Originalie
Die Bedeutung kreuzreagierender Antikörper für die Serodiagnostik der Lyme-Borreliose
und der Syphilis
The significance of cross-reacting antibodies for serodiagnosis of Lyme disease and syphilis
Isolde Alfen, HJ. Wellensiek
Institut für Medizinische Mikrobiologie der Justus-Liebig-Universität Giessen
Zusammenfassung:
Die Serodiagnostik der Lyme-Borreliose und der Syphilis wird erschwert durch kreuz- reagierende Antikörper gegen Partialantigene, die der Familie der Spirochaetaceae gemeinsam sind. In Syphilitikerseren treten häufig kreuzreagierende Antikörper gegen Partialantigene von Borrelia burgdorferi mit folgenden Molekulargewichten auf: 80-, 66-, 41-, 39- und 12 KD. Es gibt aber keine Kreuzreaktionen mit Borrelia burgdorferi spezifischen Antigenbanden. Seren von Lyme Borreliose Patienten erkennen nicht die charakteristischen Treponema pallidum Antigenbanden, wohl aberTreponema pallidum Antigene bei 80-, 66-, 60-, 41- und 39 KD. Die Kreuzreaktionen zwischen Borrelia burgdorferi und Treponema pallidum wurden in der indirekten Immun fluoreszenz und in derSDS (Sodium DodecylSulfat)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit anschließendem Immunoblot (Westernblot) untersucht. Nach Durchführung ver- schiedener serologischer Testsysteme wie Treponema-pallidum-Haemagglutinatl·
onstest (TPHA), Fluoreszenz-Treponema-pallidum-Antikörper-Absorptionstest (FTA- Abs-Test), Borrelien-ELISA undBorrelia-burgdorferi-lmmunfluoreszenztest (Borrelien- IFT) wurden hochtitrige Humanseren von Lyme-Borreliose Patienten sowie von Sy- philitikern, die im heterologen Immunfluoreszenztest Kreuzreaktionen aufwiesen, in der Immunoblot-Technik ausgewertet. Die verschiedenen Seren wurden nativ und nach "erschöpfender"Absorption mit Treponema-phagedenis-Ultrasonikatsowie nach Absorption mit intakten Borrelia burgdorferi Spirochaeten eingesetzt. Mit Hilfe der durchgeführten Absorptionsversuche kann zusammenfassend festgestellt werden, daß die Oberflächenantigene von Borrelia burgdorferi mit dem Molekulargewicht von 80-, 39- und 12 KD als familiengemeinsam, d.h. kreuzreagierende Antigene anzusehen sind. Die Antigene sind wahrscheinlich dafür verantwortlich, daß nichtabsorbierte Syphilitikerseren Kreuzreaktionen im Borrelien-IFT bewirken. Weiterhin ist aus diesen Untersuchungen ersichtlich, daß die Verwendung von Ultrasorbent zur Absorption von kreuzreagierenden Antikörpern unddamitzur Vermeidung falsch positiver Resultate im Borrelien-IFT sinnvoll und notwendig ist. Nur auf dieser Basis kann eine dem FTA-Abs- Test vergleichbare Spezifität auch im Borrelien-IFT erreicht werden.
Seh lüsselwörter:
Lyme-Borreliose - Syphilis - Westernblot - Kreuzreaktion - Absorption Summary:
Serodiagnosis of Lyme borreliosis and syphilis is complicated by antibodies cross- reacting with common antigens of the family of Spirochetaceae. Sera from patients with syphilis often contain cross-reacting antibodies againstpartial antigens of Borrelia burgdorferi with molecular weights of80-, 66-, 41-, 39- and 12 kDa. N o cross-reactivity with Borrelia burgdorferi-specific antigen bands is observed. Sera of Lyme disease patients recognize treponemal antigens with 80-, 66-, 60-, 41- and 39 kDa molecular weight, however do not react with antigen bands characteristic ofTreponema pallidum.
Serological cross-reactions between Borrelia burgdorferi and Treponema pallidum were tested using the indirect IFA (Inimuno-FluorescentAssay) andSDS-PA GE (Sodium Dodecyl Sulphate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) with subsequent immunoblotting (Westernblot). After evaluation by various serological tests such äs TPHA (Treponema pallidum Haemagglutination Assay), the FTA-Abs Test (Fluorescence
12 Lab.med. 18: 12(1994)
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VIII
Originalie
Treponema pallidum Antibody Absorption Test), a Borrelia ELISA (Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay) and a Borrelia IFA (Indirectlmmuno-FluorescentAssay), high- titered sera ofLyme disease patients äs well äs ofpatients with Syphilis, all exhibiting cross-reactivity in a heterologous IFA, were tested before and after quantitative absorption with Treponema phagedenis ultrasonicate (Ultrasorbent), äs well äs with intact borreliae.
