Etablierung spezifischer PCR und qPCR-Assays zur Analyse der Genexpression caniner Claudine-1, -3, -4 und -7 sowie deren longitudinale Gen- und Proteinexpression in Primärkulturen und Zelllinien von Mamma- und Prostatatumoren

(1)

Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375

E-Mail: info@dvg.de · Internet: www.dvg.de

ISBN 978-3-86345-357-2

(2)

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.

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Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek

Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;

Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.

1. Auflage 2016

Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-357-2

Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17

35392 Gießen 0641/24466 info@dvg.de www.dvg.de

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Etablierung spezifischer PCR und qPCR-Assays zur Analyse der Genexpression caniner Claudine-1, -3,

-4 und -7 sowie deren longitudinale Gen- und Proteinexpression in Primärkulturen und Zelllinien

von Mamma- und Prostatatumoren

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Susanne Conradine Hammer

Lippstadt

Hannover 2016

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte

Klinik für Kleintiere

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

PD Dr. rer. nat. Hugo Murua Escobar

Universitätsmedizin Rostock

Zentrum für Innere Medizin

Klinik III - Hämatologie, Onkologie, Palliativmedizin

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Marion Hewicker-Trautwein

Tag der mündlichen Prüfung: 01.11.2016

Die hier vorliegende Arbeit wurde unterstützt durch ein Stipendium des Graduierten Kollegs Biomedizintechnik des SFB599 und der Hannoverschen Gesellschaft zur Förderung der Kleintiermedizin e.V. (HGFK).

(7)

FÜR MEINE FAMILIE

(8)

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Publikationen:

Claudin-1, -3, -4 and -7 gene expression analyses in canine prostate carcinoma and mammary tissue derived cell lines

Susanne C. Hammer, Susanne Nagel, Johannes Junginger, Marion Hewicker- Trautwein, Siegfried Wagner, Alexander Heisterkamp, Anaclet Ngezahayo, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar

Neoplasma 2016;63(2):231-238 DOI:10.4149/208_150924N505 PMID: 26774145

Longitudinal Claudin Gene Expression Analyses in Canine Mammary Tissues and Thereof Derived Primary Cultures and Cell Lines

Susanne C. Hammer, Annegret Becker, Katja Rateitschak, Annika Mohr, Florenza Lüder Ripoli, Silvia Hennecke, Johannes Junginger, Marion Hewicker-Trautwein, Bertram Brenig, Anaclet Ngezahayo, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar

Int J Mol Sci. 2016 Sep 29;17(10). pii: E1655.

DOI:10.3390/ijms17101655 PMID: 27690019

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Abstracts:

Claudin Gene Expression Analysis of Canine Mammary Non-Neoplastic and Neoplastic Tissue Derived Cell Cultures

Susanne C. Hammer, Annika Mohr, Florenza Lüder Ripoli, Saskia Willenbrock, Anaclet Ngezahayo, Alexander Heisterkamp, Johannes Junginger, Marion Hewicker- Trautwein, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar

In: Proceedings of 3^rd World Veterinary Cancer Congress 2016, Foz do Iguassu, Brasilien, S. 43

Comparison of branched DNA signal amplification combined with multi-analyte profiling bead technology and quantitative real-time PCR for analyses of Claudin- gene-expression in canine mammary samples

Susanne C. Hammer, Suhayla Alnajjar, Susanne Nagel, Alexander Heisterkamp, Saskia Willenbrock, Marion Hewicker-Trautwein, Anaclet Ngezahayo, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar

In: Proceedings of ESVONC Annual Congress 2015, Krakau, Polen, S. 94

Characterisation of Claudin-Gene-Expression in Canine Mammary Tissue

Susanne C. Hammer, Suhayla Alnajjar, Susanne Nagel, Alexander Heisterkamp, Marion Hewicker-Trautwein, Anaclet Ngezahayo, Ingo Nolte I, Murua Escobar H In: Proceedings of Veterinary Cancer Society Annual Conference 2014, St. Louis, USA, S.62

Establishment of a molecular screening system for claudin-gene expression in canine neoplasias and characterisation of claudin-gene expression in canine cell lines and canine mammary tissue samples

Susanne C. Hammer, Anaclet Ngezahayo, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar In: Proceedings of ESVONC Annual Congress 2014, Wien, Österreich, S.105

(11)

Claudin-gene expression in canine neoplasias

Susanne C. Hammer, Susanne Nagel, Denise Maibaum, Katrin Pfeiffer, Anaclet Ngezahayo, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar

In: Proceedings of Veterinary Cancer Society Annual Conference 2013, Minneapolis, USA, S. 49

(12)

Vorträge:

Claudin Gene Expression Analysis of Canine Mammary Non-Neoplastic and Neoplastic Tissue Derived Cell Cultures

Susanne Conradine Hammer, Annika Mohr, Florenza Lüder Ripoli, Saskia Willenbrock, Anaclet Ngezahayo, Alexander Heisterkamp. Johannes Junginger, Marion Hewicker-Trautwein, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar

3rd World Veterinary Cancer Congress vom 25. - 29.05.2016 in Foz do Iguassu, Brasilien (Vortrag am 26.05)

Kultivierungs-bedingte Veränderungen der Claudin Genexpression caniner Mammagewebe abgeleiteter-Zelllinien

Susanne Hammer, Annika Mohr, Florenza Ripoli, Anaclet Ngezahayo, Alexander Heisterkamp, Johannes Junginger, Marion Hewicker-Trautwein, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar.

24. Jahrestagung der Fachgruppe "Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik"

der DVG vom 29. - 30.01.2016 in Berlin, Deutschland (Vortrag am 29.01.)

Charakterisierung der Claudin-Genexpression caniner Mammagewebe

Susanne Hammer, Suhayla Alnajjar, Susanne Nagel, Anaclet Ngezahayo, Alexander Heisterkamp, Marion Hewicker-Trautwein, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar.

der DVG vom 23. - 24.01.2015 in Leipzig, Deutschland (Vortrag am 24.01.)

Characterisation of Claudin-Gene-Expression in Canine Mammary Tissue

Susanne Hammer, Suhayla Alnajjar, Susanne Nagel, Alexander Heisterkamp, Marion Hewicker-Trautwein, Anaclet Ngezahayo, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar Veterinary Cancer Society Annual Conference 2014 vom 09. - 11.10.2014 in St.

Louis, USA (Vortrag am 10.10.)

