Tierärztliche Hochschule Hannover
Evaluierung ernährungsbedingter Effekte auf die Kinematik und die Telomerlänge beim alten Hund
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Malin Lorke
Bremen
Hannover 2017
Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte Klinik für Kleintiere
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
2. PD Dr. rer. nat. Hugo Murua Escobar Klinik für Kleintiere
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und
Klinik für Hämatologie, Onkologie und Palliativmedizin
Universitätsmedizin Rostock
1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte
2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Hermann Seifert Fachgebiet Allgemeine Radiologie und Medizinische Physik
Tag der mündlichen Prüfung: 11.05.2017
Für meine Eltern und für Andreas
Der erste Teil dieser Arbeit wurde bei folgender Fachzeitschrift angenommen:
• Journal of Veterinary Science:
Comparative kinematic gait analysis in young and old Beagle dogs
Malin Lorke, Maray Willen, Karin Lucas, Martin Beyerbach, Patrick Wefstaedt, Hugo Murua Escobar, Ingo Nolte
Manuskript ID: JVS-16-212
eingereicht am 01. Juni 2016 angenommen am 02. Januar 2017
Der zweite Teil dieser Arbeit wurde bei folgender Fachzeitschrift eingereicht:
• BMC Veterinary Research:
Effect of antioxidants, mitochondrial cofactors and omega-3 fatty acids on telomere length and kinematic joint mobility in young and old
shepherd dogs
Malin Lorke, Maray Willen, Karin Lucas, Jan Torben Schille, Martin Beyerbach, Patrick Wefstaedt, Hugo Murua Escobar, Ingo Nolte
Manuskript ID: BVET-D-16-00534
eingereicht am 17. September 2016
Eine Mitwirkung als Co-Autor erfolgte bei folgenden eingereichten Manuskripten der Partnerstudie:
• BMC Veterinary Research:
An individually adjusted endurance test reveals differences in physical fitness between young and old beagle dogs
Maray Willen, Malin Lorke,Patrick Wefstaedt, Karin Lucas, Ingo Nolte
Manuskript ID: BVET-D-15-00459
eingereicht am 17. Dezember 2015
• PLOS ONE:
Effects of an Enriched Diet on Physical Fitness and Kinetic Data of Aging German Shepherd Dogs
Maray Willen, Malin Lorke, Sebastian Willen, Karin Lucas, Patrick Wefstaedt, Ingo Nolte
Manuskript ID: PONE-D-16-36933
eingereicht am 15. September 2016
Teile dieser Arbeit wurden auf folgenden Fachkonferenzen präsentiert:
• Poster:
24. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe Innere Medizin und klinische Labordiagnostik – InnLab (29.–30. Januar 2016, Berlin):
Evaluierung der Southern Blot Analyse von terminalen
Restriktionsfragmenten zur Messung der leukozytären Telomerlänge von Hunden
M. Lorke, M. Willen, A. Anders, J. T. Schille, S. Willenbrock, F. Ripoli, K. Lucas, H. Murua Escobar, I. Nolte
• Vortrag:
DVG-Vet-Congress / 62. Jahreskongress der DVG-Fachgruppe Deutsche Gesellschaft für Kleintiermedizin – DGK-DVG (27.–30. Oktober 2016, Berlin):
Studie zur Untersuchung ausgewählter ernährungsbedingter Effekte auf die physische Fitness und die Länge der Telomere bei älteren Hunden
M. Lorke, M. Willen, K. Lucas, H. Murua Escobar, P. Wefstaedt, I. Nolte
• Vortrag:
24. Jahrestagung der DVG-Fachgruppe Innere Medizin und klinische Labordiagnostik – Innlab (29.–30. Januar 2016, Berlin)
Vergleich der physischen Fitness zwischen jungen und alten Beaglen
M. Willen, M. Lorke, A. Anders, P. Wefstaedt, K. Lucas, I. Nolte
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
2. Literaturübersicht ... 3
2.1 Alterung beim Hund ... 3
2.2 Alterungsprozess der Zellen ... 3
2.2.1 Telomerlängen-Analyse ... 5
2.3 Alterungsprozess des Bewegungsapparates ... 7
2.3.1 Kinematische Ganganalyse ... 9
2.4 Ernährungssupplemente für den alten Hund ... 12
3. Untersuchungsgut, Material und Methoden ... 17
3.1 Studiendesign und Tiere ... 17
3.2 Telomerlängen-Analyse ... 18
3.3 Kinematische Ganganalyse ... 20
3.3.1 Datenerfassung ... 20
3.3.2 Datenauswertung ... 21
3.4 Statistische Analyse ... 23
4. Ergebnisse ... 24
4.1 Studie 1 ... 24
4.1.1 Abstract ... 25
4.1.2 Introduction ... 26
4.1.3 Materials and Methods ... 27
4.1.3.1 Animals ... 27
4.1.3.2 Data collection ... 28
4.1.3.3 Data analysis ... 29
4.1.3.4 Statistical analysis ... 30
4.1.4 Results ... 30
4.1.4.1 Shoulder joint ... 31
4.1.4.2 Elbow joint ... 31
4.1.4.3 Carpal joint ... 31
4.1.4.4 Hip joint ... 32
4.1.4.5 Stifle joint ... 32
4.1.4.6 Tarsal joint ... 32
4.1.5 Discussion ... 33
4.1.5.1 Age-related restriction of joint mobility ... 33
4.1.5.2 Contrasting alterations ... 34
4.1.5.3 Procedure of kinematic gait analysis ... 35
4.1.5.4 Limitations and future improvements ... 36
4.1.5.5 Conclusions ... 36
4.1.6 Declarations ... 37
4.1.7 References ... 38
4.1.8 Tables and Figures ... 43
4.2 Studie 2 ... 48
4.2.1 Abstract ... 49
4.2.2 Background ... 50
4.2.3 Methods ... 52
4.2.3.1 Animals and experimental design ... 52
4.2.3.2 Telomere length analysis ... 53
4.2.3.3 Kinematic data collection ... 54
4.2.3.4 Kinematic data analysis ... 55
4.2.3.5 Statistical analysis ... 57
4.2.4 Results ... 57
4.2.4.1 Clinical data ... 57
4.2.4.2 Telomere length ... 58
4.2.4.3 Kinematic joint angles ... 58
4.2.4.3.1 Shoulder joint ... 59
4.2.4.3.2 Elbow joint ... 59
4.2.4.3.3 Carpal joint ... 60
4.2.4.3.4 Hip joint ... 60
4.2.4.3.5 Stifle joint ... 60
4.2.4.3.6 Tarsal joint ... 60
4.2.5 Discussion ... 61
4.2.5.1 Telomere length ... 61
4.2.5.2 Joint mobility ... 62
4.2.5.3 Study design and procedures ... 64
4.2.6 Conclusions ... 65
4.2.7 Abbreviations ... 66
4.2.8 Declarations ... 66
4.2.9 References ... 68
4.2.10 Tables and Figures ... 75
5. Diskussion ... 92
6. Zusammenfassung ... 98
7. Summary ... 101
8. Literaturverzeichnis ... 104
9. Danksagung ... 136
Abkürzungsverzeichnis
BCS = Körperkonditionswert / Body condition score DNA = Desoxyribonukleinsäure / Deoxyribonucleic acid GRF = Bodenreaktionskraft / Ground reaction force
GRF↑ = Seite mit höherer vertikaler GRF / Side with higher vertical GRF GRF↓ = Seite mit niedrigerer vertikaler GRF / Side with lower vertical GRF kbp = Kilobasenpaare / Kilo base pairs
MAX = Maximaler Gelenkwinkel / Maximum joint angle MIN = Minimaler Gelenkwinkel / Minimum joint angle
OC = Alte Gruppe mit Kontrollfutter / Old group with control diet
OE = Alte Gruppe mit angereichertem Futter / Old group with enriched diet PCR = Polymerasekettenreaktion / Polymerase chain reaction
RNA = Ribonukleinsäure / Ribonucleic acid ROM = Bewegungsumfang / Range of motion
ROS = Reaktive Sauerstoffspezies / Reactive oxygen species
TRF = Terminales Restriktionsfragment / Terminal restriction fragment YC = Junge Gruppe mit Kontrollfutter / Young group with control diet
YE = Junge Gruppe mit angereichertem Futter / Young group with enriched diet
1. Einleitung
Der Prozess des Alterns führt zu einer morphologischen und funktionellen Reduktion nahezu aller Gewebe im Körper. Diese Altersinvolution beinhaltet auch beim Hund un- ter anderem die Sarkopenie, einen progressiven Verlust von Muskelmasse und -stärke (PAGANO et al. 2015). Es kommt zu Veränderungen und damit einhergehend zu einer verminderten Elastizität des Bindegewebes; und damit von Gelenkkapsel, Ligament, Sehne und Faszie (BAILEY 2001). Auch der Gelenkknorpel wird dünner, eine Reduk- tion der Chondrozyten führt zu einer verminderten Produktion von extrazellulärer Mat- rix (BELLOWS et al. 2015a). Dies kann schließlich zu altersbedingter primärer Arthrose führen und erhöht im Alter das Risiko für eine sekundäre Arthrose (TOH et al. 2016). Die Altersinvolution führt so zu einer Einschränkung der Beweglichkeit von älteren Hunden, insbesondere die Gelenkbeweglichkeit ist davon betroffen.
Bisherige ganganalytische Studien beziehen sich vor allem auf das Gangbild adulter Hunde unterschiedlichen Alters (HOTTINGER et al. 1996; GOLDNER et al. 2015) oder auf Veränderungen bei Welpen im Wachstum (HELMSMÜLLER et al. 2014). Syste- matische ganganalytische Studien beim alten Hund fehlen jedoch. Daher war es ein Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, ob sich mit der kinematischen Ganganalyse ein Ein- fluss des Alters auf die Gelenkbeweglichkeit nachweisen lässt (LORKE et al., in press).
