Studiendesign und Tiere

Als Untersuchungsgut für die erste Studie dieser Arbeit dienten zehn Beagle. Fünf Beagle aus einem Wurf im Alter von 2,0 ± 0,0 Jahren (Mittelwert ± Standardabwei-chung) repräsentierten die junge Gruppe, diese Beagle gehören zur Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover. Fünf weitere Beagle im Alter von 10,4 ± 0,9 Jahren, zwei davon aus einem anderen Institut der Hochschule und drei von privaten Besitzern, repräsentierten die alte Gruppe. Bei dieser Studie mussten alle Hunde frei von orthopädischen Erkrankungen sein. Eine genaue Anamnese sowie all-gemeine und orthopädische Untersuchung wurden durchgeführt. Keiner der Hunde zeigte Anzeichen einer allgemeinen oder orthopädischen Erkrankung oder bekam eine Medikation. Für die erste Studie der Partnerarbeit von WILLEN (2016; WILLEN et al., submitted-a) wurde bei diesen Beaglen die vertikale Bodenreaktionskraft als objektive Lahmheitskontrolle ausgewertet. Es wurden keine statistisch signifikanten Unter-schiede zwischen den Gruppen gefunden, beide Gruppen zeigten eine nahezu sym-metrische Gliedmaßenbelastung während der Bewegung. Eine ausführliche Beschrei-bung findet sich im Ergebnisteil im Manuskript zu Studie 1 (LORKE et al., in press).

Für den zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden 74 Schäferhunde untersucht; ei-nige davon Polizeihunde, die meisten jedoch Hunde von privaten Besitzern. 36 Hunde zwischen einem und drei Jahren repräsentierten die junge Gruppe (Altersklasse

„young“ = Y). 38 Hunde ab acht Jahren repräsentierten die alte Gruppe (Alters-klasse „old“ = O). Die Zuteilung der Futtermittel war randomisiert. Jeweils in der jungen Gruppe und in der alten Gruppe wurden den Hunden alternierend zwei kommerziell erhältliche Futtermittel zugeteilt; alle Hunde eines Besitzers erhielten dabei das gleiche Futter. Eines der Futter war ein handelsübliches Alleinfutter mittlerer Preiskategorie für adulte Hunde (Futter „control“ = C). Das andere Futter war angereichert mit Antioxi-dantien (Vitamin C, Vitamin E, Carotinoide wie Beta-Carotin, Flavonoide, Taurin), mi-tochondrialen Cofaktoren (L-Carnitin, Alpha-Liponsäure) und Omega-3-Fettsäuren (Docosahexaensäure, DHA; Eicosapentaensäure, EPA) und speziell für ältere Hunde

konzipiert (Futter „enriched“ = E). Die Zuteilung zu den Besitzern war verblindet. Ins-gesamt resultierten aus der Einteilung vier Gruppen: zwei Gruppen mit jungen Hunden, die mit Futtermittel C und E gefüttert wurden (YC und YE), und zwei Gruppen mit alten Hunden, die ebenfalls Futtermittel C und E erhielten (OC und OE). Die Fütterung er-folgte über einen Zeitraum von sechs Monaten, zu drei Zeitpunkten wurden die Mes-sungen der Telomerlänge und der Gelenkbeweglichkeit durchgeführt. Untersuchungs-termin eins stellte den Beginn der Studie dar. Ab diesem Zeitpunkt fütterten die Besit-zer ausschließlich das zugeteilte Futter. Der zweite Untersuchungstermin wurde nach drei Monaten vergeben und die abschließende dritte Untersuchung fand nach sechs Monaten Fütterung statt. Die Besitzer wurden angewiesen, andere Futtermittel, Fut-terzusätze oder Belohnungen zu vermeiden und die durchschnittliche physische Akti-vität des Hundes beizubehalten. Bei jedem Untersuchungstermin wurden eine genaue Anamnese aufgenommen sowie eine allgemeine und orthopädische Untersuchung durchgeführt. Weitere Details zum Studiendesign und zu den Hunden finden sich im Ergebnisteil im Manuskript zu Studie 2 (LORKE et al., submitted).

Alle Messungen wurden in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz durchgeführt.