The results ofthese absorption experiments suggest, thatsurface antigens of Borrelia burgdorferi with molecular weights of80-, 39- and 12 kDa are common antigens ofthe spirochaetaceae family. These antigens seem to be responsible forthe cross-reactivity observed with non-absorbedsyphilitic sera in the Borrelia IFA. The tests confirmed the usefullness of ultrasorbent for absorbing cross-reacting antibodies. False positive reactions in the Borrelia IFA can be avoided by this procedure. Only by including an absorption Step the specificity ofthe Borrelia IFA in comparable to the established high specificity ofthe FTA-Abs test.
Keywords:
Lyme borreliosis - Syphilis - immunoblot - crossreactions - absorption
Einleitung
Die Lyme-Borreliose und die Syphilis sind bakterielle Infektionskrankheiten, die durch Spirochaeten hervorge- rufen werden. Die Lyme Borreliose, deren ätiologisches Agens Borrelia burgdorferi ist, stellt eine Multisystem- erkrankung dar, die sich vor allem durch dermatologische, rheumatologische, neurologische und kardiale Ma- nifestationen (1, 2, 3) äußert. In Analogie zur Syphilis können auch bei der Lyme Borreliose drei klinische Sta- dien unterschieden werden (4,5). Die Serodiagnostik der Lyme Borreliose und der Syphilis wird durch eine enge phylogenetische Beziehung von B. burgdorferi und Treponema pallidum erschwert. Diese antigenetische Verwandtschaft bedingt das Vorkommen von kreuz- reagierenden Antikörpern gegen Partialantigene, die der Familie der Spirochaetaceae gemeinsam sind (6). Solche
Kreuzreaktionen können zu diagnostischen Irrtümern bei Testsystemen, die komplexe Antigene verwenden, wie z.B. den indirekten Immunfluoreszenztest (IFT) und dem Enzym linked immunosorbent (ELISA) führen (7,8,9,10).
Eine Syphilis als Ursache kreuzreagierender Antikörper läßt sich sicher durch einen syphilis-spezifischen Test, wie den TPHA, ausschließen. Um die notwendige Spezi- fitätzu garantieren, wurde eine Präabsorption von kreuz- reagierenden Antikörpern mit Reiter-Spirochaeten (T.phagedenis) empfohlen (11,12,13). In der vorliegen- den Untersuchung wurden der indirekte IFT und die SDS- PAGE mitanschließender Immunoblottechnikeingesetzt, um Partialantigene, die zu Kreuzreaktionen führen, ge- nauer zu erfassen, bzw. die Antigene zu charakterisieren, die für B. burgdorferi und für T. pallidum spezifisch sind.
Material und Methoden
Abb. 1: IFT, Antikörpernachweis in humanem Serum mit B. b.- Antigen;positive Reaktion bei deutlicher Wiedergabe der helixartigen Morphologie der B.b.-Spirochaeten
Spirochaeten-Kultivierung:
Der eingesetzte B. burgdorferi Stamm B 31 (ATCC 35210) wurde in modifiziertem Kelly-Medium (14) vier Tage bei 33°C kultiviert. Die Borrelien wurden durch Zentrifugation (23500g, 20 min, 4°C) sedimentiert und anschließend bei gleichen Bedingungen dreimal mit PBS (pH 7,3-7,4) ge- waschen. Das letzte Sediment wurde in PBS (0,5 mM MgCI2, 0,15 mM CaCI2) 100-fach zur Ausgangsmenge ankonzentriert und nach erfolgter Proteinbestimmung nach Lowry (15) auf einen Proteingehalt von 1,3 mg/ml eingestellt.
T.pallidum, Stamm Nicols, wurde alle 10-11 Tage in Kaninchenhoden kultiviert. DieTreponemen wurden mit RPMI-1640 Medium (Flowlaboratories) extrahiert und bei 270 g 15 min. zentrifugiert, um Wirtsgewebe und Blutzellen zu sedimentieren. Der weitere Waschvorgang und die Proteingehalt-Einstellung wurden - wie oben beschrieben - durchgeführt.
