DEUTSCHES ÄRZTEBLATT
ÜBERSICHTSAUFSATZ
ie Diagnose von Muskelkrank- heiten basiert auf anamnesti- schen Daten sowie klinischen, la- borchemischen und elektromyo- graphischen Befunden. Ein klei- ner Teil der Krankheitsfälle, zum Beispiel die meisten Myotonien und die Myasthenien, können mit Hilfe dieser Kriterien zuverlässig diagnostiziert werden. Häufiger ist aber ergänzend zu diesen Maß- nahmen eine Muskelbiopsie, die ambulant durchgeführt wird, not- wendig, da beispielsweise ver- schiedene, heute behandelbare metabolische Muskelkrankheiten oft ohne eine bioptisch-histologi- sche Untersuchung nicht von pro- gressiven Muskeldystrophien oder spinalen Muskelatrophien ab- grenzbar sind. Auch die soge- nannten „gutartigen kongenitalen Myopathien mit speziellen Struk- turanomalien" sind nur mit Hilfe der Muskelbiopsie diagnostisch exakt zuzuordnen.
Hier wird die moderne Biopsie- technik dargestellt, da gelegent- lich immer noch Muskelbiopsien mit unzureichender Technik, das heißt nur mit Formalin-Fixierung und Paraffin-Einbettung bearbei- tet werden. Dies erlaubt keine zu- verlässige myopathologische Dia- gnose und ist deshalb für den Pa- tienten unzumutbar, da er sich meistens noch einer zweiten Mus- kelbiopsie zu unterziehen hat. In Laboratorien, in denen lichtmi- kroskopische, histochemische und elektronenmikroskopische
Präparationstechniken nicht ver- fügbar sind und Muskelgewebe nicht für biochemische Analyse- techniken präpariert werden kann, sollte nicht biopsiert werden. Die Biopsie muß in einem entspre- chend spezialisierten Labor, von denen es in der Bundesrepublik Deutschland zahlreiche in ver- schiedenen Universitätskliniken und Instituten gibt, durchgeführt werden. Als Alternative mag der Versand des bioptisch entnomme- nen Gewebes an ein geeignetes Muskellabor gelten. Dieser führt nur dann zu befriedigenden Resul- taten, wenn die Technik der Biop- sie, des Gefrierens und Fixierens erlernt werden und die unten an- geführten Kriterien des Versandes garantiert sind.
Auswahl des Muskels, Technik Geeignet für die Biopsie ist ein Muskel mit einer mittelschweren Parese; zu stark paretische oder hochgradig atrophische Muskeln ergeben häufig diagnostisch un- spezifische Befunde. Liegen keine Paresen vor, zum Beispiel im Fall belastungsabhängiger Myalgien, so wählt man einen myalgischen Muskel aus. Nur ausnahmsweise werden klinisch gesunde Muskeln biopsiert, zum Beispiel bei Ver- dacht auf Panarteriitis nodosa oder als Zusatzuntersuchung bei der Identifizierung von Kondukto- rinnen der progressiven Muskel- dystrophie Typ Duchenne.
Die modernen Möglichkeiten der Muskelbiopsie werden weithin nicht genutzt. Artefaktträchtige Biopsiemethoden und eine unzu- reichende Aufarbeitung des Ge- webes verhindern häufig eine um- fassende myopathologische Dia- gnostik. Nachbiopsien sind nicht selten erforderlich. In dem Artikel wird die korrekte Technik der Muskelbiopsie und des Versands beschrieben und auf zeitgemäße Verfahren aufmerksam gemacht.
Zu berücksichtigen ist, daß ein Muskel, der vorher in einem mehr als sechsstündigen Intervall myo- graphiert wurde, für die Biopsie ungeeignet ist, da die relativ dicke Elektromyogramm-Nadel beim Einstich in den Muskel Läsionen verursacht, die Myositis-ähnliche Veränderungen hervorrufen und Anlaß zu einer Fehlbeurteilung sein können.
