Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover
Der molekulare Mechanismus der Nitratreduktaseaktivität von Mycobacterium tuberculosis
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärzliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Marion Stermann aus Münster
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand Priv.-Doz. Dr. F.-C. Bange
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand 2. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. I. Greiser-Wilke
Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2003
Teile der hier vorliegen Arbeit wurden in folgenden Publikationsorganen veröffentlicht:
LACHNIK, J., B. ACKERMANN, A. BOHRSSEN, S. MAASS, C. DIEPHAUS, A.
PUNCKEN, M. STERMANN u. F.-C. BANGE (2002):
Rapid-Cycle PCR and Fluorimetry for Detection of Mycobacteria J. Clin. Microbiol. 40 (9): 3364-3373
STERMANN, M., A. BOHRSSEN, C. DIEPHAUS, S. MAASS u. F.-C. BANGE (2003):
Polymorphic Nucleotide within the Promotor of Nitrate Reductase (NarGHJI) Is Specific for Mycobacterium tuberculosis
J. Clin. Microbiol. 41 (7): 3252-3259
BANGE, F.-C., A. BOHRSSEN u. M. STERMANN (2003):
Erkrankungen und Diagnostik von Mykobakterieninfektionen mit Hilfe der LightCycler-Technologie
Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle 10 (3): 1-3
Darüber hinaus wurden Teile der hier vorliegenden Arbeit durch den Diagnostikpreis 2003 der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie ausgezeichnet.
Inhaltverzeichnis
1 EINLEITUNG... 1
2 LITERATURÜBERSICHT... 3
2.1 ALLGEMEINE EIGENSCHAFTEN UND TAXONOMIE DER MYKOBAKTERIEN... 3
2.2 TUBERKULOSE DES MENSCHEN... 6
2.2.1 EPIDEMIOLOGIE UND BEDEUTUNG... 6
2.2.2 ÄTIOLOGIE UND PATHOGENESE... 8
2.2.3 KLINIK... 11
2.2.4 DIAGNOSTIK... 12
2.2.5 THERAPIEMÖGLICHKEITEN... 16
2.2.6 IMPFUNGEN... 17
2.3 TUBERKULOSE BEI TIEREN... 20
2.3.1 EPIDEMIOLOGIE UND BEDEUTUNG... 20
2.3.2 ÄTIOLOGIE UND PATHOGENESE... 21
2.3.3 KLINIK... 22
2.3.4 DIAGNOSE... 22
2.3.5 BEKÄMPFUNG... 23
2.4 NITRATSTOFFWECHSEL BEI MYKOBAKTERIEN... 24
2.5 GENOM VON M. TUBERCULOSIS... 29
2.6 HERSTELLUNG VON MUTANTEN... 32
3 MATERIAL UND METHODEN... 35
3.1 MATERIAL... 35
3.1.1 BAKTERIENSTÄMME, PHAGENSTÄMME UND PLASMIDE... 35
3.1.2 PRIMER... 35
3.1.3 NÄHRMEDIEN... 37
3.1.4 LÖSUNGEN UND PUFFER... 39
3.1.5 SONSTIGE MATERIALIEN... 44
3.2 METHODEN... 44
3.2.1 KULTIVIERUNG VON LANGSAMWACHSENDEN MYKOBAKTERIEN UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN... 44
3.2.2 KONSERVIERUNG UND LAGERUNG VON KULTUREN... 44
3.2.3 ANTIBIOTIKAKONZENTRATIONEN... 45
3.2.4 PRÄPARATION VON NUKLEINSÄUREN... 45
3.2.5 RESTRIKTIONSSPALTUNG... 47
3.2.6 AGAROSEGELELEKTROPHORESE... 47
3.2.7 ISOLIERUNG UND AUFREINIGUNG VON DNA-BANDEN AUS DEM GEL... 48
3.2.8 AUFREINIGUNG VON DNA AUS LÖSUNGEN... 48
3.2.9 T4-POLYMERASE, KLENOWENZYM... 49
3.2.10 DEPHOSPHORYLIERUNG LINEARISIERTER VEKTOR-DNA... 49
3.2.11 LIGATION... 50
3.2.12 GLYCOGENFÄLLUNG... 50
3.2.13 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIENZELLEN... 51
3.2.14 ELEKTROTRANSFORMATION... 52
3.2.15 HOMOLOGE REKOMBINATION BEI LANGSAMWACHSENDEN MYKOBAKTERIEN.... 53
3.2.16 BESTIMMUNG DER KEIMDICHTE... 54
3.2.17 HERSTELLUNG, MARKIERUNG UND QUANTIFIZIERUNG EINER HYBRIDISIERUNGSSONDE... 54
3.2.18 SOUTHERNBLOTANALYSE... 55
3.2.19 HERSTELLUNG VON HYGROMYCINMARKIERTEN DELETIONSMUTANTEN IN MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS MIT HILFE REKOMBINANTER PHAGEN... 56
3.2.20 AMPLIFIKATION MIT EINER KONVENTIONELLEN BLOCK-PCR ... 63
3.2.21 AMPLIFIKATION MIT DEM LIGHTCYCLER... 63
3.2.22 SEQUENZIERUNG... 65
3.2.23 NITRATREDUKTASETEST... 65
4 ERGEBNISSE... 67
4.1 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON NARG-DELETIONSMUTATIONEN IN M. TUBERCULOSIS... 68
4.1.1 HERSTELLUNG VON NARG-DELETIONSMUTATIONEN IN M. TUBERCULOSIS... 68
4.1.2 PHÄNOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER NARG-DELETIONSMUTANTEN... 79
4.2 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON DELETIONSMUTATIONEN IM BEREICH DES NARGHJI-PROMOTORS VON M. TUBERCULOSIS... 89
4.2.1 HERSTELLUNG EINER NARGHJI-PROMOTOR-DELETIONSMUTANTE VON M. TUBERCULOSIS... 89
4.2.2 PHÄNOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER NARGHJI-PROMOTOR- DELETIONSMUTANTE VON M. TUBERCULOSIS... 92
4.3 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINER DELETIONSMUTATION IM RV1165-GEN VON M. TUBERCULOSIS... 95
4.3.1 HERSTELLUNG EINER RV1165-GEN-DELETIONSMUTANTE VON M. TUBERCULOSIS
... 95
4.3.2 PHÄNOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER RV1165-DELETIONSMUTANTE.... 98
4.4 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINER MUTATION MIT EINEM BASENAUSTAUSCH IM PROMOTORBEREICH VON M. TUBERCULOSIS...100
4.4.1 HERSTELLUNG EINER MUTANTE MIT EINEM EINZELNUKLEOTID-POLYMORPHISMUS IM NARGHJI-PROMOTORBEREICH...100
4.4.2 CHARAKTERISIERUNG DES EINZELNUKLEOTIDPOLYMORPHISMUS IM NARGHJI- PROMOTORBEREICH...104
5 DISKUSSION...108
6 ZUSAMMENFASSUNG...117
7 LITERATURVERZEICHNIS...121
8 ANHANG...136
8.1 BAKTERIENSTÄMME...136
8.2 PHAGENSTÄMME...137
8.3 PLASMIDE...137
8.4 KITS...139
8.5 ENZYME...139
8.6 CHEMIKALIEN...140
8.7 GERÄTE...142
8.8 VERBRAUCHSMATERIALIEN...143
8.9 ROHDATEN...144
Abbildungsverzeichnis
ABBILDUNG 1: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DES AUFBAUS DER ANAEROBEN
NITRATREDUKTASE VON E. COLI... 28
ABBILDUNG 2: SEQUENZVERGLEICH DER PROMOTORSEQUENZENZEN NARGHJI VON M. TUBERCULOSIS, M. BOVIS UND M. BOVIS BCG. ... 31
ABBILDUNG 3: M. TUBERCULOSIS-SEQUENZ MIT DEN FLANKEN 1 UND 2 UND PRIMERN (NARGP1, NARGP2, NARGP3 UND NARGP4) ... 69
ABBILDUNG 4: VEKTORKARTE VON PMS13 ... 70
ABBILDUNG 5: VERDÜNNUNGSREIHE VON PHMS15... 71
ABBILDUNG 6: PMS13-SEQUENZ. ... 72
ABBILDUNG 7: AGAROSEGELPHOTO VON DEN PCR-AMPLIFIKATEN ZUR ÜBERPRÜFUNG DER FLANKENAUSRICHTUNG VON PMS13 UND PHMS15 ... 72
ABBILDUNG 8: SEQUENZEN VON M. TUBERCULOSIS NARGHJI UND PMS13. ... 74
ABBILDUNG 9: SOUTHERNBLOT ZUR ÜBERPRÜFUNG DER ∆NARGHYGR-MUTATION VON PMS13, M. TUBERCULOSIS H37RV WILDTYP UND VON DEN MIT DEM MYKOBAKTERIOPHAGEN PHMS15 TRANSDUZIERTEN M. TUBERCULOSIS- KOLONIEN NR. 1 – NR. 14... 74
ABBILDUNG 10: NARGHJI-SEQUENZ MIT EINGEZEICHNETEM NARG-DELETIONSBEREICH UND DEN RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN MSCI UND BSMI... 76
ABBILDUNG 11: VEKTORKARTEN VON PMS9 UND 10... 76
ABBILDUNG 12: AGAROSEGELPHOTO VON PCR-AMPLIFIKATEN ZUR ÜBERPRÜFUNG DER COINTEGRATION VON ∆NARG IN DAS GENOM VON M. TUBERCULOSIS H37RV (NR. 1 – NR. 3) ... 77
ABBILDUNG 13: M. TUBERCULOSIS-SEQUENZ... 78
ABBILDUNG 14: SOUTHERNBLOT. ... 78
ABBILDUNG 15: NITRITPRODUKTION VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS H37RV UND ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS H37RV::NARGHJITB UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN... 80
ABBILDUNG 16: WACHSTUM VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS H37RV UND ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS H37RV::NARGHJITB UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN... 81
ABBILDUNG 17: WACHSTUM VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS
H37RV UND ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS H37RV::NARGHJITB UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN... 82 ABBILDUNG 18: KOLONIENANZAHL / ML VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGHYGRM.
