Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
E-Mail: info@dvg.de · Internet: www.dvg.de ISBN 978-3-86345-358-9
Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2016
© 2016 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-358-9
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 info@dvg.de www.dvg.de
Tierärztliche Hochschule Hannover
Die Wirkung von Dichloressigsäure auf kanine epitheliale Tumorzelllinien aus
Mamma, Prostata und Blase
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Tatjana Paola Harting Münster
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte Klinik für Kleintiere
Tierärztliche Hochschule Hannover PD Dr. rer. nat. Hugo Murua Escobar Zentrum für Innere Medizin
Klinik III: Hämatologie, Onkologie und Palliativmedizin
Universitätsmedizin Rostock
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Pablo Steinberg
Tag der mündlichen Prüfung: 09.11.2016
Die vorliegende Arbeit wurde unterstützt durch ein Stipendium der Hannoverschen Gesellschaft zur Förderung der Kleintiermedizin e. V. (HGFK) und der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
MEINER FAMILIE
Publikationen:
The effect of dichloroacetate in canine prostate adenocarcinomas and transitional cell carcinomas in vitro
TATJANA HARTING, MANDY STUBBENDORFF, SASKIA WILLENBROCK, SIEGFRIED WAGNER, PATRIK SCHADZEK, ANACLET NGEZAHAYO, HUGO MURUA ESCOBAR AND INGO NOLTE
International Journal of Oncology 49: 2341-2350, 2016 Doi: 10.3892/ijo.2016.3720
Abstracts:
The effect of Dichloroacetate on canine cancer cell lines
T. HARTING, S. WILLENBROCK, S. WAGNER, H. MURUA-ESCOBAR, M.
STUBBENDORFF, I. NOLTE
In: Proceedings of 3rd World Veterinary Cancer Congress 2016, Foz do Iguassu, Brasilien, S. 61
Vorträge:
3rd World Veterinary Cancer Congress
(WVCC, 25.05.-29.05.2016, Foz do Iguaçu, Brasilien):
The effect of Dichloroacetate on canine cancer cell lines.
T. HARTING, S. WILLENBROCK, S. WAGNER, H. MURUA-ESCOBAR, M.
STUBBENDORFF, I. NOLTE
Poster:
24. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik“
der DVG (InnLab 2016, 29.01.-30.01.2016, Berlin):
Die Wirkung von Dichloressigsäure auf kanine Tumorzellen in vitro.
T. HARTING, S. WILLENBROCK, S. WAGNER, H. MURUA-ESCOBAR, M.
STUBBENDORFF, I. NOLTE
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 9
2 Literaturübersicht ... 11
2.1 Tumortherapie beim Hund ... 11
2.2 Warburg-Effekt ... 11
2.3 Dichloressigsäure ... 13
2.4 Zellkultur als Alternative zum Tierversuch ... 14
3 Material und Methoden ... 15
3.1 Zelllinien ... 15
3.2 Zellkultur ... 15
3.3 DCA Applikation ... 16
3.4 Quantifizierung der Zellen ... 16
3.5 Laktat ... 16
3.6 RNA Isolation und quantitative RT-PCR (qRT-PCR) ... 17
3.7 Luminex Magnetic Bead Analyse ... 17
3.8 Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrie ... 18
3.9 Metabolische Aktivität ... 19
3.10 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie ... 19
3.10.1 Proliferationsrate ... 19
3.10.2 Apoptose (TUNEL-Methode) ... 20
3.10.3 Mitochondriale Aktivität ... 20
3.10.4 Bildverarbeitung ... 20
3.11 Statistik ... 20
4 Ergebnisse ... 21
4.1 Manuskript 1 ... 21
4.2 Manuskript 2 ... 23
5 Diskussion ... 49
6 Zusammenfassung... 56
7 Summary ... 58
8 Literaturverzeichnis ... 60
9 Abkürzungsverzeichnis ... 72
10 Danksagung ... 73
Einleitung
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1 Einleitung
Bei einer gestiegenen Lebenserwartung einhergehend mit einer besseren medi- zinischen Versorgung des Hundes nimmt die Tumortherapie inzwischen einen be- deutenden Teil ein (GILSON 1998; PAOLONI u. KHANNA 2008). Die Therapie ma- ligner Tumoren ist jedoch nach wie vor eine große Herausforderung. Zwar stehen grundsätzlich für den Hund Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung, die denen des Menschen ähneln (in erster Linie Tumorchirurgie, Chemotherapie und Strahlen- therapie), jedoch sind die erzielten Heilungserfolge auf Grund des palliativen Be- handlungsregimes selten kurativ (PAOLONI u. KHANNA 2008; ROWELL et al. 2011, BILLER et al. 2016). Die Behandlungskosten insbesondere der Chemotherapie sind jedoch vergleichsweise hoch und damit oft der limitierende Faktor in der Entschei- dungsfindung für eine Therapie. Wünschenswert wäre daher eine wirksame sowie gleichzeitig kostengünstige Alternative, die möglichst zielgerichtet an der Tumorzelle ansetzt und das gesunde Gewebe weitgehend schont.
Ein Angriffspunkt für die Tumorbehandlung ist der im Vergleich zur gesunden Zelle gestörte Stoffwechsel von Tumorzellen, der sogenannte Warburg Effekt (WARBURG et al. 1926). Otto Heinrich Warburg fand bereits im Jahr 1924 heraus, dass Tumor- zellen zur Energiegewinnung nicht die energetisch wesentlich effizientere oxidative Phosphorylierung, sondern den alternativen Weg der anaeroben Glykolyse von Pyruvat zu Laktat nutzen und somit unabhängig vom Sauerstoffgehalt in der Zelle werden (WARBURG et al. 1926). Dieser Stoffwechselweg wird auch dann beschrit- ten, wenn ausreichend Sauerstoff vorhanden ist („aerobe Glykolyse“). Warburg führte dies auf eine Störung des Mitochondrienmetabolismus zurück und sah in diesem Phänomen den Schlüssel zum Verständnis der Krebsentstehung.
Dichloressigsäure (DCA), ein kleines Molekül, das relativ einfach und dazu kosten- günstig herzustellen ist (STACPOOLE 1989), greift direkt in mehrere zentrale Stoff- wechselmechanismen ein, indem es über Inhibition der Pyruvatdehydrogenase- kinase (PDK) die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-Coenzym A
10
(Acetyl-CoA) beeinflusst (WHITEHOUSE u. RANDLE 1973; WHITEHOUSE et al.
1974). Aufgrund dieser Eigenschaft wurde DCA vorwiegend zur Behandlung von Stoffwechselstörungen beim Menschen eingesetzt, wie z. B. Hyperglykämie (STACPOOLE et al. 1978), Laktatazidose (STACPOOLE et al. 2006; STACPOOLE et al. 2008) und Hypercholesterinämie (MOORE et al. 1979) und auf Grund seiner postulierten Fähigkeit, die in Tumorzellen entgleiste Glykolyse zu antagonisieren, auch bei der Behandlung von verschiedenen Tumorzellen des Menschen (reviewed by KANKOTIA u. STACPOOLE 2014). Die Studien an verschiedenen Tumorzelllinien des Menschen zeigten dabei vielversprechende Resultate (reviewed by KANKOTIA u. STACPOOLE 2014). Auf Grund fehlender Erkenntnisse bei kaninen Tumoren, stellt sich die Frage, ob DCA beim Hund als Alternative zu den bisherigen Therapie- standards eingesetzt werden kann und welche Veränderungen in den Tumorzellen hervorgerufen werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden daher verschiedene kanine epitheliale Tumorzell- linien der Mamma, Prostata sowie Blase ausgewählt und mit 10 mM DCA über einen Zeitraum von 48 Stunden behandelt. Die ausgewählte Dosierung ergab in vielen Stu- dien an humanen Zelllinien eine gut zu beobachtende Wirksamkeit ohne gravierende toxische Effekte (CAO et al. 2008; WONG et al. 2008). Auch wenn diese Dosierung systemisch in vivo nicht erreicht werden kann, so ermöglicht diese Konzentration dennoch einen Vergleich zwischen humanen und kaninen Zelllinien. In der eigenen Studie sollte daher der Einfluss von DCA auf kanine Zellen in vitro evaluiert werden, um erste Erkenntnisse bezüglich Zelltod und metabolischer Alterationen ohne tierex- perimentelle Untersuchungen zu gewinnen. Da nicht von einheitlichen Effekten auf verschiedene Tumorentitäten ausgegangen werden kann, werden verschiedene neo- plastische Zelllinien von Hunden mit DCA evaluiert und geprüft, ob für die Wirkung eher ein antiproliferativer oder Apoptose beeinflussender Effekt verantwortlich ist.