Für die Routine hat es sich be- währt, die rechtsseitige Muskula- tur zu elektromyographieren und die Biopsie an der linken Seite durchzuführen. Bei proximaler Prozeßlokalisation bieten sich zur Biopsie an: M. deltoideus, M. bi- ceps und triceps brachii, M. qua- driceps femoris; bei distaler Loka- lisation wählt man meistens den M. tibialis anterior, M. ga- strocnemius oder M. extensor car- pi radialis. Es können aber auch andere, oberflächlich gelegene Muskeln meist ohne Schwierig- keiten biopsiert werden.
Das für die Biopsie ausgewählte Areal wird mit einem Lokalanäs- thetikum (zum Beispiel Scandi- kain® 1% ohne Adrenalin) subku- tan infiltriert, wobei darauf zu ach- ten ist, daß das Anästhetikum nicht in den Muskel injiziert wird.
Nach einer etwa 3 bis 4 cm langen Inzision der Haut und stumpfem Freipräparieren der Muskelfaszie wird die Faszie vorsichtig unter Schonung des darunter liegenden Muskels durchtrennt.
Möglichkeiten und Technik der Muskelbiopsie
Walter Schubert und Felix Jerusalem
Aus der Neurologischen Universitätsklinik (Direktor: Professor Dr. med. Felix Jerusalem)
der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
800 (60) Heft 12 vom 19. März 1986 83. Jahrgang Ausgabe A
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Muskelbiopsie
Zuerst erfolgt die Exzision für die Elektronenmikroskopie. Hierzu legt man quer zur Faserrichtung eines 0,3 x 0,3 x 2 cm großen Muskelfaserbündels, das an den Längsseiten stumpf gelockert wurde, durch Umstechen einen Faden, fixiert das Muskelstück durch Ligatur in einem Abstand von 1,2 bis 1,5 cm und bindet das Faserbündel an ein darüber längs- orientiertes 2 cm langes und 2 mm dickes sterilisiertes Holzstäbchen (Abbildung 1). Diese Technik ver- hindert die Kontraktion der Mus- kelfasern und ermöglicht eine prä- zise elektronenmikroskopische Diagnostik an Längs- und Quer- schnitten. Bei der Exzision darf das Stückchen nur an den Fäden gehalten werden, keinesfalls mit der Pinzette, da hierdurch Quetschartefakte entstehen. Man kann die Exzision mit dem Skal- pell oder mit einer scharfen Sche- re vornehmen.
Das Gewebe für die lichtmikro- skopische Untersuchung wird in derselben Weise entnommen. Das Stück sollte 0,5 x 0,5 x 2 cm groß sein. Die Fixierung an ein Holz- stäbchen ist hier nicht nötig. Für die biochemische Untersuchung ist ein drittes, etwa halb so großes Stück ausreichend. Zu empfehlen ist außerdem, ein Stück für die Formalin-Fixierung und Anferti- gung von Längsschnitten zu ent- nehmen. Nach der Entnahme er- folgt zunächst der Verschluß der Faszie und dann der Verschluß der Haut; die Fäden werden nach 10 Tagen entfernt. Für die sehr auf- wendige morphologische Unter- suchung der motorischen End- platten wird unter anderem aus der Interkostalmuskulatur biop- siert. Neben der hier beschriebe- nen Technik der offenen Muskel- biopsie sind unter anderem für Verlaufsuntersuchungen Nadel- biopsien möglich.
Muskelbiopsien können in allen Altersgruppen ambulant durchge- führt werden. Man kann auch bei
Kleinkindern und Säuglingen auf eine Vollnarkose, die für einige Muskelkranke das Risiko einer
malignen Hyperthermie bedeutet, verzichten. Bei vorsichtiger loka- ler Infiltrationsanästhesie wird der kleine Eingriff auch von Kindern gut toleriert. Bei mehr als 3000 Biopsien sahen wir nie ernstere Komplikationen. Leichte schmerz- hafte Sensationen können bei der Exzision des Muskelstückchens entstehen, da der Muskel selbst wegen der Artefaktmöglichkeit nicht anästhesiert werden darf.
Einmal beobachteten wir nach ei- ner Muskelbiopsie durch einen hierin unerfahrenen Arzt ein gro- ßes Oberschenkelhämatom auf- grund einer unvollständigen Blut- stillung.
