Aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover, angefertigt im Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der
Medizinischen Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Funktion der Arginindeiminase bei Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis BCG
in vitro
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Claudia Röhker aus Walsrode
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Achim Gruber
PD Dr. Franz-Christoph Bange
1. Gutachter: Prof. Dr. Achim Gruber
2. Gutachter: Prof. Dr. Stefan Schwarz
Tag der mündlichen Prüfung: 24. November 2003
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis III
Abbildungsverzeichnis VII
Abkürzungsverzeichnis IX
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 2
2.1 Taxonomie und Beschreibung 2
2.2 Tuberkulose bei Tieren 4
2.3 Geschichte der humanen Tuberkulose 7
2.4 Epidemiologie 8
2.5 Pathogenese 10
2.6 Klinisches Bild 12
2.7 Diagnostik 13
2.8 Immungeschehen 14
2.9 Impfung 19
2.10 Therapie 21
2.11 Mykobakterien im mikroaerophilen und anaeroben Milieu 22 2.12 L-Argininkatabolismus bei Bakterien und der Argininedeiminase-Weg bei Pseudomonas aeruginosa 22 2.13 Zielsetzung der Arbeit 25
3 Material und Methoden 26
3.1 Material 26
3.1.1 Plasmide, Cosmide und Cosmid-Bibliotheken 26 3.1.2 Bakterienstämme 27
3.1.3 Primer 28
3.1.4 Nährmedien und Zusätze 28
3.2 Methoden 30
3.2.1 Anzucht von Bakterien 30
3.2.2 Herstellung elektrokompetenter Zellen 30 3.2.3 Transformation in elektrokompetente E. coli 31 3.2.4 Herstellung CaCl2-kompetenter Zellen 31 3.2.5 Transformation in CaCl2-kompetente E. coli 32 3.2.6 Herstellung elektrokompetenter M. bovis BCG und M. tuberculosis 32 3.2.7 Transformation in elektrokompetente M. bovis BCG und M. tuberculosis 33 3.2.8 Präparation von Plasmid-DNA (Plasmid Mini-Prep) 33
3.2.9 Präparation von genomischer DNA 33
3.2.10 Restriktionsspaltung von DNA 34
3.2.11 Agarosegelelektrophorese 35
3.2.12 Aufreinigung von DNA 35
3.2.12.1 Aufreinigung von DNA aus Agarosegel 35 3.2.12.2 Aufreinigung von DNA aus Lösung 36
3.2.13 Verwendung der T4-Polymerase 36
3.2.14 Verwendung des Klenow-Fill-In 36
3.2.15 Dephosphorylierung von Vektor-DNA 37
3.2.16 Bestimmung des DNA-Gehaltes 37
3.2.17 Ligation 37
3.2.18 Glykogenfällung 38
3.2.19 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 39
3.2.20 Site-directed-mutagenesis 40
3.2.21 Erstellung der Konstrukte und Mutanten 41 3.2.22 Ansatz zur Messung des Ammoniakgehaltes 41 3.2.23 Ammoniakmessung (Roche Ammoniak Test) 42 3.2.24 Southern und Colony Blot-Hybridisierung 42
4 Ergebnisse 45
4.1 Etablierung des Ammoniaktest 46
4.2 Erstellung von Deletionsmutanten 56
4.2.1 Erstellung einer Gensonde 56
4.2.2 Colony Blot-Hybridisierung einer Cosmidbibliothek von M. tuberculosis H37Rv zum Auffinden des arcA-Gens 57 4.2.3 Southern Blot-Hybridisierung zur Bestätigung der Cosmide 58
4.2.4 Isolierung des arcA-Gen 62 4.2.5 Deletion mittels Site-directed-mutagenesis 62
4.2.6 Deletion im Arginindeiminase-Gen mittels Klonierung 66 4.2.7 Positive Selektion für das Insert 74 4.2.8 Überprüfung auf homologe Rekombination 76
4.2.9 Entfernung des Wildtypgens mittels „Ausloopen“ 77
4.2.10 Ausplattieren zur Bestätigung der Elimination des Wildtypgens 77
4.2.11 Überprüfung der Mutanten in der Southern Blot-Hybridisierung 78
4.3 Funktionsassay der Mutanten 80
4.4 Komplementatierung der ∆arcA-Mutanten von Mycobacterium tuberculosis 83 5 Diskussion 85
6 Zusammenfassung/Summary 93/ 94 7 Literaturverzeichnis 95
8 Anhang 107
8.1 Geräte 107
8.2 Enzyme 107
8.2.1 Restriktionsenzyme 107
8.2.2 Enzymsysteme 108
8.3 Chemikalien 109
8.4 Puffer, Lösungen und Medien 110
8.5 Verbrauchsgegenstände 111
8.6 Geräte 112
8.7 EDV-Software 113
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
Tabelle 1 Wirksamkeit der BCG-Impfung 20
Abbildung 1 Arginindeiminase-Stoffwechselweg 24 Abbildung 2 Reaktionsgleichung des Roche Ammoniak Test 46 Abbildung 3 Linearität der Ammoniakmessung bei v = 1 ml 47 Abbildung 4 Linearität der Ammoniakmessung bei v = 2 ml 48 Abbildung 5 Linearität der Ammoniakmessung bei v = 0,1 ml 49 Abbildung 6 Ammoniakbildung von M. bovis BCG unter anaeroben Bedingungen mit
verschiedenen Aminosäurezusätzen 51
Abbildung 7 Ammoniakbildung aus ausgewählten Aminosäuren durch M. bovis BCG,
anaerobe Bebrütung 52
Abbildung 8 Ammoniakbildung aus ausgewählten Aminosäuren durch M. bovis BCG,
aerobe Bebrütung 53
Abbildung 9 gemessene Ammoniakbildung der Wildtypen, anaerob 54 Abbildung 10 gemessene Ammoniakbildung der Wildtypen, aerob 55 Abbildung 11 Lage der Sonde im Genbereich und Lage der verwendeten Enzyme 56 Abbildung 12 Agarosegel der PCR-Produkte zur Sondenerstellung 57 Abbildung 13 Colony Blot-Hybridisierungsmembranen 58 Abbildung 14 Southern Blot-Hybridisierung der Cosmide (NotI) 59 Abbildung 15 Lage der Enzymschnittstellen für die Southern Blot-Hybridisierungen 60 Abbildung 16 Southern Blot-Hybridisierung der Colony Blot-positiven Cosmide
(HpaI-/XmnI) 61
Abbildung 17 Southern Blot-Hybridisierung der Cosmide (NotI und SphI) 61 Abbildung 18 Clonemanager-Programm-Darstellung der Site-directed-mutagenesis 64 Abbildung 19 Amplifikate der Site-directed-mutagenesis 65 Abbildung 20 Konstrukterstellung der Suicide-Plasmide 67- 73 Abbildung 21 PCR zur Überprüfung der Rekombination 75
Abbildung 22 Southern Blot-Hybridisierung zur Überprüfung auf homologe
Rekombination (EcoNI) 76
Abbildung 23 Lage der Enzymschnittstellen für die Southern Blot-Hybridisierung zur
Überprüfung der Mutanten 78
Abbildung 24 Southern Blot-Hybridisierung der Mutanten (PvuI) 79 Abbildung 25 Southern Blot-Hybridisierung der Mutanten (EcoRI) 80 Abbildung 26 Ammoniakbildung von Mutanten und Wildtyp, anaerob 81 Abbildung 27 Ammoniakbildung von Mutanten und Wildtyp, aerob 82 Abbildung 28 Plasmid, mit dem die Mutanten komplementiert wurden 83 Abbildung 29 Ammoniakbildung von Wildtypen und komplementierten Mutanten im
Vergleich 84
Abbildung 30 NO-Zyklus 89
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ADI Arginindeiminase
ADS Albumin Dextrose Natriumchlorid AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome (erworbenes Immundefizienz Syndrom)
AS Aminosäure
ATCC American Type Culture Collection (Amerikanische Kulturensammlung) BCG Bacille Calmette Guerin bidest. zweifach destilliert
bp Basenpaar
BSA bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
C Base Cytosin
ca. circa
dest. destilliert
DNA Deoxyribonucleic Acid (Desoxyribonukleinsäure)
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
DOTS Directly Observed Treatments Short Course (Tuberkulosebekämpfungsprogramm der WHO) E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
Fa. Firma
x g Gravitationskonstante
G Base Guanin
G.T. gereinigtes Tuberkulin
h hours (Stunden)
H. Haemophilus
HIV Humanes Immundefizienzvirus i.E. internationale Einheiten
IFN Interferon
IL Interleukin
IWGMT International Working Group on Mycobacterial Taxonomy (internationale Arbeitsgruppe der mykobakteriellen Taxonomie)
kb kilo Basenpaare
L. Lactococcus
LB-Medium Luria-Bertani-Medium
M. Mycobacterium
MHC Major histocompatibility complex
MHH Medizinische Hochschule Hannover
min minutes (Minuten)
MOTT Mycobacteria other than tubercle bacilli (andere Mykobakterien als M. tuberculosis) NAD Nicotinamidadenindinukleotid
NCBI National Center for Biotechnical Information
(nationales Zentrum für biotechnologische Information) NK Natürliche Killerzellen
NO Stickoxid
OD optische Dichte
Ori Origin of Replication
OTC Ornithin-Carbamoyl-Transferase PCR Polymerase Chain Reaction
(Polymerase-Kettenreaktion)
pH negativer, dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
Ps. Pseudomonas
rpm rounds per minute
(Umdrehungen pro Minute)
RT Raumtemperatur
s. siehe
SDS Sodiumdodecylsulfat
sec seconds (Sekunden)
SSC Sodiumchlorid/Sodiumcitrat
ssp. Subspezies
St. Staphylococcus
TAE Trisacetat-EDTA
Taq Thermus aquaticus
tb. tuberculosis
TB Tuberkulose
TBC M. tuberculosis-Komplex
TE Tris-EDTA
TGF Transforming Growth Factor
Tm Schmelztemperatur (melting temperature) TNF Tumor Necrosis Factor
U units
(Einheiten)
USA United States of America
(Vereinigte Staaten von Amerika)
UV ultraviolett
v. Chr. vor Christi Geburt v Volumen
WHO World Health Organisation (Weltgesundheitsorganisation)
z.B. zum Beispiel
ZNS Zentralnervensystem
1 Einleitung
Die Tuberkulose bei Mensch und Tier ist eine der am längsten bekannten Krankheiten und entstand vermutlich, als der Mensch begann, Tiere zu domestizieren (BROSCH et al., 2002).