SDS-PAGE und Immunoblot:
Je 1 ml der gereinigten B. burgdorferi Suspension und der T. pallidum Suspension wurden mit 0,15 ml Proben- Lab.med. 18: 13 (1994) 13
Originelle
puffer (2,5 ml 20 % SDS, 0,375 g Saccharose; 0,5 g DTE;
0 25 ml PMSF 0,1 M) versetzt und kurz aufgekocht. Das Antigen-Probenpuffergemisch wurde mit Brom- phenolblau versetzt und in einer diskontinuierlichen SDS- PAGE (16) mit 15 %igem Trenngel aufgetrennt. Die Auf- trennzeit betrug 18 Stunden bei einer konstanten Strom- stärke von 22 mA. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die Proteinbanden mit Coomasie blue gefärbt oder elektrophoretisch auf PVDF-Transfermembran (Immobilon) transferiert (Transferbedingungen: 0,8 mA/
cm2). Der Immunoblot wurde nach der modifizierten Methode von Bhakdi et al. (17) mit der halbtrockenen Technik nach Kyhse-Anderson durchgeführt (18). Die freien Protein-Bindungskapazitäten wurden mit 10 % PCS in Tris/NaCI Puffer (Inkubationspuffer) abgesättigt.
Die Membran (Länge 20 cm) wurde in 3 mm breite Streifen geschnitten und mit dem zu untersuchenden Serum nativ oder in seinem jeweiligen Absorptions- medium über Nacht in einer Verdünnung von 1:100 mit Inkubationspuffer inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit Tris/NaCI Puffer (pH 7,5) wurden die Streifen mit per- oxidasemarkiertem, polyvalentem Antihumanglobulin vom Kaninchen (DAKO, Denmark) in einer Verdünnung 1:1000 mit Inkubationspuffer 90 min. bei Raumtemp.
inkubiert. Nach drei weiteren Waschschritten wurden die Blotstreifen in einer frisch angesetzten Substratlösung (Lösung 1: 100 mg Carbarzol, 2,5 ml Dimethylformamid und Lösung 2: 0,125 ml H202, 12,5 mM Natriumacetat, 0,45 ml Eisessig, 250 ml Aqua dest.) 15-20 Min. entwik- kelt. Die Färbereaktion wurde durch Wässern der Blot- streifen mit Aqua dest. beendet.
Zur Kontrolle der Laufbedingungen wurden Standard- proteinmarker (LMW Calibration Kit Pharmacia) mit- geführt.
Absorption mit T. phagedenis Ultrasonikat:
Die Seren wurden im Verhältnis 1:5mit einem Ultrasonikat von T. phagedenis Biotyp Reiter (Ultrasorbent Fa. BAG Lieh) - welches 3,0 mg Protein/ml PBS enthält - zwei Stunden bei Raumtemp. inkubiert und anschließend mittels Ultrazentrif ugation (60 min, 50 000 g) sedimentiert.
Die Überstände mit den nichtabsorbierten Antikörpern wurden im Immunoblot eingesetzt.
Absorption mit gereinigten intakten B. burgdorferi Spirochaeten:
Die gewaschenen Borrelien (wie oben beschrieben) wur- den mittels Percoll Dichtegradienten (19) gereinigt. Im Dichtebereich von 1,068 bis 1,070 g/ml zeigten die Borrelien in der Dunkelfeldmikroskopie eine intakte Morphologie und waren aktiv beweglich. Es waren keine Agglutinate oder Bakterienbruchstücke zu sehen. Diese Bakterien wurden mit 3,7 % Formaldehyd in PBS (2 h, 4°C) fixiert, um möglichst zu verhindern, daß die Borrelien lysieren und somit lösliches Antigen in der Suspension vorliegt. Die Seren wurden zwei Stunden mit den morphologisch intakten Borrelien im Verhältnis 1:5 bei Raumtemp. inkubiert. Anschließend wurden die Bakteri- en in einer Mikrozentrifuge bei 11 000 g sedimentiert und die Serumüberstände kamen im Immunoblot zum Ein- satz.
Die Testsysteme: TPHA, FTA-Abs-Test, Borrelien-IFT wurden nach den Angaben des Herstellers (Fa. BAG Lieh) durchgeführt. Zusätzlich wurde der FTA-Abs-Test sowie der Borrelien-IFT - abweichend von der Herstellervor- schrift - ohne den Absorptionsschritt mit Ultrasorbent durchgeführt. Für den B. burgdorferi ELISA kamen die Reagenzien der Fa. Sigma-Diagnostik zum Einsatz.
Seren:
Es wurden ausgewählte, hochtitrige Lyme-Borreliose und gut charakterisierte Syphilitikerseren eingesetzt.
