4 Ergebnisse
4.2 Erstellung von Deletionsmutanten
4.2.2 Colony Blot-Hybridisierung einer Cosmidbibliothek von M. tuberculosis
1 kb
0,5 kb
Abbildung 12 Agarosegel der PCR-Produkte zur Sondenerstellung
Das Amplifikat der PCR, die mit einer Annealingtemperatur von 52°C durchgeführt wurde, wurde mittels DNA-Labeling-kit mit Digoxigenin markiert.
4.2.2 Colony Blot-Hybridisierung einer Cosmidbibliothek von M. tuberculosis H37Rv zum Auffinden des arcA-Gens
Mit der erhaltenen Sonde wurden Cosmide einer Genombibliothek (pIW2) nach homologen Sequenzen durchsucht. Hierzu wurde eine Cosmidbibliothek von M. tuberculosis (H37Rv aus pYUB412, Genomgröße: 4,4 x 106 Basenpaare, ca. 40.000 bp Insertgröße) mit etwa 200 Kolonien pro Platte ausplattiert, auf Nylonmembranen übertragen und im Colony-Blot auf
homologe Sequenzen mit der generierten Sonde untersucht. Exemplarisch sind hier die Blotmembranen Nr. 2 und Nr. 5 dargestellt:
Abbildung 13 Colony Blot-Hybridisierungsmembranen (exemplarisch Nr. 2 und Nr. 5) mit
nummerierten, im Colony Blot signalgebenden Kolonien, die weiter untersucht wurden. Als Kontrolle (+) diente genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv
4.2.3 Southern Blot-Hybridisierung zur Bestätigung der Cosmide
Zwanzig signalgebende Kolonien wurden in der Southern Blot-Hybridisierung weiter untersucht.
Hierzu wurde anhand der Markierung auf den Membranen zurückverfolgt, um welche Klone es sich auf den Platten handelte. Diese wurden dann subkultiviert, die Cosmid-DNA präpariert und mit Restriktionsendonukleasen geschnitten.
In der ersten Southern Blot-Hybridisierung wurde das Enzym NotI verwendet, das ein 3402 bp großes Fragment, in dem das arcA-Gen vorliegt, herausschneidet. Dieses Fragment wird von der Sonde 1 kenntlich gemacht. Liegt in dem Cosmid kein arcA-Gen vor, bindet die Sonde nicht und auf dem Röntgenfilm ist kein Signal zu erkennen.
Die folgende Abbildung zeigt, dass das erhaltene NotI-Fragment (3402 bp) in fünf Fällen eine Bindung mit der oben genannten Sonde einging.
Zur Lage des NotI-Fragmentes s. Abb. unten
g 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 g 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Abbildung 14 Southern Blot-Hybridisierung der Cosmide (NotI). Zusätzlich zu den zu untersuchenden Cosmiden wurde genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (g) zur Kontrolle mitgeführt.
Hierbei zeigt sich die Notwendigkeit der Southern Blot-Hybridisierung. 15 der 20 in der Colony Blot-Hybridisierung detektierten Cosmide waren falsch positiv, gaben also auf dem Colony Blot-Röntgenfilm ein Signal, obwohl aufgrund fehlender Homologie keine Bindung mit der Sonde eingegangen worden sein kann. Die Ursache dieser Fehlbindung ist unbekannt.
Vier dieser fünf Cosmide (Nr. 1, 5, 16, 17 und 19) wurden in einer weiteren Southern Blot-Hybridisierung (HpaI-/XmnI-Verdau) verifiziert. Das fünfte Cosmid (Nummer 19) erwies sich als unvollständig.
Im SphI-Verdau konnte gezeigt werden, dass Nummer 19 unvollständig war. Demzufolge konnte dieses Cosmid nicht verwendet werden.
Die folgende Abbildung zeigt die entsprechenden Enzymschnittstellen. Abgebildet ist das HpaI-/XmnI-Fragment (7308 bp):
I 5869 Sph I 4843
Not Sph I 2379
Not I 2467
Sph I 3213
0 2 4 6 kb
Rv0999 Rv1000 arcA Rv1002c Sonde1
Abbildung 15 Lage der Enzymschnittstellen für die Southern Blot-Hybridisierungen
Die erwarteten Fragmente hatten folgende Größen:
HpaI/XmnI 7.308 bp
NotI 3.402 bp
SphI 834 und 1.630 bp
SphI-Verdau verursacht zwei Fragmente (834 und 1.630 bp), da das Enzym eine Schnittstelle im Sondenbereich hat. Nachfolgend abgebildet (Abbildung 16) ist der HpaI-/XmnI-Verdau der Cosmide. Hierbei zeigt sich, dass Nr. 19 zwar ein Signal gibt, also an der Sonde bindet, jedoch nicht die erwartete Fragmentgröße von 7.308 bp aufweist.
