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I. Einleitung
Die Claudin Proteine sind ein struktureller und funktioneller Bestandteil der Tight Junctions epithelialer Gewebe (FURUSE et al. 1998). Sie verbinden benachbarte Zellen, dichten den interzellulären Raum ab und halten die Polarität der Zelle aufrecht (FARQUHAR u. PALADE 1963; GUMBINER 1987). Bei einer Vielzahl humaner und caniner epithelialer Tumoren ist die Claudin Expression im Vergleich zu gesundem Ursprungsgewebe auf Gen- und Protein-Ebene dereguliert. Beim Menschen sind Deregulationen der Claudine für Tumoren verschiedener Organe bekannt, so z.B. für die Brust, die Prostata, das Pankreas und das Kolon (LONG et al. 2001; KOMINSKY et al. 2003; KOMINSKY et al. 2004; DE OLIVEIRA et al. 2005;
KRAJEWSKA et al. 2007; UEDA et al. 2007; BORNHOLDT et al. 2011; NAKAGAWA et al. 2011). Beim Hund liegen Veränderungen der Claudin Proteinexpression in neoplastischem Gewebe des Gesäuges (JAKAB et al. 2008b), des Pankreas (JAKAB et al. 2011a; JAKAB et al. 2011b), der Analbeuteldrüsen (JAKAB et al. 2009; JAKAB et al. 2010a) und des Kolons (JAKAB et al. 2010b) vor. Zusätzlich ist beim Hund das Claudin-7 Gen in zirkulierenden Tumorzellen im Blut von Hunden, die an Tumoren der Gesäugeleiste erkrankt sind, nachgewiesen worden (DA COSTA et al. 2013). Zur Untersuchung der Claudin Gene und Proteine des Menschen wurden verschiedene Methoden (Immunhistochemie (IHC), Western Blot, Northern Blot, mRNA in situ Hybridisierung, Arrays und Polymerase-Kettenreaktion (PCR)) angewendet, die zusätzlich zu den diagnostisch feststellbaren Veränderungen der Genexpression zeigten, dass die Claudine auch prognostisches Potential besitzen (ESCUDERO-ESPARZA et al. 2011). Beim Hund beschränken sich die Methoden zum Nachweis der Claudine auf die IHC (JAKAB et al. 2008a; JAKAB et al. 2008b; JAKAB et al.
2009; JAKAB et al. 2010a; JAKAB et al. 2010b; JAKAB et al. 2011a; JAKAB et al.
2011b). Lediglich der Nachweis des Claudin-7 Gens wurde unter Anwendung der RT-PCR erbracht (DA COSTA et al. 2013). PCR-Primer-Assays zur molekularen Analyse weiterer caniner Claudin Gene standen bis zum Beginn dieser Arbeit nicht zur Verfügung. Ein Ziel der vorliegenden Studie war es daher, spezifische PCR und qPCR Primer-Assays zur Charakterisierung der caninen Claudin-1, -3, -4 und -7
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Gene epithelialer gesunder Gewebe und deren Tumoren zu etablieren. Damit sollte die Grundlage geschaffen werden, das diagnostische Potential caniner Claudin Gene zur Differenzierung epithelialer Tumoren zu evaluieren, um im Weiteren prognostische Hinweise zu erhalten. PCR und qPCR sind sehr sensitive Methoden.
Mithilfe der konventionellen PCR kann eine qualitative Analyse der Genexpression durchgeführt werden. Die Quantifizierung der Genexpression mittels qPCR ermöglicht im Vergleich zur IHC eine präzisere Aussage über Veränderungen der Genexpression erkrankter Gewebe im Vergleich zu Referenzgewebe (SANTIN et al.
2005; BORNHOLDT et al. 2011). Außerdem sind PCR und qPCR im Vergleich zur IHC zeitsparende Methoden, die kleinste Materialmengen benötigen. Die Kombination von molekularen Methoden und konventionellen immunhistologischen Untersuchungen ermöglichen genaue und sensitive Beschreibungen der untersuchten Expressionsveränderungen und eröffnen somit neue Möglichkeiten für Diagnostik und Therapie. Der Fokus der eigenen Arbeit lag auf den Claudinen1, 3, -4 und -7, da für diese Claudine beim Menschen Deregulationen der Gen- und Proteinexpression in Tumoren beschrieben sind.