(13)

Claudin-Gene Expression in Canine Neoplasias

Susanne Hammer, Suhayla Alnajjar, Susanne Nagel, Alexander Heisterkamp, Marion Hewicker-Trautwein, Anaclet Ngezahayo, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar.

3. Light and DNA - Tagung vom 27. - 28.08.2014 in Rostock, Deutschland (Vortrag am 27.08.)

Susanne Conradine Hammer, Susanne Nagel, Denise Maibaum, Katrin Pfeiffer, Anaclet Ngezahayo, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar.

der DVG vom 31.01. - 01.02.2014 in Gießen, Deutschland (Vortrag am 01.02.)

Veterinary Cancer Society Annual Conference 2013 vom 17. - 19.10.2013 in Minneapolis, USA (Vortrag am 18.10.)

Evaluation of the canine claudin-genes

2. Light and DNA-Tagung vom 22. - 23.07.2013 in Jena, Deutschland (Vortrag am 22.07.)

Evaluation der Claudin-Gene des Hundes als funktionelle Targets zur Entwicklung tumortherapeutischer Ansätze

Susanne Conradine Hammer, Anaclet Ngezahayo, Hugo Murua Escobar, Ingo Nolte.

der DVG vom 01. - 02.02.2013 in München, Deutschland (Vortrag am 02.02.)

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Poster:

Comparison of branched DNA signal amplification combined with multi-analyte profiling bead technology and quantitative real-time PCR for analyses of Claudin- gene-expression in canine mammary samples

Susanne Hammer, Suhayla Alnajjar, Susanne Nagel, Alexander Heisterkamp, Saskia Willenbrock, Marion Hewicker-Trautwein, Anaclet Ngezahayo, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar

ESVONC Annual Congress 2015 vom 28. - 30.05.2015 in Krakau, Polen

Establishment of a molecular screening system for claudin-gene expression in canine neoplasias and characterisation of claudin-gene expression in canine cell lines and canine mammary tissue samples

Susanne Hammer, Susanne Nagel, Suhayla Alnajjar, Alexander Heisterkamp, Marion Hewicker-Trautwein, Anaclet Ngezahayo, Ingo Nolte, Hugo Murua Escobar ESVONC Annual Congress 2014 vom 22 - 24.05.2014 in Wien, Österreich

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Ergebnisse folgender Publikationen flossen nicht in diese Dissertation mit ein:

Multiplex gene expression profiling of 16 target genes in neoplastic and non- neoplastic canine mammary tissues using branched-DNA assay

Florenza Lüder Ripoli, Susanne C. Hammer, Annika Mohr, Saskia Willenbrock, Marion Hewicker-Trautwein, Bertram Brenig, Hugo Murua Escobar, Ingo Nolte Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1589; doi:10.3390/ijms17091589

Hormone Receptor Expression Analyses in Neoplastic and Non-neoplastic Canine Mammary Tissue by a Bead Based Multiplex Branched DNA Assay: A Gene Expression Study in Fresh Frozen and Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Samples Annika Mohr, Florenza Lüder Ripoli, Susanne C. Hammer, Saskia Willenbrock, Marion Hewicker-Trautwein, Zdzislaw Kielbowicz, Hugo Murua Escobar, Ingo .Nolte PLoS ONE 11(9): e0163311. doi:10.1371/journal.pone.0163311

A Comparison of Fresh Frozen vs. Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Specimens of Canine Mammary Tumors via Branched-DNA Assay.

Florenza Lüder Ripoli, Annika Mohr, Susanne C. Hammer, Sasika Willenbrock, Marion Hewicker-Trautwein, Silvia Hennecke, Hugo Murua Escobar, Ingo Nolte Int J Mol Sci. 2016 May 13;17(5). pii: E724. doi: 10.3390/ijms17050724

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Characterization of the cellular response triggered by gold nanoparticle-mediated laser manipulation.

Stefan Kalies, Sebastian Keil, Sina Sender, Susanne C. Hammer, Georgio C.

Antonopoulos, Markus Schomaker, Tammo Ripken, Hugo Murua Escobar, Heiko Meyer, Dag Heinemann

J Biomed Opt. 2015 Nov;20(11):115005. doi: 10.1117/1.JBO.20.11.115005

Prevalence of the Prefoldin Subunit 5 Gene Deletion in Canine Mammary Tumors.

Silvia Hennecke, Julia Beck, Kirsten Bornemann-Kolatzki, Stephan Neumann, Hugo Murua Escobar, Ingo Nolte, Susanne C. Hammer, Marion Hewicker-Trautwein, Johannes Junginger, Franz-Josef Kaup, Bertram Brenig, Ekkehard Schütz

PLoS One. 2015 Jul 1;10(7):e0131280. doi: 10.1371/journal.pone.0131280

(17)

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

I. Einleitung ... 1

II. Manuskripte ... 4

1. Manuskript 1 ... 4

2. Manuskript 2 ... 7

III. Diskussion ... 9

IV. Zusammenfassung ... 15

V. Summary ... 17

VI. Literaturverzeichnis ... 19

VII. Danksagung ... 24

(18)

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

CPE Enterotoxin des Bakteriums Clostridium perfringens IF Immunfluoreszenz

IHC Immunhistochemie IZC Immuncytochemie PCR Polymerase Kettenreaktion

(19)

I. Einleitung

1

I. Einleitung

Die Claudin Proteine sind ein struktureller und funktioneller Bestandteil der Tight Junctions epithelialer Gewebe (FURUSE et al. 1998). Sie verbinden benachbarte Zellen, dichten den interzellulären Raum ab und halten die Polarität der Zelle aufrecht (FARQUHAR u. PALADE 1963; GUMBINER 1987). Bei einer Vielzahl humaner und caniner epithelialer Tumoren ist die Claudin Expression im Vergleich zu gesundem Ursprungsgewebe auf Gen- und Protein-Ebene dereguliert. Beim Menschen sind Deregulationen der Claudine für Tumoren verschiedener Organe bekannt, so z.B. für die Brust, die Prostata, das Pankreas und das Kolon (LONG et al. 2001; KOMINSKY et al. 2003; KOMINSKY et al. 2004; DE OLIVEIRA et al. 2005;