Die Studien wurden beim Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) in Oldenburg angezeigt (Aktenzeichen 33.9-42502-05-13A369).

3.2 Telomerlängen-Analyse

In der zweiten Studie dieser Arbeit wurde neben der kinematischen Ganganalyse auch eine Telomerlängenmessung durchgeführt. Von jedem Hund der vier Gruppen wurde bei jedem Untersuchungstermin EDTA-Vollblut abgenommen. Daraus wurde mit einem konfektionierten Kit (NucleoSpin Blood L, MACHEREY-NAGEL GmbH & Co.

KG, Düren, Deutschland) die genomische Leukozyten-DNA isoliert. Die Telomerlänge wurde durch Southern Blot Analyse der terminalen Restriktionsfragmente (TRFs) gemessen (KIMURA et al. 2010; AUBERT et al. 2012; MONTPETIT et al. 2014). In der Literatur ließen sich keine sicher reproduzierbaren Protokolle für canine Proben finden;

und es ist kein konfektioniertes Kit erhältlich, das speziell für canine Telomere gedacht

ist. Daher wurde das Kit TeloTAGGG Telomere Length Assay (Roche Diagnostics International AG, Rotkreuz, Schweiz) genutzt. Zunächst musste dieses Kit für die caninen Proben evaluiert werden. Dabei waren Anpassungen des Protokolls nötig, die genau notiert wurden, damit die Analysen reproduzierbar und die Ergebnisse somit vergleichbar sind. Die Gebrauchsanweisung des Kits empfiehlt den Einsatz von 1-2 µg DNA. In der vorliegenden Untersuchung wurde 1 µg DNA verwendet, höhere Mengen an DNA erschwerten die Auswertung durch ein starkes Hintergrundsignal. Die eingesetzte Menge DNA wurde bei 37 °C für 2 h durch die im Kit enthaltenen Restriktionsenzyme HinfI und RsaI verdaut. Durch die Sequenzspezifität dieser Enzyme bleiben die Telomere und Subtelomere erhalten, während die restliche DNA zu Fragmenten von niedrigem molekularem Gewicht zerschnitten wird. In der anschließenden Gelelektrophorese wurden die entstandenen DNA-Fragmente ihrer Länge nach aufgetrennt. Die Gebrauchsanweisung des Kits empfiehlt dafür ein 0,8 %iges Agarosegel und eine Laufzeit von 2-4 h bei 5 V/cm. Im Vergleich zu humanen Telomeren, deren Länge zwischen 0,5 und 15 kbp variiert (AUBERT u.

LANSDORP 2008; MONAGHAN 2010), sind canine Telomere länger mit einer Spanne von 10 bis 23 kbp (NASIR et al. 2001; MCKEVITT et al. 2002). Für eine klarere Auftrennung der hochmolekularen genomischen DNA-Fragmente der caninen Proben wurde die Gelelektrophorese abweichend vom Protokoll in einem 0,5 %igen Agarosegel bei 1 V/cm und mit einer Laufzeit von 18 h durchgeführt. Die DNA wurde dann über Nacht durch Southern Blotting auf eine positiv geladene Nylonmembran übertragen und anschließend hitzefixiert. Dann wurde die Membran mit einer im Kit enthaltenen telomerspezifischen und Digoxigenin-markierten DNA-Sonde bei 42 °C für 3 h hybridisiert. Es folgte die Inkubation mit einem dem Kit ebenfalls beigefügten Digoxigenin-spezifischen Antikörper, an den das Enzym Alkalische Phosphatase gebunden war. Nach Zugabe des im Kit enthaltenen Substrats CDP-Star und dessen Metabolisierung durch die Alkalische Phosphatase wurden die Telomere durch Chemilumineszenz sichtbar.

Ein Gel-Bildgebungssystem (G:Box Chemi XT4, Syngene, Cambridge, Großbritannien) wurde genutzt, um das Chemilumineszenzsignal zu detektieren und als digitales Bild zu speichern. Für die quantitative Analyse wurde anhand eines im Kit

enthaltenen Molekulargewichtsmarkers ein Raster zwischen ungefähr 5 und 45 kbp justiert. Die Intensität der Lumineszenz wurde mit dem Programm ImageJ (Version 1.46r, Wayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) gemessen.