Literaturübersicht
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2 Literaturübersicht
2.1 Tumortherapie beim Hund
Die Tumortherapie beim Hund besteht im Wesentlichen aus drei Säulen: die Tumor- chirurgie, Chemo- und Radiotherapie. Diese Therapieoptionen können beim Hund einzeln oder auch in Kombination angewendet werden. Die Tumorchirurgie wird pri- mär bei lokalen, nicht-metastasierenden, nicht infiltrativ wachsenden oder Tumoren früheren Stadiums angewendet und ist dabei in der Regel kurativ (GILSON 1998).
Diese wird, ebenso wie die Chemotherapie, auch zu palliativen bzw. zytoreduktiven Zwecken angewendet, um eine tumorspezifische Symptomatik zu verringern und die Lebensqualität zu verbessern (GILSON 1998). Zusätzlich können im Anschluss an eine Chirurgie Chemotherapeutika im Rahmen einer adjuvanten Therapie eingesetzt werden, mit dem Ziel verbliebene Tumorzellen oder Mikrometastasen zu eliminieren.
Die alleinige Chemotherapie wird beim Hund in der Regel bei nicht resezierbaren Tu- moren oder bei neoplastischen Veränderungen des lymphatischen sowie hämato- poetischen Systems angewendet (SIMON et al. 2006). Im Gegensatz zu der Chemo- therapie des Menschen werden beim Hund deutlich geringere Dosierungen von Chemotherapeutika eingesetzt, weshalb eine kurative Behandlung nur selten erreicht wird. Sie beschränkt sich somit in der Regel auf eine Verlängerung der Lebenszeit bei einer allgemein guten Lebensqualität unter der Therapie (ROWELL et al. 2011, BILLER et al. 2016). Als dritte Option in der Tumortherapie des Hundes wird insbe- sondere bei soliden Tumoren wie z. B. Mastzelltumoren eine Radiotherapie ange- wendet. Des Weiteren wird die Bestrahlung auch bei unsauberen Wundrändern bzw.
nicht vollständig resezierbaren Tumoren eingesetzt (KRY u. BOSTON 2014).
2.2 Warburg-Effekt
Unter normoxischen Bedingungen erfolgt die Energiegewinnung in nicht-neoplas- tischen Geweben über die Oxidation von Glucose über Pyruvat zu Acetyl-CoA (RACKER 1974). Die Verstoffwechselung von Pyruvat in Mitochondrien wird dabei durch das Enzym Pyruvatdehydrogenase (PDH) katalysiert. Das dabei entstandene
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Acetyl-CoA wird in den Zitratzyklus eingeschleust und zur weiteren Energiegewin- nung verwendet. Im Gegensatz dazu erfolgt die Energieproduktion in den meisten neoplastischen Geweben mittels der „aeroben Glykolyse“. Dieser sogenannte Warburg Effekt wurde bereits 1926 von Otto Warburg beschrieben, der schon zur da- maligen Zeit eine Störung im mitochondrialen Energiemetabolismus vermutete (WARBURG et al. 1926). Bei der „aeroben Glykolyse“ erfolgt die Energiegewinnung über die zytosolische Vergärung von Pyruvat zu Laktat, auch in Anwesenheit von Sauerstoff. Während der Karzinogenese kommt es zu einer Aktivierung von hypoxia- inducible-factor 1 alpha (HIF-1α) und in dessen Folge zu einer gesteigerten Exprimie- rung von Glukosetransportern sowie der Aktivierung der PDK. Die Heraufregulation von Glukosetransportern stellt die Aufnahme von ausreichend Glukosenmolekülen sicher (SEMENZA et al. 1994). Des Weiteren wird PDH durch PDK inhibiert und eine Glykolyse ermöglicht (KIM et al. 2006; LUM et al. 2007). Im Zuge der gesteigerten Laktatproduktion kommt es zu einer Azidifikation des umliegenden Gewebes, welche zunehmend toxisch auf die normalen Zellen wirkt und somit eine Expansion der tumorösen Zellen ermöglicht (GATENBY u. GILLIES 2004). Die Azidifikation sowie die HIF-1α Induktion fördert die Angiogenese und stellt somit eine ausreichende Glu- koseversorgung des veränderten Gewebes sicher. Die damit einhergehende gestei- gerte Sauerstoffverfügbarkeit führt in den Tumorzellen nicht zu einer Revidierung des Energiemetabolismus hin zur Glukoseoxidation (WARBURG et al. 1926;
MICHELAKIS et al. 2008). Neben den bisher beschriebenen Vorgängen hat eine verminderte Zellatmung in den Mitochondrien eine verminderte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zur Folge. Im Verlauf der normalen Zellatmung und Alterung, reichern sich ROS im Mitochondrium an, die ihrerseits die Mitochon- drienmembran depolarisieren, spannungsabhängige Kanäle öffnen und somit pro- apoptotische Faktoren (z. B. Cytochrom C) freisetzen. In diesem Zuge kommt es zu einer Aktivierung von Caspase 9 und im weiteren Verlauf zum Zelltod. Dieser Mecha- nismus wird in Tumorzellen auf Grund der verminderten Zellatmung und somit aus- bleibenden ROS Produktion verhindert, welches eine Apoptoseresistenz nach sich zieht (PLAS u. THOMPSON 2002; KIM u. DANG 2005).
Literaturübersicht
13 2.3 Dichloressigsäure
Bei Dichloressigsäure (DCA) handelt es sich um ein kleines Molekül (150 kDa), welches eine hohe orale sowie parenterale Bioverfügbarkeit aufweist und in die meisten Gewebe inklusive des Gehirns penetriert (ABEMAYOR et al. 1984;
STACPOOLE 1989). Über die Hemmung der PDK aktiviert DCA indirekt den Enzymkomplex der PDH, welcher die Oxidation von Pyruvat zu Acetyl-CoA katalysiert (WHITEHOUSE u. RANDLE 1973; WHITEHOUSE et al. 1974) und somit die tumorspezifischen Störungen revidiert. Untersucht wird die Wirkung von DCA seit mehreren Jahren bei verschiedenen Erkrankungen des Menschen. Hierzu zählen kongenitale Mitochondriendefekte (STACPOOLE et al. 2006; STACPOOLE et al.
2008), Diabetes (STACPOOLE et al. 1978) und pulmonale Hypertension (HADDAD et al. 2010). Des Weiteren liegt seit einiger Zeit der Interessenfokus auf der Untersuchung der Wirkung von DCA auf verschiedenen humanen Tumorzelllinien (Pankreas (CHEN et al. 2009), Kolon (SANCHEZ-ARAGO et al. 2010), Brust (SUN et al. 2010), Ovar (SAED et al. 2011), Endometrium (WONG et al. 2008), Neuroblastom (VELLA et al. 2012), Glioblastom (MICHELAKIS et al. 2010), T-Zell Lymphom (KUMAR et al. 2012)). Bei Hunden wurden bis auf pharmakokinetische Eigenschaften von DCA sowie zur Therapie der Laktatazidose bisher keine Studien über die Wirksamkeit bei Tumorerkrankungen veröffentlicht (LUKAS et al. 1980, PARK et al. 1982, MAISENBACHER et al. 2013). In der Studie von Maisenbacher et al. (2013) konnte gezeigt werden, dass die Hunde den Wirkstoff in niedrigen Konzentrationen sehr gut vertragen und dabei keine Nebenwirkungen auftreten.