Einige der Claudine fungieren neben ihrer physiologischen Funktion als Rezeptoren für das Enterotoxin des Bakteriums Clostridium perfringens (CPE) (SONODA et al.
1999; FUJITA et al. 2000). Die Lokalisation der Claudin Proteine in der lateralen Zellmembran ermöglicht eine Ansteuerung mit CPE (SONODA et al. 1999; FUJITA et al. 2000). In Untersuchungen an Tumorzellen vom Menschen wurden diese durch Zufügen von CPE und seinen Derivaten zum Zellkulturmedium, intraperitoneal, intratumoral oder durch lokale Anwendung abgetötet (LONG et al. 2001; KOMINSKY et al. 2004; SANTIN et al. 2005) oder moduliert (SONODA et al. 1999; KONDOH et al. 2005; YUAN et al. 2009; UCHIDA et al. 2010; GAO et al. 2011; TAKAHASHI et al.
2012). Um Claudin-basierte Tumor-therapeutische Verfahren für den Hund zu prüfen, ist die Verfügbarkeit von stabil Claudin-exprimierenden Zelllinien eine Voraussetzung. In verschiedenen Studien wurde allerdings berichtet, dass kultivierte humane Zellen die ursprüngliche Claudin Expression des Gewebes verloren bzw.
herab regulierten (LONG et al. 2001; KOMINSKY et al. 2003; SANTIN et al. 2005).
Daher war es ein wichtiges Ziel der vorliegenden Studie zur Etablierung geeigneter
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Zelllinien für ein Therapiescreening beim Hund, die Claudin-1, -3, -4 und -7 Gen- und die entsprechende Proteinexpression von Primärgewebe und Zelllinien aus caninem Mammagewebe und deren Tumoren zu charakterisieren. Von den Originalgeweben ausgehend wurde jeweils die longitudinale Entwicklung der Claudin Expression während der Kultivierung charakterisiert. Es sollten Zelllinien identifiziert werden, die ihre Claudin Expression während der Kultivierung nicht verlieren. Dazu wurden die selbst erarbeiteten PCR / qPCR Primer Assays und zusätzlich ein branched DNA Assay genutzt. Immunzytochemie (IZC) und Immunfluoreszenz (IF) sollten die Ergebnisse der Genexpressionsanalysen auf Protein-Ebene ergänzen. Im Vergleich zu PCR und qPCR liegt der Vorteil des branched DNA Assays darin, dass verschiedene relevante Ziel- und Referenzgene amplifikationsfrei und simultan in einem einzigen Ansatz mit geringem Proben-Volumen analysiert werden können.
Zusätzlich können in einem Durchlauf viele Proben gleichzeitig analysiert werden.
Die genannten Vorteile vereinfachen das Handling und minimieren den zeitlichen Aufwand signifikant. Für konventionelle PCR und qPCR müssen die relevanten Gene separat in jeweils eigenen Ansätzen gemessen werden. Multiplex-Ansätze von PCR Assays sind prinzipiell durchführbar, jedoch ist mit steigender Komplexität der Multiplex-Ansätze die Etablierung der Reaktion nur schwer oder gar nicht möglich.
Der branched DNA Assay ist eine sehr attraktive Alternative zu PCR / qPCR Ansätzen, da durch die parallele Detektion von bis zu 500 Zielgenen in einer Probe Zeit und Kosten signifikant eingespart werden. Ferner ist die benötigte Menge an Ausgangsmaterial bei branched DNA Assays kein limitierender Faktor, da die Bestimmung an Kleinstmengen erfolgen kann. Für vergleichbare Analysen mittels konventioneller PCR oder qPCR sind im Gegensatz größere Mengen an Ausgangsmaterial nötig.