Der Hintergrund, definiert als eine Trendlinie vom ersten bis zum letzten Feld des Rasters, wurde subtrahiert (GÖHRING et al. 2014). Die mittlere TRF-Länge wurde anhand folgender Formel berechnet:

TRF = ∑ODi

∑ODi / Li

Dabei ist ODi das Chemilumineszenzsignal und Li die TRF-Länge an der Position i des Rasters. Die minimale TRF-Länge wurde definiert als das kürzeste Feld des Rasters, bei dem das Chemilumineszenzsignal einen Schwellenwert von 20 % über dem Hintergrundsignal übersteigt. Der Schwellenwert wurde gewählt, um sicherzustellen, dass das Signal durch TRFs und nicht durch Schwankungen des Hintergrundes hervorgerufen wurde. Jeder Blot beinhaltete eine humane und eine canine Positivkontrolle, außerdem wurden die drei Proben eines Hundes immer direkt nebeneinander auf dem gleichen Blot analysiert. Zuletzt wurde die prozentuale Veränderung zwischen dem Beginn der Studie und den Untersuchungsterminen nach drei sowie nach sechs Monaten Fütterung berechnet. Weitere Details zur Telomerlängenmessung sind im Ergebnisteil im Manuskript zu Studie 2 zu finden (LORKE et al., submitted).

3.3 Kinematische Ganganalyse

3.3.1 Datenerfassung

Die kinematischen Messungen wurden im Ganganalyselabor der Klinik für Kleintiere (Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) durchgeführt. Ein instrumentiertes Lauf-band mit vier Bändern (TM-07-B, Bertec Corporation, Columbus, OH, USA) stand zur Verfügung. Sechs Hochgeschwindigkeits-Infrarotkameras (MX3+, Vicon Motion Sys-tems Ltd., Oxford, Großbritannien; Aufnahmegeschwindigkeit 100 Hz) um das Lauf-band herum detektierten die dreidimensionale Bewegung der Marker während des

Laufens. An jedem Messtag wurden die Kameras kalibriert. Eine digitale Hochge-schwindigkeits-Videokamera (pilot piA 640-210gc, Basler AG, Ahrensburg, Deutsch-land) nahm die Bewegung der Hunde von einer lateralen Position aus auf. Alle Geräte wurden von einer Bedienungseinheit aus mit den Programmen Vicon Nexus (Version 1.8.5, Vicon Motion Systems Ltd., Oxford, Großbritannien) und Treadmill Control Panel (Version 1.7.12, Bertec Corporation, Columbus, OH, USA) bedient und kontrolliert.

Bei jeder Messung wurde vor den Aufnahmen eine Trainingsphase durchgeführt, bis die Hunde entspannt und locker auf dem Laufband liefen. Mit doppelseitigem Klebe-band und Haarklammern wurden 35 retroreflektive passive Marker (Durchmesser 16 mm) an allen vier Gliedmaßen und am Rücken jedes Hundes befestigt. Die gelenk-bestimmenden Marker wurden über definierten und gut tastbaren anatomischen Kno-chenpunkten angebracht, weitere Hilfsmarker wurden an bestimmten Stellen auf den Zwischensegmenten und am Rücken befestigt. Die Markerpositionen sind im Ergeb-nisteil in den Manuskripten zu Studie 1 und Studie 2 genau beschrieben und darge-stellt (LORKE et al., in press; LORKE et al., submitted); siehe dazu auch GALINDO-ZAMORA et al. (2014; 2016) und GOLDNER et al. (2015). Bei den Aufnahmen wurde die Laufbandgeschwindigkeit für jeden Hund individuell angepasst, so dass er ein gleichmäßiges und regelmäßiges Gangbild zeigte. Für den ersten Teil der Untersu-chungen wurden alle Beagle im Trab aufgenommen. Für die zweite Studie dieser Ar-beit liefen die meisten Hunde im Trab oder Pass, drei alte Hunde mussten im Schritt aufgenommen werden. Die Laufbandgeschwindigkeit wurde beim ersten Untersu-chungstermin festgelegt, bei den beiden Folgeuntersuchungen wurde für jeden Hund die gleiche Laufbandgeschwindigkeit und die gleiche Gangart für die Aufnahmen ge-wählt.