Trotz vielversprechender Ergebnisse beim Menschen wird die Toxizität von DCA noch kontrovers diskutiert. So musste eine klinische Studie von Kaufmann et al.
(2006) an Patienten mit MELAS Syndrom nach Auftreten teilweise irreversibler peripherer Polyneuropathien abgebrochen werden, während in einer anderen Studie von Stacpoole et al. (2006) keine Toxizität und kein Auftreten einer peripheren Neuropathie nachgewiesen wurde.
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2.4 Zellkultur als Alternative zum Tierversuch
Gemäß §7a des Tierschutzgesetzes (Bundesgesetzblatt (BGBl. I), Neufassung 2006, zuletzt geändert 2015) dürfen Tierversuche zur Prüfung der Wirksamkeit und Unbe- denklichkeit von Arzneimitteln eingesetzt werden, jedoch ist zu prüfen, ob dieser Zweck nicht durch andere Methoden erreicht werden kann. Da Zellkulturen ein aner- kanntes in vitro Modell sind (BALLS et al. 2002), ist ein Tierversuch bei unzureichen- den Kenntnissen über eine Substanz somit ethisch nicht vertretbar. Zellkulturen eig- nen sich als eine potentiell unbegrenzt verfügbare Ressource sehr gut, um metabo- lische Prozesse, Protein- und Genexpressionen sowie Änderungen der Vitalität unter Einfluss von Substanzen zu untersuchen (BURDALL et al. 2003). Sie tragen in er- heblichen Maß dazu bei, die von Russell und Burch et al. (1959) definierten drei R´s (Reduction, Refinement and Replacement) umzusetzen und Schmerzen, Leiden so- wie Schäden von Tieren zu vermeiden. Darüber hinaus stellt die Zellkultur eine ein- fache, kostengünstige und effiziente Methode dar (DOKE u. DHAWALE 2015).
Material und Methoden
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3 Material und Methoden
Die verwendeten Materialien und Methoden sind in der Publikation HARTING et al.
(2016) sowie in Kapitel 4.2 ausführlich dargestellt und an dieser Stelle nur kurz be- schrieben.
3.1 Zelllinien
Die in den vorliegenden Studien verwendeten Zelllinien wurden in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover aus verschiedenen kaninen Tumoren durch kontinuierliche Kultivierung etabliert. Dabei handelt es sich um Zelllinien aus Prostataadenokarzinomen (DT08/46, CT1258, DT15/08), drei Über- gangszellkarzinomen der Prostata (DT08/40; DT15/09) bzw. der Blase (DT15/06) und zwei Mammakarzinomen (MTH52C, DT14/06T), einem benignen Mamma- adenom (ZMTH3) sowie einer Zelllinie aus nicht-neoplastischem Drüsengewebe der Mamma (MTH53A). Die Mammalinien MTH53A, MTH52C und ZMTH3 wurden mittels SV-40 Transfektion immortalisiert.
3.2 Zellkultur
Alle Zelllinien wurden routinemäßig im Labor der Klinik für Kleintiere, Tierärztliche Hochschule Hannover mit 199er Medium (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt), 10 % fetalem Kälberserum (Hyclone, Thermo Fisher Scientific) sowie 2 % Penicillin-Streptomycin (Biochrom, Berlin) in 25 cm2-Zellkulturflaschen (TPP, Faust Lab Science, Klettgau) bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Bei einer Konfluenz von circa 85 % wurden die jeweiligen Zellen trypsiniert (TrypLE Express, Gibco, Thermo Fisher Scientific) und entsprechend ihrer individuellen Wachstumskinetik geteilt.
16 3.3 DCA Applikation
Die im Experiment genutzten Zellen (s. Kapitel 3.2) wurden in 75 cm²-Zellkultur- flaschen (TPP, Faust Lab Science) mit 10 mM DCA (Sigma Aldrich, Taufkirchen) über eine Dauer von 48 Stunden kultiviert. Eine Negativkontrolle der gleichen Zell- linie ohne DCA Zusatz wurde parallel kultiviert. Zuvor wurde DCA mit destilliertem Wasser auf eine 1 M Lösung verdünnt, der pH-Wert mit NaOH auf 7,4 justiert und anschließend steril gefiltert.
3.4 Quantifizierung der Zellen
Nach 48 Stunden wurden die Zellen erneut trypsiniert, die Zellzahl mittels auto- matisiertem Cellometer Auto T4 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) ermittelt und mit der Negativkontrolle verglichen. Anschließend wurden die Zellen bei 1000 rpm über 10 Minuten zentrifugiert, mit 1x PBS (Biochrom) gewaschen und für weitere Analysen (Proteinexpression, quantitative RT-PCR) bei -80 °C gelagert.
3.5 Laktat
Die Laktatfreisetzung in das Medium wurde mittels einer kolorimetrischen Detektion ermittelt. Hierfür wurde der Medium-Überstand aus den jeweiligen Zellkulturen (s.
Kapitel 3.3) zentrifugiert, um avitale Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Zur Stabili- sierung des Laktats wurde der Überstand in ein Natrium-Fluorid-Gefäß (Sarstedt, Nümbrecht) überführt und der Laktatgehalt mit dem Cobas-Analysesystem C311 (Hitachi, Tokyo, Japan) bestimmt. Um Einflüsse des im Medium enthaltenen pH- Indikators Phenolrot sowie des fetalen Kälberserums auf die Messwerte zu elimi- nieren, wurde natives Medium als Negativkontrolle verwendet und die Werte der Kontrollmessungen von allen DCA-Werten subtrahiert. Um die unterschiedliche Zell- zahl sowie deren Volumen zwischen den Proben anzugleichen, wurden die Laktat- werte zum Proteingehalt der entsprechenden Probe ins Verhältnis gesetzt. Der Pro- teingehalt wurde mit dem Pierce BCA Assay (Thermo Fisher Scientific) gemäß dem Herstellerprotokoll ermittelt.
Material und Methoden
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3.6 RNA Isolation und quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
Die Isolation der gesamten RNA erfolgte aus jeweils 106 Zellen (s. Kapitel 3.4) mit dem NucleoSpin Small RNA Kit (Macherey Nagel, Düren) nach dem Protokoll des Herstellers.
Für die anschließende Synthese der komplementären DNA (cDNA) wurden 35 ng RNA sowie das TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) und die jeweiligen Primer für die zu untersuchenden MikroRNAs (miR141, ID 245445_mat; miR145, ID 002278; miR375, ID 000564) von Thermo Fisher Scientific verwendet. Entsprechend der Herstelleranweisung wurden folgende Zyklus-Bedingungen genutzt:
30 Minuten bei 16 °C 30 Minuten bei 42 °C 5 Minuten bei 85 °C.
Die relative Quantifizierung der MikroRNA-Expression der behandelten Zellen im Vergleich zu der entsprechenden Negativkontrolle erfolgte unter Verwendung von TaqMan Universal Master Mix NoAmpErase UNG (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific), den oben genannten Primern und einem Eppendorff realplex4 Cycler (Eppendorff, Wesseling-Berzdorf). Die Quantifizierung erfolgte gemäß den Herstellerangaben mit folgenden Zyklen:
95 °C für 10 Minuten
40 Zyklen mit 95 °C für 15 Sekunden und 60 °C für 60 Sekunden.
Die Daten wurden zum Referenzgen RNU6B (ID 001093, Thermo Fisher Scientific) normalisiert und mit der Software Rest2009 (Qiagen, Hilden, Germany) nach der delta delta CT (ΔΔCT) Methode ausgewertet.