Dabei wurde von der Hypothese ausgegangen, dass die Gelenkbeweglichkeit und da- bei insbesondere der Bewegungsumfang der Gelenke (range of motion, ROM) bei äl- teren Hunden abnimmt.
Kenntnisse darüber, welche Gelenke im Alter häufig oder besonders stark von einer eingeschränkten Beweglichkeit betroffen sind, sind für die Einschätzung der Ergeb- nisse des zweiten Teils dieser Arbeit wichtig. Mit einer randomisierten, verblindeten und placebokontrollierten Fütterungsstudie wurde der Einfluss eines Futters, angerei- chert mit Antioxidantien, mitochondrialen Cofaktoren (Alpha-Liponsäure, L-Carnitin) und Omega-3-Fettsäuren, auf das Zellalter (Telomerlänge) und die Gelenkbeweglich- keit (Kinematik) bei jungen und alten Hunden untersucht (LORKE et al., submitted).
Die Telomerlänge ist ein Biomarker für die Zellalterung sowie auch für die altersbe- dingte Involution. Während jeder Replikation einer Zelle verringert sich die Länge der Telomere; unterschreitet sie ein kritisches Minimum, wird die Seneszenz oder Apoptose der Zelle induziert (NASIR 2008). Beim Hund gibt es nur wenige Studien, in denen die Telomere analysiert wurden. In einer Studie konnte gezeigt werden, dass die Telomerlänge mit der durchschnittlichen Lebensspanne von unterschiedlichen Rassen korreliert (FICK et al. 2012).
Sowohl kurze Telomere als auch der Prozess des Alterns sollen mit oxidativem Stress in Zusammenhang stehen (RICHTER u. VON ZGLINICKI 2007; KUDRYAVTSEVA et al. 2016). Antioxidantien neutralisieren reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und reduzie- ren dadurch den oxidativen Stress (SIES 1997). Alpha-Liponsäure und L-Carnitin sind mitochondriale Cofaktoren. Es wird angenommen, dass diese die Funktion der Mito- chondrien beeinflussen und so die Produktion von ROS erniedrigen (YONEI et al.
2008). L-Carnitin fördert außerdem die effizientere aerobe Energiegewinnung und da- mit die Leistungsfähigkeit der Muskulatur (WALL et al. 2011). Mehrfach ungesättigte Omega-3-Fettsäuren reduzieren Entzündungsreaktionen und dadurch auch die damit einhergehende erhöhte Zellteilungsrate (FERRUCCI et al. 2006).
Beim Hund gibt es bisher nur wenige Studien, die den Einfluss von Ernährungssupp- lementen im Alter untersucht haben. Mit der vorliegenden Fütterungsstudie sollte da- her die Hypothese überprüft werden, dass ein Futter, angereichert mit Antioxidantien, mitochondrialen Cofaktoren (Alpha-Liponsäure, L-Carnitin) und Omega-3-Fettsäuren, die altersbedingte Verringerung der Telomerlänge und der Gelenkbeweglichkeit be- einflusst. Außerdem wurde postuliert, dass das angereicherte Futter einen stärkeren Einfluss auf ältere als auf jüngere Hunde hat. Eine Ernährungsumstellung wäre eine einfache und langfristig anwendbare Methode, um dem Prozess des Alterns entge- genzuwirken und schon aufgetretene Zeichen des Alterns möglicherweise sogar ab- zuschwächen. Die vorliegende Arbeit steht im Zusammenhang mit der Arbeit von WILLEN (2016); bei dieser wurde der gleiche Versuchsaufbau verwendet und die Wir- kung des angereicherten Futters auf die physische Fitness von jungen und alten Hun- den mit einem individuell angepassten Belastungstest untersucht.
2. Literaturübersicht
2.1 Alterung beim Hund
Die Forschung beschäftigt sich beim Hund erst seit dem Ende des 20. Jahrhunderts mit der Geriatrie. In den letzten Jahren ist das Interesse an der Ernährung und medi- zinischen Versorgung älterer Hunde gestiegen, da Hunde heute ein höheres Lebens- alter als früher erreichen und die Population älterer Hunde zunimmt (KRAFT 2003;
SALZBORN 2003; HOSKINS 2004). Dementsprechend ist der Anteil älterer Hunde in der tiermedizinischen Praxis gestiegen (KRAFT 2003; SALZBORN 2003).
Der Prozess des Alterns ist progressiv, irreversibel und führt schlussendlich zum Tod (KRAFT 2003). Sowohl der Beginn und Verlauf des Alterungsprozesses als auch die Lebensdauer hängen dabei von vielfältigen Faktoren ab. Beim Hund sind einige vor- gegeben, wie zum Beispiel Genetik, Rasse, Größe und Geschlecht, wobei die Größe hierbei der wichtigste Faktor ist – bei großen Hunden treten Alterserscheinungen frü- her auf und ihre Lebensdauer ist kürzer (LI et al. 1996; PATRONEK et al. 1997;
MICHELL 1999; KRAFT 2003; PROSCHOWSKY et al. 2003; SALZBORN 2003;
GALIS et al. 2007; GREER et al. 2007; ADAMS et al. 2010; O'NEILL et al. 2013;
INOUE et al. 2015). Andere Faktoren sind zumindest teilweise beeinflussbar, wie zum Beispiel Körperkondition, Ernährung, Kastrationsstatus, Haltungsform, Umweltein- flüsse und Krankheiten (MICHELL 1999; MOORE et al. 2001; KEALY et al. 2002).
KRAFT (2003) definiert ein beginnendes Alter ab 6 Jahren und ein fortgeschrittenes Alter ab 9 Jahren. Nach BELLOWS et al. (2015a) gelten kleine und mittlere Rassen mit 7 bis 10 Jahren als ältere Hunde und mit ≥ 11 Jahren als geriatrisch, große und riesige Rassen gelten mit 6 bis 8 Jahren als ältere Hunde und mit ≥ 9 Jahren als geri- atrisch.
2.2 Alterungsprozess der Zellen
Unter dem Aspekt der Lebensdauer kann man drei verschiedene Zelltypen unterschei- den (GEUNA et al. 2001; KRAFT 2003):
• postmitotische Zellen sind nach der Geburt nicht mehr teilungsfähig, stirbt eine Zelle ab, so gehen ihre Funktionen zugrunde; ein Beispiel sind Neuronen
• reversibel postmitotische Zellen können bei Bedarf in die Teilungsphase übergehen;
ein Beispiel sind Hepatozyten
• intermitotische Zellen sind zeitlebens teilungsfähig, allerdings ist die Anzahl der Tei- lungen begrenzt und die Teilungsrate nimmt mit dem Alter ab; ein Beispiel sind Epi- dermiszellen
HAYFLICK u. MOORDHEAD (1961) entdeckten, dass Fibroblasten in der Zellkultur nur eine begrenzte Anzahl an Zellteilungen durchmachen, dies wird als Hayflick- Grenze bezeichnet. Als Ursache für den altersbedingten Rückgang von intermitoti- schen Zellen und ihrer Teilungsrate wird die Telomerlänge diskutiert (AUBERT u.
LANSDORP 2008; TOH et al. 2016). Telomere sind protektive DNA-Protein-Komplexe an den Enden eukaryotischer Chromosomen, sie sind in die nukleäre Architektur in- volviert und essentiell für die Stabilität der Chromosomen (MONAGHAN 2010). Die telomere DNA besteht aus kurzen repetitiven Nukleotidsequenzen (short tandem repeats, STRs), bei Wirbeltieren besteht die wiederholte Sequenz aus den Basen TTAGGG (MONAGHAN 2010). Die subtelomere Region besteht aus degenerierten Wiederholungen. Menschen haben eine Telomerlänge von 0,5 bis 15 kbp (Kilobasen- paare) (AUBERT u. LANSDORP 2008; MONAGHAN 2010), bei Hunden sind die Telo- mere mit 10 bis 23 kbp länger (NASIR et al. 2001; MCKEVITT et al. 2002).
Während jeder Replikation einer Zelle verringert sich die Länge der Telomere, entspre- chend nimmt die mittlere Telomerlänge sowohl beim Menschen als auch beim Hund mit dem Alter ab (MCKEVITT et al. 2002; AUBERT u. LANSDORP 2008). Bei der Rep- likation setzt das Enzym Primase RNA-Primer als Ansatzpunkt für die DNA-Poly- merase, welche dann den komplementären Strang von 5′ nach 3′ synthetisiert (wobei die Vorlage von 3′ nach 5′ abgelesen wird) (BLACKBURN 1984). Während die Syn- these am Leitstrang in Laufrichtung der Replikationsgabel kontinuierlich erfolgen kann, erfolgt sie am Folgestrang entgegen der Laufrichtung der Replikationsgabel und des- halb diskontinuierlich (SZOSTAK u. BLACKBURN 1982). Die äußerste Lücke am neu synthetisierten 5′-Ende des Folgestrangs kann allerdings nicht mehr aufgefüllt werden, da es keine Ansatzstelle für die DNA-Polymerase gibt; das 3′-Ende bleibt als
überhängendes Stück übrig – so werden die Telomere im Verlauf der Replikationen immer kürzer (Endreplikationsproblem) (NASIR 2008; MONAGHAN 2010). Da Telo- mere nur aus Sequenzwiederholungen bestehen, gehen keine wichtigen genetischen Informationen verloren. Unterschreitet die Telomerlänge jedoch ein kritisches Mini- mum, wird die Seneszenz oder sogar die Apoptose der Zelle induziert (NASIR 2008).
Dieser Mechanismus begrenzt die zelluläre Lebenszeit und wirkt somit als Tumorsup- pressor-Mechanismus, er kann im Normalfall nur durch das Enzym Telomerase rück- gängig gemacht werden (AUBERT u. LANSDORP 2008; PANG u. ARGYLE 2009).