3.3.2 Datenauswertung

Für jeden Termin wurde eine Sequenz mit zehn zusammenhängenden und repräsen-tativen Schritten ausgewählt, bei welcher der jeweilige Hund gerade und gleichmäßig lief. Die mittels der Infrarotkameras aufgenommenen Markerpunkte wurden im Pro-gramm Vicon Nexus mit einem hinterlegten kinematischen Modell der vier Gliedmaßen

und des Rückens bearbeitet. Dabei musste jeder Markerpunkt mit einer anatomischen Lokalisation des Modells verknüpft werden. So wurde ein vernetztes Stabmodell er-stellt, bei dem die jeweiligen Gelenkwinkel durch die Ortskoordinaten von drei gelenk-bestimmenden Markern definiert waren. Die Zeitpunkte des Auf- und Abfußens wurden anhand der vertikalen Bodenreaktionskräfte und des parallel aufgezeichneten Videos bestimmt.

Die Winkel der Schulter-, Ellbogen-, Karpal-, Hüft-, Knie- und Tarsalgelenke wurden zweidimensional in die sagittale Ebene projiziert und in das Programm Excel 2010 (Studie 1) bzw. 2013 (Studie 2) exportiert (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA). Für eine bessere Vergleichbarkeit wurde eine Zeitnormierung durchgeführt, da-bei wurde die gesamte Schrittdauer auf 100 % normiert und die Stemm- und Schwing-phase wurden jeweils auf die gleiche Dauer von 50 % normiert (GALINDO-ZAMORA et al. 2014; GOLDNER et al. 2015). Die Auswertung umfasste bei jedem Gelenkwinkel den minimalen Gelenkwinkel in [°] (MIN, maximale Flexion), den maximalen Gelenk-winkel in [°] (MAX, maximale Extension) und den Bewegungsumfang des Gelenks in [°] (range of motion, ROM, Differenz zwischen MIN und MAX) während jedes Schrit-tes; bei der ersten Studie zusätzlich noch die Gelenkwinkelverlaufskurve in [°]

(BÖDDEKER et al. 2012; DRÜEN et al. 2012; GALINDO-ZAMORA et al. 2014). Die Daten wurden dann über die zehn ausgewerteten Schritte gemittelt. Um eventuelle Unterschiede der Markerpositionen auszugleichen, wurde eine Standardisierung durchgeführt, bei welcher der Mittelwert jeder Gelenkwinkelverlaufskurve von allen Werten dieses Gelenks subtrahiert wurde (KADABA et al. 1989; BOCKSTAHLER et al. 2007; BOCKSTAHLER et al. 2008). Bei der ersten Studie wurden dann die Winkel der linken und rechten Seite gemittelt, da es keine statistisch signifikanten Unter-schiede zwischen den Seiten gab. Bei der zweiten Studie wurden die Winkel der linken und rechten Seite anhand des Impulses der vertikalen Bodenreaktionskraft (ground reaction force, GRF), ausgewertet in der zweiten Studie der Partnerarbeit von WILLEN (2016; WILLEN et al., submitted-b), einer stärker belasteten (GRF↑) und einer schwä-cher belasteten (GRF↓) Seite zugeordnet, jeweils bei den Vorder- und Hintergliedma-ßen. Dies wurde so gewählt, da keine unterschiedliche Wirkung des Futters auf die

linke und rechte Körperhälfte zu erwarten war. Stattdessen konnte so festgestellt wer-den, ob es eine unterschiedliche Wirkung auf gesunde oder kompensierende und schwächere oder lahme Gliedmaßen gab. Bei der zweiten Studie wurde im Anschluss die prozentuale Veränderung zwischen dem Beginn der Studie und den Untersu-chungsterminen nach drei sowie nach sechs Monaten Fütterung berechnet. Weitere Einzelheiten zur Durchführung und Auswertung der kinematischen Ganganalyse fin-den sich im Ergebnisteil in fin-den Manuskripten zu Studie 1 und 2 (LORKE et al., in press;

LORKE et al., submitted).