KRAJEWSKA et al. 2007; UEDA et al. 2007; BORNHOLDT et al. 2011; NAKAGAWA et al. 2011). Beim Hund liegen Veränderungen der Claudin Proteinexpression in neoplastischem Gewebe des Gesäuges (JAKAB et al. 2008b), des Pankreas (JAKAB et al. 2011a; JAKAB et al. 2011b), der Analbeuteldrüsen (JAKAB et al. 2009; JAKAB et al. 2010a) und des Kolons (JAKAB et al. 2010b) vor. Zusätzlich ist beim Hund das Claudin-7 Gen in zirkulierenden Tumorzellen im Blut von Hunden, die an Tumoren der Gesäugeleiste erkrankt sind, nachgewiesen worden (DA COSTA et al. 2013). Zur Untersuchung der Claudin Gene und Proteine des Menschen wurden verschiedene Methoden (Immunhistochemie (IHC), Western Blot, Northern Blot, mRNA in situ Hybridisierung, Arrays und Polymerase-Kettenreaktion (PCR)) angewendet, die zusätzlich zu den diagnostisch feststellbaren Veränderungen der Genexpression zeigten, dass die Claudine auch prognostisches Potential besitzen (ESCUDERO- ESPARZA et al. 2011). Beim Hund beschränken sich die Methoden zum Nachweis der Claudine auf die IHC (JAKAB et al. 2008a; JAKAB et al. 2008b; JAKAB et al.

2009; JAKAB et al. 2010a; JAKAB et al. 2010b; JAKAB et al. 2011a; JAKAB et al.

2011b). Lediglich der Nachweis des Claudin-7 Gens wurde unter Anwendung der RT-PCR erbracht (DA COSTA et al. 2013). PCR-Primer-Assays zur molekularen Analyse weiterer caniner Claudin Gene standen bis zum Beginn dieser Arbeit nicht zur Verfügung. Ein Ziel der vorliegenden Studie war es daher, spezifische PCR und qPCR Primer-Assays zur Charakterisierung der caninen Claudin-1, -3, -4 und -7

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I. Einleitung

2

Gene epithelialer gesunder Gewebe und deren Tumoren zu etablieren. Damit sollte die Grundlage geschaffen werden, das diagnostische Potential caniner Claudin Gene zur Differenzierung epithelialer Tumoren zu evaluieren, um im Weiteren prognostische Hinweise zu erhalten. PCR und qPCR sind sehr sensitive Methoden.

Mithilfe der konventionellen PCR kann eine qualitative Analyse der Genexpression durchgeführt werden. Die Quantifizierung der Genexpression mittels qPCR ermöglicht im Vergleich zur IHC eine präzisere Aussage über Veränderungen der Genexpression erkrankter Gewebe im Vergleich zu Referenzgewebe (SANTIN et al.

2005; BORNHOLDT et al. 2011). Außerdem sind PCR und qPCR im Vergleich zur IHC zeitsparende Methoden, die kleinste Materialmengen benötigen. Die Kombination von molekularen Methoden und konventionellen immunhistologischen Untersuchungen ermöglichen genaue und sensitive Beschreibungen der untersuchten Expressionsveränderungen und eröffnen somit neue Möglichkeiten für Diagnostik und Therapie. Der Fokus der eigenen Arbeit lag auf den Claudinen-1, -3, - 4 und -7, da für diese Claudine beim Menschen Deregulationen der Gen- und Proteinexpression in Tumoren beschrieben sind.

Einige der Claudine fungieren neben ihrer physiologischen Funktion als Rezeptoren für das Enterotoxin des Bakteriums Clostridium perfringens (CPE) (SONODA et al.

1999; FUJITA et al. 2000). Die Lokalisation der Claudin Proteine in der lateralen Zellmembran ermöglicht eine Ansteuerung mit CPE (SONODA et al. 1999; FUJITA et al. 2000). In Untersuchungen an Tumorzellen vom Menschen wurden diese durch Zufügen von CPE und seinen Derivaten zum Zellkulturmedium, intraperitoneal, intratumoral oder durch lokale Anwendung abgetötet (LONG et al. 2001; KOMINSKY et al. 2004; SANTIN et al. 2005) oder moduliert (SONODA et al. 1999; KONDOH et al. 2005; YUAN et al. 2009; UCHIDA et al. 2010; GAO et al. 2011; TAKAHASHI et al.

2012). Um Claudin-basierte Tumor-therapeutische Verfahren für den Hund zu prüfen, ist die Verfügbarkeit von stabil Claudin-exprimierenden Zelllinien eine Voraussetzung. In verschiedenen Studien wurde allerdings berichtet, dass kultivierte humane Zellen die ursprüngliche Claudin Expression des Gewebes verloren bzw.

herab regulierten (LONG et al. 2001; KOMINSKY et al. 2003; SANTIN et al. 2005).

Daher war es ein wichtiges Ziel der vorliegenden Studie zur Etablierung geeigneter

(21)

I. Einleitung

3

Zelllinien für ein Therapiescreening beim Hund, die Claudin-1, -3, -4 und -7 Gen- und die entsprechende Proteinexpression von Primärgewebe und Zelllinien aus caninem Mammagewebe und deren Tumoren zu charakterisieren. Von den Originalgeweben ausgehend wurde jeweils die longitudinale Entwicklung der Claudin Expression während der Kultivierung charakterisiert. Es sollten Zelllinien identifiziert werden, die ihre Claudin Expression während der Kultivierung nicht verlieren. Dazu wurden die selbst erarbeiteten PCR / qPCR Primer Assays und zusätzlich ein branched DNA Assay genutzt. Immunzytochemie (IZC) und Immunfluoreszenz (IF) sollten die Ergebnisse der Genexpressionsanalysen auf Protein-Ebene ergänzen. Im Vergleich zu PCR und qPCR liegt der Vorteil des branched DNA Assays darin, dass verschiedene relevante Ziel- und Referenzgene amplifikationsfrei und simultan in einem einzigen Ansatz mit geringem Proben-Volumen analysiert werden können.

Zusätzlich können in einem Durchlauf viele Proben gleichzeitig analysiert werden.

Die genannten Vorteile vereinfachen das Handling und minimieren den zeitlichen Aufwand signifikant. Für konventionelle PCR und qPCR müssen die relevanten Gene separat in jeweils eigenen Ansätzen gemessen werden. Multiplex-Ansätze von PCR Assays sind prinzipiell durchführbar, jedoch ist mit steigender Komplexität der Multiplex-Ansätze die Etablierung der Reaktion nur schwer oder gar nicht möglich.

Der branched DNA Assay ist eine sehr attraktive Alternative zu PCR / qPCR Ansätzen, da durch die parallele Detektion von bis zu 500 Zielgenen in einer Probe Zeit und Kosten signifikant eingespart werden. Ferner ist die benötigte Menge an Ausgangsmaterial bei branched DNA Assays kein limitierender Faktor, da die Bestimmung an Kleinstmengen erfolgen kann. Für vergleichbare Analysen mittels konventioneller PCR oder qPCR sind im Gegensatz größere Mengen an Ausgangsmaterial nötig.