3.7 Luminex Magnetic Bead Analyse
Für die Analyse der Proteinexpression der C-Jun-N-terminale Kinase (JNK) und Bcl- 2-Antagonist of Cell Death (BAD), des Tumorpromoterproteins Survivin und des
18
PDH-Enzymkomplexes wurde die Luminex xMAP Magnetic Bead Technologie (Luminex Corp. Hertogenbosch, Niederlande) verwendet. Die Analyse von Survivin erfolgte aus dem Überstand der Zellkultur und wurde mit einem Multiplex Immuno- assay (eBioscience, Frankfurt am Main) durchgeführt. Die Durchführung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers mit einer Inkubation über Nacht. Die Survivin Ex- pression wurde zum Proteingehalt normalisiert. Die Expressionsanalyse der Pyruvat- dehydrogenase und ihre phosphorylierten Formen wurde mit dem Multi-Species Pyruvate Dehydrogenase (PDH) Complex Magnetic Bead Panel, die Proteine der frühen Apoptose (JNK, Bad) mit dem 7-Plex Early Apoptosis Magnetic Bead Kit von Merck Millipore (Darmstadt) analysiert. Die Durchführung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers.
3.8 Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie wurde für die Analyse der apoptotischen sowie avitalen Zellen nach DCA Behandlung gegenüber der Negativkontrolle verwendet. Dabei wurden 105 Zellen in einer 6-well Platte (TPP, Faust Lab Science) ausgesät (s.
Kapitel 3.3) und über 48 Stunden kultiviert. Anschließend wurden die Zellen trypsi- niert, pellettiert und mit Annexin V-FITC/Sytox gefärbt (Annexin V-FITC Detection Kit Plus, PromoCell, Heidelberg). Kurz nach Einleitung der Apoptose werden Phosphati- dylserinreste der inneren Membran an die Zelloberfläche transloziert, welche über Annexin-V-Bindung detektiert werden können. Sytox bindet ausschließlich an die DNA von avitalen Zellen. Vitale Zellen zeigen dabei keine, apoptotische Zellen eine grüne und tote Zellen eine starke grüne Fluoreszenz. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt mittels eines Durchflusszytometers der Firma BD Bioscience (Heidelberg) im Kanal FL-1 (grün). Die Zellpopulationen wurden in einem Dot Plot sowie einem Histo- gramm dargestellt. Die Auswertung erfolgte mit der Software FlowJo der Firma TreeStar (Ashland, OR, USA). Für die Festlegung der Gates wurden vitale Zellen als Negativkontrolle und mit Saponin permeabilisierte (tote Zellen) als Positivkontrolle verwendet.
Material und Methoden
19 3.9 Metabolische Aktivität
Die metabolische Aktivität wurde mit dem CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay von Promega (Mannheim) durchgeführt. Nach Zugabe der Tetra- zoliumsalzlösung wird diese von vitalen Zellen zu einem Formazanprodukt reduziert, welches photometrisch gemessen werden kann. Für die Durchführung wurden die Zellen entsprechend ihrer Wachstumskinetik in einer 96-well Platte (Falcon, Corning, Amsterdam, Niederlande) gemäß Kapitel 3.3 kultiviert. Für die erste Messung zum Zeitpunkt 0 wurden direkt nach der Aussaat 20 µl Tetrazoliumlösung hinzugegeben und nach zwei Stunden die Absorption mit einem Synergy2 Plate Reader (BioTek, Bad Friedrichshall) ermittelt. Die weiteren Messungen erfolgten nach 24, 48, 72 und 96 Stunden jeweils 120 Minuten nach Zugabe der Tetrazoliumsalzlösung.
3.10 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie
Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe
„Zellphysiologie & Zelluläre Mechanik“ (Prof. Dr. A. Ngezahayo) am Institut für Bio- physik der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität in Hannover durchgeführt.
Die Zellen wurden für die Ermittlung der Proliferations- sowie der Apoptoserate und der mitochondrialen Aktivität zunächst gemäß Kapitel 3.3 in einer µ-slide 8-well Platte (Ibidi, Martinsried) kultiviert.
3.10.1 Proliferationsrate
Die Proliferationsrate wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung des Proliferations- markers Ki67 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) ermittelt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit Triton X-100 permeabilisiert und über Nacht mit einem kanin-spezifischen Primärantikörper bei 37 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Färbung mittels eines monoklonalen Alexa Fluor 555 (Cell Signaling Technology, Leiden, Niederlande) Sekundärantikörpers über 60 Minuten. Eine Gegenfärbung der Zellkerne erfolgte mit DAPI.
20 3.10.2 Apoptose (TUNEL-Methode)
Für die Färbung apoptotischer Zellen wurde das Apoptag Fluorescein Direct Kit (Merck Millipore) entsprechend der Herstellerangaben verwendet. Die Anregung erfolgte mittels eines Argonlasers bei 488 nm. Die Zellkernfärbung erfolgte mit DAPI.
3.10.3 Mitochondriale Aktivität
Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie wurde indirekt die Aktivität der Mitochondrien mittels mitochondrialer ROS dargestellt. Die Färbung der Zellen erfolgte mit dem Farbstoff MitoSOX (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) sowie die Kern- färbung mit DAPI nach dem Protokoll des Herstellers. MitoSOX färbt ROS, die bei der Glukoseoxidation in den aktiven Mitochondrien anfallen (LENAZ et al. 2002).
3.10.4 Bildverarbeitung
Die Fluoreszenzbilder wurden mit dem Bildverarbeitungsprogramm ImageJ analy- siert. Hierfür wurde die Intensität der totalen Fluoreszenz (ROS, Ki67) im gesamten Bildausschnitt ermittelt, die Fluoreszenz des Hintergrundes subtrahiert und ins Ver- hältnis zu der Zellzahl (DAPI, blau) gesetzt. Anschließend wurden die relative mito- chondriale Aktivität sowie die Proliferationsrate im Vergleich zu der entsprechenden Negativkontrolle berechnet. Bei der TUNEL Methode wurde die Anzahl der TUNEL positiven Zellen im gesamten Bildausschnitt ermittelt.
3.11 Statistik
Die statistische Auswertung erfolgte mit der SAS Enterprise Guide 7.1 Software (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Für den Vergleich von zwei Stichproben wurde der t-Test verwendet. Das statistische Konfidenzniveau wurde auf 95 % festgelegt und p<0,05 als statistisch signifikant betrachtet. Alle Daten wurden als Mittel- wert ± Standardabweichung dargestellt.
Ergebnisse
21
4 Ergebnisse
4.1 Manuskript 1
Das Manuskript wurde am 05.09.2016 beim „International Journal of Oncology“ zur Publikation angenommen und am 05.10.2016 publiziert.
The effect of dichloroacetate in canine prostate adenocarcinomas and transitional cell carcinomas in vitro
DOI: 10.3892/ijo.2016.3720
Tatjana Harting1,2, Mandy Stubbendorff3, Saskia Willenbrock1, Siegfried Wagner1, Patrik Schadzek4, Anaclet Ngezahayo4, Hugo Murua Escobar1,2 and Ingo Nolte1
1Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover, Germany
2Division of Medicine Clinic III, Hematology, Oncology and Palliative Medicine, University of Rostock, Rostock, Germany
3Evotec AG, Hamburg, Germany
4Institute of Biophysics, Leibniz University, Hannover, Germany
Correspondence to:
Prof. Dr. Ingo Nolte, Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 9, 30559 Hannover, Germany
Email: Ingo.Nolte@tiho-hannover.de
22 Abstract
The Warburg effect describes the ability of cancer cells to produce energy via aerobic glycolysis instead of oxidative phosphorylation of pyruvate. This deviation in mitochondrial metabolism inhibits apoptosis, allowing increased proliferation under conditions of reduced oxygen levels. Dichloroacetate (DCA) was successfully used in several human cancer cell lines to reactivate oxidative phosphorylation in mitochondria. Aim of this study was the characterization and response of canine cancer cell lines after DCA exposure. The effect of 10 mM DCA was characterized in vitro on a set of six canine prostate adenocarcinoma and transitional cell carcinoma (TCC) derived cell lines. Cell counts, lactate levels, apoptosis, expression of apop- totic proteins, survival factors and different miRNAs were analyzed. Additionally, metabolic activity, mitochondrial activity and proliferation were investigated. DCA significantly decreased cell number of all but one utilized cell lines and leads to a significant reduction of lactate release. Decreased survivin levels were found in all cell lines, two of which presented a significant reduction in metabolic activity.