Ergebnisse:
Serologische Reaktivitäten:
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse serologischer Untersu- chungen von Lyme-Borreliose Patientenseren (BB) und Syphilitikerseren (TP) dargestellt.
Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, wurden 10 Seren mit dem Borrelien-IFT vor und nach Absorption mit Ultrasorbent geprüft.
Tabelle 1:
Serodiagnostische Untersuchungen von Lyme Borreliose Patientenseren (BB) und Syphilitiker Seren (TP)
Lues Serol.
TPHAFTA FTAAbs.
B. b. Serol.
B. b.-Elisa B. b. IFT B. b. IFT Abs.
BB1
<1:40 1:640
<1:5
806 E 1:320 1:160
BB2
<1:40 1:320
<1:5
1133E 1:640 1:640
BB3
<1:40 1:160
<1:5
1300 E 1:640 1:320
BB4
<1:40 1:320
<1:5
437 E 1:320 1:320
BB5
<1:40 1:160
<1:5
952 E 1:640 1:640
TP1 1:320 1:160 1:160
/,64E
* 1:40
<1:10
TP2 1:10240
1:1280 1:1280
110E1:640
<1:10
TP3 1:2560
1:640 1:640
11 E 1:320
<1:10 . TP4 1:10240
1:2560 1:1280
1:64060 E
<1:10
TP5 1:1, 3 Mio.
1:5120 1:5120
142 E 1:640
1:10 Angaben der Ergebnisse: Titer bzw. Einheiten (E)
14 Lab.med. 18: 14(1994)
Originalie
Nach der Absorption mit Ultrasorbent zeigten 4 von 5 Luetiker-Seren keine Reaktion mehr im Borrelien-IFT, obwohl sie vorher stark positiv reagiert hatten.
Diese 4 Syphilitiker-Seren wurden mittels verschiedener serologischer Testsystemen zur Erkennung einer Syphi- lis getestet und im TPHA und FTA Abs-Test serologisch als Syphilis bestätigt. Außerdem wurde ein Borrelien- Elisa durchgeführt, der ein negatives Ergebnis zeigte.
Von 5 Seren, die im Borrelien-IFT vor und nach Absorption einen schwach positiven oder positiven Titer zeigten, waren alle 5 Seren auch im Borrelien-Elisa positiv; es waren Seren von Lyme Borreliose Patienten. Auch diese Seren wurden mittels TPHA und FTA-Abs-Test getestet.
Der FTA-Abs-Test vor Absorption zeigte in allen 5 Seren einen deutlichen Titer, jedoch nach Absorption waren alle Titer negativ. Auch der TPHA Test war mit allen 5 Seren negativ.
Ein Serum, welches im Borrelien-IFT nach Absorption mit Ultrasorbent einen schwachen Titer erbrachte, wur- de mittels TPHA, FTA-Abs-Test und Immunoblot als Sy- philis diagnostiziert.
Zwei Seren von den Lyme Borreliose Patienten, verzeich- neten im Borrelien-IFT nach Absorption mit Ultrasorbent einen geringfügigen, zu vernachlässigenden Titerverlust.
Die ermittelten Kreuzreaktion im indirekten IFT müssen durch familiengemeinsame Antigenbanden von T.
pallidum und B. burgdorferi verursacht worden sein.
Charakterisierung der Proteinbanden:
Von B. burgdorferi lassen sich im Immunoblot bis zu 25 Proteinbanden im Molekulargewichtsbereich von 100 KD bis <10 KD darstellen. In Abb. 2 wird auf Bahn 1 das gesamte Proteinmuster von B. burgdorferi - mit Amidoschwarz gefärbt - gezeigt.
Abbildung 3
Abbildung 2
tmnuinoblol von , 1 23
12
Bahn 1 BotstFOttcff Amktosciiwarz Bahn 2 Syphilitiker Serum Bahn 3 Borreliose Pat-Sorum
MlKDi
j Bätorl Lyme-Borrelioss Pal.-Seurn
i Bahn 2 Syphilitiker Serum Bahn 1 Syphilitiker Senw l Bahn 2 lyme-BorreÜGSß PaL-Serum i
Bahn 3 zeigt im Vergleich dazu B. burgdorferi spezifische Antigene, die vom Serum eines Lyme-Borreliose Patien- ten mit Borrelien-Arthritis erkannt werden. Auf Bahn 2 wurde B. burgdorferi Antigen mit einem Syphilitikerserum inkubiert. Das verwendete Syphilitikerserum kreuzrea- gierte in diesem Fall mit Partialantigenen bei 66 KD, 41 KD und 39 KD.