Die Telomerase ist eine reverse Transkriptase, die das überhängende 3′-Ende erwei- tert, so dass ein weiterer Primer ansetzen und das 5′-Ende des Folgestrangs aufgefüllt werden kann. Dadurch kann das Enzym den Verlust der telomeren DNA ausgleichen und so eine stabile Telomerlänge ermöglichen (AUBERT u. LANSDORP 2008). Die Telomerase ist aber nur bei einzelligen Eukaryoten, in den Zellen der Keimbahn, in sich häufig teilenden Zellen (Stammzellen, bestimmten Immunzellen) und in den meis- ten aller proliferierenden Tumorzellen aktiv, dadurch haben diese Zellen eine verlän- gerte oder sogar unendliche Lebensspanne (PANG u. ARGYLE 2009). Deshalb wird die Telomerlänge als Biomarker für die Zellalterung wie auch für die altersbedingte Involution angesehen.
2.2.1 Telomerlängen-Analyse
Die älteste und bekannteste Methode zur Messung der Telomerlänge ist die Southern Blot Analyse von terminalen Restriktionsfragmenten (terminal restriction fragments, TRFs) (KIMURA et al. 2010). Statt des Southern Blots kann auch eine In-Gel-Hybridi- sierung durchgeführt werden. Die TRF-Analyse war lange Zeit die einzige Methode zur quantitativen Analyse der Telomerlänge und wurde als Referenz für später entwickelte Methoden genutzt (AUBERT et al. 2012). Ein Nachteil ist, dass die benachbarte sub- telomere Region ebenfalls erfasst und die Telomerlänge dadurch überschätzt wird (MONTPETIT et al. 2014). Außerdem wird eine relativ große Menge DNA benötigt.
Dennoch produziert diese Methode vergleichsweise wenig Fehler und ist relativ ein- fach durchzuführen, deshalb ist sie auch heute noch der Goldstandard (AUBERT et al.
(NASIR et al. 2001; YAZAWA et al. 2001; MCKEVITT et al. 2002; CADILE et al. 2007;
BENETOS et al. 2011). Bei dieser Methode wird zumeist die mittlere TRF-Länge aus- gewertet (MCKEVITT et al. 2002; CADILE et al. 2007). Andere Studien werteten zu- sätzlich zur mittleren TRF-Länge oder statt der mittleren TRF-Länge die minimale TRF- Länge aus (KADI et al. 2008; RAE et al. 2010).
Weitere Methoden zur Messung der Telomerlänge nutzen die Polymerase-Kettenre- aktion (polymerase chain reaction, PCR). Dazu gehören qPCR (quantitative real-time PCR), MMqPCR (monochrome multiplex qPCR) und aTL qPCR (absolute telomere length qPCR) (CAWTHON 2002, 2009; O'CALLAGHAN u. FENECH 2011). Bei diesen Methoden werden die telomeren DNA-Sequenzen mittels PCR amplifiziert. Dafür sind nur kleine Mengen DNA erforderlich, allerdings sind diese Methoden fehleranfälliger und variabler als die TRF-Analyse (AUBERT et al. 2012; MONTPETIT et al. 2014).
Auch für Studien am Hund wurden schon PCR-basierte Methoden genutzt (FICK et al.
2012). Weiterhin wird die PCR bei der Methode STELA (single telomere length analysis) genutzt, um einzelne Telomere von bestimmten Chromosomenenden zu amplifizieren (BAIRD et al. 2003). Allerdings ist diese Methode auf solche Chromoso- menenden beschränkt, für die passende Primer verfügbar sind. Die Universal STELA erfasst dagegen alle besonders kurzen Telomere (BENDIX et al. 2010). Die Methode Q-FISH (quantitative fluorescence in situ hybridization) verwendet fluoreszierend ge- labelte Sonden, die mit hoher Affinität mit der telomeren DNA von Chromosomen in der Metaphase hybridisieren (LANSDORP et al. 1996; KREJCI u. KOCH 1998). Bei dieser Methode kann die Telomerlänge einzelner Chromosomen gemessen werden, außerdem werden auch telomerfreie Chromosomenenden erfasst. Der Nachteil ist, dass dabei nur die Telomere von teilungsaktiven Zellen detektiert werden. Weiterent- wicklungen dieser Methode, Interphase Q-FISH und dessen Adaptation HT Q-FISH (high-throughput Q-FISH), können dagegen Zellen in der Interphase erfassen (CANELA et al. 2007). Bei der Methode Flow-FISH wird die Fluoreszenz über Durch- flusszytometrie gemessen (HULTDIN et al. 1998). Dabei können Subpopulationen von Zellen sortiert werden. Diese Methode ist als einzige für die klinische Diagnostik in Gebrauch, es sollte allerdings möglichst frisches Blut verwendet werden (MONTPETIT et al. 2014).
Beim Menschen und auch bei verschiedenen Modellorganismen gibt es zahlreiche Studien, in denen die Telomerlänge analysiert wurde. Eine kürzere Telomerlänge wird beim Menschen mit altersbedingten Veränderungen in Verbindung gebracht; zum Bei- spiel mit dem Verlust von Muskelmasse und -stärke, der Sarkopenie, (MARZETTI et al. 2014) und, vor allem bei älteren Personen, mit einer geringeren physischen Fitness (LAROCCA et al. 2010; BENDIX et al. 2011; OSTHUS et al. 2012; SOARES- MIRANDA et al. 2015). Auch besteht ein Zusammenhang zwischen einer kürzeren Telomerlänge und Arthrose (PRICE et al. 2002; ZHAI et al. 2006) sowie weiteren altersabhängigen Krankheiten wie kardiovaskulären Erkrankungen, Morbus Parkin- son, Morbus Alzheimer und Krebs (MINAMINO u. KOMURO 2002; CAWTHON et al.
2003; PANOSSIAN et al. 2003; WU et al. 2003; FITZPATRICK et al. 2007; GUAN et al. 2008). Beim Hund gibt es dagegen nur wenige Studien, in denen die Telomere analysiert wurden. Unter anderem wurde festgestellt, dass die mittlere TRF-Länge bei Hunden zwischen ca. 10 und 23 kbp liegt und mit dem Alter abnimmt (NASIR et al.
2001; MCKEVITT et al. 2002). Weiterhin fiel auf, dass die Telomerlänge mit der durch- schnittlichen Lebensspanne von unterschiedlichen Rassen korreliert und dass Rassen mit kürzeren Telomeren ein erhöhtes Risiko zeigen durch kardiovaskuläre Erkrankun- gen zu sterben (FICK et al. 2012). Es wird davon ausgegangen, dass eine kürzere Telomerlänge auch bei Hunden mit einem erhöhten Risiko für eine Krebserkrankung und einer schlechteren Prognose bei Krebs in Verbindung steht (NASIR et al. 2001;
PANG u. ARGYLE 2009; PANG u. ARGYLE 2010). Der Einfluss der Ernährung auf die Telomerlänge von Hunden wurde bisher allerdings noch nicht untersucht.
2.3 Alterungsprozess des Bewegungsapparates
Die Altersinvolution führt zu einer Reduktion nahezu aller Gewebe im Körper (KRAFT 2003). Eine zunehmend verminderte Anpassungsfähigkeit an innere und äußere Be- lastungen führt zur Einschränkung physiologischer Funktionen und zur Erhöhung der Krankheitsanfälligkeit und Multimorbidität (EGENVALL et al. 2000; KRAFT 2003). Es kommt zu einem progressiven Verlust von Muskelmasse und -stärke, genannt Sarko- penie, begleitet von einer Fibrose der Muskulatur (HUTCHINSON et al. 2012;
PAGANO et al. 2015). Die körperliche Leistungsinsuffizienz und schlechtere Beweg- lichkeit älterer Hunde liegt teilweise an dieser Entwicklung. Außerdem kommt es zu Veränderungen des Bindegewebes, und damit von Gelenkkapseln, Ligamenten, Seh- nen und Faszien (SCHOFIELD u. WEIGHTMAN 1978; HAUT et al. 1992; BAILEY 2001). Diese Veränderungen sind mit einer verringerten Elastizität und in der Folge mit einer Abnahme der Beweglichkeit verbunden. Eine Studie konnte beim Beagle im Alter eine Verminderung der Proteoglykane der Bandscheiben nachweisen (COLE et al.
1986). Auch der Gelenkknorpel verändert sich und wird dünner (FRANCUSKI et al.
2014). Eine Reduktion und Degeneration von Chondrozyten führt zu einer verminder- ten Produktion von Glykosaminoglykanen, Kollagen Typ I und Chondroitinsulfat (BELLOWS et al. 2015a).
Dies kann schließlich zu altersbedingter primärer Arthrose führen (MORGAN et al.
1987; CRAIG u. REED 2013). Ebenso steigt das Risiko für eine durch Fehlstellungen, Erkrankungen oder Traumata hervorgerufene sekundäre Arthrose (TOH et al. 2016).
Arthrose ist chronisch, progressiv und irreversibel. Dabei kommt es zur Aufrauhung der oberflächlichen Schicht des Gelenkknorpels, zu Fissuren und zum Verlust von Ge- lenkknorpel, zur Sklerose und zum Umbau von subchondralem Knochen, zur Bildung von periartikulären Osteophyten, zur Verdickung der Gelenkkapsel und zur Synovitis (MORGAN et al. 1987; SCHULZ 2009). Dies kann in einzelnen oder mehreren Gelen- ken auftreten. Zu Beginn kann die Erkrankung symptomfrei sein oder nur mit leichten klinischen Symptomen einhergehen, die oft schleichend auftreten (TAYLOR 2010). Mit Fortschreiten der Erkrankung kommt es zu Schmerzen sowie zu Gelenkversteifung und -schwellung, Folgen sind eine verminderte ROM der Gelenke, Lahmheit, Bewe- gungsunlust, Muskelatrophie und Leistungsinsuffizienz (TAYLOR 2010; BELLOWS et al. 2015b). Dies führt dazu, dass die altersbedingte Muskelatrophie und Leistungsin- suffizienz beim Auftreten von Arthrose noch verstärkt wird. Die mit dem Alter einher- gehende erhöhte Tendenz zur Adipositas begünstigt diese Entwicklung (KEALY et al.