TUBERCULOSIS H37RV UND ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS
H37RV::NARGHJITB UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN... 83 ABBILDUNG 19: NITRITPRODUKTION VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGHYGRM.
TUBERCULOSIS H37RV UND ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS
H37RV::NARGHJITB UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN... 84 ABBILDUNG 20: DIAGNOSTIKTEST ZUM NITRITNACHWEIS VON M. TUBERCULOSIS H37RV,
∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS H37RV UND ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS
H37RV::NARGHJITB. ... 85 ABBILDUNG 21: NITRITPRODUKTION VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGM.
TUBERCULOSIS H37RV UND ∆NARGM. TUBERCULOSIS H37RV::NARGTB
UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN... 86 ABBILDUNG 22: WACHSTUM VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGM. TUBERCULOSIS
H37RV UND ∆NARGM. TUBERCULOSIS H37RV::NARGTBUNTER AEROBEN
BEDINGUNGEN... 87 ABBILDUNG 23: KOLONIENANZAHL VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGM.
TUBERCULOSIS H37RV UND ∆NARG M. TUBERCULOSIS H37RV::NARGHJITB
UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN... 88 ABBILDUNG 24: DIAGNOSTIKTEST ZU NITRITNACHWEIS VON M. TUBERCULOSIS H37RV,
∆NARGM. TUBERCULOSIS H37RV UND ∆NARG M. TUBERCULOSIS
H37RV::NARGHJITB. ... 89 ABBILDUNG 25: NARGHJI-SEQUENZ. EINGEZEICHNET SIND DIE
RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN HPAI UND BGLII UND DER NARGHJI-
PROMOTOR-DELETIONSBEREICH. ... 90 ABBILDUNG 26: SOUTHERNBLOT ZUR KONTROLLE VON ∆PROMNARGHJI IN PMS3, M.
TUBERCULOSIS ERDMAN UND DEN KOLONIEN NR. 1 – 6 ... 91 ABBILDUNG 27: NITRITPRODUKTION VON M. TUBERCULOSIS ERDMAN, ∆PROMNARGHJI M.
TUBERCULOSIS ERDMAN UND ∆PROMNARGHJIM. TUBERCULOSIS
ERDMAN::PROMNARGHJITB UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN... 92
ABBILDUNG 28: WACHSTUM VON M. TUBERCULOSIS ERDMAN, ∆PROMNARGHJI M.
TUBERCULOSIS ERDMAN UND ∆PROMNARGHJIM. TUBERCULOSIS
ERDMAN::PROMNARGHJITB UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN... 93 ABBILDUNG 29: KOLONIEWACHSTUM VON M. TUBERCULOSIS ERDMAN, ∆PROMNARGHJI M.
TUBERCULOSIS ERDMAN UND ∆PROMNARGHJIM. TUBERCULOSIS
ERDMAN::PROMNARGHJITB UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN... 94 ABBILDUNG 30: DIAGNOSTIKTEST ZUM NITRITNACHWEIS VON M. TUBERCULOSIS ERDMAN,
∆PROMNARGHJI M. TUBERCULOSIS ERDMAN UND ∆PROMNARGHJIM.
TUBERCULOSIS ERDMAN::PROMNARGHJITB... 95 ABBILDUNG 31: M. TUBERCULOSIS-SEQUENZ... 96 ABBILDUNG 32: M. TUBERCULOSIS SEQUENZ. ... 97 ABBILDUNG 33: SOUTHERNBLOT ZUR KONTROLLE DER RV1165-DELETION VON M.
TUBERCULOSIS ERDMAN UND DEN KOLONIEN NR. 1 – 10. ... 97 ABBILDUNG 34: NITRITPRODUKTION VON M. TUBERCULOSIS ERDMAN UND ∆RV1165 M.
TUBERCULOSIS ERDMAN UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN... 98 ABBILDUNG 35: WACHSTUM VON M. TUBERCULOSIS ERDMAN UND ∆RV1165 M.
TUBERCULOSIS ERDMAN UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN... 99 ABBILDUNG 36: VEKTORKARTEN VON PMS28 UND PMS29. ...101 ABBILDUNG 37: VEKTORKARTEN VON PMS30 UND PMS31. ...101 ABBILDUNG 38: SOUTHERNBLOT ZUR KONTROLLE DER COINTEGRATION DES
PROMNARGHJIBCG-BEREICHES IN M. TUBERCULOSIS NR. 1. ...102 ABBILDUNG 39: SCHMELZKURVENANALYSE. ...103 ABBILDUNG 40: NITRITPRODUKTION VON M. TUBERCULOSIS ERDMAN UND H37RV UND M.
BOVIS, PROMNARGHJITÆCM. TUBERCULOSIS H37RV UND ERDMAN,
PROMNARGHJIBCGM. TUBERCULOSIS ERDMAN UND PROMNARGHJIBOVM.
TUBERCULOSIS ERDMAN UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN...105 ABBILDUNG 41: WACHSTUM UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN VON M. TUBERCULOSIS
H37RV UND ERDMAN, PROMNARGHJITÆCM. TUBERCULOSIS H37RV UND
ERDMAN UND PROMNARGHJIBCGM. TUBERCULOSIS ERDMAN...106 ABBILDUNG 42: DIAGNOSTIKTEST ZUM NITRITNACHWEIS. GETESTET WURDE M.
TUBERCULOSIS H37RV UND ERDMAN UND PROMNARGHJITÆCM.
TUBERCULOSIS H37RV UND ERDMAN, PROMNARGHJIBCGM. TUBERCULOSIS
ERDMAN UND PROMNARGHJIBOVM. TUBERCULOSIS ERDMAN. ...107
Tabellenverzeichnis
TABELLE 1: NITRITPRODUKTION VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGHYGRM.
TUBERCULOSIS H37RV UND ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS
H37RV::NARGHJITB UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN. ...145 TABELLE 2: WACHSTUM VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS
H37RV UND ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS H37RV::NARGHJITB UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN...145 TABELLE 3: WACHSTUM VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS
H37RV UND ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS H37RV::NARGHJITB UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN. ...145 TABELLE 4: KOLONIENANZAHL VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGHYGRM.
TUBERCULOSIS H37RV UND ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS
H37RV::NARGHJITB UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN. ...146 TABELLE 5: NITRITPRODUKTION VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGHYGRM.
TUBERCULOSIS H37RV UND ∆NARGHYGRM. TUBERCULOSIS
H37RV::NARGHJITB UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN. ...146 TABELLE 6: NITRITPRODUKTION VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGM.
TUBERCULOSIS H37RV UND ∆NARGM. TUBERCULOSIS H37RV::NARGTB
UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN. ...146 TABELLE 7: WACHSTUM VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGM. TUBERCULOSIS
H37RV UND ∆NARGM. TUBERCULOSIS H37RV::NARGTBUNTER AEROBEN
BEDINGUNGEN. ...147 TABELLE 8: KOLONIENANZAHL VON M. TUBERCULOSIS H37RV, ∆NARGM.