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II. Manuskripte

4

II. Manuskripte

1. Manuskript 1

Das folgende Manuskript wurde in dem Journal „Neoplasma“ publiziert:

Claudin-1, -3, -4 and -7 gene expression analyses in canine prostate carcinoma and mammary tissue derived cell lines

Neoplasma 63,2,2016: 231 – 238 DOI: 10.4149/208_150924N505 PMID: 26774145

S. C. HAMMER^1,5, S. NAGEL^1,5, J. JUNGINGER², M. HEWICKER-TRAUTWEIN², S.

WAGNER^1,5, A. HEISTERKAMP³, A. NGEZAHAYO⁴, I. NOLTE^1,*, H. MURUA ESCOBAR^1,5

1 Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 9, 30559 Hannover, Deutschland

2 Department of Pathology, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 17, 30559 Hannover, Deutschland

3 Department of Quantum Optics, Leibniz University Hannover, Welfengarten 1, 30167 Hannover, Deutschland

4 Department of Biophysics, Leibniz University Hannover, Herrenhäuser Straße 2, 30419 Hannover, Deutschland

5 Division of Medicine, Haematology, Oncology and Palliative Medicine, University of Rostock, Ernst-Heydemann-Str. 6, 18055 Rostock, Deutschland

*Correspondence: ingo.nolte@tiho-hannover.de

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II. Manuskripte

5 Abstract:

Claudins (CLDNs) are transmembrane proteins localised in the cell membrane of epithelial cells composing a structural and functional component of the tight junction protein complexes. In canine tumors deregulations of the CLDN expression patterns were described immunohistochemically. Targeting of claudin proteins has further been evaluated to establish novel therapeutic approaches by directed claudin binding. Precondition for the development of claudin targeting approaches in canine cells is the possibility to characterise claudin expression specifically and the availability of claudin positive cell lines. Herein PCR/qPCR assays were established allowing a rapid qualitative and quantitative characterisation of CLDN-1, -3, -4 and -7 gene expression in canine cell lines and tissues. Further commercially available antibodies were used to verify CLDN gene expression on protein level by Western blots. The developed assays were used to analyse six canine cell lines derived from mammary and prostate tissue for their CLDN-1, -3, -4 and -7 expressions.

The canine cell line DT08/40 (prostate transitional cell carcinoma) was used for the establishment of specific CLDNs -1, -3, -4 and -7PCR/qPCR. The designed assays were verified by amplicon cloning and sequencing. Gene expressions were verified on protein level by Western blot. Additionally further cell lines were analysed for their CLDN-1, -3, -4 and -7 expression on mRNA and protein level (mammary derived cell lines: MTH53A (non-neoplastic), ZMTH3 (adenoma), MTH52C (carcinoma); prostate derived cell lines: DT08/46 and CT1258 (both adenocarcinoma).

The screened cell lines showed expression for the CLDNs as follows: DT08/46 and DT08/40: CLDN-1, -3, -4 and -7 positive; CT1258: CLDN-1, -3, -4 and -7 negative;

ZMTH3 and MTH52C: CLDN-1 and -7 positive, CLDN-3 and -4 negative; MTH53A:

CLDN-1, -3 and -4 negative, CLDN-7 positive. Western blot analyses reflect the detected CLDN-1, -3, -4 and -7 expressions in the analysed cell lines.

The established CLDN-1, -3, -4 and -7 PCR/qPCR assays allow a qualitative and quantitative characterisation of canine CLDN gene expression. Characterisation of CLDN expression in six canine cell lines led to the identification of two canine

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II. Manuskripte

6

prostate tissue derived CLDN expressing cell lines. These cell lines serve as candidates for further research on CLDN-based functional and therapeutic approaches.

(25)

II. Manuskripte

7 2. Manuskript 2

Das folgende Manuskript wurde in dem Journal "International Journal of Molecular Sciences" publiziert:

Longitudinal Claudin Gene Expression Analyses in Canine Mammary Tissues and Thereof Derived Primary Cultures and Cell Lines

International Journal of Molecular Sciences 17 (10),2016: pii: E1655.

DOI: 10.3390/ijms17101655 PMID: 27690019

S. C. HAMMER^1,2, A. BECKER³, K. RATEITSCHAK⁴, A. MOHR^1,2, F. LÜDER RIPOLI^1,2, S. HENNECKE⁵, J. JUNGINGER⁶, M. HEWICKER-TRAUTWEIN⁶, B.

BRENIG⁵, A. NGEZAHAYO^3,7, I. NOLTE^1*, H. MURUA ESCOBAR^1,2

1 Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 9, 30559 Hannover, Germany

2 Division of Medicine, Haematology, Oncology and Palliative Medicine, University of Rostock, Ernst-Heydemann-Str. 6, 18055 Rostock, Germany

3 Institute of Biophysics, Leibniz University Hannover, Herrenhäuser Straße 2, 30419 Hannover, Germany

4 Institute for Bioinformatics, University Medicine Greifswald, Walther-Rathenau- Str.48, 17475 Greifswald, Germany

5 Institute of Veterinary Medicine, Georg-August-University Göttingen, Burckhardtweg 2, 37077 Göttingen, Germany

6 Department of Pathology, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 17, 30559 Hannover, Germany

7 Center for Systems Neuroscience (ZSN) Hannover, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 17, 30559 Hannover, Germany

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II. Manuskripte

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* Correspondence: ingo.nolte@tiho-hannover.de; Tel.: +49-511-953-6202

Abstract:

Human and canine mammary tumours show partially claudin expression deregulations. Further, claudins have been used for directed therapeutic approaches.

However, the development of claudin targeting approaches requires stable claudin expressing cell lines. This study reports the establishment and characterisation of canine mammary tissue derived cell lines, analysing longitudinally the claudin-1, -3, -4 and -7 expressions in original tissue samples, primary cultures and developed cell lines. Primary cultures were derived from 17 canine mammary tissues: healthy, lobular hyperplasia, simple adenoma, complex adenoma, simple tubular carcinoma, complex carcinoma, carcinoma arising in a benign mixed tumour and benign mixed tissue. Cultivation was performed, if possible, until passage 30. Claudin mRNA and protein expressions were analysed by PCR, QuantiGene Plex Assay, immunocytochemistry and immunofluorescence. Further, cytokeratin expression was analysed immunocytochemically. Cultivation resulted in 11 established cell lines, eight showing epithelial character. In five of the early passages the claudin expressions decreased compared to the original tissues. In general, claudin expressions were diminished during cultivation. Three cell lines kept longitudinally claudin, as well as epithelial marker expressions, representing valuable tools for the development of claudin targeted anti-tumour therapies.

