3 Material und Methoden
3.2 Zellkultur
Alle Zelllinien wurden routinemäßig im Labor der Klinik für Kleintiere, Tierärztliche Hochschule Hannover mit 199er Medium (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt), 10 % fetalem Kälberserum (Hyclone, Thermo Fisher Scientific) sowie 2 % Penicillin-Streptomycin (Biochrom, Berlin) in 25 cm2-Zellkulturflaschen (TPP, Faust Lab Science, Klettgau) bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Bei einer Konfluenz von circa 85 % wurden die jeweiligen Zellen trypsiniert (TrypLE Express, Gibco, Thermo Fisher Scientific) und entsprechend ihrer individuellen Wachstumskinetik geteilt.
16 3.3 DCA Applikation
Die im Experiment genutzten Zellen (s. Kapitel 3.2) wurden in 75 cm²-Zellkultur-flaschen (TPP, Faust Lab Science) mit 10 mM DCA (Sigma Aldrich, Taufkirchen) über eine Dauer von 48 Stunden kultiviert. Eine Negativkontrolle der gleichen Zell-linie ohne DCA Zusatz wurde parallel kultiviert. Zuvor wurde DCA mit destilliertem Wasser auf eine 1 M Lösung verdünnt, der pH-Wert mit NaOH auf 7,4 justiert und anschließend steril gefiltert.
3.4 Quantifizierung der Zellen
Nach 48 Stunden wurden die Zellen erneut trypsiniert, die Zellzahl mittels auto-matisiertem Cellometer Auto T4 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) ermittelt und mit der Negativkontrolle verglichen. Anschließend wurden die Zellen bei 1000 rpm über 10 Minuten zentrifugiert, mit 1x PBS (Biochrom) gewaschen und für weitere Analysen (Proteinexpression, quantitative RT-PCR) bei -80 °C gelagert.
3.5 Laktat
Die Laktatfreisetzung in das Medium wurde mittels einer kolorimetrischen Detektion ermittelt. Hierfür wurde der Medium-Überstand aus den jeweiligen Zellkulturen (s.
Kapitel 3.3) zentrifugiert, um avitale Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Zur Stabili-sierung des Laktats wurde der Überstand in ein Natrium-Fluorid-Gefäß (Sarstedt, Nümbrecht) überführt und der Laktatgehalt mit dem Cobas-Analysesystem C311 (Hitachi, Tokyo, Japan) bestimmt. Um Einflüsse des im Medium enthaltenen pH-Indikators Phenolrot sowie des fetalen Kälberserums auf die Messwerte zu elimi-nieren, wurde natives Medium als Negativkontrolle verwendet und die Werte der Kontrollmessungen von allen DCA-Werten subtrahiert. Um die unterschiedliche Zell-zahl sowie deren Volumen zwischen den Proben anzugleichen, wurden die Laktat-werte zum Proteingehalt der entsprechenden Probe ins Verhältnis gesetzt. Der Pro-teingehalt wurde mit dem Pierce BCA Assay (Thermo Fisher Scientific) gemäß dem Herstellerprotokoll ermittelt.
Material und Methoden
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3.6 RNA Isolation und quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
Die Isolation der gesamten RNA erfolgte aus jeweils 106 Zellen (s. Kapitel 3.4) mit dem NucleoSpin Small RNA Kit (Macherey Nagel, Düren) nach dem Protokoll des Herstellers.
Für die anschließende Synthese der komplementären DNA (cDNA) wurden 35 ng RNA sowie das TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) und die jeweiligen Primer für die zu untersuchenden MikroRNAs (miR141, ID 245445_mat; miR145, ID 002278; miR375, ID 000564) von Thermo Fisher Scientific verwendet. Entsprechend der Herstelleranweisung wurden folgende Zyklus-Bedingungen genutzt:
30 Minuten bei 16 °C 30 Minuten bei 42 °C 5 Minuten bei 85 °C.
Die relative Quantifizierung der MikroRNA-Expression der behandelten Zellen im Vergleich zu der entsprechenden Negativkontrolle erfolgte unter Verwendung von TaqMan Universal Master Mix NoAmpErase UNG (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific), den oben genannten Primern und einem Eppendorff realplex4 Cycler (Eppendorff, Wesseling-Berzdorf). Die Quantifizierung erfolgte gemäß den Herstellerangaben mit folgenden Zyklen:
95 °C für 10 Minuten
40 Zyklen mit 95 °C für 15 Sekunden und 60 °C für 60 Sekunden.
Die Daten wurden zum Referenzgen RNU6B (ID 001093, Thermo Fisher Scientific) normalisiert und mit der Software Rest2009 (Qiagen, Hilden, Germany) nach der delta delta CT (ΔΔCT) Methode ausgewertet.