TUBERCULOSIS H37RV UND ∆NARG M. TUBERCULOSIS H37RV::NARGHJITB
UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN. ...147 TABELLE 9: NITRITPRODUKTION VON M. TUBERCULOSIS ERDMAN, ∆PROMNARGHJI M.
TUBERCULOSIS ERDMAN UND ∆PROMNARGHJIM. TUBERCULOSIS
ERDMAN::PROMNARGHJITB UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN. ...147 TABELLE 10: WACHSTUM VON M. TUBERCULOSIS ERDMAN, ∆PROMNARGHJI M.
TUBERCULOSIS ERDMAN UND ∆PROMNARGHJIM. TUBERCULOSIS
ERDMAN::PROMNARGHJITB UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN...148
TABELLE 11: KOLONIEWACHSTUM VON M. TUBERCULOSIS ERDMAN, ∆PROMNARGHJI M.
TUBERCULOSIS ERDMAN UND ∆PROMNARGHJIM. TUBERCULOSIS
ERDMAN::PROMNARGHJITB UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN...148 TABELLE 12: WACHSTUM VON M. TUBERCULOSIS ERDMAN UND ∆RV1165 M.
TUBERCULOSIS ERDMAN UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN...149 TABELLE 13: NITRITPRODUKTION VON M. TUBERCULOSIS ERDMAN UND H37RV UND M.
BOVIS, PROMNARGHJITÆCM. TUBERCULOSIS H37RV UND ERDMAN,
PROMNARGHJIBCGM. TUBERCULOSIS ERDMAN UND PROMNARGHJIBOVM.
TUBERCULOSIS ERDMAN UNTER ANAEROBEN BEDINGUNGEN...149 TABELLE 14: WACHSTUM UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN VON M. TUBERCULOSIS
H37RV UND ERDMAN, PROMNARGHJITÆCM. TUBERCULOSIS H37RV UND
ERDMAN UND PROMNARGHJIBCGM. TUBERCULOSIS ERDMAN. ...150
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin
Abb. Abbildung
ADS Albumin Dextrose Salz
AIDS Aquired Immune Deficiency Syndrome
(Erworbenes Immundefizienz Syndrom)
ATP Adenosintriphosphat
BCG Bacille Calmette Guérin BSA Bovines Serum Albumin Best.-Nr. Bestell-Nummer
bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise
C Cytosin
CFU Colony forming units
(Koloniebildende Einheiten) d Tage
dest. H2O destilliertes Wasser d. h. das heißt
DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
DOTS directly observed therapy treatment short course (direkt überwachte Kurzzeittherapie)
DVG Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft
E. Escherichia
EDTA Ethylene Diamine Tetra-Acetate (Ethylendiamintetraessigsäure)
Fa. Firma
FRET Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
G Guanin
x g Gravitationskonstante h Stunde
HIV Humanes Immundefizienz Virus
Hrsg. Herausgeber
I. E. Internationale Einheiten
kb Kilobasenpaare
KBE Koloniebildende Einheiten
kDa Kilodalton
kV Kilovolt
l Liter
LB-Medium Luria Bertani Medium
M Molar
M. Mycobacterium
mA Milliampère
MB-Medium Mykobakterien-Basissalz-Medium MDR multi-drug resistent
(mehrfach resistent)
mg Milligramm
MGIT Mycobacterial Growth Indicator Tube
(Indikatorröhre für mykobakterielles Wachstum) MHH Medizinische Hochschule Hannover
min Minute
ml Mililiter
mM Milimolar
mmol milimol
MOTT mycobacteria other than tubercle bacilli
(Mykobakterien außer Tuberkulosebakterien) mRNA messenger ribonucleic acid
(Boten-Ribonukleinsäure)
µF Mikrofaraday
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
nm Nanometer
NTM Nicht tuberkulöse Mykobakterien
OD Optische Dichte
PCR Polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) Pfu Pyrococcus furiosus
pH negativ dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen- konzentration
rpm rounds per minute
(Umdrehungen pro Minute)
SDS Sodiumdodecylsulfate
(Sodiumdodecylsulfat)
sek Sekunde
sog. sogenannte
T Thymin
TAE TRIS-Acetat-EDTA
Taq Thermus aquaticus
TE TRIS-EDTA
Tm Schmelztemperatur
TRIS Tris(hydromethyl)aminoethan
U Unit
(Einheit)
USA United States of America
(Vereinigte Staaten von Amerika) u. U. unter Umständen
UV ultraviolett
v. Chr. vor Christus
WHO World Health Organisation (Weltgesundheitsorganisation) z. B. zum Beispiel
z. T. zum Teil
1 Einleitung
Die durch Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) hervorgerufene Erkrankung Tuberkulose galt und gilt als alte Geißel der Menschheit. Schon humane Mumien, die in Ägypten entdeckt wurden und aus der Zeit 2000 – 4000 vor Christus (v. Chr.) stammen, weisen charakteristische Tuberkuloseläsionen auf. Laut Aussagen der Weltgesundheitsorganisation (engl. World Health Organisation (WHO)) sterben heutzutage jährlich zwei Millionen Menschen an dieser Krankheit und ein Drittel der Weltbevölkerung ist mit dem Erreger infiziert. Deutlich verschärft wird die Situation durch die zunehmenden Infektionen mit dem Humanen Immundefizienz Virus (HIV) und durch das vermehrte Auftreten von multiresistenten Isolaten. Eine Impfung mit dem vor rund 80 Jahren entwickelten Mycobacterium bovis Stamm Bacille Calmette Guérin (BCG) wird zwar weltweit durchgeführt, die Wirksamkeit ist jedoch umstritten.
Zeigt dieser Impfstoff gegen die miliare Form der Tuberkulose beim Kleinkind noch eine zufriedenstellende Wirkung, so variiert der Impfschutz gegen die Lungentuberkulose beim Erwachsenen zwischen 0 und 80 %. Die Entwicklung einer neuen Vakkzine ist aus diesem Grund für viele Wissenschaftler ein vorrangiges Forschungsziel.
Die Verfügbarkeit der vollständigen Sequenz von M. tuberculosis seit 1998 bietet neue molekularbiologische Ansätze. Ein Ziel ist die Identifzierung von Genen, die die intrazelluläre Überlebensfähigkeit von M. tuberculosis ermöglichen. Diese Überlebensfähigkeit und die damit verbundene jahre- oder jahrzehntelange Möglichkeit der Persistenz im Wirt ist ein Hauptcharakteristikum der Infektion mit diesem Erreger. Für viele Wissenschaftler bietet in diesem Zusammenhang der anaerobe Stoffwechsel von Mykobakterien einen interessanten Ansatzpunkt, da in Granulomen und in chronisch infiziertem Gewebe vermutlich mikroaerophile oder anaerobe Bedingungen herrschen.
Diese Arbeit befasste sich mit der Untersuchung eines alternativen Stoffwechselweges – dem Nitratmetabolismus. Bei der Verstoffwechslung des Nitrates nutzen viele Bakterien die anaerobe Nitratreduktase NarGHJI. Dieses Enyzm katalysiert die Reduktion von Nitrat und dient durch Aufbau eines
Protonengradienten der ATP-Herstellung unter anaeroben Bedingungen. Codiert wird diese Nitratreduktase durch das narGHJI-Operon, welches auch in M.
tuberculosis vorhanden ist. Anhand verschiedener Deletions- und Punktmutationen innerhalb dieses Genclusters von M. tuberculosis sollte geklärt werden, ob NarGHJI auch bei Mykobakterien eine Rolle im Metabolismus sowohl unter anaeroben als auch unter aeroben Bedingungen spielt.
Erkenntnisse dieser Arbeit könnten zur Entwicklung neuer Impfstoffe und auch neuer
„drug-targets“ beitragen. Da viele Antituberkulotika nur in das Wachstum der Mykobakterien eingreifen, gegen die persistierenden Erreger jedoch wirkungslos sind, könnten während dieser Persistenz ablaufende Stoffwechselleistungen und die daran beteiligten Gene ein interessantes Ziel für neuartige Medikamente sein.
2 Literaturübersicht
2.1 Allgemeine Eigenschaften und Taxonomie der Mykobakterien
Mykobakterien sind weltweit verbreitet, am häufigsten kommt die Gruppe der saprophytären Umweltkeime vor. Diese finden sich in Ackerböden, Staub, Abwässern und anderen Umgebungen. (SZEWZYK et al. 2000). Die zum Beispiel (z.