In Abb. 3 werden jeweils auf Bahn 1 charakteristische Antigenbanden von Borrelia burgdorferi undTreponema pallidum im homologen System dargestellt.
Bei dem Lyme-Borreliose-Patientenserum sind Borrelia burgdorferi spezifische Banden im Molekulargewichts- bereich von 100-, 35-, 30-, 21-, 18- und <10 KD zu sehen.
Das verwendete Syphilitikerserum reagiert kreuz mit Antigen-Banden bei 80-, 66-, 41-, 39- und 12 KD. Es gibt aber keine Kreuzreaktionen bei den oben beschriebenen Borrelia burgdorferi beschriebenen Banden. Im homolo- gen System von Treponema pallidum ist die Reaktion eines typischen Syphilitiker-Serums mit charakteristi- schen Banden bei 45-, 35-, 30-, 17- und 14 KD zu sehen.
Das Lyme-Borreliose-Patientenserum erkennt diese cha- rakteristischen Treponema pallidum Antigene nicht, wohl aber Treponema pallidum Antigenbanden bei 80-, 66-, 60-, 41-, 39 KD.
Bei den beiden untersuchten Spirochaeten Spezies Treponema pallidum und Borrelia burgdorferi treten familiengemeinsame Antigene mit einem Molekular- gewicht von 80-, 66-, 41-, 39- und 12 KD auf, die zu Kreuzreaktionen führen und in Testsystemen mit kom- plexen Antigenen, wie der Immunfluoreszenztest, Interpretationsschwierigkeiten bereiten. Diese Kreuz- reaktionen sind Ursache dafür, daß Borrelien im IFT mit
Lab.med. 18:15(1994) 15
Originalie
nichtabsorbierten Syphilitikerseren positiv reagieren und auf der anderen Seite Treponemen im IFT mit nichtab- sorbierten Lyme Borreliose Seren intensiv fluoreszeieren (Tabelle 1), was in beiden Fällen zu Fehldiagnosen führen kann. Es ist erforderlich, diese familienspezifisch kreuz- reagierenden Antikörper aus den Patientenseren zu eli- minieren. Eine wirksame Methode hierfür ist die Absorption der Seren mit einem Treponema phagedehis Antigen-Extrakt, der die familiengemeinsamen Antikör- per eliminiert.
In Abb. 4 sind auf den Bahnen 1,3,5 Borreliose Seren vor und auf den Bahnen 2, 4, 6 nach Absorption mit Ultrasorbent im homologen System zu sehen. Charakte- ristische Banden wurden durch die Absorption kaum beeinflußt. Einige Banden wurden nach Absorption abge- schwächt, z.B. die Banden bei 39-, und 12 KD. Auf den Bahnen 7, 9, 11 sind drei Syphilitikerseren vor und auf den Bahnen 8, 10,12 nach Absorption mit Ultrasorbent im B. burgdorferi Immunoblot zu sehen. Die typischen kreuzreagierenden Banden wurden nach der Absorption sehr viel schwächer oder nicht mehr dargestellt.
Abbildung 4
Abbildung 5
8. », 12 nach Afeifpfeag
Da im Immunfluoreszenztest hauptsächlich Antikörper, die gegen die Borrelienoberfläche gerichtet sind, nach- gewiesen werden, war es wichtig Kenntnisse über die Oberflächen-Antigene von Borrelia burgdorferi zu ge- winnen und diese zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurden die Patientenseren mit intakten Borrelia burg- dorferi Spirochaeten absorbiert, um auf diese Weise Antikörper gegen die Oberflächen-Antigene zu eliminie- ren. Anschließend wurden diese Seren im Westernblot ausgetestet.
Abb. 5 zeigt in Bahn 3 und 4 ein Lyme Borreliose Serum vor und nach Absorption mit intakten B. burgdorferi Spirochaeten. Die nach der Absorption abgeschwächten Partialantigene mit den Molekulargewichten von 100- 80-, 60-, 39-, 30-, 21-, 18-, 12- und <10 KD sind auf der Oberflache von B. burgdorferi lokalisiert. Auch die typi- schen mit einem Syphilitikerserum auftretenden kreuzreagierenden Banden sind nach der Absorption eliminiert (vergl. Bahn 1, Bahn 2)
«*?'-.