(27)

III. Diskussion

9

III. Diskussion

Humane Tumoren zahlreicher Organe zeigen im Vergleich zum gesunden Gewebe Veränderungen ihrer Claudin-1, -3, -4 und -7 Gen- und Proteinexpression (ESCUDERO-ESPARZA et al. 2011), die sowohl diagnostisch als auch prognostisch genutzt werden können (SHEEHAN et al. 2007; UEDA et al. 2007; ERSOZ et al.

2011). Beim Hund liegen ebenfalls Veränderungen der Proteinexpression der genannten Claudine in Tumoren der Gesäugeleiste, des Pankreas, des Analbeutels und des Kolorektums vor (JAKAB et al. 2008b; JAKAB et al. 2009; JAKAB et al.

2010b; JAKAB et al. 2011a). Die Genexpression der Claudine in Geweben und daraus entstehenden Tumoren ist jedoch beim Hund noch nicht untersucht. Die Expression von Genen kann mittels unterschiedlicher Methoden analysiert werden.

PCR und qPCR sind dafür sehr sensitive Methoden. Für eine Charakterisierung der caninen Claudin Genexpression mittels PCR und qPCR standen bisher jedoch keine Primer-Assays zur Verfügung.

In der vorliegenden Untersuchung sollten daher zunächst spezifische PCR / qPCR Primer-Assays für die caninen Claudin-1, -3, -4 und -7 Gene etabliert werden.

Basierend auf den mRNA-Sequenzen des National Center for Biotechnology Information wurden die Primer designt und an verschiedenen caninen von Prostatatumoren- und Mammagewebe sowie -tumoren abgeleiteten Zelllinien getestet (HAMMER et al. 2016b). Sequenzierungen der amplifizierten Sequenzen bestätigten die Spezifität der Assays für die caninen Claudin-1, -3, -4 und -7 Gene (HAMMER et al. 2016b). Diese Primer-Assays ermöglichen nun qualitative und quantitative Expressionsanalysen der caninen Claudin-1, -3, -4 und -7 Gene an verschiedenen caninen Geweben und Tumorentitäten, um das diagnostische und prognostische Potential der Claudine für canine Tumoren untersuchen zu können.

Die Untersuchung der Claudin Genexpression von einer Zelllinie der gesunden caninen Gesäugeleiste und von zwei Zelllinien von Mammatumoren (Adenom und Karzinom) des Hundes zeigte, dass die Adenom-Zelllinie eins der untersuchten Claudine (Claudin-1) exprimiert, während die Zelllinien der gesunden Gesäugeleiste

(28)

III. Diskussion

10

und die Karzinom-Zelllinie negativ für die Claudine waren (HAMMER et al. 2016b).

Zusätzlich wurden drei Zelllinien caniner Prostatatumoren (ein Übergangszellkarzinom, zwei Adenokarzinome) untersucht. In der Zelllinie des Übergangszellkarzinoms der Prostata des Hundes (DT08/40) lag eine Expression der interessierenden Claudine vor (HAMMER et al. 2016b). Von den zwei Adenokarzinomen-Zelllinien zeigte eine Zelllinie (DT08/46) Aktivität der interessierenden Claudin-1, -3, -4 und -7 Gene, die andere Zelllinie (CT1258) jedoch nicht (HAMMER et al. 2016b). Zur Gen- oder Proteinexpression caniner Claudine in Gewebe von gesunder Prostata, Prostatatumoren oder daraus abgeleiteten Zelllinien liegen bisher keine Studien vor. In Adenokarzinomen der Prostata des Menschen wurde, wie in der hier untersuchten Zelllinie eines caninen Adenokarzinoms, das Claudin-3 nachgewiesen (LONG et al. 2001). In einer Zelllinie einer Lymphknoten- Metastase eines humanen Prostatakarzinoms und in einer anderen Zelllinie einer Knochen-Metastase eines Prostataadenokarzinoms des Menschen waren Claudin-3 und -4 dagegen nicht nachweisbar (LONG et al. 2001). Dies könnte in Verbindung mit einer reduzierten Expression von Claudin-3 und -7 bei der Metastasierung von humanen kolorektalen Tumoren in die Leber (OSHIMA et al. 2008) und einer reduzierten Expression von Claudin-4 für kolorektale Tumoren mit Invasion und Infiltration der Blut- und Lymphgefäße stehen (UEDA et al. 2007). Ein Zusammenhang von reduzierter Claudin-3 und -7 Expression und Metastasierung kolorektaler Tumoren in Lymphknoten konnte jedoch nicht bestätigt werden (OSHIMA et al. 2008). Die in der vorliegenden Studie untersuchte Claudin-negative Zelllinie eines Prostataadenokarzinoms stammte nicht von einer Metastase, sondern von einem hochgradig malignem Tumor ab (WINKLER et al. 2005). Somit wäre es möglich, dass im Laufe der Kultivierung Zellen selektiert wurden, die kurz vor der Metastasierung standen, oder die Genexpression änderte sich im Verlauf der Kultivierung, so wie es für kultivierte humane Zellen der Brust beschrieben ist (NACHT et al. 1999; KOMINSKY et al. 2003). Die schwache bis nicht existente Genexpression der Claudine in den drei selbst untersuchten Zelllinien der caninen Gesäugeleiste (HAMMER et al. 2016b) steht im Widerspruch zu dem Nachweis der Claudin Proteine aus caninen Gesäugeleisten und benignen und malignen Tumoren

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III. Diskussion

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der Mamma (JAKAB et al. 2008a; JAKAB et al. 2008b). Nach den Ergebnissen der eigenen Studie ist davon auszugehen, dass in den hier untersuchten Zelllinien eine Veränderung der Claudin Genexpression stattgefunden hat. Da das Originalgewebe der Zelllinien der eigenen Studie nicht mehr verfügbar war, konnte deren Genexpression leider nicht analysiert und mit der Genexpressionen der daraus abgeleiteten Zelllinien verglichen werden.

Einige der Claudin Proteine fungieren als Rezeptor für das CPE (SONODA et al.