3.7 Luminex Magnetic Bead Analyse
Für die Analyse der Proteinexpression der C-Jun-N-terminale Kinase (JNK) und Bcl-2-Antagonist of Cell Death (BAD), des Tumorpromoterproteins Survivin und des
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PDH-Enzymkomplexes wurde die Luminex xMAP Magnetic Bead Technologie (Luminex Corp. Hertogenbosch, Niederlande) verwendet. Die Analyse von Survivin erfolgte aus dem Überstand der Zellkultur und wurde mit einem Multiplex Immuno-assay (eBioscience, Frankfurt am Main) durchgeführt. Die Durchführung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers mit einer Inkubation über Nacht. Die Survivin Ex-pression wurde zum Proteingehalt normalisiert. Die ExEx-pressionsanalyse der Pyruvat-dehydrogenase und ihre phosphorylierten Formen wurde mit dem Multi-Species Pyruvate Dehydrogenase (PDH) Complex Magnetic Bead Panel, die Proteine der frühen Apoptose (JNK, Bad) mit dem 7-Plex Early Apoptosis Magnetic Bead Kit von Merck Millipore (Darmstadt) analysiert. Die Durchführung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers.
3.8 Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie wurde für die Analyse der apoptotischen sowie avitalen Zellen nach DCA Behandlung gegenüber der Negativkontrolle verwendet. Dabei wurden 105 Zellen in einer 6-well Platte (TPP, Faust Lab Science) ausgesät (s.
Kapitel 3.3) und über 48 Stunden kultiviert. Anschließend wurden die Zellen trypsi-niert, pellettiert und mit Annexin V-FITC/Sytox gefärbt (Annexin V-FITC Detection Kit Plus, PromoCell, Heidelberg). Kurz nach Einleitung der Apoptose werden Phosphati-dylserinreste der inneren Membran an die Zelloberfläche transloziert, welche über Annexin-V-Bindung detektiert werden können. Sytox bindet ausschließlich an die DNA von avitalen Zellen. Vitale Zellen zeigen dabei keine, apoptotische Zellen eine grüne und tote Zellen eine starke grüne Fluoreszenz. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt mittels eines Durchflusszytometers der Firma BD Bioscience (Heidelberg) im Kanal FL-1 (grün). Die Zellpopulationen wurden in einem Dot Plot sowie einem Histo-gramm dargestellt. Die Auswertung erfolgte mit der Software FlowJo der Firma TreeStar (Ashland, OR, USA). Für die Festlegung der Gates wurden vitale Zellen als Negativkontrolle und mit Saponin permeabilisierte (tote Zellen) als Positivkontrolle verwendet.
Material und Methoden
19 3.9 Metabolische Aktivität
Die metabolische Aktivität wurde mit dem CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay von Promega (Mannheim) durchgeführt. Nach Zugabe der Tetra-zoliumsalzlösung wird diese von vitalen Zellen zu einem Formazanprodukt reduziert, welches photometrisch gemessen werden kann. Für die Durchführung wurden die Zellen entsprechend ihrer Wachstumskinetik in einer 96-well Platte (Falcon, Corning, Amsterdam, Niederlande) gemäß Kapitel 3.3 kultiviert. Für die erste Messung zum Zeitpunkt 0 wurden direkt nach der Aussaat 20 µl Tetrazoliumlösung hinzugegeben und nach zwei Stunden die Absorption mit einem Synergy2 Plate Reader (BioTek, Bad Friedrichshall) ermittelt. Die weiteren Messungen erfolgten nach 24, 48, 72 und 96 Stunden jeweils 120 Minuten nach Zugabe der Tetrazoliumsalzlösung.
3.10 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie
Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe
„Zellphysiologie & Zelluläre Mechanik“ (Prof. Dr. A. Ngezahayo) am Institut für Bio-physik der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität in Hannover durchgeführt.