Seitdem sind viele Anstrengungen unternommen worden, um die Tuberkulose zu tilgen. Noch vor 20 Jahren, nach signifikantem Rückgang der Rindertuberkulose durch entsprechende Maßnahmen in weiten Teilen der Welt, war man zuversichtlich, auch in Bezug auf die Tuberkulose des Menschen ähnliche Erfolge verzeichnen zu können. Ein sukzessiver Rückgang der Fallzahlen, Therapieerfolge durch wirksame Antibiotika und ein Impfstamm ließen darauf hoffen, der Tuberkulose in naher Zukunft nur noch geschichtliche Bedeutung beimessen zu müssen (HAHN et al., 2001).
Diese Hoffnungen wurden in den letzten Jahren zunehmend zerstreut. Die Wirksamkeit des Impfstoffes schwankt zwischen 0-80 %, es treten zunehmend multiresistente Erregerstämme von Mycobacterium tuberculosis auf und die Fallzahlen steigen wieder an. Zur Zeit sterben jährlich ca. 2 Millionen Menschen an Tuberkulose. Diesen hohen Opferzahlen versucht man, durch neue, zusätzliche Bekämpfungsstrategien zu begegnen (BLOOM und FINE, 1994;
WHO, 2002).
Ein Ansatz ist hierbei, durch Gendeletion veränderte Stämme zu erzeugen, deren Virulenz so weit herabgesetzt ist, dass sie als Impfstamm Verwendung finden können.
Ziel dieser Arbeit war, festzustellen, ob Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium bovis BCG über einen bei Pseudomonas aeruginosa vollständig vorhandenen Stoffwechselweg, den sogenannten Arginindeiminase-Weg verfügen. Dieser Stoffwechselweg ermöglicht es dem obligat aeroben Pseudomonas aeruginosa, in vitro unter anaeroben Bedingungen zu wachsen und aus der Aminosäure Arginin in mehreren Schritten Energie zu gewinnen. Eine Vorgehensweise, die auch dem ebenfalls obligat aeroben Mycobacterium tuberculosis im sauerstoffarmen Milieu des Makrophagen von Nutzen sein könnte und dessen Verlust durch Gendeletion eine Attenuierung des Erregers zur Folge haben könnte. Ein derart attenuierter Stamm könnte zur Erstellung eines neuen Impfstammes Verwendung finden.
2 Literaturübersicht
2.1 Taxonomie und Beschreibung
Die Mykobakterien, die einzige Gattung aus der Familie der Mycobacteriaceae (Ordnung Actinomycetales), zeichnen sich gegenüber anderen Bakterien durch ihre Zellwandbeschaffenheit aus. Aufgrund ihres hohen Gehaltes an Wachsen sind sie ungewöhnlich beständig gegenüber Säuren und Basen.
In der Gramfärbung zeigen sich die unbeweglichen, 0,2-0,7 x 1,0-10,0 µm großen, nicht- sporenbildenden, obligat aeroben Stäbchen aufgrund ihrer Zellwandbestandteile schwach positiv und ihre charakteristische Ausprägung entfaltet sich in der Ziehl-Neelsen-Färbung (spezifisch für Säurefestigkeit) und in der Färbung mit Auramin (Fluoreszenz, der Farbstoff wird ebenfalls durch Säure nicht entfernt; HAHN et al., 2001).
Diese beruht auf dem Gehalt von Arabinogalaktan in der Zellwand, an das Mykolsäuren (Lipide) gebunden sind. Etwa 60 % des Zellwandtrockengewichtes bilden die Lipide (Mykolsäuren und Mykoside). Diese bewirken die Hydrophobie und die Säurefestigkeit der Bakterien. Aufgrund der Säurefestigkeit kann gebundener Farbstoff (Karbolfuchsin) selbst mit Salzsäurealkohol nicht aus den Bakterien gelöst werden (PETZOLDT und KIRCHHOFF, 1986).
In der Gattung Mycobacterium wird unterschieden zwischen den klassischen, Mykobakterieninfektionen hervorrufenden Erregern wie M. tuberculosis-Komplex (M. tuberculosis, M. bovis BCG, M. africanum und M. microti) und M. leprae und den
„atypischen“ Mykobakterien (Mycobacteria other than tuberculosis, MOTT), die meist fakultativ pathogen sind und ubiquitär vorkommen (FRY et al., 1986). Des Weiteren wird unterschieden zwischen schnellwachsenden und langsamwachsenden Mykobakterien.
Um zu den langsamwachsenden Mykobakterien gezählt zu werden, muss ein Bakterium säurefest sein. Außerdem muss es Mykolsäuren enthalten (bestehend aus 60-90 Kohlenstoffatomen, die durch Pyrolyse in 22-26 C-Atome gespalten werden können) und einen G/C-Gehalt der DNA von 61-71 mol% aufweisen (LEVY-FREBAULT und PORTAELS, 1992). Für schnellwachsende Mykobakterien sind keine Anforderungen
formuliert. Als langsam wachsend bezeichnet man diejenigen Mykobakterien, die in 21 Tagen ein den schnell wachsenden Mykobakterien nach 3-7 Tagen Inkubation vergleichbares Wachstum aufweisen.
Die „International Working Group on Mycobacterial Taxonomy“ (IWGMT) begründete die Einteilung der Mykobakterien anhand von morphologischen, physiologischen und biochemischen Eigenschaften.
Eine weitere mögliche Einteilung erfolgt anhand der Pigmentation von angezüchteten Kolonien. Nach RUNYON (1959) unterteilt man die langsamwachsenden Mykobakterien nach ihrer Pigmentierung in Kultur in photochrome (Gruppe 1), skotochromogene (Gruppe 2) und pigmentfreie (Gruppe 3) Spezies. Die schnellwachsenden Mykobakterien bilden die Gruppe 4. Hierbei nehmen einige Mykobakterien Zwischenpositionen ein. Eine Sonderstellung nimmt M. leprae ein. M. leprae ist bisher nicht in vitro anzüchtbar.
Heute wird die Einteilung der Mykobakterien anhand der Ergebnisse der vergleichenden Sequenzanalyse vorgenommen (PITULLE et al., 1992; ROGALL et al., 1990). Eine weitere, klinisch oft verwendete Einteilung findet nach Risikogruppen statt (BÖTTGER, 1991):
In der Risikogruppe I befinden sich die apathogenen, saprophytären Mykobakterien, deren
Infektionen nur selten bei immunsupprimierten Patienten Bedeutung erlangen (z.B.
M. gordonae). Die Risikogruppe II bilden die fakultativ pathogenen, opportunistischen Mykobakterien (z.B. M. avium). In die Risikogruppe III werden obligat pathogene Mykobakterien eingeteilt (z.B. M. tuberculosis).
Ethymologisch erhielten die Mykobakterien ihren Namen von den Pilzen (mykes, gr. Pilz) weil M. tuberculosis aufgrund seiner Zellwandbeschaffenheit, die zur Hydrophobie führt, an der Oberfläche flüssiger Nährmedien wächst, was zur Verwechslung mit Schimmelpilzen führt. Diese Bezeichnung wurde für alle Mykobakterien übernommen, auch wenn andere Gattungszugehörige anderes Wachstum in Flüssigkultur zeigen (HAHN et al., 2001).
2.2 Tuberkulose bei Tieren
Mykobakterien gehören als Erreger der Tuberkulose bei Menschen und Tieren, der Paratuberkulose der Tiere und der Lepra des Menschen zu den wichtigsten pathogenen Bakterien.
Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf den Erkrankungen durch M. tuberculosis und M.
bovis, bzw. M. bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), weshalb hier auch nur die in Bezug auf diese Erreger wesentlichen Erkrankungen behandelt sind.
Viele Säugetiere sind für M. tuberculosis und M. bovis empfänglich. Eine Ansteckung vom Tier auf den Menschen (Zooanthroponose) ist jedoch von der Rindertuberkulose abgesehen die Ausnahme. Wesentlich häufiger ist die Ansteckung des Tieres durch den Menschen (Anthropozoonose; ROLLE und MAYR, 2002).
Es wird angenommen, dass sich M. tuberculosis aus M. bovis entwickelt hat, was erklärt, warum M. bovis unter den Säugetieren über ein relativ breites Wirtsspektrum verfügt, während die Empfänglichkeit für M. tuberculosis sehr begrenzt ist (BROSCH et al., 2002).
Beim Rind führt M. bovis zur anzeigepflichtigen Rindertuberkulose. Das klinische Bild ist ähnlich dem der menschlichen Tuberkulose. Die Infektion erfolgt vor allen aerogen, selten oral. Sie kann bei Kälbern auch omphalogen erfolgen. Da die Rindertuberkulose in weiten Teilen der Welt als getilgt gilt, ist als wichtigste Ansteckungsquelle der an M. bovis erkrankte
Mensch zu berücksichtigen. Rinder sind allerdings in geringerem Maße auch für M. tuberculosis und M. africanum empfänglich. Nach der Infektion mit M. bovis kommt es
typischerweise zu einer von der Infektionspforte abhängigen, lokalisierten Ausbildung eines Primärherdes, der mit der nachfolgenden Einbeziehung des entsprechenden Lymphknotens den Primärkomplex bildet (Cornet´sche Verteilung). An dieser Stelle endet der Prozess für gewöhnlich und erzeugt ein lokales Granulom, begleitet von der Ausbildung einer zellulären Immunität, die eine Diagnose mittels Tuberkulintest ermöglicht. In seltenen Fällen kann auch eine Frühgeneralisation auftreten, die in Form einer Miliartuberkulose oder protrahierter Generalisation in Erscheinung tritt. Postprimär ist auch eine chronische Organtuberkulose (Lunge, Niere, Euter) möglich. Bei Anschluss der sich bildenden Kavernen an ein kanalikuläres System bildet sich eine „offene Tuberkulose“ aus. Die häufigste Organmanifestation befindet sich wie beim Menschen in der Lunge. In diesem Fall tritt
progredienter Husten und zunehmender Verfall des Tieres auf. Sowohl Früh- als auch Spätgeneralisation sind durch Fieberschübe und Allgemeinstörungen mit letalem Ausgang gekennzeichnet (ROSENBERGER, 2002; DAHME und WEISS, 1999; ROLLE und MAYR, 2002).