HpaI-/XmnI-Verdau
g 1 5 16 17 19
7 kb
Abbildung 16 Southern Blot-Hybridisierung der in der Colony Blot-Hybridisierung signalgebenden Cosmide (HpaI-/XmnI). Als Kontrolle wurde genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (g) mitgeführt.
Das Cosmid Nr. 19 bindet nicht im erwünschten Fragment. Dies bedeutet, dass zwar Homologien zur Sonde vorhanden sind, jedoch nicht das vollständige HpaI-/XmnI-Fragment.
Es ist somit möglich, dass das Cosmid auch im Bereich des arcA-Gens unvollständig ist. Da das HpaI-/XmnI-Fragment relativ groß ist (7.308 bp) wurde Cosmid Nr. 19 auch in den weiteren Southern Blot-Hybridisierungen mitgeführt. Die Cosmide wurden in NotI und SphI-Southern Blot-Hybridisierungen verifiziert. Auf dem nachfolgend abgebildeten Röntgenfilm (Abbildung 17) sind beide Southern Blot-Hybridisierungen dargestellt:
NotI-Verdau SphI-Verdau g 1 5 16 17 19 g 1 5 16 17 19
3 kb
1,6 kb 1 kb 0,5 kb
Abbildung 17 Southern Blot-Hybridisierung der Cosmide (NotI und SphI). Als Kontrolle diente genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (g).
In den NotI-verdauten Genomen, die mittels Southern Blot-Hybridisierung untersucht wurden, war diesmal kein Signal des Cosmids Nr. 19 erkennbar.
In der SphI-verdauten Southern Blot-Hybridisierung war das signalgebende Fragment ca.
1.200 bp groß. Da keines der erwarteten Fragmente für SphI diese Größe aufwies, war immer noch unklar, in welchem Bereich das Cosmid unvollständig ist. Cosmid Nr. 19 wurde deshalb verworfen.
4.2.4 Isolierung des arcA-Gens
Aus dem Cosmid Nummer 17 (entspricht pCR4) wurde das HpaI-/XmnI-Fragment (7.308 bp) in einen Bluescript-Vektor (pBSK-) subkloniert (pCR7).
Dieses Konstrukt wurde aus praktischen Gründen modifiziert (s. Methodenteil) und mit dem entstandenen Konstrukt pCR10 wurde eine Site-directed-mutagenesis durchgeführt, in deren Rahmen 489 bp aus dem arcA-Gen deletiert wurden.
4.2.5 Deletion mittels Site-directed-mutagenesis
Mittels oligonukleotidgerichteter Site-directed-mutagenesis können Punktmutationen vorgenommen und einzelne oder mehrere Basenpaare entfernt oder verändert werden. Mit diesem Ansatz sollte festgestellt werden, ob es möglich ist, auch größere Mengen Basenpaare (um 500 bp) zu deletieren. Hierzu wurden zunächst die Primer generiert. Diese sollten grundsätzlich zwischen 25-45 bp lang sein, 40 % Gehalt haben, in einer oder mehr G/C-Paaren enden und eine Schmelztemperatur haben, die ca. 10°C über der Extensionstemperatur von 68°C liegt. Die gewünschte Deletion sollte sich jeweils in der Mitte der Primer befinden, flankiert von 10-15 mit dem Ausgangskonstrukt (template) übereinstimmenden Basenpaaren.
Mit den so konstruierten Primern ArcA5 und ArcA6 (Schmelztemperatur laut MWG Biotech:
62°C) wurde das Ausgangskonstrukt pCR10 (template) einer PCR ausgesetzt.
Das Plasmid pCR10 enthält kein vollständiges arcA-Gen. Es handelt sich hierbei um ein Arbeitsplasmid. Eine Verkleinerung des Ursprungsplasmids war nötig, da dieses über 10.000
bp groß war. Ein Plasmid dieser Größe ist schwierig in der PCR zu amplifizieren, da die Extensionszeit relativ lang gewählt werden muss.
Das Programm der PCR orientierte sich an den Vorgaben von Stratagene (Quick-change-site-directed-mutagenesis-Anleitung von Stratagene)
Eine Schwierigkeit stellte hierbei die Anzahl der Zyklen dar. Eine Zyklenzahl zwischen 12 und 18 Zyklen wird von Stratagene vorgeschlagen. Grundsätzlich sollten mehr Zyklen gewählt werden, je größer die gewünschte Deletion ist. Bei einer höheren Zyklenzahl erhöht sich jedoch auch die Wahrscheinlichkeit von Amplifikationsfehlern. Das ausgewählte Programm, mit dem es schließlich gelang, das Plasmid zu amplifizieren lautete:
1. Denaturieren 95°C 30 sec 1x
Das Produkt der PCR wurde mit dem Restriktionsenzym DpnI behandelt. Dieses Enzym schneidet die methylierte Ausgangs-DNA, so dass lediglich das PCR-Produkt ohne Template-DNA übrigbleibt. 5 µl dieses Verdaus wurden mittels Agarosegelelektrophorese kontrolliert.