2002; ZORAN 2010). Diese altersbedingten Veränderungen vermindern die Gelenk- beweglichkeit älterer Hunde und beeinträchtigen ihre Beweglichkeit insgesamt.
2.3.1 Kinematische Ganganalyse
Die visuelle Beurteilung der Bewegung ist weder objektiv noch ausreichend genau, denn das menschliche Auge kann die komplexen und schnellen Anteile der Bewegung nicht in allen Einzelheiten gleichzeitig und korrekt wahrnehmen (OFF u. MATIS 1997a;
GILLETTE u. ANGLE 2008). Es konnte gezeigt werden, dass Untersucher bei Hunden sogar induzierte Lahmheiten nicht zuverlässig erkennen; selbst bei orthopädisch er- fahrenen Untersuchern waren die Ergebnisse nur geringfügig besser (QUINN et al.
2007; WAXMAN et al. 2008). Aus diesem Grund wurde schon früh versucht messtech- nische Hilfsmittel zu finden. Die ersten fundierten Untersuchungen der Fortbewegung wurden mithilfe der Chronofotografie gemacht, bei welcher durch schnell aufeinander folgende Fotos die Bewegung dokumentiert wird (MAREY 1894; MUYBRIDGE 1899).
Später folgte die Kinematographie, bei der die Fortbewegung durch Filmaufnahmen analysiert wird (HILDEBRAND 1968). Diese Technik wird auch heutzutage noch ge- nutzt, allerdings mit Hochgeschwindigkeits-Videokameras (OFF u. MATIS 1997a;
MAES et al. 2008; HELMSMÜLLER et al. 2014; GOLDNER et al. 2015). Bei der Elekt- rogoniometrie werden Gelenkwinkelveränderungen dagegen mechanisch gemessen, was allerdings zu einer starken Bewegungsbehinderung führt (ADRIAN et al. 1966).
Untersuchungen mit modernen Bewegungserfassungssystemen (Motion Capture) be- gannen beim Hund erst gegen Ende des 20. Jahrhunderts (ALLEN et al. 1994;
KORVICK et al. 1994; OFF u. MATIS 1997b). Der Begriff Motion Capture bezeichnet die automatische Erfassung von Bewegungen, dabei werden unterschiedliche Tracking-Verfahren zur Bestimmung der Position im Raum genutzt (WEISEL 2004).
Es können beispielsweise Beschleunigungssensoren (Akzelerometrie) oder frequent sendende sonografische Marker am Hund befestigt werden (HEGEWALD 2000;
WEISEL 2004; PILLARD et al. 2012). Am häufigsten werden jedoch optische Tracking- Verfahren genutzt (HELMSMÜLLER et al. 2014; GOLDNER et al. 2015; GALINDO- ZAMORA et al. 2016). Dabei werden aktive oder passive optische Marker am Hund befestigt; aktive Marker sind selbst Lichtquellen, passive Marker bestehen aus stark reflektierendem Material (HEGEWALD 2000; WEISEL 2004). Passive Marker sind klei- ner und leichter und führen deshalb zu einer geringeren Bewegungsbeeinflussung
(OFF u. MATIS 1997a). Neueste Systeme kommen auch ganz ohne Marker aus und nehmen lediglich die Silhouette auf. Unterschieden werden weiterhin zweidimensio- nale und dreidimensionale Aufnahmesysteme. Bei den modernen computergestützten Verfahren werden die Daten elektronisch gespeichert und so verfügbar gemacht. Voll- automatische Systeme ermöglichen einen direkten Datentransfer (Online-Messung, z.B. Vicon), andere Systeme benötigen Zwischenspeicher (Offline-Messung) (OFF u.
MATIS 1997b). Mit den modernen Motion-Capture-Systemen können hunderte Be- obachtungen pro Sekunde korrekt aufgezeichnet werden und die Ergebnisse werden quantifizierbar (MCLAUGHLIN 2001; GILLETTE u. ANGLE 2008). Dadurch können kleinste Unterschiede objektiv erfasst und unterschiedliche Bewegungskomponenten berechnet werden. Durch die Verwendung eines Laufbands sind zusätzlich repetitive und kontinuierliche Messungen bei konstanter Geschwindigkeit möglich (OFF u.
MATIS 1997b).
Noch genauere Ergebnisse können durch die direkte Darstellung der Knochenbewe- gung gewonnen werden, zum Beispiel durch fluoroskopische Verfahren. Dadurch kön- nen die Weichteilgewebsartefakte der markerbasierten Techniken verhindert werden.
Die Analyse der Bewegung mittels Röntgenstrahlung (Fluoroskopie, Röntgenkine- matographie, Röntgen-Stereometrie-Analyse (RSA)) oder dynamischem CT (Compu- tertomografie) oder MRT (Magnetresonanztomografie) ist aber oftmals auf kleine Ak- tionsräume beschränkt und verursacht, mit Ausnahme des MRT, eine Strahlenbelas- tung (ANDERST u. TASHMAN 2003; TASHMAN u. ANDERST 2003; FISCHER u.
LILJE 2011; JONES et al. 2014b, a; REY et al. 2014; KIM et al. 2015b; MOORE et al.
2016; WACHS et al. 2016). Auch können im Knochen implantierte Marker verwendet werden, die aber mit großer Invasivität verbunden sind (TASHMAN u. ANDERST 2003).
Die Kinematik beschreibt die zeitliche und räumliche Bewegung von Punkten im Raum, unabhängig von Kräften (DECAMP 1997; MCLAUGHLIN 2001). Dadurch können die Bewegungen von Körpersegmenten sowie Winkelparameter der Gelenke erfasst wer- den, wie beispielsweise die Extension und Flexion von Gelenken sowie, daraus be- rechnet, ihr Bewegungsumfang (range of motion, ROM) (BÖDDEKER et al. 2012;
Geschwindigkeit und Beschleunigung können analysiert werden (SCHAEFER et al.
1998). Der Schritt kann für die Messungen in eine Stemmphase und eine Schwing- phase unterteilt werden. Die Stemmphase bezeichnet den Teil des Schrittes, in dem die Pfote Bodenkontakt hat; die Schwingphase bezeichnet das Intervall zwischen zwei Stemmphasen, wenn die Pfote sich in der Luft befindet (DECAMP 1997). Zusammen ergeben sie einen Schritt der jeweiligen Gliedmaße; ein Schrittzyklus umfasst dagegen jeweils einen Schritt von jeder Gliedmaße (DECAMP 1997). Gleichzeitig zur kinemati- schen Bewegungsuntersuchung können auch kinetische und elektromyographische Parameter erhoben werden. Die Kinetik befasst sich mit den auf einen Körper wirken- den Kräften, aus denen die Bewegung resultiert (MCLAUGHLIN 2001). Dazu werden die Bodenreaktionskräfte mit ihren drei orthogonalen Komponenten erfasst: die verti- kale Kraft Fz, die kraniokaudale Kraft Fy und die mediolaterale Kraft Fx (BUDSBERG et al. 1987; DECAMP 1997; ABDELHADI et al. 2012; ABDELHADI et al. 2013; FI- SCHER et al. 2013a; FUCHS et al. 2014). Die Elektromyographie misst die Aktivitäts- muster von an der Bewegung beteiligten Muskeln (FISCHER et al. 2013b; FUCHS et al. 2015). Weiterhin können zeitlich-räumliche Grundparameter der Metrik wie Kadenz, Schrittzykluslänge oder Schrittzyklusdauer bestimmt werden (ABDELHADI et al. 2013;
FISCHER et al. 2013a; FUCHS et al. 2014).
Bisherige kinematische Studien beim Hund haben unter anderem das Gangbild ge- sunder adulter Hunde untersucht (ALLEN et al. 1994; HOTTINGER et al. 1996;
CLEMENTS et al. 2005; BOCKSTAHLER et al. 2008; RAITH 2010) oder auch das Gangbild unterschiedlicher Rassen verglichen (BERTRAM et al. 2000; AGOSTINHO et al. 2011). Andere Studien haben speziellere Aspekte der Fortbewegung analysiert, zum Beispiel den Einfluss der Körperkondition (BRADY et al. 2013), die kinematischen Veränderungen während des Wachstums beim Welpen (HELMSMÜLLER et al. 2014) oder die Symmetrie der Gliedmaßenbewegungen im Trab (SCHAEFER et al. 1998;
GILLETTE u. ZEBAS 1999; COLBORNE 2008; COLBORNE et al. 2011). Auch Ein- flüsse auf die Ganganalyse wurden untersucht, zum Beispiel der Einfluss des Lauf- bands (BÖDDEKER et al. 2010; TORRES et al. 2013), der Laufgeschwindigkeit (COLBORNE et al. 2006; MAES et al. 2008; TIAN et al. 2011), der Markerpositionen (TORRES et al. 2011) oder der Hautverschieblichkeit (KIM et al. 2011; SCHWENCKE
et al. 2012). Weiterhin haben viele Studien den Einfluss verschiedener orthopädischer Erkrankungen auf die Fortbewegung analysiert. Zu den untersuchten Erkrankungen gehörten unter anderem die Arthrose (VILENSKY et al. 1994a; VILENSKY et al.
1994b; BOCKSTAHLER et al. 2012a; BOCKSTAHLER et al. 2012b), die Hüftge- lenksdysplasie (BENNETT et al. 1996; BOCKSTAHLER et al. 2007; MIQUELETO et al. 2013), der Kreuzbandriss (KORVICK et al. 1994; DECAMP et al. 1996; RAGETLY et al. 2012a; RAGETLY et al. 2012b), der fragmentierte Processus coronoideus medialis (BURTON et al. 2008) oder eine eingeschränkte Beweglichkeit des Karpal- gelenks (EWARD et al. 2003). Auch die Veränderungen durch eine echte oder simu- lierte Amputation verschiedener Gliedmaßen wurden untersucht (HOGY et al. 2013;
JARVIS et al. 2013; GOLDNER et al. 2015; GALINDO-ZAMORA et al. 2016). Außer- dem wurde der Erfolg von verschiedenen Therapien orthopädischer Erkrankungen durch die kinematische Ganganalyse evaluiert, unter anderem für den Kreuzbandriss (LEE et al. 2007; BÖDDEKER et al. 2012), die Hüftgelenksdysplasie (DRÜEN et al.