B.) im Staub vorkommenden Mykobakterien können sich dort nicht vermehren, bleiben aber über einen langen Zeitraum infektionsfähig und werden zusammen mit dem Staub verbreitet (SCHULZE-RÖBBECKE 1993).
Die klinisch bedeutsamste Gruppe bilden M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M.
avium und M. leprae (SCHULZE-RÖBBECKE 1993). Diese Bakterien sind in der unbelebten Umwelt nicht vermehrungsfähig und auf einen Wirt angewiesen. M.
tuberculosis und M. africanum können Menschen und andere Primaten infizieren, M.
bovis bewirkt im allgemeinen in Säugetieren eine Erkrankung (ROSENBERGER 1970, WILESMITH u. CLIFTON-HADLEY 1994, SELBITZ 2002). M. avium ist der Erreger der Geflügeltuberkulose bei Vögeln, kann aber durch Übertragung von Rindern, Schafen, Ziegen, Schweinen, Hunden und Katzen auf den Menschen übergehen (HAWTHORNE u, LAUDER 1962; WILESMITH u. CLIFTON-HADLEY, 1994). Von Zoonosen sind besonders immunsupprimierte Menschen betroffen, z. B.
HIV-Patienten, die mit M. bovis infiziert sind (COSIVI et al. 1998). M. leprae konnte bislang nur aus Menschen isoliert werden (HAHN 1994).
Die Familie der Mycobacteriaceae besteht aus dem einzigen Genus Mycobacterium.
Die Mindestanforderungen für die Zugehörigkeit zu diesem Genus sind die Säurefestigkeit, ein Desoxyribonukleinsäure (engl. Desoxyribonucleic acid (DNA))- G/C-Gehalt von 61 – 71 mol% und die Anwesenheit von Mykolsäuren mit 60 – 90 C- Atomen (LEVY-FREBAULT u. PORTAELS 1992).
Die Bakterien gehören zu den obligaten Aerobiern und wachsen bei 37 °C auf komplexen Nährböden in z. T. variabler Kolonieform und mit unterschiedlichen Wachstumgeschwindigkeiten (DEDIÉ et al. 1993).
Die Mykobakterien sind gerade bis leicht gekrümmte, unbewegliche, sporenlose Stäbchen von 0,2 – 0,6 x 1,0 - 10 µm Größe. Charakteristisch ist der hohe Lipidgehalt von 13 bis 23 %, das Vorkommen von Wachs D und die Säurefestigkeit der Zellwand. Die wichtigsten Lipide der Bakterienwand sind Mykolsäuren und Mykoside, zu den letzteren zählt Trehalose-6,6-Dimykolat, auch als Cord-Faktor bezeichnet, da dieser Virulenzfaktor für das zopfartige Wachstum in Kulturen verantwortlich ist (DEDIÈ et al. 1993). Die Zellwand bewirkt, dass die Färbung nach Gram nur eine schwache Rotfärbung zeigt, die Bakterien werden dadurch zu den grampositiven Bakterien gezählt (METCHOCK et al. 1999). Erst spezielle Färbemethoden lassen die genauere Differenzierung zu: die Ziehl-Neelsen-Färbung und die Auramin-Färbung. Beide Färbemethoden nutzen die besondere Säurefestigkeit der Mykobakterien (HAHN 1994).
Neben der Mikroskopie erfolgt die Identifizierung und Differenzierung mit weiteren Methoden. Zusätzlich zu dem Wachstums- und Pigmentationsverhalten werden auch biochemische Kriterien, wie z. B. der Niacintest oder der Nitratreduktasetest herangezogen. Eine wichtige Rolle spielen der Bactec P-Nitro-α-Acetylamino-β- Hydroxypropiophenon-Test, chromatographische Analysen, DNA-Sequenzierungen und Identifizierung über Nukleinsäure-Amplifikation und Hybridisierung (METCHOCK et al. 1999).
Aufgrund ihres Zellwandaufbaues ist die Tenazität von Mykobakterien höher als die anderer sporenloser Bakterien. In der Außenwelt können sie unter günstigen Bedingungen mehrere Monate infektionsfähig bleiben. In Abwässern oder Gülle können die Bakterien bis zu 6 Monate überleben und in Nährmedien wurden Mykobakterien bis zu 12 Jahre kultiviert (DEDIÉ et al. 1993). Die Einlagerung in Bronchialschleim, Milch oder ähnlichen Medien verstärkt die Tenazität zudem.
Temperaturen über 100 °C führen innerhalb kürzester Zeit zum Absterben, für die Milch haben sich die Kurzzeitpasteurisierung bei 71 – 74 °C und die Hocherhitzung bei 80 – 85 °C bewährt (SELBITZ 2002). Direktes Sonnenlicht, Ultraviolett (UV)-Licht oder oxidierende Verbindungen führen ebenfalls zum Absterben der Mykobakterien (DEDIÉ et al. 1993). Säuren und Alkalien hingegen haben ebenso wie Eintrocknung,
Gefrieren oder Behandlung mit vielen chemischen Reagenzien nur eine begrenzte Wirkung. Zur Desinfektion sollten deshalb nur Mittel verwendet werden, die hinsichtlich ihrer Wirkung gegen Mykobakterien geprüft wurden, wie z. B.
Formaldehyd und Phenol. Weitere Stoffe sind der Desinfektionsmittelliste der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft (DVG) zu entnehmen (SELBITZ 2002).
Die Einteilung der Bakterien kann nach verschiedenen Kriterien erfolgen.
Zum einen werden sie in langsamwachsende und schnellwachsende Spezies eingeteilt. Die langsamwachsenden Mykobakterien, zu denen unter anderem M.
tuberculosis gehört, benötigen mindestens 7 Tage, um auf Kulturmedien sichtbare Kulturen zu bilden. Die schnelllwachsenden Bakterien, wie z. B. M. smegmatis, brauchen unter den gleichen Bedingungen weniger als 7 Tage (METCHOCK et al.
1999).
Weiterhin teilten RUNYON und TIMPE die Mykobakterien 1959 nach ihrer Wachstumgeschwindigkeit und ihrem Pigmentationsverhalten in vier Gruppen auf (RUNYON u. TIMPE 1959). Diese Einteilung ist veraltet, wird jedoch zur Differenzierung herangezogen, wenn molekularbiologische Methoden keinen Aufschluss geben (z. B. bei M. gastrii und M. kansasii).
Als „Tuberkulosebakterien“ werden M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis und M.
bovis BCG bezeichnet. Die früher unter dem Namen „Atypische Mykobakterien“
bekannte Gruppe von Mykobakterien trägt heute die Benennung „Nichttuberkulöse Mykobakterien“, „nontuberculous mycobacteria“ (NTM) oder „Mycobacteria other than Tubercle bacilli“ (MOTT). M. leprae nimmt eine Sonderstellung bei dieser Einteilung ein (SALFINGER u. KAFADER 1992 ).
Neuere molekularbiologische Techniken erlauben die Einteilung nach der Phylogenie der einzelnen Spezies. Dabei werden z. B. Sequenzanalysen des
16S rRNA-Gens verschiedener Mykobakterienspezies miteinander verglichen (ROGALL et. al. 1990; PITULLE et al. 1992).
Für den klinischen Bereich werden Mykobakterienspezies oftmals in Komplexen zusammengefasst. Eine der wichtigsten Gruppen ist der M. tuberculosis-Komplex, zu dem M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti und M.
canettii gehören. Neben dem M. avium-Komplex und dem M. fortuitum-Komplex bilden einige Spezies eigene wichtige klinische Gruppen, wie z. B. M. leprae (METCHOCK et al. 1999). Der wichtigste Erreger aus der Gruppe der Mykobakterien in der Tiermedizin ist M. avium spp. paratuberculosis, Erreger der Paratuberkulose, auch Johne`sche-Erkrankung genannt.
Aufgrund ihres Pathogenitätspotentials können Mykobakterien in Risikogruppen eingeteilt werden:
Risikogruppe I: In diese Gruppe gehören saprophytäre Mykobakterien (z. B. M.
vaccae), die nur selten klinische Relevanz besitzen.
Risikogruppe II: Die fakultativ pathogenen Mykobakterien (z. B. M. abscessus) dieser Gruppe sind besonders bei immunsuppremierten Patienten von Bedeutung.
Risikogruppe III: Diese Gruppe umfasst die obligat pathogenen Keime, wie z. B. M.
tuberculosis. Der Nachweis ist immer mit einer Erkrankung verbunden.