Die Zellen wurden für die Ermittlung der Proliferations- sowie der Apoptoserate und der mitochondrialen Aktivität zunächst gemäß Kapitel 3.3 in einer µ-slide 8-well Platte (Ibidi, Martinsried) kultiviert.
3.10.1 Proliferationsrate
Die Proliferationsrate wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung des Proliferations-markers Ki67 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) ermittelt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit Triton X-100 permeabilisiert und über Nacht mit einem kanin-spezifischen Primärantikörper bei 37 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Färbung mittels eines monoklonalen Alexa Fluor 555 (Cell Signaling Technology, Leiden, Niederlande) Sekundärantikörpers über 60 Minuten. Eine Gegenfärbung der Zellkerne erfolgte mit DAPI.
20 3.10.2 Apoptose (TUNEL-Methode)
Für die Färbung apoptotischer Zellen wurde das Apoptag Fluorescein Direct Kit (Merck Millipore) entsprechend der Herstellerangaben verwendet. Die Anregung erfolgte mittels eines Argonlasers bei 488 nm. Die Zellkernfärbung erfolgte mit DAPI.
3.10.3 Mitochondriale Aktivität
Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie wurde indirekt die Aktivität der Mitochondrien mittels mitochondrialer ROS dargestellt. Die Färbung der Zellen erfolgte mit dem Farbstoff MitoSOX (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) sowie die Kern-färbung mit DAPI nach dem Protokoll des Herstellers. MitoSOX färbt ROS, die bei der Glukoseoxidation in den aktiven Mitochondrien anfallen (LENAZ et al. 2002).
3.10.4 Bildverarbeitung
Die Fluoreszenzbilder wurden mit dem Bildverarbeitungsprogramm ImageJ analy-siert. Hierfür wurde die Intensität der totalen Fluoreszenz (ROS, Ki67) im gesamten Bildausschnitt ermittelt, die Fluoreszenz des Hintergrundes subtrahiert und ins Ver-hältnis zu der Zellzahl (DAPI, blau) gesetzt. Anschließend wurden die relative mito-chondriale Aktivität sowie die Proliferationsrate im Vergleich zu der entsprechenden Negativkontrolle berechnet. Bei der TUNEL Methode wurde die Anzahl der TUNEL positiven Zellen im gesamten Bildausschnitt ermittelt.
3.11 Statistik
Die statistische Auswertung erfolgte mit der SAS Enterprise Guide 7.1 Software (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Für den Vergleich von zwei Stichproben wurde der t-Test verwendet. Das statistische Konfidenzniveau wurde auf 95 % festgelegt und p<0,05 als statistisch signifikant betrachtet. Alle Daten wurden als Mittel-wert ± Standardabweichung dargestellt.
Ergebnisse
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4 Ergebnisse
4.1 Manuskript 1
Das Manuskript wurde am 05.09.2016 beim „International Journal of Oncology“ zur Publikation angenommen und am 05.10.2016 publiziert.
The effect of dichloroacetate in canine prostate adenocarcinomas and transitional cell carcinomas in vitro
DOI: 10.3892/ijo.2016.3720
Tatjana Harting1,2, Mandy Stubbendorff3, Saskia Willenbrock1, Siegfried Wagner1, Patrik Schadzek4, Anaclet Ngezahayo4, Hugo Murua Escobar1,2 and Ingo Nolte1
1Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover, Germany
2Division of Medicine Clinic III, Hematology, Oncology and Palliative Medicine, University of Rostock, Rostock, Germany
3Evotec AG, Hamburg, Germany
4Institute of Biophysics, Leibniz University, Hannover, Germany
Correspondence to:
Prof. Dr. Ingo Nolte, Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 9, 30559 Hannover, Germany
Email: Ingo.Nolte@tiho-hannover.de
22 Abstract
The Warburg effect describes the ability of cancer cells to produce energy via aerobic glycolysis instead of oxidative phosphorylation of pyruvate. This deviation in mitochondrial metabolism inhibits apoptosis, allowing increased proliferation under conditions of reduced oxygen levels. Dichloroacetate (DCA) was successfully used in several human cancer cell lines to reactivate oxidative phosphorylation in mitochondria. Aim of this study was the characterization and response of canine cancer cell lines after DCA exposure. The effect of 10 mM DCA was characterized in vitro on a set of six canine prostate adenocarcinoma and transitional cell carcinoma (TCC) derived cell lines. Cell counts, lactate levels, apoptosis, expression of apop-totic proteins, survival factors and different miRNAs were analyzed. Additionally, metabolic activity, mitochondrial activity and proliferation were investigated. DCA significantly decreased cell number of all but one utilized cell lines and leads to a significant reduction of lactate release. Decreased survivin levels were found in all cell lines, two of which presented a significant reduction in metabolic activity.