1999; FUJITA et al. 2000). Claudin-exprimierende Tumorzellen konnten mithilfe des CPEs und seinen Derivaten angesteuert und abgetötet werden (LONG et al. 2001;

MICHL et al. 2001; KOMINSKY et al. 2004; SANTIN et al. 2005; YUAN et al. 2009;

GAO et al. 2011; KONO et al. 2015). Um allerdings solche Ansätze für Claudin- exprimierende Tumoren des Hundes entwickeln zu können, braucht es stabil Claudin-exprimierende Zelllinien caniner Tumoren. Die eigenen Ergebnisse (HAMMER et al. 2016b), die analog zu anderen Studien (NACHT et al. 1999;

KOMINSKY et al. 2003) auf einen Verlust der Genexpression in Zelllinien hinweisen, bedeutet, dass geeignete Zelllinien zur Entwicklung Claudin-basierter Tumortherapien identifiziert werden müssen. Daher wurde in der eigenen Untersuchung die Expression von Claudin-1, -3, -4 und -7 in Primärkulturen und neuen Zelllinien aus Mammagewebe des Hundes über einen Zeitraum von 30 Passagen longitudinal überprüft. Aus siebzehn frisch gewonnenen Gewebeproben nicht-neoplastischer und neoplastischer Gesäugeanteile von Hündinnen wurden dazu Primärkulturen zur Anzüchtung von Zelllinien angesetzt. War eine Primärkultur über die 19. Passage hinweg kultivierbar, wurde sie als Zelllinie bezeichnet. In diesen Primärkulturen und den sich daraus entwickelnden Zelllinien wurden die Claudin-1, -3, -4 und -7 Gene und Proteine analysiert. Diese wurden jeweils mit im Rahmen dieser Studie etablierten Primer-Assays, einem branched DNA Assay, IZC und IF überprüft. Auf diese Weise gelang es sechs Primärkulturen und elf neue Zelllinien anzuzüchten. Von elf Gewebeproben war genug Material vorhanden, um auch das Ausgangsgewebe zu charakterisieren. Die Analyse bezog sich nicht auf verschiedene Subtypen von Mammatumoren. Eine Untersuchung der Claudin Expression verschiedener Tumorsubtypen im Vergleich zu Normalgewebe befindet

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III. Diskussion

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sich momentan in der Auswertung. Die Veränderungen der Claudin Expression von der originalen Gewebeprobe zu daraus kultivierten Zellen wurde longitudinal in Abständen von 10 Passagen bis zum Erreichen der 30. Passage bei Zelllinien, bei Primärkulturen bis zur letzten vitalen Passage gemessen. Der angewendete branched DNA Assay ermöglichte es, die Claudin-1, -3, -4 und -7 Genexpression von unterschiedlichen Passagen aller Primärkulturen und Zelllinien sowie die originalen Gewebeproben in einem Durchgang simultan zu messen. Der Immunfluoreszenz- Test bestätigte Ergebnisse der Genexpressionsanalysen auf Protein-Ebene.

Die hier durchgeführten Claudin Expressionsanalysen an caninen Primärkulturen und Zelllinien nicht-neoplastischer und neoplastischer Mamma- sowie caniner Prostatakarzinom-Zelllinien sind die ersten Claudin Genexpressionsanalysen für den Hund (HAMMER et al. 2016a; HAMMER et al. 2016b). Die Mehrheit der hier neu gewonnenen Zelllinien und alle Primärkulturen wiesen während der gesamten Kultivierung eine kaum nachweisbare Expression der untersuchten Claudine auf (HAMMER et al. 2016a). Dies steht, wie die Ergebnisse der Genexpressionsanalysen an den bereits etablierten caninen Gesäugeleisten- Zelllinien (HAMMER et al. 2016b), im Widerspruch zum Nachweis der Claudin- Protein aus Gewebe der caninen gesunden Gesäugeleiste (JAKAB et al. 2008a;

JAKAB et al. 2008b). Obwohl das Gewebe aus dem gesunden Gesäuge bei JAKAB et al. (2008a) eine starke Expression der Claudin-1, -3, -4 und -7 Proteine aufwies (JAKAB et al. 2008a), wurde in den Zelllinien und Primärkulturen der eigenen Studie, die auch von Gewebe gesunder Gesäugeleisten abgeleitet wurden, keine oder nur eine schwache Claudin Genexpression nachgewiesen (HAMMER et al. 2016a;

HAMMER et al. 2016b). In der vorliegenden Studie wurden auch aus zwei Gewebeproben verschiedener hyperplastischer Gesäuge Primärkulturen angesetzt.

Daraus entwickelte sich eine zu einer Zelllinie, die andere nicht (HAMMER et al.

2016a). Interessanter Weise exprimierte die Zelllinie der hyperplastischen Mamma die Claudin-1, -3, -4 und -7 Gene, in der Primärkultur fehlte die Expression (HAMMER et al. 2016a).

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III. Diskussion

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Nach JAKAB et al. (2008b) war in Adenomen und Karzinomen immunhistochemisch eine Expression der Claudin-1, -3, -4 und -7 Proteine nachweisbar (JAKAB et al.

2008b), im Vergleich zu dem gesunden Gewebe zwar abgeschwächt, aber dennoch vorhanden (JAKAB et al. 2008b). Auf Gen-Ebene war im Rahmen der vorliegenden Untersuchung in den Zelllinien und Primärkulturen, die sich ebenfalls von Adenomen oder Karzinomen ableiteten, die Claudin Expression kaum vorhanden.

In drei Zelllinien (eine von gesundem Gewebe, zwei von Karzinomen) und drei Primärkulturen (eine von einer lobulären Hyperplasie, zwei von Karzinomen) wurde die Veränderung der Genexpression der zuerst kultivierten Zellen einer Zelllinie bzw.

einer Primärkultur im Vergleich zum jeweiligen Ursprungsgewebe untersucht. Die Claudin Expression dieser zuerst kultivierten Zellen lag unter der des Originalgewebes. Weiterhin ergab sich, dass die Claudin Expression der Zelllinien und Primärkulturen, die in der letzten untersuchten Passage keine Expression aufwiesen, direkt zu Beginn der Kultivierung sehr gering war und dies auch im weiteren Verlauf der Kultivierung blieb. Die Verminderung der Claudin Expression geschieht demnach zu Beginn der Kultivierung. Solche Untersuchungen an humanen oder caninen Zelllinien über einen Zeitraum von 30 Passagen sind in der zugänglichen Literatur noch nicht beschrieben. Lediglich aus zwei Studien geht hervor, dass die herabgesetzte Expression von Claudin-7 bis zur neunten Passage erfolgte (NACHT et al. 1999; KOMINSKY et al. 2003). Der Mechanismus, der zu diesem Effekt führt, ist jedoch unbekannt und dürfte darauf zurückzuführen sein, dass die Zellen aus dem Gewebeverband herausgelöst wurden und als Monolayer wachsen.