Abbildung 1:
Exzidiertes Mus- kelstück (etwa 3x3x20 mm) für die elektronen- optische Untersu- chung
Postbioptische Schmerzen und ein Spannungsgefühl im Wundbe- reich können vorkommen; sie dauern meist einige Tage und sind durch leichte Analgetika gut zu beeinflussen. Persistierende Be- hinderungen sind uns nicht be- kannt. In sehr seltenen Fällen ent- wickelt sich ein Keloid.
Gefriertechnik und Fixierung Das für die lichtmikroskopische Untersuchung entnommene Mus- kelstück wird zuerst mit einer Ra- sierklinge senkrecht zum Faser- verlauf in zwei Hälften getrennt.
Das jeweils quergeschnittene En- de wird in 5prozentigem Traga- canth auf ein Korkplättchen ge- klebt, so daß die längsverlaufen- den Muskelfasern senkrecht zum Korkplättchen stehen. Auf diese Weise erhält man später exakte Querschnitte.
Die so orientierten Muskelstück- chen werden dann tiefgefroren.
Hierzu wird ein Dewargefäß mit flüssigem Stickstoff gefüllt, auf dem man ein Becherglas, das etwa 50 cm 3 Isopentan enthält, schwim- men läßt. Wenn sich auf dem Bo- den des Becherglases eine unge- fähr ein Zentimeter dicke Eis- schicht gebildet hat, kann man mit dem Gefriervorgang beginnen:
Das Korkplättchen mit dem aufge- klebten Gewebestück wird mit ei- ner Pinzette in das Isopentan ge- senkt und möglichst nahe an die Eisschicht gebracht. Dabei sollen etwa eineinhalb Minuten lang leicht kreisende Bewegungen aus- geführt werden. Man kann das so gefrorene Gewebe im Eisfach bei
minus 65 bis 80 Grad Celsius dau- erhaft lagern. Auch das Gewebe für die biochemische Untersu- chung wird in dieser Weise tiefge- froren, allerdings ohne Fixierung auf einem Korkplättchen, da hier- aus später ein Muskelhomogenat hergestellt wird. Spezielle bioche- mische Untersuchungen an den Mitochondrien und dem sarko- plasmatischen Retikulum aber er- fordern eine sofortige Bearbei- tung des nichtgefrorenen Gewe- bes.
Für die Elektronenmikroskopie fi- xiert man das etwas kleinere und an ein Holzstäbchen gebundene Stück ohne Teilung 4 Stunden lang in 5prozentigem Glutaralde- hyd bei 4° C. Nach einer Behand- lung in Cacodylat-Puffer wird das Gewebe zerkleinert, nochmals in Puffer gewaschen und in 1prozen- tiger Osmiumsäure nachfixiert.
Die Entwässerung erfolgt in einer aufsteigenden Aceton- oder Alko- holreihe, die Einbettung in Kunst- harz (z. B. Epon®).
Ausgabe A 83. Jahrgang Heft 12 vom 19. März 1986 (61) 801
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Muskelbiopsie
Versand
Einige Ärzte möchten die Biopsie selbst durchführen und das Gewe- be zur Untersuchung an ein spe- zialisiertes Muskellabor schicken.
Dies ist nur möglich, wenn eine optimale Biopsietechnik und ein korrektes Einfrieren beziehungs- weise Fixieren des Gewebes ga- rantiert sind. Geeignet für den Ver- sand des tiefgefrorenen Gewebes sind Isoliergefäße, die flüssigen Stickstoff enthalten. Trockeneis in einem Isolierkarton kann benutzt werden, wenn der Versand nicht länger als 24 Stunden dauert. Das Gewebe für die elektronenopti- sche Untersuchung kann man nach der Fixierung (Glutaralde- hyd) in Cacodylat-Puffer verschik- ken.
Die Erfahrung zeigt leider, daß ei- ne voll befriedigende Beurteilung an zugesandten Biopsien oft nicht möglich ist. Dies liegt zum Teil an einer falschen Biopsietechnik oder unsachgemäßem Einfrieren.