Increased miR-375 levels were measured in all TCC cell lines. Reactivation of pyru-vate dehydrogenase and an elepyru-vated mitochondrial activity appear to induce the tran-sition from aerobic glycolysis back to oxidative phosphorylation. Further, these results display that DCA treatment has a suppressant effect on proliferation of canine cancer cells.
Key words: Dichloroacetate, canine prostate adenocarcinoma, canine transitional cell carcinoma, Warburg effect
Ergebnisse
23 4.2 Manuskript 2
Das folgende Manuskript wurde am 19.08.2016 bei dem Journal „PLOS ONE” zur Publikation eingereicht.
Dichloroacetate Affects Proliferation but not Apoptosis in Canine Mammary Cell Lines
Tatjana P Harting1,2, Mandy Stubbendorff3, Saskia Willenbrock1, Susanne C Hammer1,2, Siegfried Wagner1, Patrik Schadzek4, Anaclet Ngezahayo4, Hugo Murua Escobar1,2, Ingo Nolte1*
1Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover, Germany
2Division of Medicine Clinic III, Hematology, Oncology and Palliative Medicine, University of Rostock, Rostock, Germany
3Evotec AG, Hamburg, Germany
4Institute of Biophysics, Leibniz University, Hannover, Germany
* Corresponding author Correspondence to:
Prof. Dr. Ingo Nolte, Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 9, 30559 Hannover, Germany
Email: Ingo.Nolte@tiho-hannover.de
24 Abstract
Targeting mitochondrial energy metabolism is a novel approach in cancer research and can be traced back to the description of the Warburg effect. Dichloroacetate, a controversially discussed subject of many studies in cancer research, is a pyruvate dehydrogenase kinase inhibitor. Dichloroacetate causes metabolic changes in cance-rous glycolysis towards oxidative phosphorylation via indirect activation of pyruvate dehydrogenase in mitochondria. Canine mammary cancer is frequently diagnosed but after therapy prognosis still remains poor. In this study, canine mammary carcinoma, adenoma and non-neoplastic mammary gland cell lines were treated using 10 mM Dichloroacetate. The effect on cell number, lactate release and PDH expression was investigated. Further, the effect on apoptosis and several apoptotic proteins, proliferation, and microRNA expression was evaluated. Dichloroacetate was found to reduce cell proliferation without inducing apoptosis in all examined cell lines with minor effects in the non-neoplastic mammary gland derived cell line.
Key words: Dichloroacetate, canine mammary cancer, pyruvate dehydrogenase, Warburg effect
Ergebnisse subsequent chemotherapy [1]. In advanced tumor disease the prognosis still remains poor [1] wherefore new alternatives for chemotherapy have to be investigated.
The Warburg effect was characterized in the early 1920s by Otto Warburg and describes the metabolic energy production of most cancer cells which rely on aerobic glycolysis in presence of oxygen [2, 3]. Hypoxia in early cancer transformation results in expression of hypoxia inducible factor 1 alpha (HIF-1α) activating pyruvate dehydrogenase kinase (PDK), a pyruvate dehydrogenase (PDH) inhibiting enzyme [4]. PDH inhibition prevents incorporation of pyruvate in mitochondria and is related with cytoplasmic metabolization of pyruvate to lactate [4]. Compensation of negative energy output during glycolysis occurs with increased expression of glycose transporters induced by HIF-1α [5]. Glycolysis contains several advantages for cancer progression such as lactic acidosis allowing tumor growth due to damage of extracellular matrix and increased cell mobility [6]. Decreased cell respiration leads to lower production of reactive oxygen species (ROS) in mitochondria as well as decreased DNA damage and enables apoptosis resistance [7, 8]. The glycolytic feature of cancer cells might offer a selective therapeutic target sparing treatment of non-cancerous cells [3].