Increased miR-375 levels were measured in all TCC cell lines. Reactivation of pyru- vate dehydrogenase and an elevated mitochondrial activity appear to induce the tran- sition from aerobic glycolysis back to oxidative phosphorylation. Further, these results display that DCA treatment has a suppressant effect on proliferation of canine cancer cells.
Key words: Dichloroacetate, canine prostate adenocarcinoma, canine transitional cell carcinoma, Warburg effect
Ergebnisse
23 4.2 Manuskript 2
Das folgende Manuskript wurde am 19.08.2016 bei dem Journal „PLOS ONE” zur Publikation eingereicht.
Dichloroacetate Affects Proliferation but not Apoptosis in Canine Mammary Cell Lines
Tatjana P Harting1,2, Mandy Stubbendorff3, Saskia Willenbrock1, Susanne C Hammer1,2, Siegfried Wagner1, Patrik Schadzek4, Anaclet Ngezahayo4, Hugo Murua Escobar1,2, Ingo Nolte1*
1Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover, Germany
2Division of Medicine Clinic III, Hematology, Oncology and Palliative Medicine, University of Rostock, Rostock, Germany
3Evotec AG, Hamburg, Germany
4Institute of Biophysics, Leibniz University, Hannover, Germany
* Corresponding author Correspondence to:
Prof. Dr. Ingo Nolte, Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 9, 30559 Hannover, Germany
Email: Ingo.Nolte@tiho-hannover.de
24 Abstract
Targeting mitochondrial energy metabolism is a novel approach in cancer research and can be traced back to the description of the Warburg effect. Dichloroacetate, a controversially discussed subject of many studies in cancer research, is a pyruvate dehydrogenase kinase inhibitor. Dichloroacetate causes metabolic changes in cance- rous glycolysis towards oxidative phosphorylation via indirect activation of pyruvate dehydrogenase in mitochondria. Canine mammary cancer is frequently diagnosed but after therapy prognosis still remains poor. In this study, canine mammary carcinoma, adenoma and non-neoplastic mammary gland cell lines were treated using 10 mM Dichloroacetate. The effect on cell number, lactate release and PDH expression was investigated. Further, the effect on apoptosis and several apoptotic proteins, proliferation, and microRNA expression was evaluated. Dichloroacetate was found to reduce cell proliferation without inducing apoptosis in all examined cell lines with minor effects in the non-neoplastic mammary gland derived cell line.
Key words: Dichloroacetate, canine mammary cancer, pyruvate dehydrogenase, Warburg effect
Ergebnisse
25 Introduction
Mammary tumors are the most frequent neoplasia in intact female dogs and often accompany with high recurrence and metastasis rates [1]. In veterinary medicine as well as human medicine a surgical intervention is indicated often with subsequent chemotherapy [1]. In advanced tumor disease the prognosis still remains poor [1] wherefore new alternatives for chemotherapy have to be investigated.
The Warburg effect was characterized in the early 1920s by Otto Warburg and describes the metabolic energy production of most cancer cells which rely on aerobic glycolysis in presence of oxygen [2, 3]. Hypoxia in early cancer transformation results in expression of hypoxia inducible factor 1 alpha (HIF-1α) activating pyruvate dehydrogenase kinase (PDK), a pyruvate dehydrogenase (PDH) inhibiting enzyme [4]. PDH inhibition prevents incorporation of pyruvate in mitochondria and is related with cytoplasmic metabolization of pyruvate to lactate [4]. Compensation of negative energy output during glycolysis occurs with increased expression of glycose transporters induced by HIF-1α [5]. Glycolysis contains several advantages for cancer progression such as lactic acidosis allowing tumor growth due to damage of extracellular matrix and increased cell mobility [6]. Decreased cell respiration leads to lower production of reactive oxygen species (ROS) in mitochondria as well as decreased DNA damage and enables apoptosis resistance [7, 8]. The glycolytic feature of cancer cells might offer a selective therapeutic target sparing treatment of non-cancerous cells [3].
Dichloroacetate (DCA) is a pyruvate dehydrogenase kinase inhibitor [9] and thus enhances the flux of pyruvate into the mitochondria by indirect activation of pyruvate dehydrogenase [10]. By reason of occurring glycolytic profile in cancer and penetration of most tissues after oral administration [10, 11], DCA appears to be a proficient strategic therapeutic target in oncology [11]. The last decades, DCA was used as lactate lowering drug in human with congenital mitochondrial dysfunction in phase III studies [12, 13] and became a controversially discussed subject in cancer research. Michelakis et al. found that DCA normalized mitochondrial function and decreased cancer growth in vitro and pointed out that non-cancerous cells were not affected [14]. Dunbar et al. reported that DCA was well tolerated and feasible in a
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phase I trial in patients suffering from recurrent glioblastomas [15] but in contrast, another study had to be cancelled due to severe neuropathies [16]. DCA in human mammary tumors showed inconsistent results. Feuerecker et al. reported higher viability and proliferation in human SrBr3 cells after DCA treatment [17] whereas Sun et al. determined inhibited cell growth in several mammary cancer cell lines [18].
Higher apoptotic resistance [19] as well as increased mitochondrial depolarization was reported in human MCF-7 cells [11].
Until now, there is no data available analyzing the effects of DCA on canine mammary tumors. DCA seems to be well tolerated in dogs with lactic acidosis [20]
and other studies concerning pharmacokinetic effects [21, 22].
For evaluation of anticancer drug efficacy in preclinical experiments cell lines represent important in vitro models to gain more information of cancer independent sensitivity [23-25]. In this study several cell lines derived from canine mammary tissue were used in order to evaluate DCA efficiency.
This is the first study evaluating the effect of 10 mM DCA on canine mammary carcinoma as well as canine mammary adenoma cell lines in comparison to a non- cancerous mammary gland cell line and a non-treated negative control. Therefore, the influence on cell counts, viability, apoptosis and proliferation was examined.
Furthermore, the expression of microRNA involved in proliferation and apoptosis was determined.
Materials and Methods Cell lines
Four cell lines derived from different mammary tissues were used for experiments. MTH53A (non-cancerous mammary gland), MTH52C (mammary carcinoma) and ZMTH3 (mammary adenoma) were transfected with SV-40 and routinely maintained in the Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine, Hannover, Germany. DT14/06T (mammary carcinoma) was established by continuous cultivation in the Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Germany. The cell lines were classified after pathohistological examination of the primary tissue. All tissues used for cell line establishment were
Ergebnisse
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collected with the owner’s permission and according to German standards, ethical approval was not required.
Cell culture
All cell lines were routinely maintained in 25 cm² culture flasks (TPP, Faust Lab Science, Klettgau, Germany) with medium 199 (GibcoTM, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany) containing 10 % fetal calf serum (HyClone®, Thermo Fisher Scientific), 2 % penicillin-streptomycin (Biochrom, Berlin, Germany) and incubated at 37 °C and 5 % CO2 in humidified atmosphere. At 85 % confluency cells were trypsinized with TrypLETM Express (GibcoTM, Thermofisher Scientific) and were splitted 1:2.
DCA application
Cells used in experiments were exposed to 10 mM DCA over 48 hours and cultured with 10 ml medium in 75 cm2 flasks (TPP, Faust Lab Science). DCA was diluted in deionized water and filter-sterilized after pH modulation to 7.4 with NaOH.
For better comparability with previous human in vitro studies a concentration of 10 mM DCA was used.