(BÖTTGER 1991)
2.2 Tuberkulose des Menschen
2.2.1 Epidemiologie und Bedeutung
Nach Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation sterben jährlich mehr als zwei Millionen Menschen an Tuberkulose und acht Millionen werden neu infiziert. Zwei Milliarden Menschen, also 1/3 der Menschheit, sind bereits infiziert. Bei ca. 10 % der infizierten Personen wird es zu einer Erkrankung kommen und ungefähr < 5 % werden an Tuberkulose sterben (KAUFMANN 2000). Schätzungen ergeben, dass zwischen 2002 und 2020 fast 1 Milliarde Menschen infiziert werden, über
150 Millionen Infizierte erkranken und 36 Millionen an Tuberkulose sterben werden.
Der Zusammenbruch vieler Gesundheitssysteme, die Verbreitung von HIV und dem erworbenen Immundefizienz Syndrom (engl. Aquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS)) und die Entstehung von multiresistenten Mykobakterienstämmen bewirken, dass die globale Epidemie wächst und zunehmend gefährlicher wird.
Die Infektion mit HIV und die Tuberkuloseerkrankung bilden eine tödliche Kombination, beide forcieren einander. 11 % aller AIDS-Patienten sterben an Tuberkulose. Einen besonderen Brennpunkt bildet Afrika, wo die HIV-Infektion in den letzten 10 Jahren drastisch angestiegen ist (CORBETT et al. 2003).
Zur Resistenz von Tuberkuloseerregern gegen Antituberkulotika tragen in erster Linie ein schlechtes Behandlungsmanagement und mangelhafte Tuberkulose-Kontrolle bei. Therapien werden aufgrund vermeintlicher Besserung des Gesundheitszustandes des Patienten und aufgrund von Arzneimittelnebenwirkungen vorzeitig abgebrochen. Besonders ernst zu nehmen sind Resistenzen gegen mehr als ein Arzneimittel, besonders gegen Isoniazid und Rifampicin, die zu den wirkungsvollsten Mitteln gehören. Resistente Stämme werden verbreitet, die Behandlung dieser Stämme ist sehr teuer und zeigt mehr Nebenwirkungen für den Patienten (WHO 2002).
Zur Verbreitung der Tuberkuloseerreger tragen auch der zunehmende internationale Reiseverkehr und die ansteigende Migration bei (RAVIGLIONE et al. 1995). In den Vereinigten Staaten von Amerika (engl. United States of America (USA)) treten fast 40 % aller Tuberkulosefälle bei Menschen auf, die aus dem Ausland stammen.
Ein weiterer Faktor in der Verbreitung der Tuberkulose ist die zunehmende Zahl an Flüchtlingen und Obdachlosen. Oft werden erkrankte Personen nicht behandelt oder die Behandlung, die mindestens 6 Monate dauert, kann aufgrund von Flüchtlingsbewegungen nicht fortgesetzt und nicht kontrolliert werden (WHO 2002).
Aus diesen Gründen rief 1993 die WHO in Zusammenhang mit der Tuberkulose den weltweiten Notstand aus.
Unter dem Namen DOTS (directly observed therapy treatment short course oder direkt überwachte Kurzzeittherapie) wurden von der WHO Kriterien zur Bekämpfung der Tuberkulose weltweit aufgestellt. DOTS umfasst fünf Elemente: politische Verantwortung, mikroskopische Untersuchung, Versorgung mit Arzneimitteln, Monitoring der Tuberkulose allgemein und direkte Überwachung von Behandlungen.
Das Ziel besteht darin 70 % aller Neuinfektionen aufzudecken und 85 % dieser Fälle zu heilen (WHO 2002).
Deutschland zählte 2001 innerhalb Europas zu den Ländern mit geringer Rate an Neuinfektionen (9,6 Fälle pro 100.000 Einwohner). Dabei schwankten die Inzidenzen zwischen 16,1 Erkrankungen pro 100.000 Einwohner im Bundesland Hamburg und 5,9 in Schleswig-Holstein. Der Anteil an importierten Erkrankungen stieg leicht an und lag bei 43 %, ein Großteil stammte aus den Nachfolgestaaten der Sowjetunion.
80 % aller Tuberkulosepatienten leiden an der Lungentuberkulose. Auch in Deutschland nimmt die Anzahl an resistenten und multiresistenten Erregern über die Jahre zu (2,7 % mehrfach resistente (engl. Multi-drug resistent (MDR)) Isolate 2001).
DOTS wird auch in Ländern mit niedriger Inzidenz angewendet, wie z . B. in Deutschland. Dabei steht die Überwachung des Behandlungsergebnisses gegenüber einer generell überwachten Therapie im Vordergrund (ROBERT-KOCH-INSTITUT 2002). Das am 1. Januar 2001 in Kraft getretene Infektionsschutzgesetz regelt in Nachfolge des bis dahin gültigen Bundesseuchengesetzes die Meldepflicht in Deutschland. Dem Gesetz nach müssen die Erkrankung und der Tod, nicht aber der Verdacht auf Tuberkulose gemeldet werden (BUNDESGESETZBLATT 2000).
2.2.2 Ätiologie und Pathogenese
Die Tuberkulose des Menschen wird durch M. tuberculosis, M. africanum oder M.
bovis hervorgerufen. Den größten Anteil nimmt dabei die Erkrankung mit M.
tuberculosis ein. Infektionen mit M. africanum kommen hauptsächlich in Westafrika vor. M. bovis-Infektionen sind seit der Bekämpfung der Rindertuberkulose selten
geworden, kommen aber in Entwicklungsländern als Zoonosen vor (MATTHIESSEN et al. 1992; COSIVI et al. 1998).
Die Infektion über Aerosole ist der Hauptinfektionsweg. RILEY zeigte 1957 in seinen klassischen Studien diesen Ansteckungsweg: Meerschweinchen, die in einem Raum lebten, der nur mit einer Luftzufuhr aus einem Raum mit einem Patienten, der an der aktiven Form der Lungentuberkulose litt, versehen war, waren nach kurzer Zeit mit Tuberkulose infiziert (RILEY 1957).
Die Ansteckungsquelle geht meistens von den Menschen aus, die an einer „offenen“
Tuberkuloseerkrankung leiden. Ein Patient gilt solange als ansteckungsfähig wie säurefeste Stäbchen im Direktpräparat aus dem Sputum nachweisbar sind. Das entspricht ca. 5.000 Bakterien in 1 Mililiter (ml) Sputum (MAGNUSSEN u. KANZKOW 2001). Schätzungen gehen davon aus, dass ein Patient, der an einer unbehandelten aktiven Form der Tuberkulose leidet, ca. 10 – 15 Menschen pro Jahr infiziert (WHO 2002). Die Infektiösität von Patienten gilt als wesentlich geringer, solange nur ein kultureller oder molekularbiolgischer Nachweis gelingt (VELCOVSKY u. SEEGER 1998). Von extrapulmonalen Tuberkulosen geht kein Infektionsrisiko aus (ROBERT- KOCH-INSTITUT 2002).
Prädisponierend für die Empfänglichkeit wirken Immunsuppression sowie häufiger und intensiver Kontakt zu Ausscheidern. HIV- / AIDS-Patienten, Alkoholabhängige, Kinder oder ältere Personen sind nur einige Beispiele für Menschen, die ein erhöhtes Risiko haben an Tuberkulose zu erkranken (MAGNUSSEN u. KANZKOW 2001).
Neben der Erstinfektion durch Inhalation einer kleinen Anzahl an Mykobakterien kann die Erkrankung mit Tuberkulose auf weiteren Wegen zustande kommen: über die endogene Reaktivierung eines latenten Prozesses einer früheren Infektion oder die exogene Reinfektion auf aerogenem Wege nach einer vorherigen Infektion (McKINNEY et al. 1998).
Aerosolpartikel, die mit Mykobakterien behaftet sind und die einen kleineren Durchmesser als 5 µm aufweisen, werden nicht von der mukoziliären Clearance
erfasst und gelangen in die tieferen Atemwege. Die Eintrittsstelle, zumeist eine Lungenläsion, bildet den sogenannten Primärherd. Nach der Streuung auf lymphogenem Weg in einen regionalen Lymphknoten bildet dieser zusammen mit dem Primärherd den Primärkomplex oder Ghon-Komplex (SHAH 2001, JUNGBLUT 2002). Parallel zur Vermehrung der Mykobakterien kommt es zu charakteristischen Veränderungen im Patienten wie der Granulombildung, der Makrophagenaktivierung und der Tuberkulinallergie. Makrophagen nehmen normalerweise Partikel auf, umschließen sie in einem Phagosom, das zum Phagolysosom wird. Die Abtötung und Verdauung von Erregern erfolgt in diesen Phagolysosomen in erster Linie durch bakterizide reaktive Sauerstoff- und Stickstoff-Metabolite, Peptide, einen niedrigen pH-Wert und Verdauungsenzyme. Auch Mykobakterien werden von den Phagosomen der Makrophagen aufgenommen, haben aber die Fähigkeit, die weitere Entwicklung des Phagosomen zum Phagolysosom zu verhindern. Im Laufe der Infektion drosseln die Bakterien ihren Metabolismus und können in diesem ruhenden Zustand über Jahre in dem Infizierten überleben, ohne ein Krankheitsbild hervorzurufen. 95 % aller Tuberkuloseträger befinden sich in diesem Zustand der Latenz (KAUFMANN u. SCHAIBLE 2002).