Dichloroacetate (DCA) is a pyruvate dehydrogenase kinase inhibitor [9] and thus enhances the flux of pyruvate into the mitochondria by indirect activation of pyruvate dehydrogenase [10]. By reason of occurring glycolytic profile in cancer and penetration of most tissues after oral administration [10, 11], DCA appears to be a proficient strategic therapeutic target in oncology [11]. The last decades, DCA was used as lactate lowering drug in human with congenital mitochondrial dysfunction in phase III studies [12, 13] and became a controversially discussed subject in cancer research. Michelakis et al. found that DCA normalized mitochondrial function and decreased cancer growth in vitro and pointed out that non-cancerous cells were not affected [14]. Dunbar et al. reported that DCA was well tolerated and feasible in a
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phase I trial in patients suffering from recurrent glioblastomas [15] but in contrast, another study had to be cancelled due to severe neuropathies [16]. DCA in human mammary tumors showed inconsistent results. Feuerecker et al. reported higher viability and proliferation in human SrBr3 cells after DCA treatment [17] whereas Sun et al. determined inhibited cell growth in several mammary cancer cell lines [18].
Higher apoptotic resistance [19] as well as increased mitochondrial depolarization was reported in human MCF-7 cells [11].
Until now, there is no data available analyzing the effects of DCA on canine mammary tumors. DCA seems to be well tolerated in dogs with lactic acidosis [20]
and other studies concerning pharmacokinetic effects [21, 22].
For evaluation of anticancer drug efficacy in preclinical experiments cell lines represent important in vitro models to gain more information of cancer independent sensitivity [23-25]. In this study several cell lines derived from canine mammary tissue were used in order to evaluate DCA efficiency.
This is the first study evaluating the effect of 10 mM DCA on canine mammary carcinoma as well as canine mammary adenoma cell lines in comparison to a non-cancerous mammary gland cell line and a non-treated negative control. Therefore, the influence on cell counts, viability, apoptosis and proliferation was examined.
Furthermore, the expression of microRNA involved in proliferation and apoptosis was determined.
Materials and Methods Cell lines
Four cell lines derived from different mammary tissues were used for experiments. MTH53A (non-cancerous mammary gland), MTH52C (mammary carcinoma) and ZMTH3 (mammary adenoma) were transfected with SV-40 and routinely maintained in the Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine, Hannover, Germany. DT14/06T (mammary carcinoma) was established by continuous cultivation in the Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Germany. The cell lines were classified after pathohistological examination of the primary tissue. All tissues used for cell line establishment were
Ergebnisse
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collected with the owner’s permission and according to German standards, ethical approval was not required.
Cell culture
All cell lines were routinely maintained in 25 cm² culture flasks (TPP, Faust Lab Science, Klettgau, Germany) with medium 199 (GibcoTM, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany) containing 10 % fetal calf serum (HyClone®, Thermo Fisher Scientific), 2 % penicillin-streptomycin (Biochrom, Berlin, Germany) and incubated at 37 °C and 5 % CO2 in humidified atmosphere. At 85 % confluency cells were trypsinized with TrypLETM Express (GibcoTM, Thermofisher Scientific) and were splitted 1:2.
DCA application
Cells used in experiments were exposed to 10 mM DCA over 48 hours and cultured with 10 ml medium in 75 cm2 flasks (TPP, Faust Lab Science). DCA was diluted in deionized water and filter-sterilized after pH modulation to 7.4 with NaOH.
For better comparability with previous human in vitro studies a concentration of 10 mM DCA was used.
Cell counting
After trypsinization with TrypLETM Express (GibcoTM, Thermo Fisher Scientific) cell number was counted with an automated CellometerTM Auto T4 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) and compared with negative control. Cells were washed with PBS (Biochrom) and stored at -80 °C for further examinations (quantitative RT-PCR and protein analysis).
Lactate levels
Lactate release in media was performed by colorimetric determination with Cobas® C311 (Hitachi, Tokio, Japan). Therefore growth media from cell culture was centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes to remove floating cells and debris and 1.3 ml were removed to a sodium fluoride vessel (Sarstedt, Nümbrecht, Germany). To
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eliminate influences of phenol red and fetal calf serum, medium was used as negative control and deducted from measurements. Further the lactate content was normalized to intracellular protein concentration to prevent influences of cell numbers and volume. Protein concentration was assessed with PierceTM BCA Assay (Thermo Fisher Scientific) as described in manufacturer´s instructions.