Die Tuberkulose von Schaf und Ziege ähnelt dem Krankheitsbild des Rindes. Es tritt vor allem die Lungentuberkulose in Erscheinung. Als weitere Organmanifestation, hauptsächlich bei Ziegen, wurde die Eutertuberkulose dokumentiert. Als Erreger wurde bei Ziegen in Spanien der bei uns unbekannte Erreger M. tuberculosis spp. caprae isoliert.
Ebenfalls ähnlich ist das Krankheitsbild bei Cerviden. So sind auf Hirschfarmen ähnliche Verhältnisse wie in mit M. bovis infizierten Rinderbeständen vorgefunden worden (DAHME und WEISS, 1999; ROLLE und MAYR, 2002).
Schweine infizieren sich vor allem oral, jedoch hauptsächlich mit M. avium ssp. avium, worauf hier nicht weiter eingegangen werden soll. Infektionsherde befinden sich vor allem im Darm und im Bereich des lymphatischen Rachenringes. Chronische Organtuberkulose ist aufgrund der kurzen Lebensdauer zumindest bei Mastschweinen selten.
Bei Rind, kleinen Wiederkäuern und dem Schwein kann mittels Tuberkulintest auf Tuberkulose untersucht werden. Lediglich bei Hund und Katze ist der Test wenig zuverlässig.
Die Pferde-Tuberkulose hat proliferativen Charakter. Die Infektion mit M. bovis (80-90 %), selten mit M. tuberculosis, erfolgt in der Regel hämatogen, nach enteraler Infektion. Darm, Lunge, Tonsillen, Kehlgangs- und Retropharyngeallymphknoten sind betroffen. In Schlachtstatistiken weisen ca. 1 % der untersuchten Tiere Tuberkulosesymptome auf.
Interessant ist die Tuberkulose des Pferdes hauptsächlich differentialdiagnostisch, da meist die Lunge betroffen ist, was zur Verwechslung mit der Dämpfigkeit (chronisch obstruktive Bronchitis) führen kann (DAHME und WEISS, 1999; ROLLE und MAYR, 2002; DIETZ und HUSKAMP, 1999).
Die Erkrankungen bei Hund und Katze haben sich als abhängig von der Verbreitung der Rindertuberkulose erwiesen. Als Hauptquelle für die früher weitverbreitete Infektion der Katzen mit M. bovis gilt unpasteurisierte Milch von an Eutertuberkulose erkrankten Rindern.
Eine Betrachtung der Sektionsergebnisse von Katzen von 1939-1956, die eine Tuberkulose bei ca. 7 % der sezierten Tiere feststellte (95 % M. bovis) zeigt, wie verbreitet die Rindertuberkulose zu diesem Zeitpunkt noch war. Aus neuerer Zeit liegen keine Daten vor, es
ist jedoch anzunehmen, dass die noch auftretenden Fälle von Tuberkulose bei Katzen auf die Ansteckung durch den Menschen zurückzuführen sind. Katzen sind für M. tuberculosis relativ wenig empfänglich, weniger als Hunde. Sie sind jedoch in der Lage, wenn sie in der Umgebung offen tuberkulöser Menschen gehalten werden, ohne selbst zu erkranken, zu temporären Mykobakterienträgern und -ausscheidern (Speichel, Kot) zu werden (KRAFT und DÜRR, 2003; DAHME und WEISS 1999; ROLLE und MAYR, 2002).
Beim Hund handelt es sich bei der Tuberkulose ausschließlich um eine inverse Zoonose. Die Ansteckung mit M. tuberculosis erfolgt durch das Sputum des Besitzers. Das Krankheitsbild ähnelt dem des Menschen (NIEMAND und SUTER, 2003).
Heimtiere seien hier nur der Vollständigkeit halber erwähnt. Bei ihnen wird Tuberkulose nur selten diagnostiziert. Die Übertragung auf den Menschen wurde bisher nicht beschrieben, es handelt sich auch hier eher um eine Anthropozoonose. Hochempfänglich für M. tuberculosis sind Meerschweinchen, was zu ihrer Nutzung als Versuchstier in der Tuberkuloseforschung führte. Kaninchen sind relativ empfänglich für M. bovis-Infektionen. Extrem selten ist die Übertragung von Tuberkulose auf den Menschen durch Zierfische, Singvögel, Psittaziden und Schildkröten nachgewiesen (GABRISCH und ZWART, 2001).
Wildtiere sind als Erregerreservoir von Bedeutung. Dachse in der Schweiz und in England wurden als Träger von M. bovis identifiziert. Meist sind lediglich die Lymphknoten verändert, selten tritt eine Lungentuberkulose oder gar eine Generalisation auf. Der Tierkontakt mit einer eventuell durchseuchten Population muss jedoch in der Therapieplanung berücksichtigt werden.
Auch Exoten sind für die Verbreitung der Tuberkulose verantwortlich. In Neuseeland wurden kleine Beuteltiere (Fuchskusu-Trichosurus vulpecula) als Wirte von M. bovis ausgemacht (DAHME und WEISS 1999; ROLLE und MAYR, 2002).
Besonders in Zoos sollte die Empfänglichkeit von Affen, Rindern, Antilopen und Katzenartigen für M. bovis und von Affen, Elefanten und Papageien für M. tuberculosis berücksichtigt werden. Eine BCG-Impfung ist erwiesenermaßen erfolgreich bei jungen Affen und Feliden. Bei jedem einzelnen Fall sollte jedoch die Therapie sorgfältig gegen das Risiko einer möglichen Weiterverbreitung der Tuberkulose abgewogen werden (ROLLE und MAYR, 2002).
Die meldepflichtige Tuberkulose des Geflügels beruht auf einer Infektion mit M. avium ssp.
avium und soll hier nicht weiter ausgeführt werden. Die Dokumentation der Infektionen mit M. tuberculosis beschränkt sich auf Einzelfälle, vor allem bei Papageien (GABRISCH und
ZWART, 2001).
Im weiteren Verlauf werden nur die Erscheinungen der Tuberkulose beim Menschen behandelt.
2.3 Geschichte der humanen Tuberkulose
Die Tuberkulose ist eine der am längsten bekannten Krankheitsbilder. Bereits Skelette aus dem Neolithikum (ca. 4000 v. Chr.) und ägyptische Mumien (3700-1000 v. Chr.) lassen charakteristische Veränderungen erkennen, die auf spinale Tuberkulose schließen lassen.
Erstmalig schriftlich erwähnt wird die Tuberkulose in der Rig Veda (verfasst zwischen 2000 und 1500 v. Chr.), dem ersten Buch der Veda, der ältesten, indischen religiösen Literatursammlung (GRANGE, 1998). Auch das Krankheitsbild der Rindertuberkulose ist schon lange bekannt und wird bereits in der Bibel (5. Buch Mose) erwähnt (SELBITZ und BISPING, 1995). Im Laufe der Jahre wurde die Tuberkulose mit vielen Namen bedacht. Im 16. Jahrhundert wurde die „Perlsucht“ des Rindes vorübergehend gar als Form der Syphilis (Franzosenkrankheit) fehlinterpretiert (ROSENBERGER, 2002). Der Begriff der „Phthisis“
(Schwindsucht) wurde von Hippokrates (um 400 v. Chr.) geprägt. Der von Thomas G.
Morton geprägte Ausdruck „Tuberkel“ für die durch die Lungenform der Tuberkulose entstandenen Läsionen (1689) wurde von Johann Lucas Schönlein 1832 zum Krankheitsbegriff „Tuberkulose“ abgeleitet (HAHN et al., 2001). Als „Scrofula“ oder
„Krankheit der Könige“ (da man Königen die Fähigkeit zur Heilung dieser Form durch Handauflegen nachsagte) wurde die tuberkulöse Lymphadenitis bezeichnet. Als „weiße Pest“
verursachte die Tuberkulose im 16./17. Jahrhundert in Europa ein Viertel aller Todesfälle bei Erwachsenen und die Zahl der Todesfälle stieg weiter an. Im 19. Jahrhundert verstarben in Europa ca. 30 % der Erwachsenen an Tuberkulose.
Mythen begannen sich um das rätselhafte Siechtum und um dessen Therapie zu ranken. Die Überzeugung, dass es sich um ein ererbtes, von der körperlichen Beschaffenheit abhängiges Schicksal handele, verbreitete sich. Bizarre Anstrengungen wurden unternommen, um dieses
Schicksal abzuwenden. Die von Buchan (1782) empfohlene Aufnahme von Muttermilch, möglichst direkt aus der Brust, stellt noch eine der am wenigsten abschreckenden Therapieformen dar und ist zumindest eine Weiterentwicklung der von John of Gaddesden (1280-1361) in seiner „Curatio scrofulorum“ empfohlenen Mixtur aus Taubenkot und Wieselblut (GRANGE, 1998).
Im 18. und 19. Jahrhundert verbreitete sich im Nordosten der USA gar das Gerücht, Vampire würden die Menschen schwächen. Angeblich würde ein kürzlich verstorbenes Familienmitglied als Vampir weitere Verwandte „aussaugen“. Die Folge hiervon war, dass Verstorbene exhumiert wurden. Fand man bei ihnen „Blut im Herzen“, so wurde dies als Beweis des Vampirismus angesehen. Das Herz des Verstorbenen wurde daraufhin verbrannt, der Schädel abgetrennt und auf die Brust gelegt und die Beinknochen darunter gekreuzt.
Hiervon versprach man sich die Prävention weiterer Tuberkuloseerkrankungen (SLEDZIK, 1998).