Diskussion
Serologische Kreuzreaktionen zwischen B. burgdorferi und T. pallidum sind von* mehreren Experimentatoren beschrieben worden (6,7,9,11,12,13). Dieses Auftreten von Kreuzreaktionen führt zu Interpretationsschwie- rigkeiten in der Differentialdiagnose von Syphilis und Lyme-Borreliose. Da B. burgdorferi gemeinsame Antigen- determinanten mit anderen Spirochaeten aufweist (6), wird von verschiedenen Untersuchern eine Präabsorption der kreuzreagierenden Antikörper mit ReiterTreponemen (T. phagedenis) empfohlen (12, 13, 20, 21, 22). In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Immunfluoreszenz- test humane Antiseren von Syphilitiker und Lyme-Bor- reliose Patienten gegen homologe und heterologe Anti- gene, vor und nach der Absorption mit einem T. phage- denis Ultrasonikat, ausgewertet.
Kreuzreagierende B. burgdorferi Antikörper gegen T. pallidum Antigen wurden mittels der Präabsorption mit Ultrasorbent vollständig eliminiert, ohne daß die homologe Reaktivität vermindert wurde.
Kreuzreaktionen durch T. pallidum Antikörper im Borrelien IFT wurden weitgehend durch die Präabsorption der Seren rrjit Ultrasorbent vermieden. Nur ein Syphilitiker Serum mit einem sehr hohen Titer (>1:5000) im homologen Testsystem (FTA-Abs-Test) reagierte im Bor- relien IFT - nach Absorption - mit einem geringem Titer von 1:10.-Hier liegt die Vermutung nahe, daß die Absorption durch T. phagedenis Antigen nicht vollstän- 16 Lab.med. 18: 16(1994)
Originalie
dig war. Auch nach Präabsorption der Syphilitikerseren wurde keine Reaktivitätsverminderung im homologen System registriert.
Vergleichbar erfolgreiche Absorptionen werden von Wilskeet a/. (13), Luther et Moskophidis (12), Bruckbauer (22) und Hunterei al. (11) beschrieben.
Erfolglose Versuche um kreuzreagierende Antikörper aus Seren von Syphilitiker bzw. Lyme-Borreliose Patien- ten mit Hilfe einer Absorption durch Reiter Treponemen zu entfernen, wie sie u.a. von Craft et al. (10) beschrieben wurden, könnten vielleicht dadurch erklärt werden, daß die kommerziell erhältlichen Absorptionsreagenzien nicht genügend Treponemen Antigen enthielten, um hochti- trige Seren nach der Absorption spezifisch wirken zu
lassen.
Die Behauptung von Blenk(2S) sowie die Beobachtung von Russeletal. (9), daß die IFT-Titer von Lyme Borreliose Patienten nach dem Absorptionsschritt mit Reiter Trepo- nema deutlich abgeschwächt werden, konnten in der vorliegenden Untersuchung nicht bestätigt werden.
Antigene, die gemeinsame Antigendeterminanten von T. pallidum und B. burgdörferi beinhalten und deren induzierte humorale Immunantwort im B. burgdörferi Immunfluoreszenztest zu einer positiven Reaktion füh- ren, sollten mittels SDS-PAGE mit anschließendem Immu- noblot genauer charakterisiert werden.
Die in der SDS-PAGE vorherrschenden Proteinbanden von B. burgdörferi und von T. pallidum stimmten in dieser Arbeit mit anderen Experimenten weitgehend überein (12,23,24,25). Im Immunoblot von B. burgdörferi wurden von homologen, humanen Immunseren bis zu
18 Partialantigene mit einem Molekulargewichtsbereich von 100 KD bis <10 KD erkannt. Dieser Molekular- gewichtsbereich, welcher die Hauptantigene nachweist, ist vergleichbar mit dem vonanderen Forschungsgruppen beschrieben Bereich (6, 23). Diskrepanzen zwischen der vorliegenden Untersuchung und anderen Ergebnissen können möglicherweise durch die Unterschiede in der Gelkonzentration und die Verwendung von verschiede- nen Molekulargewichtsmarker erklärt werden.
Einzig eine breite Antigenbande, mit einem Molekular- gewicht <10 KD7 wurde von den genannten Untersuchern nie beobachtet. Eine Erklärung dafür könnte sein, daß bei anderen Untersuchungen sowohl dem Verdünnungs1
medium für die Immunseren als auch der Waschlösung fürdielmmunoblotstreifen e.in Detergenzwiez.B.Tween 20 zugesetzt worden ist. In eigenen Versuchen ließ sich nachweislich beiZusatz von DetergenzzumVerdünnungs- medium und zur Waschlösung keine Antigenbande im Molekulargewichtsbereich <10 KD delektieren. Eventuell könnten auch noch unterschiedliche Laufbedingungen der SDS-PAGE dazu geführt haben, daß die entsprechen- de Antigenbande weder im Gel noch nach dem Transfer auf den Blotstreifen sichtbar wurde.