Die zelluläre Immunantwort bewirkt einen Tropismus von Epitheloidzellen, Langhans- Riesenzellen, Lymphozyten und Makrophagen, die einen Abwehrwall um die zentral gelegenen Makrophagen bilden (FRIEDLAND 1999). Zu einer Abtötung der Bakterien führt diese Abwehrmaßnahme nicht, der immunkompetente Wirt schützt sich nur vor einer weiteren Ausbreitung der Mykobakterien. Im Inneren dieser Granulome kann es zu einer Verkäsung und Verkalkung kommen (BARON et al.
1994). Die Mykobakterien können über Jahrzehnte innerhalb dieser entzündlichen Herde persistieren, verlieren aber nicht ihre Virulenz. Kommt es innerhalb dieser Granulome zur Verflüssigung der verkästen Areale, so bietet sich ein reichhaltiges Nährmedium für die Mykobakterien (McKINNEY et al. 1998).
Eine lymphogene und / oder hämatogene Ausbreitung der Bakterien vor Eintreten der zellulären Immunantwort führt zu einer Komplikation der Primärtuberkulose in Form einer akuten Miliartuberkulose. Die Miliartuberkulose kommt vor allem bei immunsuppremierten Personen vor, wie z. B. bei HIV- / AIDS-Patienten oder bei
Kindern. Die Expansion der Bakterien und die Gewebezerstörung schreiten bei dieser Form schnell voran, besonders betroffen sind häufig die Meningen, die Leber und das Knochenmark. Die Miliartuberkulose kann tödlich enden, wenn keine Behandlung erfolgt (McKINNEY et al. 1998).
Der Einbruch der Erreger in die Atemwege führt zur Ausbreitung der Krankheit auf bronchogenem Weg, der Patient leidet an einer „offenen Tuberkulose“ und ist hochansteckend (McKINNEY et al. 1998). Eine Fallbeschreibung handelt von einer Frau, die 41 Jahre lang an einer aktiven Form der Lungentuberkulose litt (EDWARDS et al. 1970).
Auch wenn die Immunantwort des Wirtes einen aktiven Prozess der oben genannten Formen verhindern kann, so bleibt das lebenslange Risiko der Entwicklung einer postprimären Tuberkulose der Lunge oder anderer Organe. Von dieser späteren Form der Erkrankung spricht man, wenn die Erkrankung 5 Jahre oder später nach der Infektion auftritt. Eine Reaktivierung oder eine Superinfektion erfolgt typischerweise aufgrund einer Immunsuppression. Abhängig vom Immunsstatus kann es zu einer Generalisation kommen (GRANGE 1998).
Organtuberkulosen können sich sowohl in der primären Phase als auch bei der postprimären Tuberkulose bilden. Nach der Lunge, die mit 85 % den größten Anteil an Organtuberkulosen darstellt, gibt es Nieren-, Knochen-, Nebennierenrinden-, Haut-, Augen- oder Hirntuberkulose sowie die Tuberkulose der weiblichen Geschlechtsorgane. Eine tuberkulöse Meningitis tritt vor allem bei Kindern auf (HAHN 1994).
2.2.3 Klinik
Die Ausbildung des Primärkomplexes und auch die Streuung des Erregers verlaufen subklinisch.
Die Symptome im Anfangsstadium einer Erkrankung sind unspezifisch, wie z. B.
Gewichtsabnahme, Inappetenz, nächtliches Schwitzen, Müdigkeit, Husten, eine Störung des Allgemeinbefindens oder Fieber.
Schreitet die Erkrankung voran, sind - je nach betroffenem Organ - auch spezifische Symptome möglich.
Bei der Lungentuberkulose kommt es je nach Erkrankungsform zu Symptomen wie Atemnot bei Belastung oder in Ruhephasen, Husten mit eitrigem oder blutigem Auswurf oder Thoraxschmerzen (MATTHYS 2000; ROBERT-KOCH-INSTITUT 2002).
Bei der Darmtuberkulose leidet der Patient an abdominalen Schmerzen, an unstillbaren Durchfällen oder an einem Ileus. Häufig lässt sich Blut im Stuhl finden.
Bei der Urogenitaltuberkulose steht eine oft rezidivierende Pyelonephritis mit Hämaturie im Vordergrund.
Betrifft die Erkrankung die Meningen, so zeigen sich zerebrale Erscheinungen einer Meningitis beziehungsweise (bzw.) einer Meningoenzephalitis. Die Symptome sind Kopfschmerz, Erbrechen, Krämpfe, Bewusstseinsstörungen, Nackensteifigkeit und ausgeprägter Tagesschlaf. Der Liquordruck ist erhöht (MATTHYS 2000).
Die Knochen- und Gelenkstuberkulose betrifft vor allem die Wirbelkörper. Neben Schmerzen und Funktionsstörungen kann die Zerstörung der Wirbelkörper zu einer Kompression des Rückenmarks führen, auch eine Querschnittslähmung ist dann möglich (DEDIÉ et al. 1993; DIERICH et al. 2000).
Sehr selten kommt es zu einer tuberkulösen Pericarditis, die mit einer Senkung des Herzminutenvolumens und den daraus resultierenden Symptomen einhergeht oder zur Hauttuberkulose, in deren Verlauf es zu papulösen Entzündungen oder zu granulomatösen, warzenähnlichen Läsionen kommt (DEDIÉ et al. 1993; DIERICH et al. 2000).
2.2.4 Diagnostik
Neben den unterschiedlichen Symptomen können auch bestimmte Lebensumstände, wie z. B. Alkoholabusus Hinweise auf eine Tuberkuloseerkrankung geben. Weiterhin
können eine Leukozytose mit Kernlinksverschiebung, eine stark erhöhte Blutsenkungsgeschwindigkeit und ein erhöhter a2-Globulinwert zur Verdachtsdiagnose beitragen. Eine röntgenologische Thoraxübersicht sollte angefertigt werden (MATTHIESSEN u. RADENBACH 1987).
An Biopsieproben können histologische und zytologische Untersuchungen erfolgen, die Diagnose einer Tuberkuloseerkrankung unterstützen können.
Auch mit dem Tuberkulintest können Menschen, die Antikörper gegen Mykobakterien gebildet haben, ausfindig gemacht werden. Die am häufigsten eingesetzten Tests sind der Tine-Test und der Mendel-Mantoux-Test. In die Haut injiziertes Tuberkulin bewirkt bei infizierten Personen eine Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ. Die Nachteile sind, dass genauere Aussagen über das Infektions- oder Erkrankungsstadium nicht gemacht werden können und dass es aufgrund einer Impfung zu einem falsch positiven Ergebnis kommen kann (MATTHYS 2000).
Zur Diagnosesicherung muss ein Erregernachweis erfolgen. Als Probenmaterial eignen sich z. B. Sputen, Nüchternmagensaft, bronchoalveoläre Lavagen oder Morgenurin. Die Probennahme sollte zur Absicherung der Diagnose mehrmals erfolgen. Die Kultivierung möglicher Mykobakterien erfolgt auf oder in Nährmedien auf Ei- oder Kartoffelbasis, wie z. B. das Löwenstein-Jensen-Medium oder Middlebrook 7H10/11 (SALFINGER u. KAFADER 1992). An der Medizinischen Hochschule Hannover wird eine Kombination aus 7H10/11-Agarplatten mit Löwenstein-Jensen-Medium verwendet. Die Kultivierung erfolgt bei 37 °C und einer erhöhten CO2-Spannung für acht Wochen. Als Flüssigmedium eignet sich besonders das Middlebrook 7H9. Bei dieser Form des Kulturmediums besteht der Vorteil in einem schnelleren und besseren Wachstum, welches besonders bei keimarmen Proben wichtig ist. Die Nachteile sind die erhöhte Kontaminationsrate und dass keine makroskopische Beurteilung erfolgen kann. Der kulturelle Nachweis ist in der Mykobakteriendiagnostik der „Goldstandard“.