Abbildung 2a bis 2e: Immunzytochemi- sche Reaktionen an gefrorenen Schnit- ten. (a) und (b): Neue Methode der simul- tanen Darstellung von zwei lymphozytä- ren Oberflächenantigenen mittels mono- klonaler Antikörper und verschiedener Fluorochrome (FITC grün, Phycoerythrin rot) in entzündlichen Infiltraten. Die Dop- pelbelichtungen selektiv gefilterter Fluo- reszenzen zeigen grüne, rote und gelbe Lymphozytenmembranen. Gelb entsteht in der Addition der roten und grünen Fluoreszenz und markiert zwei Antigene auf derselben Zellmembran. — (a) Perimy- siales Infiltrat. T8+ (rot), la+ (grün), T8+1a±
(gelt:4: aktivierte T8+-Zelle). — (b) Poly- myositis. Ein T8+-Lymphocyt (1) dringt in eine morphologisch intakte Muskelzelle ein. T4+-Lymphocyt (2) — (c) T8+-Lym- phocyten. Peroxidase-anti-Peroxidase- Methode (PAP, rot-braun). — (d) Interleu- kin-2-Rezepto r tragender Lymphozyt.
Glucose-Oxidase-Methode (blau). — (e) Markscheidenfluoreszenz eines kleinen intramuskulären Nerven (Texas-Red)
Quetschartefakte durch Pinzet- tengriff bei Gewebsentnahme, Gefrierartefakte (zum Beispiel durch zu kurzes Einfrieren) und Berühren des Gewebes mit war- men Gegenständen sind häufige Fehler. Man sollte daher die Biop- sie nur selbst durchführen und auf eine Überweisung in eine Spe- zialeinrichtung verzichten, wenn ausreichende methodische Erfah- rungen und Routine vorhanden sind.
Gewebe-Färbungen
Für die Routinediagnostik werden neun Färbungen beziehungsweise Enzymreaktionen an gefrorenen
Schnitten durchgeführt (Tabelle).
Für spezielle Störungen des Koh- lenhydratstoffwechsels und mito- chondriale Myopathien stehen weitere histochemische Untersu- chungsmethoden zur Verfügung.
Jede Färbung für sich bietet Krite- rien, die in der Gesamtschau eine Klassifizierung in die verschiede- nen Gewebssyndrome erlauben.
Werden aber Befunde erkennbar, die für eine metabolische oder spezielle strukturelle Anomalie sprechen, so kann das färberische Grundprogramm erheblich erwei- tert werden. Bei den Stoffwechsel- anomalien sind dies histochemi- sche Enzymreaktionen, die unter anderem dazu dienen, den zu- grundeliegenden Enzymdefekt di- rekt nachzuweisen: zum Beispiel Phosphorylasemangel, Phospho- fruktokinasemangel, Zytochrom- C-Oxidasemangel, und andere.
Ergänzend hierzu sind bei diesen Fragestellungen und Hinweisen auf andere metabolische Myopa- 802 (62) Heft 12 vom 19. März 1986 83. Jahrgang Ausgabe A
gefärbte Gewebebestandteile Färbungen
Enzymreaktionen Markierung
Tabelle: Wichtige Färbungen und Enzymreaktionen für die myopathologische Routinediagnostik
Hämatoxylin-Eosin und Gomori-Trichrom Oil-red-O
PAS
Muskelfasern, Bindegewebe, Zellkerne
Fett Glykogen
saure Phosphatase NADH-Dehydrogenase myofibrilläre ATPase (pH 9,4; 6,4; 4,3)
lysosomale Aktivität
Mitochondrien, sarkoplasmatisches Retikulum
Fasertypen (I, II und Intermediärtypen)
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Muskelbiopsie
thien immer biochemische Unter- suchungen durchzuführen, da ein quantifizierter Nachweis erforder- lich ist und nicht alle metaboli- schen Störungen histochemisch darstellbar sind (zum Beispiel Car- nitinmangel, Carnitin-palmityl- transferase-Mangel usw.). Die elek- tronenoptische Untersuchung er- möglicht die exakte Klassifizierung struktureller Anomalien und Identi- fizierung von Speichermaterial.