2012) oder den fragmentierten Processus coronoideus medialis (GALINDO-ZAMORA et al. 2014).
Der Einfluss des Alters sowie der Ernährung auf kinematische Parameter wurden beim Hund bisher allerdings kaum untersucht. Beim Menschen gibt es dagegen kinemati- sche Studien, die Veränderungen des Gangbildes durch das Alter analysiert haben (MILLS u. BARRETT 2001; ARNOLD et al. 2014; AFIAH et al. 2016; ROLDAN- JIMENEZ u. CUESTA-VARGAS 2016). Allerdings lassen sich die Ergebnisse des bipeden Menschen nicht ohne weiteres auf den quadrupeden Hund übertragen. Auch bei der Ratte gibt es dazu eine kinematische Studie (HORNER et al. 2011).
2.4 Ernährungssupplemente für den alten Hund
Kurze Telomere und die altersbedingte Involution sollen mit oxidativem Stress in Zu- sammenhang stehen (RICHTER u. VON ZGLINICKI 2007; KUDRYAVTSEVA et al.
2016). HARMAN (1956) formulierte dazu die Free Radical Theory of Aging (FRTA), bei der er in freien Radikalen die Ursache für das Altern sieht. Oxidativer Stress be- schreibt ein Ungleichgewicht zwischen den im Körper entstehenden freien Radikalen,
von denen die reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) die größte Rolle spielen, und der Fähigkeit des Körpers, diese Radikale zu neutralisieren. Später erweiterte HARMAN (1972) seine Theorie um den Aspekt der Mitochondrien zur Mito- chondrial Free Radical Theory of Aging (MFRTA). ROS entstehen hauptsächlich in den Mitochondrien als Nebenprodukt der Zellatmung. Er nimmt an, dass ROS im Be- sonderen die benachbarte und empfindliche mitochondriale DNA schädigen und so zur Dysfunktion der Mitochondrien und dadurch zu einem weiteren Anstieg der mito- chondrialen Produktion von ROS führen (KUDRYAVTSEVA et al. 2016). ROS schädi- gen weiterhin verschiedene Makromoleküle der Zelle inklusive der DNA. Dies führt zu Mutationen der DNA und in der Folge, wenn die Schäden nicht schnell genug oder nicht vollständig repariert werden konnten, kann es zu altersbedingten Veränderun- gen, Erkrankungen und Tumoren kommen (KUDRYAVTSEVA et al. 2016). Umfang- reiche und nicht mehr reparable Schäden der DNA führen zu einer vorzeitigen Senes- zenz oder Apoptose betroffener Zellen (DUAN et al. 2005). Dieser Mechanismus ver- hindert, dass sich zu viele geschädigte Zellen ansammeln. Auch die Enzymaktivität der Telomerase wird durch ROS negativ beeinflusst (BORRAS et al. 2004;
MATTHEWS et al. 2006). Während der Alterung kommt es zu einer Akkumulation die- ser Prozesse. Dadurch wird der Alterungsprozess beschleunigt und die Lebensdauer der Zellen sowie auch die Gesamtlebensdauer des Organismus verringert.
Beim Menschen soll die altersbedingte Sarkopenie mit oxidativem Stress in Verbin- dung stehen (MENG u. YU 2010; BRIOCHE u. LEMOINE-MOREL 2016). Bei Men- schen mit Arthrose wurden erhöhter oxidativer Stress und eine erniedrigte Menge an Antioxidantien gefunden (ALTINDAG et al. 2007; REGAN et al. 2008). Weiterhin wird oxidativer Stress beim Menschen mit altersabhängigen Krankheiten wie kardiovasku- lären Erkrankungen, Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer und Krebs in Verbindung gebracht (HALLIWELL 2007; BONOMINI et al. 2008; HWANG 2013; POHANKA 2014). Auch beim Hund wurde in Studien ein Zusammenhang zwischen oxidativem Stress und Arthrose (GORANOV 2007; DYCUS et al. 2013) sowie Krebs (KARAYANNOPOULOU et al. 2013; MACOTPET et al. 2013; FINOTELLO et al. 2014) gefunden. Außerdem soll oxidativer Stress beim Hund am altersbedingten Rückgang kognitiver Funktionen beteiligt sein (HWANG et al. 2008; HEAD et al. 2009;
ROMANUCCI u. DELLA SALDA 2015). Dem entgegengesetzt gehen einige Studien davon aus, dass eine leichte Erhöhung der ROS über eine darauf folgende Erhöhung der zelleigenen Abwehr gegenüber oxidativem Stress einen positiven Effekt hat (SCHULZ et al. 2007; LIU et al. 2014). Dieser Prozess wird mitochondriale Hormesis oder Mitohormesis genannt. Es ist noch unklar, ob es bezüglich der Menge oder Ein- wirkungsdauer von ROS möglicherweise einen Schwellenwert gibt, ab dem ein positi- ver Effekt von ROS in einen schädlichen Effekt umschwenkt (LIU et al. 2014).
Antioxidantien neutralisieren ROS und reduzieren so den oxidativen Stress (SIES 1997). Für den Menschen konnte in Studien gezeigt werden, dass eine Ernährung mit einem hohen Anteil an Obst, Gemüse, Antioxidantien (Beta-Carotin) und Vitaminen (A, C, E) und weiterhin auch eine Supplementierung mit Antioxidantien (besonders Beta- Carotin) und Vitaminen (Multivitamine, Vitamin B12) mit einer größeren Telomerlänge korreliert ist (MIRABELLO et al. 2009; XU et al. 2009; MARCON et al. 2012). In weite- ren Untersuchungen beim Menschen führten Antioxidantien zu einer Erhöhung der physischen Fitness, besonders bei älteren Teilnehmern (CESARI et al. 2004;
PALAZZETTI et al. 2004; CHEN et al. 2010). Die Einnahme von Vitamin E wird als Möglichkeit zur Vorbeugung und Behandlung von Sarkopenie diskutiert (KHOR et al.
2014). Antioxidantien sollen beim Menschen eine positive Wirkung auf den Knorpel haben und werden daher als Therapie für Arthrose in Betracht gezogen (MCALINDON et al. 1996; WANG et al. 2007; GROVER u. SAMSON 2016; WANG et al. 2016b).
Auch für den Hund konnte in einer Arbeit nachgewiesen werden, dass Vitamin E bei Arthrose einen positiven Effekt auf das Voranschreiten histologischer Veränderungen hatte und die Ausschüttung von Entzündungsmarkern sowie die Schmerzen reduzierte (RHOUMA et al. 2013). Bei einer Studie mit Ratten, die an Arthrose litten, führte Se- samöl, das durch seinen hohen Gehalt an Vitamin E antioxidativ wirkt, über eine Hem- mung des muskulären oxidativen Stresses zu einer Schmerzreduktion (HSU et al.
2016).
Alpha-Liponsäure und L-Carnitin sind mitochondriale Cofaktoren. Es wird angenom- men, dass diese die Funktion der Mitochondrien beeinflussen und so die Produktion von ROS erniedrigen (HAGEN et al. 2002a; HEAD et al. 2008; YONEI et al. 2008).
Antioxidantien zu regenerieren. L-Carnitin hat zusätzlich eine wichtige Rolle im Fett- säurestoffwechsel der Zelle, es wird benötigt für den Transport von langkettigen Fett- säuren in die Mitochondrien; außerdem dient es als Puffersystem. Durch diese Funk- tionen fördert L-Carnitin die effizientere aerobe Energiegewinnung und verhindert eine Laktatakkumulation und damit eine Übersäuerung des Muskelgewebes, so wird die Leistungsfähigkeit der Muskulatur erhöht (WALL et al. 2011; KIM et al. 2015a). Die Gewebekonzentration von L-Carnitin sinkt mit dem Alter (COSTELL et al. 1989). In einer Studie beim Menschen zeigte L-Carnitin einen positiven Einfluss auf die Telo- merlänge (FARAHZADI et al. 2016). Für den Menschen und die Maus konnte außer- dem ein positiver Einfluss von L-Carnitin auf die physische Fitness nachgewiesen wer- den (WALL et al. 2011; KIM et al. 2015a). Bei alten Ratten verbesserten Alpha-Lipon- säure und Acetyl-L-Carnitin die metabolische Funktion, reduzierten den oxidativen Stress und erhöhten die Bewegungsaktivität (HAGEN et al. 2002a; HAGEN et al.
2002b). In Untersuchungen beim Menschen und bei der Ratte hatte L-Carnitin einen positiven Einfluss auf den Knorpel und führte bei Arthrose zu einer Schmerzreduktion, einer Verbesserung des klinischen Status und hemmte das Voranschreiten der histo- logischen Veränderungen (STOPPOLONI et al. 2013; BIANCHI et al. 2014; MALEK MAHDAVI et al. 2015). Auch für Alpha-Liponsäure konnte bei der Ratte nachgewiesen werden, dass bei Arthrose ein Voranschreiten histologischer Veränderungen und eine Sekretion von Zytokinen gemindert wird (WANG et al. 2016a).