In der vorliegenden Arbeit wurden von B. burgdprferi- Immunseren in der Regel 12 Hauptantigene im B.
burgdörferi Immunobloterkannt, von denen fünf Antigene auch mit T. pallidum Immunserum angezeigt wurden.
Dabei handelte es sich um Partialantigene mit den Moleku- largewichten 80-, 66-, 41-, 39- und 12 KD.
Nicht jedes Immunserum delektierte im homologen wie im heterologen System die selben Antigenbanden. Auch die Anzahl der Antigenbanden, die von einem Immun- serum erkannt wurden, war sehr unterschiedlich.
Das nachgewiesene Proteinmuster von B. burgdörferi, welches von homologen Antikörpern erkannt wird, steht im Einklang mit den Untersuchungen von Bingman etal.
(26). Sie wiesen in der Immunoblot-Technik 8 kreuzrea- gierende Antigene, die von mindestens 10% der unter- suchten Syphilitiker-Seren delektiert wurden, nach. Die- se kreuzreagierenden Antigenbanden befanden sich im Molekulargewichtsbereich von 94 KD bis 34 KD. Am häufigsten kreuzreagierende Antigene hatten die Moleku- largewichte 66 KD, 60 KD und 41 KD.
Luther und Moskophidis (12) berichten in ihrer Studie von 3 kreuzreagierenden B. burgdörferi Antigenen, die mittels Kaninchen Immunseren gegen T. pallidum er- kannt wurden. Sie zeigten die Molekulargewichte 75-, 66- und 40 KD.
Durch die Präabsorption der Immunseren mit Reiter Treponemen sollten, wie oben erwähnt, die familien- spezifischen Antikörper absorbiert werden. Danach sicht- bare Antigenbanden kommen somit offenbar durch speziesspezifische Ag-AK-Bindungen zustande.
Die von Wilske (22) beschriebene Proteinbande p 40, welche nicht mit dem Flagellin zu verwechseln ist, wird auch von Antiseren gegen T. pallidum und T. phagedenis erkannt. Sie entspricht möglicherweise der hier ermittel- ten Antigenbande bei 39 KD. Beide Proteinbanden sind wahrscheinlich nicht identisch mit dem 39 KD Borrelia burgdörferi spezifischen Protein, welches von Simpson (27) beschrieben worden ist.
Luther und Moskophidis (12) konnten in ihrer Untersu- chung eine völlige Absorption* der kreuzreagierenden Antikörper durch ein T. phagedenis Ultrasorbens zeigen.
Dieses Ergebnis steht nicht vollkommen im Einklang mit den Absorptionsversuchen mittels Ultrasorbent in der hier vorliegenden Arbeit. Sie verwendeten im Unter- schied zu den vorliegenden Untersuchungen Kaninchen- seren. Die Kaninchen wurden mit abgetöteten Bakterien- preparationen in Freunds Adjuvans immunisiert. Somit bleibt zu berücksichtigen, daß es sich um eine künstliche Immunisierung handelte, deren Ergebnis nicht gleichzu- setzen ist mit einer Immunreaktion des Menschen infolge einer natürlichen Infektion. In unseren Patientenseren könnte ein sehr hoher Antikörpertiter gegen das jewei- lige kongruente Partialantigen vorhanden gewesen sein, so daß der Antigengehalt'des Ultrasonikats nicht zur völligen Absorption der analogen Antikörper ausreichte.
Jedoch ist festzuhalten, daß die Reduktion der Ban- denintensität eine deutliche Antigengemeinschaft mit T. phagedenis beweist.
Partialantigene mit den Molekulargewichten 100-, 60-, 30-, 21-, 18- und <10 KD, die als weitgehend immun- dominante Antigene von B. burgdörferi identifiziert wur- den, werden von T. pallidum Immunseren nichtdetektiert.
Grundsätzlich stimmen die, in der vorliegenden Untersu- chung erhobenen Befunde mit der Beschreibung von
W'//s/teefa/.(28)überein.
Die Darstellung der absorbierten Syphilitiker-Seren im homologen Immunoblot weist daraufhin, daß lediglich Lab.med. 18: 17 (1994) 17
Originalie
im höher molekularen Bereich die Absorption mittels T. phagedenis Antigen eine Auswirkung im Immunoblot zeigen. Der für die Westernblotdiagnostik der Syphilis relevante Molekulargewichtsbereich ist davon nicht be- troffen. Eine Präabsorption von Syphilitikerseren mit T. phagedenis Ultrasonikat ist für die Auswertung von T. pallidum Immunoblots nicht unbedingt erforderlich, wohl aberfürdie übrige serologische Syphilis Diagnostik.