Eine Eindämmung der Tuberkulose war auch nach der Entdeckung der Erregers (Robert Koch, 1882) nicht absehbar. Erst die Entwicklung von Antibiotika (Thiosemikarbazon, 1943, und Isoniazid, 1952, durch Gerhard Domagk und Streptomycin durch Selman A. Waksman, 1946) machte den oft kuriosen Therapieversuchen ein Ende, ermöglichte eine Therapie der Tuberkulose und reduzierte die Fallzahlen in den Industrieländern (ROLLE und MAYR, 2002).
2.4 Epidemiologie
Die Tuberkulose fordert zwei Millionen Todesopfer pro Jahr. Jedes Jahr infiziert sich ein Prozent der Weltbevölkerung mit M. tuberculosis. Etwa ein Drittel der Menschheit ist zur Zeit mit Tuberkulose infiziert. Die Verbreitung von humanem Immundefizienzvirus/ acquired immuno deficiency syndrome (HIV/AIDS; 11 % aller Aidstoten weltweit versterben an Tuberkulose) und die wachsende Anzahl an multiresistenten Stämmen führten 1993 zur Ausrufung des gesundheitlichen Notstandes in Bezug auf die Tuberkulose durch die Weltgesundheitsorganisation (world health organisation, WHO; WHO, 2002).
Trotz der Entwicklung von wirksamen Antibiotika und eines Impfstoffes (M. bovis BCG) und
40 Jahre lang sinkenden Fallzahlen sterben nun jedes Jahr mehr Menschen an Tuberkulose (HAHN et al., 2001).
Ein Problem ist die zunehmende Unwirksamkeit der BCG-Impfung. Ein weiteres Problem stellt die wachsende Zahl multiresistenter Stämme dar (sowohl gegen Isoniazid, als auch gegen Rifampicin resistent), die hauptsächlich auf unsachgemäße Verordnung und unsachgemäße Einnahme der Medikamente zurückzuführen ist. Die WHO versucht, dieser Zunahme multiresistenter Stämme als Folge unsachgemäßer Therapie entgegenzuwirken.
DOTS (directly observed treatments short course) ist ein System der WHO, das mittels geschulter Diagnostik, fachgerechter Dosierung bereitgestellter Medikamente, Kontrolle der Patientencompliance und des Therapieerfolges ermöglichen soll, die Heilungschancen zu erhöhen und die Rate der Neuinfektionen zu senken (WHO, 2002).
Mittels DOTS gelingt es, Heilungsraten von bis zu 95 % selbst in Dritte-Welt-Ländern zu erreichen, was zu einem signifikanten Abfall der Neuerkrankungen führt. Ziel des Programms ist es, 70 % aller Neuinfektionen zu detektieren und 85 % der Detektierten zu heilen. Seit 1991 existiert dieses Programm. Im Jahre 2000 gelang es bereits 10 Ländern, dieses Ziel zu erreichen (WHO, 2002; FRIEDEN, 2002).
In Deutschland wurden im Jahre 2001 7.866 Neuerkrankungen von Tuberkulose gemeldet.
Die Inzidenz liegt somit bei 9,57 pro 100.000 Einwohner. Dies entspricht einem Rückgang gegenüber dem Jahr 2000 (9064 erfasste Fälle) von 13,2 % (RKI, 2003). Trotzdem ist Deutschland weit von einer Vorreiterstellung bei der Tuberkulosebekämpfung entfernt.
Die Erkrankungen durch M. bovis beim Menschen gingen aufgrund des Rindertuberkulose- Eradikationsprogramms und des Pasteurisierens der Milch stark zurück (0,1 % aller Tuberkulosefälle).
1896 initiierte Bernhard Bang in Dänemark ein Eradikationsprogramm, das auf dem Tuberkulintest fußte. Alle testpositiven Tiere wurden ausgemerzt. Soweit dies wirtschaftlich nicht vertretbar war, wurden testpositive Tiere von der Herde abgetrennt und deren Kälber in tuberkulosefreier Umgebung aufgezogen. In Deutschland beschränkte man sich auf das Ostertag´sche Verfahren, nach dem lediglich klinisch und bakteriologisch positive Tiere ausgemerzt wurden. Auf diese Weise wurden 40-50 % der offen tuberkulösen Rinder nicht erkannt. Demzufolge waren noch 1955 (MEYN, 1955) über 30 % aller Rinder und etwa 60 % aller Bestände befallen. Aufgrund der positiven Erfahrungen in den USA und Skandinavien
wurde auch in West-Deutschland 1952 ein freiwilliges Bekämpfungsprogramm gestartet, das auf dem Tuberkulintest beruhte. Das Programm wurde von Regierung und Industrie durch Beihilfen für die Ausmerzung tuberkulöser Rinder und Honorierung von Milch aus anerkannt tuberkulosefreien Betrieben vorangetrieben. 1961 betrug der Anteil anerkannt tuberkulosefreier Betriebe in Deutschland 99,7 %. Der Anteil der Tuberkulintest-positiven Tiere betrug seitdem jährlich ca. 1 %. Von diesen 1 % entfiel nur ein kleiner Anteil (10-20 %) auf Infektionen des bovinen Typs. Der Hauptanteil waren falschpositive Probanden, die mit atypischen Mykobakterien oder mit Paratuberkulose infiziert waren, was eine fragliche oder positive Tuberkulinreaktion verursachen kann (ROSENBERGER, 2002).
2.5 Pathogenese
Eine Infektion des Menschen mit M. tuberculosis hat nicht zwangsläufig eine Erkrankung zur Folge. Nur 5-10 % der infizierten Immunkompetenten erkranken im Laufe ihres Lebens an aktiver Tuberkulose. Bei immunsupprimierten HIV-positiven Patienten liegt die Wahrscheinlichkeit, nach einer Infektion mit M. tuberculosis an Tuberkulose zu erkranken, bei ca. 50 %.
Es wird zwischen der Primärtuberkulose und der Postprimärtuberkulose (Reaktivierungskrankheit) unterschieden.
Bei der Primärtuberkulose werden die erregerhaltigen Aerosoltröpfchen nach der Einatmung von Alveolarmakrophagen phagozytiert. M. tuberculosis ist in der Lage, sich im Makrophagen zu vermehren und dort zu persistieren, bis dieser abstirbt. Beim Zerfall des Makrophagen werden entzündungsfördernde Stoffe freigesetzt, die zur Entstehung von Läsionen, dem sogenannten Primäraffekt (PA) führen. Wenn die Infektion über die Atemwege erfolgte, wandern Tuberkulosebakterien über die ableitenden Lymphbahnen in den Hiluslymphknoten und verursachen dort eine regionale Immunantwort, die zur Anschwellung der Lymhknoten führen. Diese Einheit von Primäraffekt und lokalem Lymphknoten bezeichnet man als Primärkomplex oder Ghonscher Primärkomplex. Zu diesem Zeitpunkt besteht bereits eine Tuberkulinallergie und es wird eine Granulombildung und eine Aktivierung der Makrophagen induziert.
Bei über 90 % der Erkrankungen stagniert der Krankheitsverlauf an dieser Stelle. Der Primäraffekt und der Primärkomplex vernarben und verkalken und eine zelluläre Immunität entsteht. Es besteht kein akuter Krankheitsbestand, obwohl lebenslang Keime in diesem Herd enthalten sein können.
In Einzelfällen treten progrediente Verläufe der Primärtuberkulose auf:
Bei der progressiven Primärtuberkulose der Lunge kann sich ohne Ausbildung eines Primärkomplexes kurze Zeit nach der Infektion ein primär verkäsender, nekrotischer Prozess entwickeln. Ein solcher Verlauf tritt in Einzelfällen bei Kindern und Jugendlichen auf. Als Ursache wird eine verminderte zelluläre Immunantwort angenommen.
Eine lymphogen-hämatogene Streuung kann bei abwehrschwachen Patienten auftreten.
Befallene Organe weisen miliare Herde auf, die dem Krankheitsbild den Namen primäre Miliartuberkulose verliehen. Diese Herde finden sich oft auch in den Meningen, in der Leber und im Knochenmark. Der progressive, schwere Verlauf dieser Form führt unbehandelt zum Tode.
Wenn das Immunsystem des Infizierten nahezu zusammengebrochen ist, kann sich eine septische Verlaufsform ohne Granulombildung entwickeln. Diese als Landouzy-Sepsis bezeichnete Verlaufsform wird gelegentlich bei AIDS-Patienten beobachtet.
Vorwiegend bei Kleinkindern kann sich eine primäre tuberkulöse Meningitis entwickeln, die an der Schädelbasis lokalisiert ist. Diese wird durch hämatogene Infektion der Meningen verursacht und hat einen charakteristischen, langsamen Verlauf.
Auch bei Erwachsenen ist eine hämatogene Streuung der Erreger möglich. Die Erreger gelangen mit dem Lymphfluss über den Milchbrustgang in die Blutbahn und werden in verschiedenen Organen abgelagert (Primäre Streuherdbildung). Besonders betroffen sind hierbei das Nierenparenchym, die Knochenepiphysen, Milz und apikale Lungenabschnitte.
Die sich hierbei bildenden Herde (besonders die Simonschen Spitzenherde in der Lunge) können als Ausgangspunkt eines Postprimärstadiums fungieren.
Die Reaktivierungskrankheit (Postprimärtuberkulose) tritt dann auf, wenn nach Ausbildung eines Primärkomplexes eine Schwächung des Immunsystems auftritt. Die verantwortlichen Faktoren für eine Schwächungen des Immunsystems sind vielseitig. Nicht nur eine HIV- Infektion, Krankheit oder schlechte körperliche Verfassung, z.B. durch Unterernährung sind in Erwägung zu ziehen, auch Diabetes mellitus, eine Superinfektion oder der Eintritt der
Pubertät können eine Postprimärtuberkulose verursachen.
Diese Postprimärtuberkulose zeichnet sich durch eine käsige Nekrotisierung der Granulome aus. Verflüssigt sich der Inhalt des Granuloms, nennt man die sich bildende flüssigkeitsgefüllte Höhle „Kaverne“. In dieser Kaverne vermehren sich die Erreger massenhaft. Findet der nekrotisierende Prozess Anschluss an einen Bronchus, werden die Erreger über die Lunge abgehustet. Man bezeichnet dies als „offene Lungentuberkulose“.