Cell counting
After trypsinization with TrypLETM Express (GibcoTM, Thermo Fisher Scientific) cell number was counted with an automated CellometerTM Auto T4 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) and compared with negative control. Cells were washed with PBS (Biochrom) and stored at -80 °C for further examinations (quantitative RT-PCR and protein analysis).
Lactate levels
Lactate release in media was performed by colorimetric determination with Cobas® C311 (Hitachi, Tokio, Japan). Therefore growth media from cell culture was centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes to remove floating cells and debris and 1.3 ml were removed to a sodium fluoride vessel (Sarstedt, Nümbrecht, Germany). To
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eliminate influences of phenol red and fetal calf serum, medium was used as negative control and deducted from measurements. Further the lactate content was normalized to intracellular protein concentration to prevent influences of cell numbers and volume. Protein concentration was assessed with PierceTM BCA Assay (Thermo Fisher Scientific) as described in manufacturer´s instructions.
Metabolic activity
Depending on each cell line 3000-6000 cells were seeded in a 96-well-plate (Falcon, Corning, Amsterdam, The Netherlands) with 200 µl medium 199, 10 % fetal calf serum, 2 % penicillin-streptomycin, 10 mM DCA and incubated at 37 °C and 5 % humidified CO2. Measurements were performed every 24 hours for four days.
Therefore medium was replaced and 20 µl MTT (CellTiter96® Aqueous One Solution Assay, Promega, Mannheim, Germany) was added and incubated for two hours at 37 °C in the dark. Absorbance was determined with a Synergy2 plate reader (BioTek, Bad Friedrichshall, Germany) and data were analyzed with Gen5TM 1.11 Software (BioTek). Absorbance was reduced by media negative control and in addition normalized to non-treated new seeded cells.
Flow cytometry
Apoptosis and quantity of dead cells was analyzed with Annexin FITC and Sytox labeling (Annexin V-FITC Detection Kit Plus, PromoCell, Heidelberg, Germany). Therefore 105 cells were cultured in a 6-well-plate (TPP, Faust Lab Science) as described above. After 48 hours following 10 mM DCA exposure, cells were trypsinized and centrifuged together with supernatant containing non-adherent and dead cells at 1000 rpm for 6 minutes. Cell pellet was resuspended in 500 µl assay buffer and staining was performed as described in manufacturer’s protocol. 104 events were counted with BD FACScaliburTM (BD Biosciences, Heidelberg, Germany) and CellQuestTM Pro 6.0 software (BD Biosciences). Annexin and Sytox were detected in FL-1. Data analysis was performed with FlowJo Version 10.0.8r1 (FlowJo, Ashland, OR, USA). Gates were determined based on positive controls
Ergebnisse
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(cells permeabilized with Saponin) and negative controls of each cell line (non- treated viable cells).
RNA isolation and quantitative RT-PCR
Isolation of total RNA was performed with 106 cells using the NucleoSpin Small RNA Kit (Macherey Nagel, Düren, Germany) as described in manufacturer’s protocol. 35 ng total RNA was used for cDNA synthesis using Taqman® MicroRNA Reverse Transkription Kit (Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific) according to manufacturer´s instructions. Following cycle conditions were used:
30 minutes 16 °C, 30 minutes 42 °C, 5 minutes 85 °C. Relative quantification of microRNA expression of treated cells in comparison to negative control was performed with Eppendorff realplex4 Cycler (Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany) using 1.33 µl cDNA in a total volume of 20 µl containing TaqMan®
Universal Master Mix NoAmpErase® UNG (Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific) and TaqMan® MicroRNA assays for Mir141 (ID 245445_mat), Mir145 (ID 002278), Mir375 (ID 000564) purchased from Thermo Fisher Scientific.
Procedure was maintained as manufacturer´s protocol conducting following conditions: 95 °C for 10 minutes subsequently 40 cycles of 95 °C for 15 seconds and 60 °C for 60 seconds. Data were normalized to the reference gene RNU6B (ID 001093) and analysis was performed using Rest2009 (Qiagen, Hilden, Germany).
Samples with Ct-values >35 were excluded from analysis.
Luminex Magnetic Bead analysis
Samples for protein expression analysis were prepared as specified in manufacturer´s protocol and measurements were performed with xMAP® Luminex Bead Technology using a Luminex 200TM instrument (Luminex Corporation, Hertogenbosch, The Netherlands) and processed with xPONENT 3.1 software (Luminex Corporation). Additionally, samples for PDH measurements were filtered with centrifugal ultrafree filter units with a pore size of 0.65 µm (Merck Millipore) at 7000 rpm for 4 minutes. Values with MFI < background MFI + 2 x standard deviation were excluded from analysis. Quantitation of survivin was performed with
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ProcartaPlex Human Survivin Simplex Kit (eBioscience, Frankfurt am Main, Germany) using cell culture supernatant as described in manufacturer´s protocol.
Survivin values were normalized to protein concentration (Pierce BCA Assay, Thermo Fisher Scientific). PDH-P and apoptotic proteins (BAD and JNK) were analyzed with multiplex assays from Merck Millipore (Multi-species PDH Complex Magnetic Bead Panel and 7-Plex Early Apoptosis Magnetic Bead Kit, Darmstadt, Germany).
Mitochondrial activity
Mitochondrial activity was determined by staining of mitochondrial derived ROS using 4 µM MitoSox (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) for 15 minutes. Cells were grown on 8-well µ-dishes (Ibidi, Martinsried, Germany) treated with 10 mM DCA for 48 hours. After fixation with 4 % paraformaldehyde, µ-slides were washed with Hank´s Balanced Salt Solution (HBSS) containing calcium and magnesium. After staining cell nuclei were labeled with DAPI (dilution of 1:1000, Sigma Aldrich GmbH) for 5 minutes. Fluorescence imaging was performed with an inverted confocal laser scanning microscope (Eclipse TE2000-E, Nikon, Düsseldorf, Germany) using a 60x water immersion objective (Nikon). Images were taken with EZ-C1 1.80 software (Nikon). The excitation occurred with a diode laser at 408 nm (DAPI) and with a helium/neon laser at 543 nm (MitoSox). Total cell fluorescence of MitoSox deducting background was analyzed with ImageJ and normalized to cell counts.
Immunofluorescence staining of Ki67 and TUNEL
Cultivation, fixation and washing were performed as described above. After permeabilization using 0.2 % Triton X-100 for 20 minutes, cells were exposed overnight to a canine specific rabbit-polyclonal Ki67 antibody (dilution of 1:150; Life Technologies, Thermo Fisher Scientific). For labeling, a monoclonal anti-rabbit Alexa Fluor® 555 antibody (Cell Signaling Technology, Leiden, The Netherlands) was incubated for 1 hour (1:250) and cells were counterstained with DAPI (1:1000) for 5 minutes. Fluorescence imaging protocol was the same as described above. Total cell fluorescence was established as described above. For TUNEL staining Apoptag
Ergebnisse
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Fluorescein Direct Kit (Merck Millipore) was performed as manufacturer´s instructions. The excitation occurred with an argonlaser at 488 nm and imaging was performed as described above. The amount of TUNEL positive cells was evaluated.
Statistical analysis
Statistical analysis of data was performed with SAS software 7.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). For comparison of two means, two-tailed t-test was used. The confidence value was set to 5 % (p<0.05) and was considered statistically significant.
Results
DCA reduces cell growth
Following 48 hours DCA treatment (10 mM) the cell numbers of both mammary carcinoma cell lines MTH52C (p=0.0171) and DT14/06T (p<0.0001) decreased significantly in comparison to non-treated control. A comparable significant effect was observed in the mammary adenoma cell line ZMTH3 (p=0.0131) and could also be constituted in the non-cancerous mammary gland cell line MTH53A (p=0.0039). Although MTH53A showed decreasing cell numbers, a statistically significant difference between the mammary carcinoma cell line DT14/06T (p=0.0140) and the non-cancerous cell line MTH53A was present. No difference was observed between MTH53A and the adenoma derived cell line ZMTH3 or the mammary carcinoma cell line MTH52C (Fig 1).