Aus den Patientenproben werden Direktpräparate angefertigt, die nach Ziehl- Neelsen oder mit Auramin gefärbt werden. Im positiven Fall kann durch die Mikroskopie der Nachweis von säurefesten Stäbchen erfolgen, eine genaue Diagnose ist nicht möglich.
Auch automatisierte Kultursysteme werden zur Diagnosestellung herangezogen. Das radiometrische Bactec-Verfahren oder das fluorimetrische MGIT-Verfahren detektieren das Wachstum mit sensitiven Nachweismethoden (SALFINGER u.
KAFADER 1992).
Für die Speziesdiagnose müssen biochemische und molekularbiologische Verfahren angewendet werden. Zur biochemischen Differenzierung wird neben dem Niacin- und Katalasetest vor allem der Nitratreduktasetest angewendet. M. tuberculosis ist die einzige Spezies aus dem M. tuberculosis-Komplex, die unter den Bedingungen dieses Diagnostiktestes Nitrat zu Nitrit reduzieren kann (VIRTANEN 1960;
MATTHIESSEN u. RADENBACH 1987).
Die wichtigsten Merkmale von M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG werden im folgenden Abschnitt zusammengefasst.
M. tuberculosis bildet auf festen Nährböden üppige, krümelige, weiß-gelb-orange Kolonien. Der Niacinnachweis und der Nitratreduktasetest fallen positiv aus, eine hitzesensitive Katalase wird nicht gebildet.
M. bovis zeigt nach drei bis vier Wochen ein spärliches Wachstum auf festen Nährböden mit glatten, flachen, pigmentlosen Kolonien. Der Niacinnachweis, der Nitratreduktasetest und die Ausbildung einer hitzelabilen Katalase weisen negative Resultate auf. Im Niveau-Agartest nach Lebek zeigt sich ein Tiefenwachstum. Gegen Pyrazinamid ist M. bovis resistent.
M. bovis BCG weicht in einigen Kriterien von M. bovis ab: U. a. sind die Kolonien pigmentiert und im Niveau-Agartest zeigt M. bovis BCG Oberflächenwachstum.
(SALFINGER u. KAFADER 1992)
In den letzten Jahren nehmen molekularbiologische Nachweisverfahren für Mykobakterien einen immer größeren Stellenwert innerhalb der Diagnostik ein.
Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (engl. Polymerase chain reaction (PCR)) können Mykobakterien auf bestimmte DNA-Sequenzen untersucht werden. Zur Anwendung kommt die Direkt-PCR in Kombination mit einer Sondenhybridisierung, eine PCR aus Kulturmaterial oder die Sequenzierung, die meistens das IS6110 oder das 16S-rRNA-Gen betrifft (MATTHIESSEN u. RADENBACH 1987; FRIEDLAND 1999).
Eine weitere Vereinfachung und Beschleunigung der PCR-Technologie wurde mit dem LightCycler Real Time PCR System der Firma Roche erreicht (WITTWER et al.
1997). Bei diesem System wird eine PCR mit anschließender Detektion der PCR- Amplifikate durch eine DNA-DNA-Hybridisierung in ca. 80 min durchgeführt. Der Vorteil dieser Methode besteht in seiner Schnelligkeit, seiner hohen Spezifität und in seiner geringen Kontaminationsgefahr.
Durch Zugabe von fluoreszenzmarkierten Sonden zum PCR-Ansatz werden während der PCR sowie bei der sich anschließenden Schmelzkurvenanalyse Fluoreszenzsignale gemessen. Eine Lichtquelle regt die Fluoreszenz an und drei Kanäle messen das Licht in einem unterschiedlichen Wellenbereich (Kanal F1: 530 Nanometer (nm), Kanal F2: 640 nm und Kanal F3: 705 nm). Die Einzelmessungen während eines jeden PCR-Zyklus bieten quantitative Informationen über die Menge des in der Probe enthaltenen Targets. Die Messung bei der Schmelzkurvenanalyse enthält eine rein qualitative Aussage über die Sequenz der Zielstruktur.
Die beiden Sonden, die eingesetzt werden, haben unterschiedliche Schmelzpunkte und binden in einem Abstand von 1 – 10 Basen zueinander an das PCR-Produkt. Die Donor- / Ankersonde ist am 3´-Ende mit dem Farbstoff Fluoreszein markiert, während die Akzeptor- / Detektionssonde am 5´-Ende einen roten Farbstoff – LC Red 640 oder LC Red 705 – trägt. Bei Bindung der Sonden an die Zielstruktur kommt es zum Förster-Transfer oder auch Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET). Bei dieser Reaktion wird der Farbstoff der Ankersonde von der Lichtquelle angeregt und emittiert grünes Licht, welches wiederum den roten Farbstoff der Detektionssonde aktiviert. Die Emission dieses Farbstoffes wird in einem entsprechenden Kanal gemessen. Da es nur bei der Bindung der Sonden an die Zielstruktur zum FRET
kommt, ist diese Art der Detektion hochspezifisch. Bei der Schmelzkurvenanalyse wird zunächst die doppelsträngige DNA denaturiert, anschließend erfolgt die Bindung der Sonden in einem niedrigen Temperaturbereich. Bei langsamer Erhöhung der Temperatur und kontinuierlicher Fluoreszenzmessung emittiert die Detektionssonde solange Licht, bis die Sonden abschmelzen, was durch ein abruptes Ende des Fluoreszenzsignals gekennzeichnet ist. Dieser Abbruch von 50 % der Sonden wird in der ersten negativen Ableitung als Peak der Abschmelztemperaturen dargestellt. Die Abschmelztemperatur ist für das jeweilige Sonden-Zielsequenz-Paar charakteristisch und reproduzierbar. Die Temperatur ist abhängig von der Länge des Sonden- Zielsequenz-Paares, von dem G / C-Gehalt und der Watson-Crick-Basenpaarung.
Weist die Zielstruktur wenige Fehlbasen zur Sonde auf, so ist die Bindung destabilisiert, es kommt zu einem Abschmelzen der Sonde in einem niedrigeren Temperaturbereich (ROCHE LIGHTCYCLER OPERATOR MANUAL 2000).
2.2.5 Therapiemöglichkeiten
Zur Bekämpfung der Tuberkulose gibt es eine Reihe von Chemotherapeutika, die in Kombination eingesetzt werden. Die gebräuchlichsten Medikamente sind Rifampizin, Isoniazid, Pyrazinamid, Ethambutol und Streptomycin.
Am Anfang erfolgt eine Intensivbehandlungsphase von durchschnittlich zwei Monaten mit einer Drei- oder Vierfachkombination der oben aufgeführten Medikamente. Der Einsatz mehrerer Arzneimittel soll die Keimzahl möglichst schnell reduzieren, eine Sputumkonversion erzielen und die Entwicklung von sekundären Resistenzen verhindern. In der sich anschließenden Stabilisierungsphase werden häufig Isoniazid und Rifampizin über einen Zeitraum von vier bis sechs Monaten eingesetzt. Je nach Schwere der Erkrankung und Immunstatus des Patienten kann die Medikation bis zu zwei Jahre fortgesetzt werden (SHAH 2001).
Die Behandlung wird in vielen Fällen stationär eingeleitet und nach der Sputumkonversion ambulant fortgeführt. Leidet der Patient an der aktiven Form der Tuberkulose, so sollten Isolierungsmaßnahmen erfolgen.
Ein besonderes Problem stellt die Entwicklung von resistenten, besonders multiresistenten Stämmen dar. Als multiresistent (MDR = multi drug resistent) werden Stämme bezeichnet, die zumindest gegen die beiden wichtigsten Tuberkulostatika Isoniazid und Rifampizin resistent sind. In mehreren Ländern hat der Anteil an MDR- Isolaten dramatisch zugenommen, so haben diese in den baltischen Staaten einen Anteil von 10 % (KAUFMANN u. SCHAIBLE 2002). Im Falle der Erkrankung mit MDR-Stämmen werden Medikamente der zweiten Wahl, wie Ethionamid, Imipenem, Clofazamin und Thiazetazon, eingesetzt (GRANGE u. ZUMLA 1999).
Das Interesse an der Entwicklung neuer Medikamente ist – trotz der Chemotherapeutika der zweiten Wahl - groß.
Eine sehr wichtige Rolle bei der Behandlung spielt die Einstellung und die Zuverlässigkeit des Patienten. Die Medikamenteneinnahme muss konsequent erfolgen, andernfalls drohen Rezidive und das Auftreten von sekundär resistenten Keimen. Menschen aus schwierigen Lebensverhältnissen, in denen z. B.