Diese allenfalls geringe oder sogar fehlende Claudin Genexpression muss bei der Verwendung von Zelllinien, die sich von Claudin-exprimierenden Tumoren ableiten und in der Entwicklung Claudin-basierter Tumor-therapeutischer Verfahren angewendet werden sollen, bedacht werden. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der eigenen Studien am Hund (HAMMER et al. 2016a; HAMMER et al. 2016b) und Berichten anderer, die das Absinken der Genaktivität in humanen Zelllinien feststellten (NACHT et al. 1999; KOMINSKY et al. 2003), berichten jedoch einige

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III. Diskussion

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Studien von humanen Zelllinien, die eine Claudin Expression beibehielten (MICHL et al. 2001; KOMINSKY et al. 2004; TODD et al. 2015). Im Rahmen der vorliegenden Studie konservierten zwei canine Prostatatumor-Zelllinien die Expression aller untersuchten Claudine (HAMMER et al. 2016b), die damit für in vitro Therapiestudien nutzbar sind. In einer neu etablierten Zelllinie eines einfachen Adenoms der Mamma war ebenfalls die longitudinale Expression von Claudin-1, -4 und -7 messbar (HAMMER et al. 2016a). Bei zwei weiteren selbst angezüchteten neuen Zelllinien, abgeleitet von einer Hyperplasie und einem komplexen Karzinom, blieb sogar die Expression der Claudine-1, -3, -4 und -7 erhalten (HAMMER et al. 2016a). Diese Zelllinien des Hundes eignen sich damit als Kandidaten für die Entwicklung einer Claudin-gerichteten Tumortherapie.

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IV. Zusammenfassung

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IV. Zusammenfassung

Hammer, Susanne Conradine (2016)

Etablierung spezifischer PCR und qPCR-Assays zur Analyse der Genexpression caniner Claudine-1, -3, -4 und -7 sowie deren longitudinale Gen- und Proteinexpression in Primärkulturen und Zelllinien von Mamma- und Prostatatumoren

Die Claudin Proteine sind ein struktureller und funktioneller Bestandteil der Tight Junctions des epithelialen Gewebes. Sie zeigen in Tumoren des Menschen im Vergleich zum gesunden Gewebe Deregulierungen ihrer Gen- und Proteinexpression. Beim Hund ist ebenfalls eine veränderte Expression der Claudin Proteine in Tumoren bekannt. Auf Genebene gibt es für den Hund bisher keine Erkenntnisse. Einige der Claudin Proteine fungieren als Rezeptor für das Enterotoxin des Bakteriums Clostridium perfringens (CPE), wodurch Claudin-exprimierende Zellen mithilfe des CPEs angesteuert und abgetötet werden können. Um solche Verfahren für Tumoren des Hundes zu entwickeln, ist das Vorhandensein von Claudin-exprimierenden Zelllinien eine Voraussetzung.

Um die Genexpression der Claudine-1, -3, -4 und -7 in Tumoren des Hundes untersuchen zu können, wurden im Rahmen der vorliegenden Studie PCR / qPCR Assays etabliert. Mit diesen PCR / qPCR Assays wurde die Claudin Genexpression von drei caninen Prostatatumor-Zelllinien (ein Übergangszellkarzinom, zwei Adenokarzinome) und drei weiteren Zelllinien, welche sich vom Gewebe des Gesäuges von Hündinnen (gesund, Adenom, Karzinom) ableiten, untersucht. Zwei der Prostatatumor-Zelllinien (die des Übergangszellkarzinoms, eine eines Adenokarzinoms) exprimierten die Claudine-1, -3, -4 und -7, die Mammaadenom- Zelllinie exprimierte das Claudin-1. Die zweite Prostata-Adenokarzinom-Zelllinie sowie die Zelllinie des gesunden Gesäuges und die des Karzinoms waren negativ für die untersuchten Claudin Gene. Die Claudin-Negativität der caninen Zelllinien des Gesäuges steht im Gegensatz zu dem Nachweis der Claudin Proteine aus der gesunden Gesäugeleiste des Hundes sowie benignen und malignen Tumoren.

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IV. Zusammenfassung

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Die selbst generierten Daten und Studien anderer geben Hinweise darauf, dass sich in Zelllinien ursprünglich Claudin-exprimierender Gewebe die Claudin Expression vermindert. Dies schränkt die universelle Anwendung von Zelllinien für die Entwicklung Claudin-basierter Tumor-therapeutischer Methoden ein. Um geeignete Zelllinien zu finden, wurden daher aus 17 frisch gewonnenen Proben der caninen nicht-neoplastischen und neoplastischen Gesäugeleiste Primärkulturen angesetzt.

Waren die Primärkulturen über die 19. Passage hinaus kultivierbar, wurden sie als Zelllinien bezeichnet. Die Claudin Expression wurde in den Primärkulturen bis zum Erreichen der letzten vitalen Passage und in den Zelllinien bis zur 30. Passage während der Kultivierung longitudinal untersucht. War von einer Probe genügend Ausgangsmaterial vorhanden, wurde auch die Probe auf ihre Claudin Expression untersucht und mit der Expression der zuerst daraus kultivierten Zellen verglichen.

Der Vergleich der Originalprobe zu Zellen, die daraus kultiviert wurden, zeigte, dass die Zellen zu Beginn der Kultivierung bereits eine geringere Claudin Expression vorwiesen. Entsprechend verloren alle Primärkulturen und die Mehrheit der neu etablierten Zelllinien im Verlauf der Kultivierung Claudin Gen- und Proteinexpression.

Eine Zelllinie eines Adenoms der Gesäugeleiste dagegen exprimierte die Claudine-1, -4 und -7. Bei einer Zelllinie einer Hyperplasie und einer Zelllinie eines Karzinoms blieben die Claudine-1, -3, -4 und -7 stabil exprimiert. Diese Zelllinien, sowie die Claudin exprimierenden Prostatatumor-Zelllinien des Hundes, können zukünftig zur Prüfung Claudin-basierter Tumortherapien eingesetzt werden.