Kreuzreaktionen durch Immunseren von Syphilitiker, die im Immunfluoreszenztestauftreten, müssen hauptsäch- lich durch Antikörper, die gegen Oberflächendeter- minanten von B. burgdorferi gerichtet sind, verursacht werden.
Diese Erkenntnis resultiert aus der Verwendung von ganzen Borrelien als "Antigen" in der Immunfluoreszenz- Technik. Da nach Absorption der kreuzreagierenden Se- ren eine deutlicheTiterabnahme registriert werden kann, liegt die Schlußfolgerung nahe, daß es gemeinsame Antigendeterminanten von B. burgdorferi, T. pallidum undT.phagedenisgeben muß und somit immunologische Kreuzreaktionen vorkommen können.
Weitere Experimente sollten klären, welche Partialanti- gene an der Oberfläche von B. burgdorferi exprimiert werden, die gemeinsame Epitope mit B. burgdorferi und T. pallidum besitzen. Dazu wurden die eingesetzten Immunseren beider Patientengruppen mit morpholo- gisch intakten Borrelien absorbiert. Dieser Absorptions- schritt sollte dazu führen, daß alle vorhandenen, gegen B. burgdorferi Oberflächendeterminanten gerichteten Antikörper, von den Bakterien absorbiert wurden. Da- nach konnte keine Reaktion mit der kongruenten Proteinbande im B. burgdorferi Immunoblot mehr statt- finden.
Wie erwartet, wurden fünf Antigenbanden (100-, 60-,39-, 18 und <10 KD) von B. burgdorferi nach der Absorption der Antiseren von Lyme Borreliose Patienten nicht mehr detektiert. Weitere fünf Banden mit den Molekular- gewichten von 80-, 30-, 21- und 12 KD wurden in ihrer
Intensität abgeschwächt dargestellt. Möglicherweise gibt es Partialantigene, die zu Strukturen unter der äußeren Bakterienmembran gehören, die jedoch bestimmte Antigendeterminanten an der Oberfläche exprimieren.
Proteinbanden, die durch Kreuzreaktionen mit Syphilitiker Seren detektiert wurden, waren nach Absorption der Seren mit intakten Borrelien nahezu alle nicht mehr sichtbar. Nur Banden mit den Molekulargewichten von 80-, 39- und 12 KD sind Oberflächendeterminanten von B.
burgdorferi und weisen gemeinsame Epitope mit T.
pallidum auf. Antigenbanden mit dem Molekulargewicht 100-, 60-, 30-, 21-, 18- und <10 KD sind spezifische Oberflächenepitope von B. burgdorferi, die keine Kreuz- reaktionen mit T. pallidum zeigen.
Die Antigenbanden mit dem Molekulargewicht von 80-, 66-, 41-, 39- und 12 KD werden durch kreuzreagierende Antikörper aus T. pallidum Immunseren detektiert und können durch die Absorption der kreuzreagierenden Seren mit T. phagedenis Antigen in ihrer Intensität deut- lich abgeschwächt werden. Damit entsprechen diese Antigenbanden familienspezifischen, gemeinsamen Antigenen.
Als kreuzreagierende Antikörper, die für falsch positive Ergebnisse im Borrelien Immunfluoreszenztest ver- antwortlich sind, kommen Antikörper in Betracht, die Antigenbanden mit den Molekulargewichten von 80-, 39- und 12 KD delektieren. Aus den vorgelegten Untersu- chungen wird ersichtlich, daß erregerspezifische und familiengemeinsame Epitope auf Partialantigenen mit unterschiedlichen Molekulargewichten liegen. Die Be- fürchtung, daß durch den Absorptionsschritt erreger- spezifische Antikörper eliminiert werden können, ist nicht berechtigt.
Zur Vermeidung falsch positiver Ergebnisse im Borrelien- IFT durch kreuzreagierende Antikörper aus Syphilitiker- seren sollte eine Bewertung des Borrelien-IFT nur nach Absorption der Immunseren mit T. phagedenis Ultra- sonikat erfolgen.
18 Lab.med. 18: 18 (1994)
Originalie
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Anschrift der Verfasser:
Dipl.-Biol. Isolde Alfen Prof. Dr. H.-J. Wellensiek
Institut für Medizinische Mikrobiologie der Justus-Liebig-Universität Frankfurter Straße, 35385 Gießen
Lab.med. 18: 19 (1994) 19