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Fig 1. Influence of 10 mM DCA on mammary cell lines after 48 hours. Statistical significant reduction of cell growth was observed in all cell lines. Significant difference between MTH53A and mammary carcinoma DT14/06T was determined. Data are shown as mean ± standard deviation (SD), n≥3 and are presented as relative cell numbers in comparison to the corresponding negative control (%). Control was set to 100 %. Statistical analysis was performed with two-tailed t-test, *p<0.05,
**p<0.01, ***p<0.001.
DCA affects proliferation
The proliferation, assessed by detection of the proliferation marker Ki67, decreased significantly in all mammary cell lines with exception of the normal-like cell line MTH53A in comparison to non-treated control and further a significant decrease in proliferation can be observed within comparison of MTH53A and the other cell lines. No difference was assessed between neoplastic cell lines (Fig 2).
Ergebnisse
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Fig 2. Impact of 10 mM DCA on proliferation of mammary cell lines after 48 hours determined with fluorescence microscopy. (A-H) Images showing fluorescence of Ki67 (red) and DAPI (blue). In comparison to non-treated control (A,C,E,G) amount of Ki67 is reduced in all cell lines (B,D,F,H) except in MTH53A (B). Statistical significant reduction of Ki67 was observed in ZMTH3, MTH52C and DT14/06T in comparison to non-treated control and non-neoplastic tissue derived cell line MTH53A.
No significant decrease in proliferation could be determined in within neoplastic cell lines (I). Data are shown as mean ± SD, n≥3 and are presented as relative proliferation in comparison to negative control (%). Control was set to 100 %. Statistical analysis was performed with two-tailed t-test;
*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. (A) MTH53A control; (B) MTH53A+DCA; (C) ZMTH3 control; (D) ZMTH3+DCA; (E) MTH52C control; (F) MTH52C+DCA; (G) DT14/06T control; (H) DT14/06T+DCA; (I) relative proliferation.
34 Decreased lactate release after DCA treatment
In comparison to negative control DCA reduced the lactate release into the media in all examined cell lines except in the benign mammary adenoma cell line ZMTH3 (p=0.1218). No statistical difference was observed within non-cancerous and neoplastic cell lines (Fig 3).
Fig 3. Effect of 10 mM DCA on lactate release of mammary cell lines after 48 hours. In comparison to negative control significant reduction of lactate production was proved in all cell lines except the benign mammary adenoma (ZMTH3). No significant difference was evaluated between MTH53A and the other cell lines. Data are shown as mean ± SD, n≥3 and are presented as relative lactate content in comparison to negative control (%). Control was set to 100 %. Statistical analysis was performed with two-tailed t-test, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
Decreased PDH phosphorylation after DCA treatment
In order to assess decreased lactate release due to increased pyruvate oxidation in mitochondria phosphorylated PDH (PDH-P) and thus inactive PDH was measured with Luminex Magnetic Bead technology. Phosphorylation of PDH at Ser232 decreased significantly in all cell lines whereas PDH-P at Ser293 was reduced only in the mammary carcinoma DT14/06T (p=0.0445) (Fig 4). The mammary adenoma cell line ZMTH3 and mammary carcinoma cell line MTH52C showed apparent decreased average values, but due to variations between experiments no significance was observed. MTH53A showed no difference in comparison to control.
With consideration of PDH-P at Ser300 a significant difference is apparent between
Ergebnisse
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mammary carcinoma derived cell lines MTH52C (p=0.0263), DT14/06T (p=0.0282) and negative control. ZMTH3 showed visible tendency of PDH-P reduction but did not reach significance (p=0.0852). No difference was apparent in all PDH-P residues between MTH53A and neoplastic cell lines.
Fig 4. Effect of 10 mM DCA on PDH phosphorylation at three different residues after 48 hours treatment. Data was assessed with Luminex Magnetic Bead technology. PDH-P at Ser232 decreased significantly in all cell lines. Residue Ser293 showed no significant response to DCA treatment except in cell line DT14/06T. The third phosphorylation site Ser300 has decreased values in carcinoma cell lines but not in normal mammary gland cell line MTH53A and benign cell line ZMTH3. Data are shown as mean ± SD, n≥3 and are presented as relative PDH-P values in comparison to negative control (%).
Control was set to 100 %. Statistical analysis was performed with two-tailed t-test, *p<0.05, **p<0.01,
***p<0.001.
DCA affects mitochondrial activity
Mitochondrial activity was evaluated via measurement of mitochondrial derived ROS. As shown in Fig 5 the production of mitochondrial derived ROS increased slightly in MTH53A (p=0.1386), DT14/06T (p=0.1519) and significantly in MTH52C (p=0.0359). In contrast the benign cell line ZMTH3 showed significantly decreased ROS production and thus decreased mitochondrial activity (p=0.0243). A statistical significant difference is apparent by comparison of MTH53A and ZMTH3 (p=0.0178).
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Fig 5. Influence of 10 mM DCA on mitochondrial activity in mammary cell lines after 48 hours.
(A-H) Fluorescence of mitochondrial derived ROS (red) and counterstained cell nuclei (DAPI, blue). (I) In comparison to negative control significant improvement of mitochondrial activity was observed in mammary carcinoma cell line MTH52C. A visible but insignificant increase was observable in the mammary carcinoma cell line DT14/06T and non-cancerous cell line MTH53A. The adenoma cell line ZMTH3 showed significantly decreased mitochondrial activity in comparison to negative control and non-cancerous cell line MTH53A. No significant difference was evaluated between MTH53A and the other cell lines. Data are shown as mean ± SD, n≥3 and are presented as relative fluorescence (mitochondrial activity) in comparison to negative control (%). Control was set to 100 %. Statistical analysis was performed with two-tailed t-test, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. (A) MTH53A control; (B) MTH53A+DCA; (C) ZMTH3 control; (D) ZMTH3+DCA; (E) MTH52C control; (F) MTH52C+DCA; (G) DT14/06T control; (H) DT14/06T+DCA; (I) relative mitochondrial activity.
Ergebnisse
37 DCA did not affect apoptosis
After 48 hours DCA treatment, viability analysis with flow cytometry revealed no changes in apoptosis and amount of dead cells in MTH53A, ZMTH3 and DT14/06T (Fig 6A). In MTH52C the percentage of apoptotic cells (p=0.0256) decreased significantly after DCA exposure and accompanied with significantly increased viability (p=0.0472).
To determine if trypsinization caused negative effects, apoptosis was evaluated with TUNEL method via fluorescence microscopy. No difference in number of TUNEL positive cells was evaluated in any of these cell lines (S1 Fig.).
Further, two proteins (c-jun N-terminal kinases and BAD) involved in apoptosis were evaluated. The protein expression was performed with Luminex Magnetic Bead technology. After 48 hours of DCA treatment, the phosphorylated and thus activated c-jun N-terminated kinases (JNK) decreased significantly in MTH53A (p=0.0046), ZMTH3 (p=0.0228) and MTH52C (p=0.0131). The inverse case was observed in mammary carcinoma cell line DT14/06T (p=0.0121) presenting significantly increased JNK expression (Fig 6B).
The phosphorylated and thus inactive form of Bcl-2-Antagonist-of-cell-death (BAD) showed significantly increased values in all neoplastic cell lines. In MTH53A (p=0.2340) no difference was detectable (Fig 6C).
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Fig 6: Effect of 10 mM DCA on protein expression in mammary cell lines after 48 hours. In comparison to negative control, significant decrease in JNK expression was observed in all cell lines except DT14/06T which showed increased JNK values. Significantly increased BAD expression was observed in all cell lines except MTH53A. Data are shown as mean ± SD, n≥3 and are presented as relative mean in comparison to negative control (%). Control was set to 100 %. Statistical analysis was performed with two-tailed t-test, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. (A) Apoptosis and dead cells in flow cytometry; (B) relative expression of JNK; (C) relative expression of BAD.