Metabolic activity
Depending on each cell line 3000-6000 cells were seeded in a 96-well-plate (Falcon, Corning, Amsterdam, The Netherlands) with 200 µl medium 199, 10 % fetal calf serum, 2 % penicillin-streptomycin, 10 mM DCA and incubated at 37 °C and 5 % humidified CO2. Measurements were performed every 24 hours for four days.
Therefore medium was replaced and 20 µl MTT (CellTiter96® Aqueous One Solution Assay, Promega, Mannheim, Germany) was added and incubated for two hours at 37 °C in the dark. Absorbance was determined with a Synergy2 plate reader (BioTek, Bad Friedrichshall, Germany) and data were analyzed with Gen5TM 1.11 Software (BioTek). Absorbance was reduced by media negative control and in addition normalized to non-treated new seeded cells.
Flow cytometry
Apoptosis and quantity of dead cells was analyzed with Annexin FITC and Sytox labeling (Annexin V-FITC Detection Kit Plus, PromoCell, Heidelberg, Germany). Therefore 105 cells were cultured in a 6-well-plate (TPP, Faust Lab Science) as described above. After 48 hours following 10 mM DCA exposure, cells were trypsinized and centrifuged together with supernatant containing non-adherent and dead cells at 1000 rpm for 6 minutes. Cell pellet was resuspended in 500 µl assay buffer and staining was performed as described in manufacturer’s protocol. 104 events were counted with BD FACScaliburTM (BD Biosciences, Heidelberg, Germany) and CellQuestTM Pro 6.0 software (BD Biosciences). Annexin and Sytox were detected in FL-1. Data analysis was performed with FlowJo Version 10.0.8r1 (FlowJo, Ashland, OR, USA). Gates were determined based on positive controls
Ergebnisse Reverse Transkription Kit (Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific) according to manufacturer´s instructions. Following cycle conditions were used:
30 minutes 16 °C, 30 minutes 42 °C, 5 minutes 85 °C. Relative quantification of microRNA expression of treated cells in comparison to negative control was performed with Eppendorff realplex4 Cycler (Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany) using 1.33 µl cDNA in a total volume of 20 µl containing TaqMan®
Universal Master Mix NoAmpErase® UNG (Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific) and TaqMan® MicroRNA assays for Mir141 (ID 245445_mat), Mir145 (ID 002278), Mir375 (ID 000564) purchased from Thermo Fisher Scientific.
Procedure was maintained as manufacturer´s protocol conducting following conditions: 95 °C for 10 minutes subsequently 40 cycles of 95 °C for 15 seconds and 60 °C for 60 seconds. Data were normalized to the reference gene RNU6B (ID 001093) and analysis was performed using Rest2009 (Qiagen, Hilden, Germany).
Samples with Ct-values >35 were excluded from analysis.
Luminex Magnetic Bead analysis
Samples for protein expression analysis were prepared as specified in manufacturer´s protocol and measurements were performed with xMAP® Luminex Bead Technology using a Luminex 200TM instrument (Luminex Corporation, Hertogenbosch, The Netherlands) and processed with xPONENT 3.1 software (Luminex Corporation). Additionally, samples for PDH measurements were filtered with centrifugal ultrafree filter units with a pore size of 0.65 µm (Merck Millipore) at 7000 rpm for 4 minutes. Values with MFI < background MFI + 2 x standard deviation were excluded from analysis. Quantitation of survivin was performed with
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ProcartaPlex Human Survivin Simplex Kit (eBioscience, Frankfurt am Main, Germany) using cell culture supernatant as described in manufacturer´s protocol.
Survivin values were normalized to protein concentration (Pierce BCA Assay, Thermo Fisher Scientific). PDH-P and apoptotic proteins (BAD and JNK) were analyzed with multiplex assays from Merck Millipore (Multi-species PDH Complex Magnetic Bead Panel and 7-Plex Early Apoptosis Magnetic Bead Kit, Darmstadt, Germany).
Mitochondrial activity
Mitochondrial activity was determined by staining of mitochondrial derived
Mitochondrial activity was determined by staining of mitochondrial derived