Mehrfach ungesättigte Omega-3-Fettsäuren können Entzündungsreaktionen reduzie- ren und damit auch die mit Entzündungen einhergehende erhöhte Zellteilungsrate ver- mindern (FERRUCCI et al. 2006). In einer Studie bei Mäusen erhöhten Omega-3-Fett- säuren die Aktivität von antioxidativen Enzymen und verlängerten die Lebensspanne (JOLLY et al. 2001). Beim Menschen führten ein höherer Gehalt an Omega-3-Fettsäu- ren oder ein erniedrigter Omega-6:Omega-3-Quotient zu einem positiven Effekt auf die Telomerlänge (FARZANEH-FAR et al. 2010; KIECOLT-GLASER et al. 2013;
O'CALLAGHAN et al. 2014). Auch zeigen Omega-3-Fettsäuren beim Menschen einen positiven Einfluss bei Sarkopenie (SMITH et al. 2011; DI GIROLAMO et al. 2014;
SMITH et al. 2015) und verbessern den Effekt von physischem Training bei älteren Personen (RODACKI et al. 2012). In mehreren Studien beim Hund milderten Omega-
3-Fettsäuren (vor allem Docosahexaensäure (DHA) und Eicosapentaensäure (EPA)) die Symptome bei Arthrose (FRITSCH et al. 2010; ROUSH et al. 2010b; BARROUIN- MELO et al. 2016; MEHLER et al. 2016). In einigen Untersuchungen wurde dieser Zusammenhang sogar durch ganganalytische Messungen bestätigt (ROUSH et al.
2010a; MOREAU et al. 2013; STRIKE et al. 2016).
Andererseits gibt es auch Studien, die keinen positiven Einfluss von exogen zugeführ- ten Ernährungssupplementen finden konnten (MACPHERSON et al. 2013;
SADOWSKA-BARTOSZ u. BARTOSZ 2014). Weitere Forschung auf diesem Gebiet ist nötig. Für den Hund gibt es bisher insgesamt nur wenige Studien zum Einfluss von oxidativem Stress oder Ernährungssupplementen im Alter. In einigen Arbeiten zeigten Antioxidantien und mitochondriale Cofaktoren einen positiven Einfluss hinsichtlich ei- nes verminderten Abbaus kognitiver Fähigkeiten bei älteren Hunden (COTMAN et al.
2002; MILGRAM et al. 2002; HEAD et al. 2008; OPII et al. 2008; SECHI et al. 2015;
SNIGDHA et al. 2016). Eine Diät, angereichert mit Antioxidantien, mitochondrialen Cofaktoren und Fischöl, verbesserte die Nierenfunktion bei älteren Hunden (HALL et al. 2016). Omega-3-Fettsäuren wirkten sich positiv auf die Immunfunktion aus, sowohl bei jungen als auch bei alten Hunden (KEARNS et al. 1999).
3. Untersuchungsgut, Material und Methoden
3.1 Studiendesign und Tiere
Als Untersuchungsgut für die erste Studie dieser Arbeit dienten zehn Beagle. Fünf Beagle aus einem Wurf im Alter von 2,0 ± 0,0 Jahren (Mittelwert ± Standardabwei- chung) repräsentierten die junge Gruppe, diese Beagle gehören zur Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Fünf weitere Beagle im Alter von 10,4 ± 0,9 Jahren, zwei davon aus einem anderen Institut der Hochschule und drei von privaten Besitzern, repräsentierten die alte Gruppe. Bei dieser Studie mussten alle Hunde frei von orthopädischen Erkrankungen sein. Eine genaue Anamnese sowie all- gemeine und orthopädische Untersuchung wurden durchgeführt. Keiner der Hunde zeigte Anzeichen einer allgemeinen oder orthopädischen Erkrankung oder bekam eine Medikation. Für die erste Studie der Partnerarbeit von WILLEN (2016; WILLEN et al., submitted-a) wurde bei diesen Beaglen die vertikale Bodenreaktionskraft als objektive Lahmheitskontrolle ausgewertet. Es wurden keine statistisch signifikanten Unter- schiede zwischen den Gruppen gefunden, beide Gruppen zeigten eine nahezu sym- metrische Gliedmaßenbelastung während der Bewegung. Eine ausführliche Beschrei- bung findet sich im Ergebnisteil im Manuskript zu Studie 1 (LORKE et al., in press).
Für den zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden 74 Schäferhunde untersucht; ei- nige davon Polizeihunde, die meisten jedoch Hunde von privaten Besitzern. 36 Hunde zwischen einem und drei Jahren repräsentierten die junge Gruppe (Altersklasse
„young“ = Y). 38 Hunde ab acht Jahren repräsentierten die alte Gruppe (Alters- klasse „old“ = O). Die Zuteilung der Futtermittel war randomisiert. Jeweils in der jungen Gruppe und in der alten Gruppe wurden den Hunden alternierend zwei kommerziell erhältliche Futtermittel zugeteilt; alle Hunde eines Besitzers erhielten dabei das gleiche Futter. Eines der Futter war ein handelsübliches Alleinfutter mittlerer Preiskategorie für adulte Hunde (Futter „control“ = C). Das andere Futter war angereichert mit Antioxi- dantien (Vitamin C, Vitamin E, Carotinoide wie Beta-Carotin, Flavonoide, Taurin), mi- tochondrialen Cofaktoren (L-Carnitin, Alpha-Liponsäure) und Omega-3-Fettsäuren (Docosahexaensäure, DHA; Eicosapentaensäure, EPA) und speziell für ältere Hunde
konzipiert (Futter „enriched“ = E). Die Zuteilung zu den Besitzern war verblindet. Ins- gesamt resultierten aus der Einteilung vier Gruppen: zwei Gruppen mit jungen Hunden, die mit Futtermittel C und E gefüttert wurden (YC und YE), und zwei Gruppen mit alten Hunden, die ebenfalls Futtermittel C und E erhielten (OC und OE). Die Fütterung er- folgte über einen Zeitraum von sechs Monaten, zu drei Zeitpunkten wurden die Mes- sungen der Telomerlänge und der Gelenkbeweglichkeit durchgeführt. Untersuchungs- termin eins stellte den Beginn der Studie dar. Ab diesem Zeitpunkt fütterten die Besit- zer ausschließlich das zugeteilte Futter. Der zweite Untersuchungstermin wurde nach drei Monaten vergeben und die abschließende dritte Untersuchung fand nach sechs Monaten Fütterung statt. Die Besitzer wurden angewiesen, andere Futtermittel, Fut- terzusätze oder Belohnungen zu vermeiden und die durchschnittliche physische Akti- vität des Hundes beizubehalten. Bei jedem Untersuchungstermin wurden eine genaue Anamnese aufgenommen sowie eine allgemeine und orthopädische Untersuchung durchgeführt. Weitere Details zum Studiendesign und zu den Hunden finden sich im Ergebnisteil im Manuskript zu Studie 2 (LORKE et al., submitted).
Alle Messungen wurden in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz durchgeführt.
Die Studien wurden beim Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) in Oldenburg angezeigt (Aktenzeichen 33.9-42502- 05-13A369).
3.2 Telomerlängen-Analyse
In der zweiten Studie dieser Arbeit wurde neben der kinematischen Ganganalyse auch eine Telomerlängenmessung durchgeführt. Von jedem Hund der vier Gruppen wurde bei jedem Untersuchungstermin EDTA-Vollblut abgenommen. Daraus wurde mit einem konfektionierten Kit (NucleoSpin Blood L, MACHEREY-NAGEL GmbH & Co.
KG, Düren, Deutschland) die genomische Leukozyten-DNA isoliert. Die Telomerlänge wurde durch Southern Blot Analyse der terminalen Restriktionsfragmente (TRFs) gemessen (KIMURA et al. 2010; AUBERT et al. 2012; MONTPETIT et al. 2014). In der Literatur ließen sich keine sicher reproduzierbaren Protokolle für canine Proben finden;
und es ist kein konfektioniertes Kit erhältlich, das speziell für canine Telomere gedacht
ist. Daher wurde das Kit TeloTAGGG Telomere Length Assay (Roche Diagnostics International AG, Rotkreuz, Schweiz) genutzt. Zunächst musste dieses Kit für die caninen Proben evaluiert werden. Dabei waren Anpassungen des Protokolls nötig, die genau notiert wurden, damit die Analysen reproduzierbar und die Ergebnisse somit vergleichbar sind. Die Gebrauchsanweisung des Kits empfiehlt den Einsatz von 1-2 µg DNA. In der vorliegenden Untersuchung wurde 1 µg DNA verwendet, höhere Mengen an DNA erschwerten die Auswertung durch ein starkes Hintergrundsignal. Die eingesetzte Menge DNA wurde bei 37 °C für 2 h durch die im Kit enthaltenen Restriktionsenzyme HinfI und RsaI verdaut. Durch die Sequenzspezifität dieser Enzyme bleiben die Telomere und Subtelomere erhalten, während die restliche DNA zu Fragmenten von niedrigem molekularem Gewicht zerschnitten wird. In der anschließenden Gelelektrophorese wurden die entstandenen DNA-Fragmente ihrer Länge nach aufgetrennt. Die Gebrauchsanweisung des Kits empfiehlt dafür ein 0,8 %iges Agarosegel und eine Laufzeit von 2-4 h bei 5 V/cm. Im Vergleich zu humanen Telomeren, deren Länge zwischen 0,5 und 15 kbp variiert (AUBERT u.
LANSDORP 2008; MONAGHAN 2010), sind canine Telomere länger mit einer Spanne von 10 bis 23 kbp (NASIR et al. 2001; MCKEVITT et al. 2002). Für eine klarere Auftrennung der hochmolekularen genomischen DNA-Fragmente der caninen Proben wurde die Gelelektrophorese abweichend vom Protokoll in einem 0,5 %igen Agarosegel bei 1 V/cm und mit einer Laufzeit von 18 h durchgeführt. Die DNA wurde dann über Nacht durch Southern Blotting auf eine positiv geladene Nylonmembran übertragen und anschließend hitzefixiert. Dann wurde die Membran mit einer im Kit enthaltenen telomerspezifischen und Digoxigenin-markierten DNA-Sonde bei 42 °C für 3 h hybridisiert. Es folgte die Inkubation mit einem dem Kit ebenfalls beigefügten Digoxigenin-spezifischen Antikörper, an den das Enzym Alkalische Phosphatase gebunden war. Nach Zugabe des im Kit enthaltenen Substrats CDP-Star und dessen Metabolisierung durch die Alkalische Phosphatase wurden die Telomere durch Chemilumineszenz sichtbar.