DCA decreased survivin expression
Decreased survivin expression is apparent in all cell lines but significance is present in cell line DT14/06T (p=0.0125) in comparison to negative control as well as in comparison to normal-like cell line MTH53A (p=0.0200) (Fig 7).
Ergebnisse
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Fig 7. Effect of 10 mM DCA on survivin production in several mammary cell lines after 48 hours. Significant reduction of survivin expression was observed in DT14/06T in comparison to negative control and MTH53A. Data are shown as mean ± SD, n=3 and are presented as relative survivin expression in comparison to negative control (%). Control was set to 100 %. Statistical analysis was performed with two-tailed t-test, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
Metabolic activity following 96 hours continuous DCA treatment
The metabolic activity as reference for proliferation and viability was assessed during 96 hours ongoing DCA treatment (Fig 8). After 96 hours the non-neoplastic cell line MTH53A and the mammary carcinoma cell line DT14/06T showed no significant differences in metabolic activity compared to negative control. Merely ZMTH3 showed significant decreased metabolic activity starting at 24 hours whereas MTH52C displayed significantly decreased MTT-values after 24 hours. Following DCA treatment metabolic activity in MTH52C converge to non-treated control.
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Fig 8. Effect of 10 mM DCA on metabolic activity after 48 hours. In comparison to negative control no significant reduction metabolic activity was proved in MTH53A (A) and DT14/06T (D). ZMTH3 (B) showed significantly reduced metabolic activity after 48 hours and MTH52C after 24 hours (C). Data are shown as mean ± SD, n=3 and are presented as relative metabolic activity in comparison to negative control (%). Control was set to 100 %. Statistical analysis was performed with two-tailed t-test, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. (A) MTH53A; (B) ZMTH3; (C) MTH52C; (D) DT14/06T.
MicroRNA expression after DCA exposure
Three MicroRNAs involved in apoptosis and proliferation were analyzed with quantitative RT-PCR. Mir-145 was detectable only in the mammary carcinoma cell line DT14/06T (Fig 9A) and showed no significant difference after DCA treatment (p=0.1025), the other cell lines were downregulated and excluded from analysis.
Regarding miR-375, significant changes after DCA treatment revealed in the cell line ZMTH3 (p=0.0086), whereas MTH53A and MTH52C showed no modifications in miR expression (Fig 9B). MiR-141 was downregulated in all cell lines and was excluded from analysis due to Ct-values >35.
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Fig 9. Effect of 10 mM DCA on miR expression after 48 hours. In comparison to negative control no significant changes in miR-145 was proved. Regarding miR-375, a significant increase was observed in ZMTH3. Data are shown as mean ± SD, n=3 and are presented as relative miR expression in comparison to negative control. Ct-values were analyzed with Rest2009 and statistical analysis was performed with two-tailed t-test, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. (A) miR-145 expression;
(B) miR-375 expression.
Discussion
The initial aim of this study was to determine which metabolic processes occur in canine mammary gland derived cell lines during DCA exposure and if DCA might be beneficial for cancer treatment in dogs bearing mammary gland neoplasia. The results presented illustrate that DCA has anti-proliferative effects on cell growth which is shown in decreased cell number and amounts of Ki67 expression. The growth retarding effect was likewise observed in several human studies [26-29]
including mammary cell lines [11, 18, 30]. Due to increased cellular respiration and thus mitochondrial ROS production, it is hypothesized that DCA induces mitochondrial dependent apoptosis by release of cytochrome c and activation of several apoptosis proteins [11]. However, the mammary carcinoma cell line MTH52C showed increased mitochondrial derived ROS production but no differences in apoptosis could be constituted in all examined cell lines. It should be noted that not all ROS are efficient enough to induce apoptosis [31]. Despite ROS increase, it might be possible that not enough apoptosis inducing ROS mediators, e. g. hydrogen peroxide or hypochloric acid, are produced during DCA treatment. Further no
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changes in apoptotic proteins JNK and BAD were determined. Solely the mammary carcinoma cell line DT14/06T had increased JNK values but no increased apoptosis was determined by flow cytometry and TUNEL method. Possibly the ROS and JNK values may not be sufficient for apoptosis induction. The metabolic activity, as indicator for cell viability, did not indicate a decrease of values in all cell lines after 96 hours and is consistent with data provided from flow cytometry. Stockwin et al.
reported that high concentrations of DCA are required for apoptosis induction [19].
The same extent was noticed in several human cancer entities as well as in mammary cancer using dosages between 0.5 and 40 mM DCA [17, 18, 32-36], whereas Bonnet et al. was able to induce apoptosis with 0.5 mM DCA in human MCF-7 cells. Further Babu et al. reported that SLC5A8 transporters are required for membrane transportation of DCA [35]. SLC5A8 is silenced in many cancer tissues as well as in mammary cancer, so that DCA might not accumulate in mammalian cells and apoptosis was not induced with 1 mM DCA [35]. The same cancer cell lines expressing SLC5A8 transporters undergo apoptosis when treated with 1 mM DCA [35]. Different SLC5A8 expression in cancer cell lines would declare why apoptosis is apparent inconsistently.
Apart from this, survivin expression, an apoptosis inhibitor and proliferation promotor [37, 38], showed slight but insignificant decreasing values following DCA treatment and supports the hypothesis that DCA has no pro-apoptotic effects on canine mammary cancer cells. Nevertheless a supportive anti-proliferative effect might be possible.
DCA, a known PDK inhibitor, shifted the energy production from glycolysis towards normal cellular respiration with glucose oxidation [9]. This is illustrated by decreased lactate release and reduction in PDH phosphorylation. The results suggest that PDH phosphorylation at Ser232 and Ser300 seem to be the most important metabolic modulation in canine PDH regulation. This supports the assumption of Rardin et al., that PDH phosphorylation at Ser232 is not limited to heart tissue [39]. In contrast to studies in humans, Ser293 phosphorylation was not significantly affected by DCA [26, 27]. Ser293 is reported to be phosphorylated rapidly
Ergebnisse
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by PDK, especially isoform 2 [39], indicating that DCA might not influence all PDK isoforms equally in dogs. The data provided demonstrate a shift towards normal cellular respiration which might declare the anti-proliferative effect.
MiR-145 is reported to be a tumor suppressor and usually downregulated in mammary breast cancer tissues [40, 41]. The used dose of DCA had no effect on miR-145 expression neither in benign nor in malign mammary tumors. Thus, a general miR-145 effect in canine mammary tissue derived cell lines appears unlikely.
MiR-375 was significantly upregulated (1.5 fold) in mammary adenoma cell line, which may indicate that proliferation may be influenced by miR-375. It has to be considered, that this can also occur due to biological variations within experiments.
Ward et al. showed, that upregulation of miR-375 could sensitize mammary cancer cells to Tamoxifen [42]. If DCA is able to alter miR-375 expression, sensitization to other cytotoxic components might be beneficial. In miR-141, no changes were observed due to comprehensive downregulation and exclusion from analysis.
In comparison to human mammary cancer cell lines following DCA treatment, canine mammary cell lines are almost consistent [18, 36]. DCA has anti-proliferative effects on canine mammary neoplasia cell lines and minor effects in normal-like mammary gland cells, but no apoptosis inducing properties. Further glycolytic property was inverted towards glucose oxidation as shown in human mammary cancer [11].
Further the dose of 10 mM DCA is clinically not achievable in vivo without severe side effects. But these data indicate that DCA might be supportive in sensitization of cancer cells to other chemotherapeutics [43]. Further a post-surgical therapy with drug releasing inlays implanted in the surgical area could be beneficial to achieve higher local concentrations of DCA to treat remaining cancer cells [44].
Conflict of interest: The authors declare no conflicts of interest.
