et al. 1982b; MILLER et al. 1993). Die Zelldifferenzierung ist daher entsprechend fehleranfällig. Ebenfalls zu Ungenauigkeiten führt der Ausschluss nicht eindeutig differenzierbarer Zellen aus dem Zelldifferentialbild (LEE et al. 1980;
MIELKE u. KOBLENZ 1980a). Die ermittelten Anteile der Zellpopulationen sind stark vom Untersucher abhängig, da dieser selbst nach gründlicher Einweisung letztendlich selbst die Kriterien für die Unterscheidung der Zellen festlegen muss.
2.7.1 Färbungen zur lichtmikroskopischen Differenzierung von somatischen Zellen
Aufgrund der zytoplasmatischen Partikel (ZP) sind nur wenige Färbetechniken zur mikroskopischen Differenzierung somatischer Zellen aus Ziegenmilch geeignet. Die Färbungen müssen eine deutliche Unterscheidung zwischen somatischen Zellen und ZP ermöglichen.
Nicht geeignet sind die Methylenblau-, Toluidinblau-, Giemsa- und die Pappenheim Färbung. Als geeignet wird die Masson-Goldner-, Hämalaun-, Papanicolaou- und die
Pyronin-Y-Methylgrün-Färbung bezeichnet, wobei die letztgenannte Färbung die beste Unterscheidung zwischen ZP und Zelle ermöglicht (HÜSLER 1978; PAAPE et al. 2001).
Färbung nach Wright
Zahlreiche Autoren verwendeten zur Differenzierung von Zellen aus Ziegenmilch die Wright- bzw. die kombinierte oder modifizierte Wright-Färbung (DULIN et al. 1983b;
DROKE et al. 1993; FAHR et al. 1999; RANKL 2004). Diese Färbungen basieren auf den Färbeeigenschaften des eosinsauren Methylenblaus. Kerne färben sich blassblau bis violettrot an, das Zytoplasma ist schwach blau gefärbt (ROMEIS 1989).
DULIN et al. (1982b) beschreiben die zytoplasmatischen Partikel in der Färbung nach Wright als zellähnliche Partikel mit einer großen, homogenen, basophilen Zone sowie einem kleineren, dunkleren und einem klaren, zirkulären Bereich. Einerseits wird die Wright- Färbung als eine zufrieden stellende Methode für die Differenzierung von Milchzellen beschrieben (CONTRERAS et al. 1996), andererseits scheint sie für Zellzählungen nicht geeignet zu sein, da Zellen teilweise maskiert werden und im Hintergrund verschwinden (PAAPE et al. 1963).
Hematoxilin-Eosin-Färbung
Hematoxilin färbt Zellkerne tief blau-vilolett, Eosin färbt das Zytoplasma rot. SIERRA et al. (1999) versetzten Ziegenmilchausstriche mit diesen Farbstoffen und unterschieden zwischen Granulozyten, Makrophagen, Agranulozyten und anderen Zellen, die sich als degenerierte oder schwer zu differenzierende Zellen darstellten.
Pyronin-Y-Methylgrün (PYMG)
Die Zellkerne sind blau und das Zytoplasma rot gefärbt. Die Farbintensität und die Zellrandschärfe geben oft eine mangelhafte morphologische Darstellung. Der große Vorteil dieser Färbetechnik liegt in der unterschiedlichen Anfärbung von Kernmaterial und Zytoplasma. Dadurch können die ZP sicher erkannt und von der Auswertung des Differentialzellbildes ausgeschlossen werden (HÜSLER 1978). PAAPE et al. (1963)
beschreiben geringere Abweichungen bei der wiederholten Zellzählung von PYMG-gefärbten Kuhmilchausstrichen im Vergleich zur Wright-Färbung.
2.7.2 Herstellung der Milchausstriche für die Lichtmikroskopie
Direkter Ausstrich der Milch
Das eigentliche Ziel der unter 2.4.4 beschriebenen Methode von PRESCOTT und BREED aus dem Jahr 1910, die auf dem direkten Ausstrich der Milch beruht, ist die reine Zellzählung. Allerdings können Zellen mit einer geeigneten Färbung durchaus auch differenziert werden. Der große Vorteil besteht darin, dass die Zellpopulationen nicht in ihrer Zusammensetzung verändert werden, wie dies beispielsweise durch eine vorherige Zellsedimentation geschehen kann. FAHR et al. (1999) erstellten Differentialzellbilder aus Ziegenmilch durch den Ausstrich von je 0,01 ml Vollmilch in zwei 1 cm² großen Quadraten. Die Ausstriche wurden nach Wright gefärbt. Je Ausstrichpräparat wurden 200 Zellen differenziert und den Zellgruppen Makrophagen, PMN, Lymphozyten und nicht differenzierbaren Zellen zugeordnet.