Ein Gel-Bildgebungssystem (G:Box Chemi XT4, Syngene, Cambridge, Großbritannien) wurde genutzt, um das Chemilumineszenzsignal zu detektieren und als digitales Bild zu speichern. Für die quantitative Analyse wurde anhand eines im Kit
enthaltenen Molekulargewichtsmarkers ein Raster zwischen ungefähr 5 und 45 kbp justiert. Die Intensität der Lumineszenz wurde mit dem Programm ImageJ (Version 1.46r, Wayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) gemessen.
Der Hintergrund, definiert als eine Trendlinie vom ersten bis zum letzten Feld des Rasters, wurde subtrahiert (GÖHRING et al. 2014). Die mittlere TRF-Länge wurde anhand folgender Formel berechnet:
TRF = ∑ODi
∑ODi / Li
Dabei ist ODi das Chemilumineszenzsignal und Li die TRF-Länge an der Position i des Rasters. Die minimale TRF-Länge wurde definiert als das kürzeste Feld des Rasters, bei dem das Chemilumineszenzsignal einen Schwellenwert von 20 % über dem Hintergrundsignal übersteigt. Der Schwellenwert wurde gewählt, um sicherzustellen, dass das Signal durch TRFs und nicht durch Schwankungen des Hintergrundes hervorgerufen wurde. Jeder Blot beinhaltete eine humane und eine canine Positivkontrolle, außerdem wurden die drei Proben eines Hundes immer direkt nebeneinander auf dem gleichen Blot analysiert. Zuletzt wurde die prozentuale Veränderung zwischen dem Beginn der Studie und den Untersuchungsterminen nach drei sowie nach sechs Monaten Fütterung berechnet. Weitere Details zur Telomerlängenmessung sind im Ergebnisteil im Manuskript zu Studie 2 zu finden (LORKE et al., submitted).
3.3 Kinematische Ganganalyse
3.3.1 Datenerfassung
Die kinematischen Messungen wurden im Ganganalyselabor der Klinik für Kleintiere (Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) durchgeführt. Ein instrumentiertes Lauf- band mit vier Bändern (TM-07-B, Bertec Corporation, Columbus, OH, USA) stand zur Verfügung. Sechs Hochgeschwindigkeits-Infrarotkameras (MX3+, Vicon Motion Sys- tems Ltd., Oxford, Großbritannien; Aufnahmegeschwindigkeit 100 Hz) um das Lauf- band herum detektierten die dreidimensionale Bewegung der Marker während des
Laufens. An jedem Messtag wurden die Kameras kalibriert. Eine digitale Hochge- schwindigkeits-Videokamera (pilot piA 640-210gc, Basler AG, Ahrensburg, Deutsch- land) nahm die Bewegung der Hunde von einer lateralen Position aus auf. Alle Geräte wurden von einer Bedienungseinheit aus mit den Programmen Vicon Nexus (Version 1.8.5, Vicon Motion Systems Ltd., Oxford, Großbritannien) und Treadmill Control Panel (Version 1.7.12, Bertec Corporation, Columbus, OH, USA) bedient und kontrolliert.
Bei jeder Messung wurde vor den Aufnahmen eine Trainingsphase durchgeführt, bis die Hunde entspannt und locker auf dem Laufband liefen. Mit doppelseitigem Klebe- band und Haarklammern wurden 35 retroreflektive passive Marker (Durchmesser 16 mm) an allen vier Gliedmaßen und am Rücken jedes Hundes befestigt. Die gelenk- bestimmenden Marker wurden über definierten und gut tastbaren anatomischen Kno- chenpunkten angebracht, weitere Hilfsmarker wurden an bestimmten Stellen auf den Zwischensegmenten und am Rücken befestigt. Die Markerpositionen sind im Ergeb- nisteil in den Manuskripten zu Studie 1 und Studie 2 genau beschrieben und darge- stellt (LORKE et al., in press; LORKE et al., submitted); siehe dazu auch GALINDO- ZAMORA et al. (2014; 2016) und GOLDNER et al. (2015). Bei den Aufnahmen wurde die Laufbandgeschwindigkeit für jeden Hund individuell angepasst, so dass er ein gleichmäßiges und regelmäßiges Gangbild zeigte. Für den ersten Teil der Untersu- chungen wurden alle Beagle im Trab aufgenommen. Für die zweite Studie dieser Ar- beit liefen die meisten Hunde im Trab oder Pass, drei alte Hunde mussten im Schritt aufgenommen werden. Die Laufbandgeschwindigkeit wurde beim ersten Untersu- chungstermin festgelegt, bei den beiden Folgeuntersuchungen wurde für jeden Hund die gleiche Laufbandgeschwindigkeit und die gleiche Gangart für die Aufnahmen ge- wählt.
3.3.2 Datenauswertung
Für jeden Termin wurde eine Sequenz mit zehn zusammenhängenden und repräsen- tativen Schritten ausgewählt, bei welcher der jeweilige Hund gerade und gleichmäßig lief. Die mittels der Infrarotkameras aufgenommenen Markerpunkte wurden im Pro- gramm Vicon Nexus mit einem hinterlegten kinematischen Modell der vier Gliedmaßen
und des Rückens bearbeitet. Dabei musste jeder Markerpunkt mit einer anatomischen Lokalisation des Modells verknüpft werden. So wurde ein vernetztes Stabmodell er- stellt, bei dem die jeweiligen Gelenkwinkel durch die Ortskoordinaten von drei gelenk- bestimmenden Markern definiert waren. Die Zeitpunkte des Auf- und Abfußens wurden anhand der vertikalen Bodenreaktionskräfte und des parallel aufgezeichneten Videos bestimmt.
Die Winkel der Schulter-, Ellbogen-, Karpal-, Hüft-, Knie- und Tarsalgelenke wurden zweidimensional in die sagittale Ebene projiziert und in das Programm Excel 2010 (Studie 1) bzw. 2013 (Studie 2) exportiert (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA). Für eine bessere Vergleichbarkeit wurde eine Zeitnormierung durchgeführt, da- bei wurde die gesamte Schrittdauer auf 100 % normiert und die Stemm- und Schwing- phase wurden jeweils auf die gleiche Dauer von 50 % normiert (GALINDO-ZAMORA et al. 2014; GOLDNER et al. 2015). Die Auswertung umfasste bei jedem Gelenkwinkel den minimalen Gelenkwinkel in [°] (MIN, maximale Flexion), den maximalen Gelenk- winkel in [°] (MAX, maximale Extension) und den Bewegungsumfang des Gelenks in [°] (range of motion, ROM, Differenz zwischen MIN und MAX) während jedes Schrit- tes; bei der ersten Studie zusätzlich noch die Gelenkwinkelverlaufskurve in [°]
(BÖDDEKER et al. 2012; DRÜEN et al. 2012; GALINDO-ZAMORA et al. 2014). Die Daten wurden dann über die zehn ausgewerteten Schritte gemittelt. Um eventuelle Unterschiede der Markerpositionen auszugleichen, wurde eine Standardisierung durchgeführt, bei welcher der Mittelwert jeder Gelenkwinkelverlaufskurve von allen Werten dieses Gelenks subtrahiert wurde (KADABA et al. 1989; BOCKSTAHLER et al. 2007; BOCKSTAHLER et al. 2008). Bei der ersten Studie wurden dann die Winkel der linken und rechten Seite gemittelt, da es keine statistisch signifikanten Unter- schiede zwischen den Seiten gab. Bei der zweiten Studie wurden die Winkel der linken und rechten Seite anhand des Impulses der vertikalen Bodenreaktionskraft (ground reaction force, GRF), ausgewertet in der zweiten Studie der Partnerarbeit von WILLEN (2016; WILLEN et al., submitted-b), einer stärker belasteten (GRF↑) und einer schwä- cher belasteten (GRF↓) Seite zugeordnet, jeweils bei den Vorder- und Hintergliedma- ßen. Dies wurde so gewählt, da keine unterschiedliche Wirkung des Futters auf die
linke und rechte Körperhälfte zu erwarten war. Stattdessen konnte so festgestellt wer- den, ob es eine unterschiedliche Wirkung auf gesunde oder kompensierende und schwächere oder lahme Gliedmaßen gab. Bei der zweiten Studie wurde im Anschluss die prozentuale Veränderung zwischen dem Beginn der Studie und den Untersu- chungsterminen nach drei sowie nach sechs Monaten Fütterung berechnet. Weitere Einzelheiten zur Durchführung und Auswertung der kinematischen Ganganalyse fin- den sich im Ergebnisteil in den Manuskripten zu Studie 1 und 2 (LORKE et al., in press;
LORKE et al., submitted).
3.4 Statistische Analyse
Aufgrund der kleinen Gruppengröße von 2x n = 5, wurde bei der ersten Studie dieser Arbeit nicht von einer Normalverteilung ausgegangen. Deshalb wurden der nichtpara- metrische Wilcoxon-Rangsummen-Test (Mann-Whitney-Test) für zwei unabhängige Stichproben (signifikant bei p < 0,05; statistische Tendenz bei p < 0,10) und der eben- falls nichtparametrische Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test für zwei verbundene Stich- proben (signifikant bei p < 0,05) für die statistische Auswertung genutzt. Außerdem wurde die statistische Power retrospektiv berechnet, um die Ergebnisse zu validieren.