Spezielle immunologische Reak- tionen mit Antiseren, besonders
monoklonalen Antikörpern, haben für die histologische Untersu- chung neuromuskulärer Krank- heiten vorläufig noch rein wissen- schaftliche Bedeutung. Schwer- punkte sind die Differenzierung des muskulären Zytoskeletts, neu- ronaler Antigene intramuskulärer Nerven und die Charakterisierung lymphozytärer Subpopulationen in entzündlichen Infiltraten (Abbil- dung 2). Besonders dieser letzte Anwendungsbereich hat bereits interessante Befunde gezeigt.
Es ist zum Beispiel mit rezeptor- spezifischen monoklonalen Anti- körpern (OKT4: sogenannte Hel- ferzellen; OKT8: sogenannte zyto- toxische oder Suppressor-Zellen;
Leu7: sogenannte Killerzellen und so weiter) möglich, diejeni- gen Lymphozyten zu identifizie-
ren, die morphologisch intakte Muskelzellen direkt attackieren.
Bei der Polymyositis spielen zyto- toxische T-Lymphozyten (OKT8) hier eine dominierende Rolle (Ab- bildung 2b). Fluoreszenzoptische Mehrfachmarkierungen zeigen aber, daß auch diese Gruppe noch sehr heterogen ist, da mehrere Oberflächenantigene auf Lympho- zyten in verschiedenen Kombina- tionen vorkommen. Simultane Mehrfachmarkierungen erlauben somit eine weitere Differenzierung
immunologisch aktiver Lymphozy- ten in entzündlichen Infiltraten und stellen eine wichtige Grundla- ge für weiterführende Untersu- chungen dar.
In absehbarer Zeit werden auch die klonotypischen Antigene (Ti- Moleküle) der zytotoxischen T- Lymphozyten in solchen Infiltraten identifiziert werden können. Ein wesentlicher Schritt zur Aufklä- rung entzündlicher Muskelkrank- heiten, möglicherweise auch zu ei- ner weiteren Behandlungsform (spezifische Lymphozytenantise- ren) wäre hiermit geleistet.
Biopsiebefunde
Die gefärbten und histochemisch präparierten Muskelschnitte wer-
den nach bestimmten morphologi- schen und myopathologischen Kriterien analysiert und abschlie- ßend beurteilt. Im einzelnen sind Faserdurchmesser, interstitielles und endomysiales Bindegewebe, Größe, Zahl und Lagerung der Muskelzellkerne, Gefäße, Nerven und Muskelspindeln sowie die in- trazellulären Strukturen und Orga- nellen zu beurteilen.
Hierbei ist zu achten auf die Faser- kalibervariation, die Relationen der verschiedenen Fasertypen, hy- per- und atrophische Fasern, de- ren Lagerung und Form, Art und Lokalisation entzündlicher Infiltra- te, Gefäßwandnekrosen, degene- rative Faserveränderungen, spe- zielle Strukturanomalien und an- deres.
Entgegen der verbreiteten Erwar- tung und auch gelegentlich geüb- ten Praxis kann in vielen Fällen aus dem myopathologischen Be- fund allein keine spezifische, defi- nitive Diagnose gestellt werden.
Der Myopathologe muß sich oft auf die Diagnosen „neurogenes Gewebssyndrom", „myopathi- sches Gewebssyndrom" oder
„myositisches Gewebssyndrom"
beschränken und es dem klinisch tätigen Arzt überlassen, aus der Summe der bei ihm zusammen- kommenden Informationen und Daten die Diagnose zu stellen.
Auch der sehr erfahrene Myopa- thologe kann gar nicht so selten seinen Befundbericht nur mit der Bemerkung „diagnostisch unspe- zifische myopathologische Verän- derungen" abschließen. Nur sel- ten ist es möglich, allein aufgrund myopathologischer Biopsiebefun- de eine definitive Diagnose zu stel- len (zum Beispiel Nemaline Myo- pathie, zentronukleäre Myopathie, Phosphorylase-Mangel usw.).
Anschrift für die Verfasser:
Dr. med. Walter Schubert Neurologische Universitätsklinik Sigmund-Freud-Straße 25 5300 Bonn-Venusberg 804 (64) Heft 12 vom 19. März 1986 83. Jahrgang Ausgabe A