Dehnt sich der Prozess auf ein Blutgefäß aus, so werden die Erreger hämatogen gestreut und es entsteht eine Organtuberkulose. Für das Infektionsgeschehen wichtig ist auch der Anschluss einer Kaverne an das kanalikuläre System der Niere. Im Urin können massenhaft Erreger ausgeschieden werden (HAHN et al., 2001; ROLLE und MAYR, 2002).
2.6 Klinisches Bild
Die klinischen Symptome der Tuberkulose sind im primären Stadium zunächst unspezifisch und im weiteren, postprimären Verlauf von den entstehenden Granulomen, der typischen Gewebereaktion bei Infektionen mit M. tuberculosis, geprägt.
Die Lungentuberkulose ist mit 85 % die häufigste klinische Form der Postprimärtuberkulose.
Ihre klinischen Erscheinungen sind zunächst unspezifisch. Chronisches Fieber, Gewichtsverlust, Nachtschweiß, Husten, eventuell mit blutigem Auswurf (wenn eine Kaverne Anschluss an ein Blutgefäß gefunden hat) weisen auf eine Lungentuberkulose hin.
Nierentuberkulose wird meist erst durch Hämaturie bemerkt, wenn auch hier eine Kaverne Anschluss an das kanalikuläre System der Niere erlangt.
Die Infektion des Zentralnervensystems (ZNS) kann zu einer subakuten basalen Meningitis oder einem Granulom im Gehirn führen und entsprechende neurologische Symptome hervorrufen.
Bei einer Tuberkulose der Nebennierenrinde versagt die Hormonproduktion der Kortikosteroide und führt zum klinischen Bild des Morbus Addison.
Außerdem gibt es Haut-, Augen-, Hirn-, Miliar- und Darmtuberkulose mit entsprechenden Symptomen und die oftmals Sterilität hinterlassende Tuberkulose des weiblichen Genitale (HAHN et al., 2001; McKINNEY, 1998).
2.7 Diagnostik
Robert Koch bemühte sich, einen Impfstoff durch Abtötung des Erregers zu entwickeln. Zu diesem Zweck filterte er den abgekochten, proteinhaltigen Überstand von Flüssigkulturen.
Aus diesem sogenannten „Alttuberkulin“ wurden durch Fällung mit Ammoniumsulfat Proteine erhalten, die als „gereinigtes Tuberkulin“ (G.T.) bezeichnet werden.
Wird dieses G.T. in die menschliche Haut verbracht, so verursacht es bei Patienten, die bereits einen Ghonschen Primärkomplex entwickelt haben (6-14 Wochen post infectionem), nach 24-72 Stunden eine allergische Reaktion vom Typ IV (verzögerter Typ), die sich in einer Rötung und Schwellung an der G.T.-exponierten Stelle äußert. Dieser Tuberkulintest wird auf mehrere Arten durchgeführt.
Der Moro-Test bei Säuglingen und Kleinkindern wird mit tuberkulinhaltiger Salbe ausgeführt.
Der bei Reihenuntersuchungen bei Erwachsenen durchgeführte Tine-Test appliziert mittels eines Nadelstempels mit vier Spitzen G.T. intrakutan.
Der Mendel-Mantoux-Test verbringt ebenfalls G.T. intrakutan, allerdings festgelegt als 10 i.E. G.T. (10 internationale Einheiten gereinigten Tuberkulins). Dieser Test wird angewendet, wenn eine M. tuberculosis-Infektion mit Sicherheit ausgeschlossen werden muss. Bei negativem Ausfall wird der Mendel-Mantoux-Test mit 100 i.E. G.T. wiederholt.
Hierbei ist keine Unterscheidung zwischen einer Tuberkulinallergie aufgrund einer M. tuberculosis-Infektion und einer erworbenen Immunität durch eine BCG-Impfung möglich. Der beweisende Nachweis im Labor erfolgt noch immer durch Erregeranzüchtung, vorausgesetzt, das Patientenmaterial wurde gekühlt versandt, so dass die Begleitflora eine Anzüchtung der ohnehin schwer kultivierbaren (große Erregermenge nötig), da zum Teil langsamwachsenden Mykobakterien, nicht erschwert.
Zunächst wird jedoch ein Präparat des eingesandten Materials (z.B. Sputum) nach Ziehl- Neelsen (nach Erhitzen Färbung) oder mit Auramin (ohne Erhitzen) gefärbt. Beide Färbungen identifizieren säurefeste Bakterien. Ein positiver Befund ist nicht beweisend für eine Tuberkuloseinfektion, da auch apathogene (MOTT) Mykobakterien säurefest sind. Bei massenhaftem Erregervorkommen, kann eine mikroskopisch sichtbare, zopfartige Anordnung aufgrund des Cordfaktors (Virulenzfaktor) zur Verdachtsdiagnose der M. tuberculosis-
Infektion führen.
Ein negativer Befund ist ebenfalls nicht beweisend, da erst ein relativ hoher Erregergehalt (105 Bakterien pro ml Untersuchungsmaterial) mikroskopisch feststellbar ist.
Bei der Anzucht ist zu beachten, dass nach der Homogenisierung des Probenmaterials die Begleitflora abgetötet werden muss. Die durch Zentrifugation angereicherte Bakteriensuspension wird in speziellen Nährmedien (meist mit Eigelbzusatz) 2-3 Wochen bei 37°C bebrütet, bis ein positiver Befund erhoben werden kann. Wenn nach 6-8 Wochen kein Wachstum aufgetreten ist, gilt die Kultur als negativ. Ein Antibiogramm nimmt weitere 6 Wochen in Anspruch.
Dieses zeitaufwendige, althergebrachte Diagnostikprogramm wird in den letzten Jahren durch Polymerase-Kettenreaktion- (Polymerase chain reaction, PCR)-Amplifikation unterstützt, die eine Diagnose einer Mykobakterieninfektion innerhalb von 2-3 Tagen zumindest ausschließen kann. Im positiven Fall ist es inzwischen möglich, mittels Lightcycler-PCR zum Teil die Mykobakterien zu differenzieren. Beweisend ist in diesem Fall allerdings immer noch der kulturelle Nachweis (LACHNIK et al., 2002).
Wenn eine Tuberkulose diagnostiziert wird, so sind sowohl die Erkrankung als auch der Tod eines Patienten nach §3 des Infektionsschutzgesetzes meldepflichtig (HAHN et al., 2001;
McKINNEY et al., 1998).
2.8 Immungeschehen
Bereits Robert Koch stellte 1882 fest, dass sich M. tuberculosis in Riesenzellen in granulomatösen Läsionen befindet (KOCH, 1882).
Die Granulombildung ist kennzeichnend für das Krankheitsbild der Tuberkulose. Angelockte Makrophagen und vereinzelte T-Lymphozyten bilden einen lockeren Zellverbund, der sich zu einem Granulom verdichtet. In diesem Granulom verschmelzen Makrophagen zu Langhansschen Riesenzellen, bzw. entwickeln sich in der Randzone zu Epitheloidzellen (HAHN et al., 2001).
Die Aktivierung von Makrophagen und die in ihnen ablaufenden Vorgänge sind sehr komplex. Die Adhärenz von Mykobakterien an Makrophagen wird von
Oberflächenmolekülen des Makrophagen vermittelt. Komplementrezeptor CR1 und CR3, Mannoserezeptoren, Lipopolysaccharid-(LPS-) Rezeptor (CD14), Fc-Rezeptoren und der Scavenger-Rezeptor nehmen daran teil. Die Mykobakterien befinden sich nach der Opsonierung in einem Endosomen oder Phagosomen, dessen zunehmende Ansäuerung (bis zu einem pH von 5,0-5,5) physiologischerweise in einer Fusion mit dem Lysosom endet.
Normalerweise werden in dem entstandenen Phagolysosom ingestierte Bakterien durch saure Hydrolasen abgetötet. Mykobakterien sind im Phagosom jedoch in der Lage, die Ansäuerung und damit die Fusion mit dem Lysosom in der Mehrzahl der Fälle zu verhindern. Ein Effekt, der auf das Fehlen der vakuolären Protonenpumpe (STURGILL-KOSZYCKI et al., 1994), sowie auf eine fehlende Ansäuerung mittels Ammoniakakkumulation zurückgeführt wird (GORDON et al., 1980). Auch die Präsentation von Sulfatiden auf der Mykobakterienoberfläche ist in vitro in der Lage, eine Fusion von Phagosom und Lysosom zu verhindern.
Ein weiterer Mechanismus, um den sauren Hydrolasen zu entgehen, ist das Entkommen aus der Vakuole in das Zytoplasma. Ein Mechanismus zur Lysis der Vakuolenmembran wurde postuliert (KING et al., 1993). Ob dieser Mechanismus wirklich genutzt wird, konnte elektronenmikroskopisch nicht geklärt werden (XU et al., 1994), da im beobachteten Fall die Mykobakterien nur in membrangebundenen Vakuolen und nicht frei im Zytoplasma vorlagen.
Ein weiterer Schachzug, dem Immunsystem seines Wirtes zu entgehen, besteht darin, dass M.
tuberculosis die Präsentation seiner Antigene zu verhindern weiß (PANCHOLI et al., 1993).
Die intrazellulären Vorgänge im Makrophagen sind aus vielerlei Gründen interessant. Zum einen, weil in der Vakuole weniger Nährstoffe als im Zytoplasma zum Wachstum zur Verfügung stehen. Es ist nicht bekannt, wieviel Nährstoffe vom Zytoplasma in die Vakuole übergehen können, aber die Attenuierung einer Leucin-auxotrophen Mutante ist ein Hinweis darauf, dass der Nährstoffgehalt in der Vakuole begrenzt ist (BANGE et al., 1996). Wäre der Gehalt an Leucin in der Vakuole dem Zytoplasmaspiegel ähnlich, wäre keine Attenuierung aufgetreten.