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V. Summary

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V. Summary

Hammer, Susanne Conradine (2016)

Establishment of specific PCR and qPCR-Assays for analyses of the expression of canine claudin-1, -3, -4 and -7 genes and their longitudinal gene and protein expression in primary cultures and cell lines of mammary and prostate tumours

Claudin proteins are a structural and functional part of the tight junctions of epithelial tissues. Human tumours compared to healthy tissues show deregulations of their claudin gene and protein expression. Such deregulations of claudin proteins are also known for canine tumours, but claudin gene expression analyses have not yet been performed. Some of the claudin proteins act as receptor for the enterotoxin of Clostridium perfringens (CPE), enabling the targeting and killing of claudin- expressing cells. For the development of such strategies for canine tumours, canine claudin expressing cell lines need to be found.

The establishment of PCR / qPCR assays that enable claudin gene expression analyses was performed in this study. These assays were used to analyse the claudin gene expression of three canine prostate tumour derived cell lines (two prostate adenocarcinomas, one transitional cell carcinoma) and three canine mammary tissue derived cell lines (healthy, adenoma, carcinoma). Two of the prostate tumour derived cell lines (one adenocarcinoma derived, the other transitional cell carcinoma derived) showed expression of the claudins-1, -3, -4 and -7, the mammary adenoma derived cell line expressed claudin-1. The second prostate adenocarcinoma derived cell line, the healthy mammary tissue and the mammary carcinoma derived cell lines were negative for the analyzed claudins. The claudin-negativity of the canine mammary tissue derived cell lines is contrary to claudin expression in the healthy mammary gland and benign and malignant tumours.

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V. Summary

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The own conducted study and reports of others indicate, that cultivated cells show a diminished claudin expression, limiting the use of cell lines for testing claudin- targeting antitumor-therapies. To identify such cell lines, primary cultures were generated from 17 canine non-neoplastic and neoplastic mammary gland samples in this study. If the primary cultures were cultivable beyond passage 19, they were designated as cell line. The claudin expression was longitudinally analysed in the primary cultures until the last viable passage and in the cell lines for a cultivation period of 30 passages. If there was enough material from one sample, the claudin expression of the sample was also analyzed and compared to the expression of the freshly cultivated cells. The comparison of claudin expression in the original tissue und cultivated cells showed, that cultivated cells have a lower claudin expression than the original sample. Accordingly, all primary cultures and the majority of the generated cell lines lost expression of the claudin-1, -3, -4 and -7 genes and proteins.

One cell line derived from a mammary adenoma expressed the claudins-1, -4 und -7.

A cell line derived from a hyperplasia and a cell line derived from a carcinoma kept stable expression of all analyzed claudins-1, -3, -4 und -7. These cell lines and the claudin-expressing prostate tumour derived cell lines can be used for testing claudin- targeting antitumor therapies.

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VI. Literaturverzeichnis

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VI. Literaturverzeichnis

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VII. Danksagung

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VII. Danksagung

Der erste große Dank geht an Herrn Prof. Dr. Ingo Nolte für die Möglichkeit diese überaus spannende Thematik untersucht haben zu dürfen und dadurch viele Erlebnisse, Eindrücke und Weiterbildungsmöglichkeiten genossen haben zu dürfen.

Der nächste große Dank geht an Herrn Priv.-Doz. Dr. Hugo Murua Escobar für die wissenschaftliche Betreuung trotz der räumlicher Entfernung und das stets offene Ohr.

Ein weiterer Dank geht an Frau Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein, Herrn Prof. Dr.

Anaclet Ngezahayo, Herr Dr. Johannes Junginger, Frau Dr. Katja Rateitschak und Annegret Becker für die Zusammenarbeit und Unterstützung hinsichtlich Immunzytochemie, Immunfluoreszenz oder Statistik.

Frau Gabriele Bante und Herrn Andreas Köppen möchte ich für die Hilfe bei organisatorischen, computertechnischen und sonstigen Angelegenheiten herzlich danken.

Ein großer Dank geht an meine aktuellen und ehemaligen Kollegen der AG (aufgelistet in alphabetischer Reihenfolge): Suhayla Alnajjar, Alexandra Anders, Jan Peter Bach, Regina Carlson, José Granados Soler, Michael Grau, Katharina Haverkamp, Lisa Harder, Tatjana Harting, Laura Hobohm, Karin Lucas, Florenza Lüder Ripoli, Susanne Nagel, Eva Packeiser, Laura Roland, Jan Torben Schille, Lisa Schulten, Nayeli Schulze, Heike Thiemeyer, Annika Mohr, Camila Penter, Siegfried Wagner, Leona Wall, Claudia Windhövel und Saskia Willenbrock. Vielen Dank für eine schöne und unvergessliche Zeit in Büro / Labor und Freizeit. Vielen Dank an meine ehemaligen Büro-Kollegen Siggi und Hugo und an meinen jetzigen Büro- Kollegen Jan für die aufheiternden Diskussionen über die Expression von Genen und die Proteinbiosynthese, Star Wars, Star Trek, Game of Thrones, das Marvel Universum und Sport. Vielen Dank auch an die Damen des harten Kerns für die gemeinsamen Mittagessen, die morgendlichen Radtouren zur Arbeit und wieder zurück sowie für die Besuche der Eisdiele. Nicht zu vergessen sind meine Reisebegleitungen auf den Kongressen: Hugo, Siggi, Sassi, Stephi, Tatjana und Jan, es war fantastisch! München, Gießen, Leipzig, Berlin, Jena, Rostock, Göttingen, Krakau, Wien, Minneapolis, St. Louis, Foz do Iguacu oder Rio de Janeiro. Jeder Kongress wird lange in Erinnerung bleiben!

Tausend Dank meinen Eltern Marianne Schulte-Hammer und Jan Walter Hammer für alles, was sie in den letzten 3 Jahrzehnten für mich getan haben. Danken möchte ich natürlich auch meinem Bruder Jan Hendrik, meiner Großtante Franziska Thiemeyer, meinem Zukünftigen Stefan Hohmeier sowie Emily und Charly, deren Unterstützung

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und Gesellschaft ebenfalls von großem Wert war. Meine Großmutter Anna Schulte- Thiemeyer und meine vierbeinige Begleitung aus Studienzeiten Cinnamon, die ebenfalls mein Zuhause ausgemacht haben, sollen nicht vergessen sein.

Meinen Freunden Lena, Jenni, Katrin, Isi, Stefan, Carina, Anne und Stephie möchte ich für das „Kopf freibekommen“ und „neue Kraft tanken“ danken.

Letztendlich danke ich allen von ganzem Herzen, die mich bei der Erstellung dieser Dissertation unterstützt haben und dadurch das Leben im Labor und außerhalb des Labors bereichert haben.

May the force be with you!

Live long and prosper!

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