Im zweiten Teil dieser Arbeit waren die Daten graphisch nahezu normal verteilt. Des- halb wurde der parametrische Zweistichproben-t-Test für unabhängige Stichproben (hoch signifikant bei p < 0,01; signifikant bei p < 0,05) genutzt. Für die statistischen Auswertungen wurde das Programm SAS Enterprise Guide (Version 7.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) verwendet und für die Berechnung der statistischen Power das Programm PASS (Version 14, NCSS LLC, Kaysville, UT, USA). Weitere Details zur statistischen Auswertung der Ergebnisse sind im Ergebnisteil in den Manuskripten zu Studie 1 und 2 zu finden (LORKE et al., in press; LORKE et al., submitted).
4. Ergebnisse
4.1 Studie 1
Dieses Manuskript wurde am 01. Juni 2016 beim „Journal of Veterinary Science“ ein- gereicht und am 02. Januar 2017 angenommen.
Manuskript ID: JVS-16-212
Comparative kinematic gait analysis in young and old Beagle dogs
Malin Lorke1, Maray Willen1, Karin Lucas1, Martin Beyerbach2, Patrick Wefstaedt1, Hugo Murua Escobar1,3, Ingo Nolte1,*
1Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, D-30559 Hannover, Germany
2Institute for Biometry, Epidemiology and Information Processing, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, D-30559 Hannover, Germany
3Division of Medicine Clinic III, Hematology, Oncology and Palliative Medicine, University of Rostock, D-18057 Rostock, Germany
*Corresponding author
4.1.1 Abstract
Age-related involution in dogs involves loss of muscle mass and changes in connective tissue and articular cartilage. The aim of this study was to examine whether an age- related influence on joint mobility can be detected in the absence of diseases. Five young (Ø 2.0 years) and five old (Ø 10.4 years) healthy and sound Beagle dogs were measured during locomotion on a treadmill by computer-assisted gait analysis. Angles of the shoulder, elbow, carpal, hip, stifle and tarsal joints were analyzed, including joint angle progression curves, minimum and maximum joint angles and range of motion (ROM). The old group showed a smaller maximum joint angle (p = 0.037) and ROM (p = 0.037) of the carpal joint and similar tendencies in the shoulder, elbow and carpal joint. The descriptive analysis of the progression curves revealed less flexion and ex- tension of the joints of the forelimb. This indicates restricted joint mobility of the forelimb but primarily of the carpal joint. Findings in the joints of the hindlimb were not con- sistent; contrasting alterations may be due to a compensatory mechanism. As most alterations were found in the distal joints, these should receive particular attention when examining elderly dogs.
Keywords: Locomotion, Joints, Range of Motion, Geriatrics, Canine
4.1.2 Introduction
It is only since the end of the 20th century that research has been concerned with pet geriatrics. In recent years interest in this topic has grown as pets today reach a higher age than ever before and the population of elderly pets is increasing [27, 33]. During the progressive and irreversible process of aging adaptability to internal and external stresses is decreasing. This reduces physiological functions, increases multimorbidity and finally leads to death [17]. The onset and progression of the aging process in dogs as well as longevity depend on various factors, with the body size being the most im- portant one – in large dogs signs of aging occur earlier and their lifespan is shorter [34]. According to Bellows et al. [3] small- and medium-breed dogs may be classified as senior at 7 to 10 years of age and as geriatric at ≥ 11 years of age, large- and giant- breed dogs may be classified as senior at 6 to 8 years of age and as geriatric at
≥ 9 years of age.
The aim of this pilot study was to examine whether, and if so, to what extent an influ- ence of the aging process on the locomotor system in the absence of diseases can be detected. Signs of aging in dogs are, among other things, a loss of muscle mass and strength as well as changes of connective tissue and articular cartilage [20, 29, 37, 39].
This can finally lead to primary degenerative joint disease [35]. These processes could affect locomotion and restrict joint mobility in elderly dogs. More precise knowledge of the influence of aging on the locomotor system could support the need for regular or- thopedic health examinations as well as physiotherapy and exercise therapy in elderly dogs. Knowledge of which joints are most frequently or most intensely affected by re- stricted joint mobility could enable a more targeted therapy. In addition, determining base values for old dogs compared to young ones of the same breed could be helpful for further studies in this field.
The human eye cannot perceive the complex and fast elements of locomotion in detail.
It has been shown that observers cannot reliably score an induced lameness in dogs, not even observers with orthopedic experience [38, 44]. This demonstrates that visual examination is neither objective nor sufficiently accurate. Computer-assisted gait
analysis systems can record hundreds of observations per second and enable quanti- fication [22]. As a result, minute differences can be captured and various components of locomotion such as the range of motion (ROM) of joints can be calculated. Previous kinematic studies mostly analyzed the gait of healthy adult dogs at different ages [13, 28] or of dogs with various orthopedic diseases [4, 8], focusing in particular on the investigation of different therapeutic treatments [10, 16]. In one case even alterations of limb angles in growing puppies were analyzed [25], but not the effects associated with aging. In the present pilot study it was hypothesized that joint mobility is restricted and that consequently joint ROM is decreased in elderly dogs. Therefore, the joint angles of five young and five old Beagle dogs during trotting were examined using computer-assisted gait analysis.
4.1.3 Materials and Methods
4.1.3.1 Animals
Ten Beagle dogs participated in this study. Five Beagle dogs from the same litter, owned by the Small Animal Clinic (University of Veterinary Medicine Hannover, Foun- dation, Germany), represented the young group. The dogs were on average 2.0 ± 0.0 years of age (mean ± standard deviation), male, neutered and had a body weight of 18.3 ± 2.4 kg. Five more Beagle dogs, two from another institute of the uni- versity and three from private owners, represented the old group. They were 10.4 ± 0.9 years of age, three of the dogs were male and two female and all were neutered, except for one male dog. The old dogs had a body weight of 15.5 ± 2.4 kg.
The deviation of body weight between these two groups was not statistically significant.
All experiments were performed in accordance with the relevant statutory provisions.
The study was reported to the Lower Saxony State Office for Consumer Protection and Food Safety in Oldenburg, Germany (reference number 33.9-42502-05-13A369).
All participating dogs had to be free of orthopedic diseases. Therefore, detailed anam- nesis as well as general and orthopedic examinations were performed. There were no signs of general or orthopedic diseases in the participating dogs and none of the dogs
were receiving any medication. In the companion study by Willen et al. (manuscript submitted for publication) the vertical ground reaction force was recorded as an objec- tive measure of lameness. Kinetic and kinematic data were recorded parallel; except for one young dog, where the kinetic recordings had to be retaken and the later results were used for kinetic analysis. No statistically significant differences between the groups could be found in vertical impulse, peak vertical force or mean vertical force.
The body weight distribution, calculated according to Steiss et al. [41], was in both groups nearly 60 % for the forelimbs and 40 % for the hindlimbs, which is considered physiological in the Beagle dog [1]. The symmetry indices for the fore- and hindlimbs were calculated according to Herzog et al. [26] and a symmetry index of ˂ 6 % was considered physiological [11]. The symmetry indices of both groups confirmed an al- most symmetrical gait pattern without signs of lameness.
4.1.3.2 Data collection
Kinematic measurements were performed in the gait analysis laboratory of the Small Animal Clinic, similar to previous kinematic studies in this laboratory [10, 16, 21, 24, 25]. An instrumented four-belt treadmill (TM-07-B, Bertec Corporation, Columbus, OH, USA) was used. Six high-speed infrared cameras (MX3+, Vicon Motion Systems Ltd., Oxford, Great Britain; recording frequency 100 Hz) around the treadmill detected the three-dimensional movement of the markers during locomotion. A digital high-speed video camera (pilot piA 640-210gc, Basler AG, Ahrensburg, Germany) recorded the locomotion of the dogs from a lateral position. All devices were managed and controlled with the programs Vicon Nexus (version 1.8.5, Vicon Motion Systems Ltd., Oxford, Great Britain) and Treadmill Control Panel (version 1.7.12, Bertec Corporation, Colum- bus, OH, USA).
Prior to the recordings a training phase was carried out until the dogs were running at a relaxed and loose trot. The young dogs, which were used to the treadmill due to a previous study, had a predetermined training phase of 5.0 ± 0.0 minutes; the old dogs needed 18.2 ± 14.5 minutes. With double-sided adhesive tape and hair clips 35 retroreflective passive markers (16 mm diameter) were attached, by the same person,
to all four limbs and the back of each dog. The joint determining markers were attached above defined and well palpable anatomical landmarks, additional markers were attached to certain places on the intermediate segments (Fig. 1, above; [21, 24]). For each dog the treadmill speed was adjusted until the respective dog was able to trot smoothly and regularly. The young group trotted at 1.8 ± 0.0 m/sec, the old group at 1.7 ± 0.1 m/sec. In each case around ten recordings of about 30 seconds in length were made, therefore the complete duration of the recordings was about ten minutes.
4.1.3.3 Data analysis
For each dog a sequence of ten consecutive and representative strides was chosen in which the respective dog ran straight and uniformly. The marker points, recorded by the infrared cameras, were processed by the program Vicon Nexus with a deposited kinematic model of the four limbs and the back. Each marker point had to be linked to an anatomical location of this model. Thus, a linked stick model was created (Figure 1, below), in which the respective joint angles were defined by the location coordinates of three joint determining markers. The time points when the feet touched the ground and lifted off were determined manually. Therefore, the measured vertical ground re- action force, which indicates the beginning and end of the stance phase and as a con- sequence also the duration of the swing phase, and the parallel recorded video were used.
The angles of the shoulder, elbow, carpal, hip, stifle and tarsal joints were projected two-dimensionally in the sagittal plane and exported to the program Excel 2010 (Mi- crosoft Corporation, Redmond, WA, USA). For better comparability between the dogs, the data output was time normalized to a stride duration of 100 % and the same stance and swing phase duration of 50 % [21, 24]. The analysis of each joint angle included the joint angle progression curve in [°], the minimum joint angle in [°] (MIN, maximum flexion), the maximum joint angle in [°] (MAX, maximum extension) and the range of motion of the joint in [°] (ROM, difference between MIN and MAX) during each stride [10, 16, 21]. For each joint angle the data were averaged over the ten analyzed strides.