Zum Anderen wird dadurch, dass MHC-I gebundene T-Zellen wichtig für die Immunantwort sind, gezeigt, dass Antigenpeptide einen Zugang zum Zytoplasma und endoplamatischen Retikulum erhalten haben müssen. Eine M. tuberculosis-Infektion erhöht die Präsentation von löslichen Antigenen von MHC-I-Molekülen (MAZZACCARO et al., 1996).
Die Immunantwort in murinen Makrophagen ist relativ ausführlich erforscht. Eine antimykobakterielle Funktion ist seit langem bewiesen (PATTERSON und YOUMANS, 1970). Später wurde IFN-γ als Trigger der murinen Makrophagenaktivierung entdeckt (ROOK et al., 1986) und der synergistische Effekt von TNF-α auf IFN-γ im murinen Makrophagen (FLESCH und KAUFMANN, 1990).
TNF-α wird auch für die Granulombildung verantwortlich gemacht (KINDLER et al., 1989).
TNF-α wird von infizierten Makrophagen sezerniert und akkumuliert in tuberkulösen Läsionen (BARNES et al., 1990). Die Freisetzung von TNF-α wird von den Zellwandbestandteilen der Mykobakterien (Muramyldipeptid und LAM) verursacht (MORANO et al., 1989). Die andauernde Sekretion und Akkumulation von TNF-α wird für die Begleiterscheinungen der Tuberkulose wie Fieber, Gewichtsverlust und Nachtschweiß verantwortlich gemacht.
Auch Interleukine (IL) sind an der Makrophagenaktivierung beteiligt. In vitro sind Interleukin 4 (IL-4) und IL-6 in der Lage, Makrophagenaktivität zu stimulieren. In der menschlichen Myelomonocyten-Zellinie THP-1 führte eine Infektion mit M. tuberculosis zu einer Ausschüttung von IL-6 und IL-8 (FRIEDLAND et al., 1993). Von IL-8 wird ebenfalls angenommen, dass seine Fähigkeit, für T-Zellen als chemotaktisches Agens zu wirken, bei der Granulombildung eine Rolle spielt.
Es ist nicht genau bekannt, welche Zytokine im menschlichen Organismus zusätzlich notwendig sind, um Makrophagen zum Abtöten von Mykobakterien zu befähigen. Eine alleinige Stimulation mittels IFN-γ und TNF-α wie bei der Maus reicht zumindest nicht aus.
Auch durch Aktivierung von 1,25-dihydoxyvitamin-D wird lediglich eine Verlangsamung der intrazellulären Erregervermehrung erreicht (ROOK et al., 1986; CROWLE et al., 1987;
CROWLE und ELKINS, 1990; DENIS, 1991).
Die Wirkung von IFN-γ und TNF-α besteht darin, dass sie in der Lage sind, den Makrophagen zur Produktion von Sauerstoffradikalen (ROI) anzuregen. Die Ausschüttung von Wasserstoffperoxid und reaktiven Sauerstoffintermediaten während des „respiratory burst“ nach Aktivierung der Makrophagen durch Überstand von immunologisch stimulierten Lymphozyten (KLEBANOFF, 1980) wurden als Erzeuger des antimykobakteriellen Effekts identifiziert (WALKER und LOWRIE, 1981). Allerdings zeigten CHAN und Kollegen
(1992), dass M. tuberculosis relativ widerstandsfähig gegen Sauerstoffradikale und Wasserstoffperoxid (den sogenannten „respiratory burst“) ist.
Zunehmend wird den Stickstoffintermediaten (RNI) wie NO (Stickoxid) eine Bedeutung beim Mikrobizid der Mykobakterien zugeschrieben. In murinen Makrophagen war es mit IFN-γ und TNF-α möglich, die induzierbare NO-Synthase (iNOS) hochzuregulieren (DENIS, 1991;
FLESCH und KAUFMANN, 1991; CHAN et al., 1992) und somit vermehrt NO zu produzieren, was zur Abtötung von M. tuberculosis in vitro führte.
Die Wechselwirkungen von IFN-γ und TNF-α mit den Interleukinen ist vielfältig. Die Ausschüttung von IFN-γ durch Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) wird z.B. durch die Interleukin-12-(Il-12-) Sekretion von mykobakterieninfizierten Makrophagen verursacht (FLESCH et al., 1995; FULTON et al., 1996). IFN-γ und TNF-α wiederum stimulieren die Sekretion von IL-12 aus infizierten Makrophagen. Die Akkumulation von IL-12- sezernierenden Makrophagen in tuberkulösen Läsionen bei Patienten mit Lungentuberkulose unterstützt diese These (ZHANG et al., 1994; LIN et al., 1996). Die Schutzwirkung von IL-12 wurde bewiesen, indem mit M. tuberculosis infizierten Mäusen IL-12 verabreicht wurde, was zu verlängerter Lebenszeit und Abschwächung der Symptome führte (COOPER et al., 1995;
FLYNN et al., 1995).
Des Weiteren kann das IFN-γ zur Makrophagenaktivierung auch von γδ-T-Zellen stammen, die sich vermehrt in der Lunge befinden und nach Kontakt mit Mykobakterienantigen proliferieren. γδ-T-Zellen produzieren auch TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5 und IL-10, ähnlich den αβ-T-Zellen. Außerdem haben sie eine zytotoxische Aktivität gegenüber Mykobakterien- infizierten Monozyten (TSUKAGUCHI et al., 1995).
Die erworbene Tuberkuloseresistenz wird den T-Lymphozyten zugeschrieben. Diese präsentieren den αβ-T-Zellrezeptor und entweder den CD4- oder CD8-Corezeptor. CD8-T- Zellen erkennen von MHC-I-Molekülen präsentierte Antigene überall im Körper. CD4-T- Zellen erkennen von MHC-II-Molekülen präsentierte Antigene. Diese MHC-II-Moleküle sind nicht ubiquitär im Körper vorhanden, sondern finden sich nur auf spezialisierten, antigenpräsentierenden Zellen wie Makrophagen. CD4- und CD8-Zellen können ebenfalls IFN-γ bilden, um Makrophagen zu aktivieren. Als Zusatz zu IFN-γ sezernieren T-Helferzellen Cytokine. TH1-Zellen bilden IFN-γ und IL-2, TH2-Zellen bilden IL-4.
Bei mit M. tuberculosis infizierten Menschen zeigen γδ-T-Zellen und MHC-II-assoziierte CD4+αβ-T-Zellen zytolytische Fähigkeiten gegenüber Mykobakterienantigen-präsentierenden Makrophagen (KUMARARATNE et al., 1990; BOOM et al., 1991; LORGAT et al., 1992;
TSUKAGUCHI et al., 1995).
Zusätzlich antwortet eine weitere Klasse menschlicher zytotoxischer T-Zellen auf die Präsentation von Mykolsäuren und LAM durch CD1b (PORCELLI et al., 1992). Diese T- Zellen tragen einen αβ-T-Zell-Rezeptor, zeigen aber weder einen CD4-, noch CD8-Rezeptor.
Diese CD1b-abhängigen T-Zellen können M. tuberculosis in vitro abtöten (STENGER et al., 1997).
Von Nutzen ist den Mykobakterien auch Transforming growth factor beta (TGF-β). Infizierte Makrophagen bilden TGF-β, das die MHC-II-Funktion abreguliert (HIRSCH et al., 1994, 1996). Bei Tuberkulosepatienten wurde TGF-β-Produktion in Blutmonozyten, Riesenzellen und Epithelzellen in pulmonären Läsionen nachgewiesen (TOOSSI et al., 1995). TGF-β hat mehrere immunsuppressive Fähigkeiten, die einer Mykobakterieninfektion zugute kommen können. Die T-Zellantwort auf Antigene wird durch TGF-β vermindert, ebenso die Funktionen von zytotoxischen T-Zellen und Natürlichen Killerzellen. Außerdem bremst es die Makrophagenproduktion von Sauerstoffradikalen und NO als Reaktion auf die Ausschüttung von IFN-γ und TNF-α (TSUNAWAKI et al., 1988; DING et al., 1990). Die Mykobakterien nutzen dies zu ihrem Vorteil und in Anwesenheit von TGF-β erhöht sich die Replikationsrate (HIRSCH et al., 1994). Andererseits bewahrt TGF-β den Wirtsorganismus vor weitgreifenden Gewebeschäden durch eine überschießende Immunantwort, was seine Rolle im Immunsystem erklärt.
2.9 Impfung
Bereits Antoine Bernard-Jean Marfan entdeckte 1886, dass Patienten mit überstandener Hauttuberkulose oder überstandener tuberkulöser Adenitis nicht an Lungentuberkulose erkranken (RICH, 1944).
Um 1890 begann auch Robert Koch, sich mit erworbener Immunität zu beschäftigen. Er beobachtete, dass mit Tuberkulose infizierte Meerschweinchen bereits 2-3 Tage nach subkutaner Injektion von M. tuberculosis eine lokale Nekrose ausbildeten, während gesunde Meerschweinchen eine solche Nekrose erst nach 2-3 Wochen entwickelten. Derselbe Effekt konnte mit abgetöteten Tuberkuloseerregern oder zellfreiem Bakterienderivat (Alt- Tuberkulin) erzeugt werden (Koch´sches Phänomen). Es wurden Anstrengungen unternommen, einen Impfstoff aus zellfreien Derivaten von M. tuberculosis herzustellen.
Diese Bemühungen misslangen (HAHN et al., 2001).