Obdachlosigkeit, Drogen- oder Alkoholabusus eine Rolle spielen, müssen unter Umständen genauer in der Medikamenteneinnahme kontrolliert werden. Auch die starken Nebenwirkungen der Chemotherapeutika, die auftreten können und die vermeintliche Verbesserung des Allgemeinbefindens des Patienten, bewirken in einigen Fällen den vorzeitigen Abbruch der Therapie (MATTHIESSEN u.
RADENBACH 1987).
Diese Kriterien fallen u. a. auch in das von der WHO aufgestellte Programm DOTS, welches die globale Bekämpfung der Tuberkulose zum Ziel hat (s. Kapitel 2.2.1 Epidemiologie und Bedeutung).
2.2.6 Impfungen
Am Anfang des 20. Jahrhunderts entwickelten die französischen Forscher Calmette und Guérin am Pasteur Institut in Lille den Impfstoff BCG (Bacille-Calmette-Guérin).
Dafür wurde Mycobacterium bovis in 230 in-vitro-Passagen in 13 Jahren attenuiert.
Seit dem ersten Einsatz im Jahr 1921 wurde dieser Impfstoff weltweit mehr als drei
Milliarden Menschen und jährlich rund 100 Millionen Neugeborenen verabreicht (KAUFMANN 2000).
Die Vorteile einer Impfung mit dieser Lebendvakzine bestehen in den geringen Nebenwirkungen bei immunkompetenten Menschen. Die Impfung ist sehr kostengünstig und die Verabreichung kann zu jedem Zeitpunkt nach der Geburt erfolgen. Ferner führt eine einmalige Applikation zu einer lang anhaltenden Immunität und der Impfstoff ist temperaturresistent, was vor allem in Ländern wichtig ist, in denen eine geschlossenen Kühlkette nicht gewährleistet ist. Eine Impfung im frühen Kindesalter schützt Kleinkinder vor der lebensbedrohenden Miliartuberkulose, die häufig die Hirnhäute befällt (COLDITZ 1996; MC KINNEY et al. 1998).
Gegen die weltweit häufigste Form der Erkrankung – die Lungentuberkulose des adulten Menschen – ist dieser Impfstoff aber weitgehend wirkungslos. Studien belegen, dass der Impfschutz weltweit zwischen 80 und 0 % schwankt (BLOOM u.
FINE 1994). Anhand einer Analyse, die alle erhältlichen Impfdaten mit BCG mit einbezog, hat sich eine theoretische Schutzrate von 50 % ergeben. Schätzungen gehen davon aus, dass nur 5 % aller Tuberkulosetodesfälle durch eine Impfung mit BCG verhindert hätten werden können (KAUFMANN 2000).
In den letzten Jahren hat sich ein zusätzliches Problem bei der Impfung mit BCG herausgestellt. Immunsuppremierte Menschen, insbesondere die Gruppe der HIV- Infizierten bzw. AIDS-Erkrankten, können nach der Impfung eine generalisierte Infektion, die sogenannte disseminierte BCGitis, mit oft tödlichem Ausgang entwickeln (WELTMANN u. ROSE 1993; NEWPORT et al. 1996). Ein Beispiel für eine Erkrankung durch BCG ist ein AIDS-Patient, der 30 Jahre nach Verabreichung des BCG-Impfstoffes eine Adenitits entwickelte (REYNES et al. 1989).
Weiterhin nachteilig ist, dass mit der Impfung Tuberkulintests wie der Tine-Test ihre Aussagekraft verlieren, da diese Tests nicht zwischen Antikörpern, die nach einer Infektion mit Mykobakterien bzw. nach einer Impfung mit BCG entwickelt worden sind, unterscheiden können.
Trotz dieser Nachteile empfiehlt die WHO eine Impfung mit BCG in Ländern mit einer hohen Tuberkuloseprävalenz und –inzidenz. Ausgenommen werden sollten allerdings HIV-infizierte Kinder (WHO 1987).
In Deutschland und anderen Industrienationen wird eine Impfung, aufgrund der günstigen epidemiologischen Situation und der unzureichenden Wirkung, mit diesem Impfstoff derzeit nicht empfohlen (ROBERT-KOCH-INSTITUT 2002).
Trotz der günstigen Lage in einigen Ländern wie z. B. Deutschland und aufgrund der fatalen Situation in vielen anderen Ländern ist die Entwicklung eines neuen, verbesserten Impfstoffes zum Schutz vor einer Infektion und Erkrankung für eine erfolgreiche globale Bekämpfung der Tuberkulose dringend erforderlich.
Drei Strategien werden bei der Entwicklung verfolgt: zum einen soll der Impfstoff vor einer Infektion genügend Schutz aufbauen. Zweitens soll eine Vakkzine nach einer Infektion mit M. tuberculosis die Progression der Erreger verhindern. Und drittens soll der Impfstoff während einer aktiven Tuberkulose die Behandlung unterstützen (GINSBERG 2002).
Die zur Zeit entwickelten Impfstoffe lassen sich in zwei große Gruppen einteilen: die Spaltvakzine und die Lebendimpfstoffe. Die Spaltvakzine bestehen aus bestimmten Antigenen, die von T-Zellen erkannt werden sollen. Zum besseren Schutz werden verschiedene Antigene für unterschiedliche T-Zellgruppen angeboten. In diese Gruppe fallen die Protein-Adjuvanz-Formulierungen, nackte DNA-Konstrukte und rekombinante Antigen-Träger. Auch die Lebendimpfstoffe sprechen die T- Zellpopulationen an. Bei dieser Vakkzinegruppe handelt es sich vor allem um genetisch veränderte BCG-Impfstämme und um attenuierte M. tuberculosis-Stämme.
Die M. bovis BCG-Stämme werden u. a. mit Genen aus anderen Bakterien rekombiniert. Man erhofft sich davon eine bessere Exprimierung der schützenden T- Zellen. Veränderte M. tuberculosis-Stämme sollen eine protektive Immunantwort auslösen, aber die Fähigkeit eine Krankheit hervorzurufen vollständig verloren haben. Gerade bei der letztgenannten Gruppe existieren jedoch Sicherheitsbedenken (KAUFMANN 2000, KAUFMANN u. SCHAIBLE 2002;
JUNGBLUT u. KAUFMANN 2002).
Die Entwicklung eines geeigneten Impfstoffes wird lange Zeit in Anspruch nehmen, da sich nach einem erfolgreichen Ergebnis im Tierversuch ausführliche klinische Studien anschließen müssen. Da die Tuberkulose als chronische Infektion auch Jahrzehnte nach der Ansteckung ausbrechen kann, werden diese Impfstudien lange dauern (KAUFMANN u. SCHAIBLE 2002).
2.3 Tuberkulose bei Tieren
2.3.1 Epidemiologie und Bedeutung
Die Tuberkulose verläuft bei Tieren genauso wie bei dem Menschen zumeist chronisch. Viele Tierarten können befallen werden, die häufigste Tuberkulose ist die Rindertuberkulose.
Robert Koch entdeckte 1882 den Tuberkuloseerreger und stellte fest, dass die Tuberkulose des Menschen und der Tiere durch den gleichen Erreger hervorgerufen werde. 1901 gelang ihm jedoch der Nachweis, dass es sich um zwei unterschiedliche Erreger handelte (SELBITZ 2002).
Bei Erkrankungen mit Mykobakterien spielt M. bovis unter Säugetieren die größte Rolle. In vielen Industrienationen konnte die Rindertuberkulose erfolgreich bekämpft werden, z. B. in Deutschland oder Kanada (HUNTER 1996; SELBITZ 2002). Auch wenn Deutschland den Status eines tuberkulosefreien Landes hat, so treten auch hier vereinzelte Erkrankungsfälle auf (z. B. TIERSEUCHENBERICHT DES BUNDESMINISTERIUMS FÜR ERNÄHRUNG, LANDWIRTSCHAFT UND FORSTEN vom März 2003 im Deutschen Tierärzteblatt). Ein größeres Problem von Infektionen und Erkrankungen durch M. bovis gibt es in den sogenannten Entwicklungsländern, vor allem in Afrika. Unzureichende Kontrollprogramme und ein großes Wirtsspektrum von M. bovis erschweren die Tilgung in diesen Ländern (COSIVI et al. 1998).
Allerdings gibt es auch Beispiele für Industrienationen, in denen Wildtiere als Erregerreservoir zur Verbreitung der Krankheit beitragen, wie z. B. Dachse in Großbritannien oder Opossums in Neuseeland (CLIFTON-HADLEY u. WILESMITH 1991).