Kieler Sedimentausstrich
Dieses Ausstrichverfahren geht auf SEELEMANN et al. (1936) zurück. Nach der ursprünglichen Methode wird die Milch zunächst auf 85 °C erhitzt, dann für zehn Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment wird mit einer Öse auf einer Fläche von 3 cm2 ausgestrichen und nach Lufttrocknung für ca. 5 Sekunden mit Toluidinblau oder für ca. 10 Minuten mit Methylenblau gefärbt. In späteren Methodenbeschreibungen wurden die Proben nicht erhitzt. Hauptziel dieses Ausstrichverfahrens war die semiquantitative Zellzahlbestimmung. Durch die Automatisierung der Zellzählung in Milch hat es hier jedoch seine Bedeutung verloren (DILBAT 1963; KRAFT u. SCHILLINGER 1989). Durch die wenig aufwändige und einfache Art der Zellgewinnung und Färbung wurde dieses Verfahren auch in jüngster Zeit als Vergleichsmethode für durchflusszytometrische Zelldifferenzierungen verwendet (SCHRÖDER 2003; KÖSS 2004; SULZER 2005;
KÖSS u. HAMANN 2008). Die Färbung mit Toluidinblau ist allerdings nicht DNA-spezifisch und kann daher nicht zur Färbung von Sedimenten aus Ziegenmilch verwendet werden. Nach HÜSLER (1978) ist die Färbung von Sedimentausstrichen mit Pyronin-Y-Methylgrün möglich und stellt im Gegensatz zu gefärbten Vollmilchausstrichen eine vereinfachte Möglichkeit der Zelldifferenzierung dar.
Zytospin
Die Zytospinzentrifugation wurde für Zellstudien in biologischen Flüssigkeiten entwickelt (WATSON 1966). Zytospin ist eine Zentrifuge für Objektträger, auf denen eine Probenkammer fixiert ist. DULIN et al. (1982a) haben eine heute weit verbreitete Zytospin-Methode beschrieben. Durch saugfähiges Papier ist direkt unter der Kammer eine runde Fläche mit einem Durchmesser von ca. 6 mm begrenzt. Nur diese Fläche wird später mikroskopiert. Zur Gewinnung des Sediments wird 1 ml Milch mit 8 ml eiskalter Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) für 10 Minuten bei 180 x g zentrifugiert. Je nach Pelletgröße wurde das Pellet in nur 0,2 ml Tryptikase-Soja-Nährlösung (TSB) oder zusätzlich in 2 ml PBS resuspendiert. 0,2 ml der Zellsuspension wurden in die Zytospinkammer überführt und bei 225 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Nach dem Trocknen wird das auf dem Objektträger vorhandene Zellsediment gefärbt.
Modifizierte Zytospin-Methode
Die auch als Prinzip „Kaffeemühle“ beschriebene Methode ist der Zytospin-Methode ähnlich und arbeitet ebenfalls mit der Verteilung von Zellen auf Deckgläschen durch Zentrifugalkraft (SCHRÖDER 2003; KÖSS 2004). Eine umgebaute Kaffeemühle stellt die Zentrifuge dar. Die Probenkammer besitzt einen Durchmesser von 3 cm und hat einen glatten, runden Boden. In die Kammer wird jeweils ein quadratisches Deckgläschen mit den Maßen 18 mm x 18 mm eingesetzt wird. Die Kammer ist ca.
1 cm hoch und kann mit einem Drehverschluss geschlossen werden. Nach Gewinnung der Zellsuspension werden 10 μl Blutplasma und 40 μl Zellsuspension auf das Deckgläschen gegeben, das daraufhin für 3 sec. bei ca. 200 x g zentrifugiert
wird. Nach dem Aufkleben auf einen Objektträger und der Lufttrocknung erfolgt die Färbung der Zellen.