Am Institut Pasteur beschäftigten sich Albert Calmette und Camille Guerin mit der Nutzung attenuierter Stämme als Impfstoff. Sie gingen dabei von Louis Pasteurs Beobachtung aus, dass ein virulenter Organismus durch wiederholte Passagierung attenuiert werden kann (GEISON, 1995). 1902 wurde von Edmond Nocard ein virulenter Stamm von Mycobacterium bovis isoliert, den Calmette und Guerin als „souche lait nocard“ von 1908-1919 in 230 Passagierungen attenuierten. Der ihnen zu Ehren M. bovis BCG (Bacillus Calmette Guerin) genannte Stamm wurde in zahlreichen Versuchstieren und schließlich auch an Rindern getestet. Nachdem als erwiesen angesehen werden konnte, dass er in vivo nicht in die virulente Form zurückmutiert, wurde BCG ab 1921 zunächst oral, später subkutan (um einen positiven Tuberkulintest als Impfbestätigung zu erhalten) als Impfstoff angewandt. 1939 wurde die Impfmethode von S. R. Rosenthal modifiziert. Seine Applikationstechnik, die den Impfstoff auf mehrere Injektionsstellen verteilte, reduzierte die bis dato häufig aufgetretene Nekrosenbildung am Injektionsort (HAHN et al., 2001). Zunächst schien BCG ein idealer Impfstoff zu sein. Er ist relativ ungefährlich für den Impfling, günstig herzustellen, kann in jedem Lebensalter verabreicht werden und kann ohne die Notwendigkeit einer Kühlung in die entlegendsten Gebiete verbracht werden. Doch nach heutigen Erkenntnissen variiert die Effizienz (Immunantwort) einer BCG-Impfung zwischen 0-80% (BLOOM und FINE, 1994).
Die Ergebnisse der Studie von BLOOM und FINE sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt.
Ort (Jahr) Ungeimpfte Probanden
Geimpfte Probanden
Tuberkulosefälle bei Ungeimpften
Tuberkulosefälle bei Geimpften
Impfschutz Exposition mit atyp.
Mykobakterien Haiti (1973) 629 2545 15 25 80 % unbekannt
Kanada (1949)
303 306 29 6 80 % gering
Nord- amerikan.
Indianer (1958)
1451 1541 372 108 75 % gering
Chicago (1961)
1665 1716 65 17 75 % gering
Südafrika (1968)
17135 20623 74 48 37 % unbekannt
Puerto Rico (1974)
27338 50634 141 186 31 % hoch
Indien (1973)
5805 5069 56 28 31 % hoch
USA (1969) 2341 2398 3 5 0 % hoch
USA(1976) 17854 16913 32 26 14 % hoch
Indien (1980)
30000 60000 93 192 0 % hoch
Tabelle 1 Wirksamkeit der BCG-Impfung (BLOOM u. FINE, 1994)
Mehrere Gründe wurden hierfür verantwortlich gemacht (Heterogenität des Impfstammes, genetische Unterschiede der Impflinge, etc.). Als Hauptursache wird die Exposition der Impflinge gegenüber atypischen Mykobakterien betrachtet (WILSON et al., 1995). Des Weiteren ist die Impfung nie zu 100 % erfolgreich. Dies ist auch von einem attenuierten Stamm nicht zu erwarten, da selbst eine erworbene Immunität nicht 100 %ig vor einer Reinfektion schützt.
Zur Zeit stellt die BCG-Impfung in Ländern mit hoher Prävalenz immer noch die wichtigste
Methode dar, um einer Ausbreitung der Tuberkulose entgegenzuwirken. Eine Schwierigkeit stellen hierbei HIV-positive Impflinge dar, bei denen eine Impfung kontraindiziert ist und zur Ausbildung einer disseminerten BCGitis führen kann. Ein HIV-Test vor der Impfung ist vor diesem Hintergrund zu empfehlen (WHO, 2002).
In Deutschland wird aufgrund der geringen Inzidenz zur Zeit keine Impfung für Kinder empfohlen (HAHN et al., 2001).
2.10 Therapie
Man unterscheidet zwei Therapieformen: die chirurgische Therapie und die Chemotherapie.
Eine chirurgische Therapie besteht im Entfernen der Tuberkuloseherde im Körper. Sie ist grundsätzlich von einer chemotherapeutischen Maßnahme flankiert.
Die Chemotherapie basiert grundsätzlich auf mehreren Antibiotika, um einer Resistenzbildung vorzubeugen (Kombinationstherapie). In den ersten 2-3 Monaten nach Erkrankung (Initialphase) werden 3-4 Mittel (Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid und Streptomycin und /oder Ethambutol) verabreicht. In der Stabilisierungsphase (ab dem vierten Monat nach Erkrankung) reicht eine Applikation von Isoniazid und Rifampicin, sofern das Antibiogramm, das zu diesem Zeitpunkt vorliegen sollte, nicht dagegen spricht. Der Therapieerfolg wird regelmäßig kontrolliert. Eine „offene Tuberkulose“ gilt als auskuriert, wenn in drei nacheinander gewonnenen Sputumproben mikroskopisch und in Kultur keine Erreger mehr nachgewiesen werden können.
Die Therapie der Tuberkulose muss nicht zwingend stationär erfolgen. Sofern der Patient zuverlässig in Bezug auf die Einnahme der Medikamente ist (Compliance) und keine offene Tuberkulose besteht, kann eine Behandlung außerhalb des Krankenhauses erfolgen (HAHN, et al., 2001).
2.11 Mykobakterien im mikroaerophilen und anaeroben Milieu
Da die Mykobakterien im Wirt in Makrophagen vorliegen, stellt sich die Frage, wie die angeblich obligat aeroben Erreger in diesem mikroaerophilen bis anaeroben Milieu (BARCLAY und WHEELER, 1989) zum Teil über einen sehr langen Zeitraum persistieren und sich sogar vermehren (MANABE und BISHAI, 2000). Um herauszufinden, welcher Mechanismen sich Mykobakterien zur Erlangung der Persistenz im anaeroben Milieu bedienen, lohnt sich ein Vergleich mit Pseudomonas (Ps.) aeruginosa. Ps. aeruginosa kann aus Patientenisolaten mit Cystischer Fibrose isoliert werden (HAHN et al., 2001). Unter den Bedingungen der Cystischen Fibrose (Schleimbildung im Respirationstrakt) ist der Sauerstoffgehalt stark bis völlig reduziert. Da Ps. aeruginosa ebenfalls ein angeblich obligat aerober Keim ist, stellt sich auch hier die Frage, wie es ihm möglich ist, unter diesen Bedingungen zu persistieren. Ein beschriebener Weg hierfür ist der Arginindeiminase-Weg (ADI-Weg).
2.12 L-Argininkatabolismus bei Bakterien und der Arginindeiminase-Weg bei Pseudomonas aeruginosa
Man unterscheidet bei Bakterien diverse Möglichkeiten, Arginin abzubauen:
Die vier wichtigsten sind:
• ADI-Weg: L-Arginin L-Ornithin, Bikarbonat und Ammoniak
• Arginin-Decarboxylase-Weg:
L-Arginin GABA
• Arginin-Succinyltransferase-Weg:
L-Arginin Glutamat und Succinat
• Arginase-Weg: L-Arginin Glutamat
Die Sequenzierung von M. tuberculosis (COLE et al., 1998) zeigte mehrere Homologien zu Enzymen dieser Stoffwechselwege auf: Arginindeiminase (Rv1001), Arginindecarboxylase
(Rv2531c) und Genhomologien zum Arginase-Weg (Rv2321c, Rv2322c und Rv1187).
PETEROY-KELLY und Kollegen (2003) fanden zudem eine Homologie zu dem L-Arginin-
Transporter RocE von Bacillus subtilis in den Genen Rv0522 und Rv2320c von M. tuberculosis und postulierten daraufhin eine wichtige Funktion des L-Arginin im
Mykobakterien-Stoffwechsel.
Der ADI-Weg ist nicht bei allen Bakterien komplett vorhanden. Einige besitzen nur einzelne Gene, anderen fehlt ein Enzym. So fehlt Haemophilus (H.) influenzae, Lactococcus (L.) lactis und Staphylococcus (S.) aureus das arcA-Gen, während Borrelia (B.) afzelii und B.
burgdorferii das arcC und Mesorhizobium (M.) loti gar arcB und arcC fehlen (ZUNIGA et al., 2002).
Beispielhaft angeführt sei hier der vollständig vorhandene ADI-Weg bei Ps. aeruginosa angeführt.
Der ADI-Weg wird vermittelt durch die Enzyme Arginindeiminase (ADI), Ornithin- Carbamoyltransferase (OTCase) und Carbamatkinase (CK). Reguliert wird der ADI-Weg durch arcR. Weitere Regulatoren werden vermutet. Dem arcABC-Cluster assoziiert ist ein Membranprotein (arcD), das die Aufnahme des Substrates Arginin reguliert.
Im Verlauf des ADI-Stoffwechselweges wird L-Arginin über Citrullin zu Ornithin und Carbamoylphosphat, das zur Phosphorylierung von ADP zu ATP genutzt wird, abgebaut.
Hierbei wird aus 1 mol L-Arginin 1 mol ATP generiert (THAUER et al., 1977).
In der nachfolgenden Abbildung 1 ist der Verlauf des ADI-Weges schematisch dargestellt.
Arginin
NH3 ADI
Citrullin
Carbamoylphosphat Pi ADP
OTCase
Carbamatkinase
Ornithin ATP
NH3 + CO2
Abbildung 1 Argininedeiminase-Stoffwechselweg (abgewandelt nach ZUNIGA et al., 2002)
Dieser Stoffwechselweg wird unter mikroaerophilen (MERCENIER et al., 1980) bzw.
anaeroben Bedingungen (GALIMAND et al., 1991) beschritten und ermöglicht bei Ps.
aeruginosa sogar die Differenzierung gegenüber anderen gramnegativen Bakterien (SHERRIS und SHOESMITH, 1959). Die Depletion von Kohlenstoff- und Energiequellen verstärkt die Expression der Gene des ADI-Weges (MERCENIER et al., 1980). Mit Hilfe der Energiegewinnung durch den ADI-Weg ist es dem obligat aeroben Ps. aeruginosa möglich, unter anaeroben Bedingungen zu wachsen (VANDER WAUVEN et al., 1984).
2.13 Zielsetzung der Arbeit
Die Ziele dieser Arbeit gliedern sich in zwei Teile:
Zunächst war es erforderlich, ein geeignetes Nachweissystem für einen Phänotyp zu finden, das es ermöglicht, unter S2- und S3-Bedingungen, festzustellen, ob das als Arginindeiminase annotierte Gen in M. tuberculosis und M. bovis exprimiert wird.
Hierauf sollten Deletionsmutanten im arcA-Gen bei M. tuberculosis H37Rv und Erdmann, sowie in M. bovis BCG erstellt werden.
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Plasmide, Cosmide und Cosmid-Bibliotheken
• pIW2: Cosmid-Bibliothek aus pYUB412::M.tb.H37Rv, erstellt von Isabell Weber, Genomgröße: 4,4 x 106 Basenpaare, ca. 40.000 bp Insertgröße
• pCR1: durch Colony-Blot-Hybridisierung detektiertes arcA-Gen-haltiges Cosmid aus pIW2
• pCR2: durch Colony-Blot-Hybridisierung detektiertes arcA-Gen-haltiges Cosmid aus pIW2
• pCR3: durch Colony-Blot-Hybridisierung detektiertes arcA-Gen-haltiges Cosmid aus pIW2
• pCR4: durch Colony Blot-Hybridisierung detektiertes arcA-Gen-haltiges Cosmid aus pIW2
• pCR5: EcoRV-Fragment aus pCR7 (enthält arcA-Gen) in pMV306kanamycin kloniert
• pCR6: wie pCR5, jedoch andere Ausrichtung
• pCR7: HpaI-/XmnI-Fragment aus pCR4 (enthält arcA-Gen) in pBSK- kloniert
• pCR8: wie pCR7, jedoch andere Ausrichtung
• pCR9: XbaI-/AscI-Fragment aus pCR7 deletiert, um unerwünschte EcoRI-Schnittstelle zu entfernen
• pCR10: EcoRI-Fragment aus pCR9 in pBSK- kloniert, um ein kleineres Konstrukt für die site-directed-mutagenesis herzustellen.
• pCR11: pCR10 nach site-directed-mutagenesis (489 bp mittels PCR deletiert)
• pCR12: EcoRI-Fragment aus pCR11 in pCR9 kloniert, dem das entsprechende Fragment fehlt
• pCR14: NotI-Fragment aus pCR12 in pMP62
• pCR16: pCR10, kleines NsiI-/SphI-Fragment deletiert, großes Fragment religiert
• pCR17: pCR16-EcoRI-Fragment in pCR9 kloniert
• pCR19a: EcoRV-/MluI-Fragment aus pCR17 in pMP62 (Konstrukt mit kleinen Flanken)
• pCR19b: wie pCR19a, jedoch andere Ausrichtung
• pCR20a: BclI-Fragment aus pCR17 in pMP62 (Konstrukt mit großen Flanken)
• pCR20b: wie pCR20a, jedoch andere Ausrichtung
• pCR21a: MluI-BclI-Fragment aus pCR17 in pMP62 (Konstrukt mit einer kleinen und einer großen Flanke)
• pCR21b: wie pCR21a, jedoch andere Ausrichtung
• pBSK-: Klonierungsvektor aus der Stammsammlung der AG Bange
• pMP62: Klonierungsvektor aus der Stammsammlung der AG Bange
• pMV306kan: Klonierungsvektor aus der Stammsammlung der AG Bange
3.1.2 Bakterienstämme
Stamm Quelle
Mycobacterium smegmatis mc² 155 Labor W.R. Jacobs, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York, USA
Mycobacterium bovis BCG Pasteur Impfstamm, Statens Serum Institut, Kopenhagen, Dänemark
Mycobacterium tuberculosis H37Rv ATCC 25618
Mycobacterium tuberculosis Erdmann Labor W.R. Jacobs, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York, USA
Escherichia coli, Stamm Ec²191 Firma Stratagene, LaJolla, California, USA Escherichia coli, Stamm HB101 Firma Promega, Mannheim
Escherichia coli, Stamm DH5α Labor PD Dr. Gunzer, Medizinische Hochschule Hannover
3.1.3 Primer
Alle Primer wurden von MWG Biotech (Ebersberg) synthetisiert.
• Arg1: 5´-TAA GAG TGG TCA TCC TGC-3´ und
Arg2: 5´-ATA CGC AAC CAC AAC GAC-3´ zur Amplifikation eines arcA-Gen-Stücks, um damit eine Sonde für eine Colony Blot- und folgende Southern Blot-Hybridisierungen zu konstruieren.
• ArcA3: 5´-CAC TAC ATC ACA GCA TCG ACA AGC TGC G-3´ und
ArcA4: 5´-CGC AGC TTG TCG ATG CTG TGA TGT AGT G-3´, um mittels Site- directed-mutagenesis ein 720 bp-Fragment aus arcA-Gen in pCR10 zu deletieren.
• ArcASeq1: 5´-CGA GGT CGA CGG TAT CG-3´ und ArcASeq2: 5´-GGC CGC TCT AGA ACT AG-3´ zum Sequenzieren des Produktes aus der
Site-directed-mutagenesis.
• Arg1: s.oben und
ArcA7: 5´-ATC GTC GTC TGC TGC TAC-3´ zur Überprüfung auf Rekombination mittels PCR.
• ArcASeq3: 5´-CCA ATC TCA CAA CAG AC-3´und
ArcA8: 5´-GAT GGT CGA CAC CGA TAC-3´ zur Konstruktion einer Sonde für eine Southern Blot-Hybridisierung zur Prüfung auf homologe Rekombination.
3.1.4 Nährmedien und Zusätze
Weitere, hier nicht genannte Puffer, Lösungen, Nährmedien und Geräte sind im Anhang aufgeführt.
Middlebrook 7H9 Medium
4,7 g Middlebrook 7H9 (Difco, über Becton-Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 0713-01-7) werden in 900 ml destilliertem Wasser gelöst und nach Zugabe von 100 ml ADS, 2,5 ml 20 % Tween 80® und 10 ml 50 % Glycerin sterilfiltriert.
Middlebrook 7H10 Agar
19 g Middlebrook 7H10 Agar (Difco, Best.-Nr. 0627-17-4) werden in 900 ml destilliertem Wasser gelöst und mit einem Rührfisch autoklaviert. Nach Zugabe von 10 ml Glycerin, 100 ml ADS und der gewünschten Antibiotikumkonzentration wird der mit dem Rührfisch gemischte Nährboden a` 25 ml in Petrischalen gegossen.
ADS (Albumin Dextrose Natriumchlorid)
8,1 g NaCl werden mittels Rührfisch in 950 ml destilliertem Wasser gelöst, 22 g D-Glucose- Monohydrat werden zugegeben, komplett gelöst, 50 g Bovine Albumine Fraktion (Boehringer, Best.-Nr. 100021) werden dazugegeben, komplett gelöst und das ADS durch zwei Filtereinsätze für sterile Filtrationseinheiten sterilfiltriert.
MB-Medium
Zu vorgelegten 840 ml destilliertem Wasser werden 100 ml Basic-salt-Lösung (Zusammensetzung siehe unten, Verzicht auf Ammoniumchlorid beachten!) zugegeben, 2 ml Spurenelementlösung (siehe unten), 50 ml ADS (siehe oben), 4 ml 50 %iges Glycerol, 2,5 ml 20 %ige Tween 80, 0,5 ml 1 M MgCl2 und 0,5 ml 1M CaCl2. Die Bestandteile werden mit dem Rührfisch gemischt und sterilfiltriert.
10 x Basic salt für MB-Medium
In 945 ml destilliertem Wasser werden 10 g KH2PO4, 25 g Na2HPO4 und 20 g K2SO4 einzeln zugegeben, mit dem Rührfisch jeweils vollständig gelöst und sterilfiltriert.
Auf die Zugabe von 50 ml NH4Cl wurde verzichtet, da dieses die Ammoniakbestimmung im Versuch verfälscht hätte.
500 x Trace elements für MB-Medium
40 mg ZnCl2, 200 mg FeCl3x6H2O, 10 mg CuCl2 x 4H2O, 10 mg MnCl2 x 4H2O, 10 mg Na2B4O7 x 10H2O, 10 mg (NH4)6Mo7O24 x 4H2O werden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst und sterilfiltriert.
Der NH4-Gehalt ist hierbei so minimal, dass er bei der Ammoniakmessung in den Versuchen vernachlässigt werden kann.
LBB (LB-Bouillon)
20 g Lennox-Broth-Base (LBB; über Becton-Dickinson, Heidelberg, Best.-Nr. 12780-052) werden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst und autoklaviert.
3.2 Methoden
3.2.1 Anzucht von Bakterien
Die Anzucht von Bakterien richtete sich nach dem Erreger, der gewünschten Kulturmenge und dem eventuell erforderlichen Antibiotikumzusatz.
Plasmide in E. coli wurden in LBB-Flüssigmedium angezüchtet. Hierzu wurden 5 µl einer aufgetauten Kultur bzw. eine von einer Platte gepickte Kolonie in 5 ml LBB beimpft und mit dem entsprechenden Antibiotikum über Nacht bei 37 °C im Schüttelinkubator inkubiert.
Entsprechend wurde mit Mykobakterien in 7H9-Medium verfahren, lediglich die Inkubation war entsprechend verlängert und unter S3-Bedingungen konnten die Flüssigkulturen nicht in Reagenzgläsern angezüchtet werden, sondern wurden in ink-square-bottles inkubiert.
Zum Erhalt größerer Flüssigkulturen wurden entsprechende Mengen Medium in Rollerbottles beimpft und bis zur gewünschten OD600 ebenfalls bei 37°C inkubiert.
3.2.2 Herstellung elektrokompetenter Zellen
10 µl E. coli HB 101 wurden über Nacht in 5 ml LBB im Schüttelinkubator bei 37°C bebrütet.
Am nächsten Tag wurden 2-5 ml der Übernachtkultur in 500 ml LBB im 1000-ml-Kolben gegeben. Bei 37°C wurde die Kultur im Schüttelinkubator bebrütet, bis die OD600 0,5 betrug.
Danach wurden die Zellen 15 min auf Eis gestellt und anschließend in einer vorgekühlten Zentrifuge (Biofuge) 20 min bei 3000 x g und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Es schlossen sich zwei Waschschritte mit eiskaltem Aqua dest. an. Die Sedimentation erfolgte jedes Mal bei 3000 x g, 4°C, 20 min. Beim dritten Waschschritt wurde das Pellet in 10 %igem Glycerol aufgenommen (ca. 100 ml), wiederholt abzentrifugiert und