Das Ausgangskonstrukt war hierbei 4.568 bp, das Amplifikat mit der gewünschten Deletion 4.079 bp groß, wie in Abbildung 18 dargestellt.
PCR pCR10
4568 bp F1(-)
'arcA lacZ
ColE1 origin Ampicillin
pCR11
4079 bp F1(-)
'+1
arcA lacZ
ColE1 origin Ampicillin
Abbildung 18 Clonemanager-Programm-Darstellung der Site-directed-mutagenesis
Es war nicht klar, ob ein solches Amplifikat auf dem Gel sichtbar ist. Deshalb wurde jedes Amplifikat zunächst DpnI verdaut und in CaCl2-kompetente E. coli DH5∝ transformiert, auf antibiotikumhaltigem Nährboden ausplattiert und die gewachsenen Kolonien präpariert. Es stellte sich heraus, dass bei gelungener Site-directed-mutagenesis eine deutliche Bande auf dem gezeigten Agarosegel zu erkennen war.
L 1:10 1:100 - L
3 kb 5 kb
Abbildung 19 Amplifikate der mit 1:10 und 1:100 verdünnter Ausgangs-DNA durchgeführter Site-directed-mutagenesis. Als Größenmarker wurde 1-kb-DNA-Ladder (L) mitgeführt, als Negativkontrolle diente Aqua dest.
Mit dem oben genannten PCR-Programm gelang es, die Site-directed-mutagenesis durchzuführen und das PCR-Amplifikat in die kompetenten Zellen zu transformieren. Im Probeverdau mittels EcoRI wurde kontrolliert, ob die Kolonie das veränderte Plasmid enthält.
Im Probeverdau zeigte das Konstrukt die erwarteten Banden. Das EcoRI-Fragment (1.121 bp) wurde aus dem mutierten Plamid entnommen und gegen das vollständige EcoRI-Fragment (1.610 bp) in pCR9 ausgetauscht. Im entstandenen pCR12 lag somit ein bis auf die gewünschte Deletion vollständiges arcA-Gen vor. Da die Polymerase während der Amplifikation Ablesefehler macht, war es notwendig, die PCR-Amplifikate zu sequenzieren.
Da nur mit dem 1.121 bp-EcoRI-Fragment aus dem Amplifikat weitergearbeitet werden sollte, musste auch nur dieses Fragment sequenziert werden. Das EcoRI-Fragment aus pCR12 (1.121 bp) wurde von MWG Biotech nach Sanger sequenziert. Hierbei stellte sich heraus, dass die verwendete Pfu-Hotstart-Polymerase (angegebene Fehlerquote bei der Amplifikation laut Stratagene: 1,3 x 10-6) bereits im Bereich der ersten 200 bp drei Basen fehlerhaft amplifiziert hatte. Dieser Ansatz wurde daraufhin verworfen und der klassische, enzymatische Weg gewählt, um eine In-Frame-Deletion (522 bp) im arcA-Gen herbeizuführen.
4.2.6 Deletion im Arginindeiminase-Gen mittels Klonierung
Auch in diesem Fall konnte kein Plasmid mit einem vollständigen arcA-Gen verwendet werden, da in diesem Fall keine verwendbaren Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen vorhanden gewesen wären. Es wurde deshalb wieder auf das bereits für die Site-directed-mutagenesis verwendete Arbeitsplasmid pCR10 zurückgegriffen. Mittels NsiI-/SphI wurde aus pCR10 ein 518 bp großes Fragment herausgeschnitten, die 5´-3´-Überhänge des größeren Konstruktes mittels T4-Polymerase geblunted (Verlust von weiteren 4 bp) und das verbleibende Fragment religiert (pCR16). Da das arcA-Gen in pCR16 nicht vollständig vorlag, wurde ein Fragment aus pCR16 (1.058 bp) gegen das entsprechende EcoRI-Fragment in pCR9 (1.610 bp) ausgetauscht, um ein bis auf die gewünschte Deletion vollständiges arcA-Gen zu erhalten (pCR17). Aus diesem Konstrukt wurde das arcA-Gen mit drei unterschiedlich großen Flanken in den Suicide-Vektor pMP62 kloniert. Der Übersichtlichkeit halber ist die Konstrukterstellung der Suicide-Plasmide hier als Fließdiagramm dargestellt (s. Abbildung 20).
Aus dem Cosmid pCR4 wurde das HpaI-/XmnI-Fragment in den EcoRV geöffneten Vektor
Aus pCR7 wurde eine für die weitere Klonierung störende EcoRI-site deletiert. Zu diesem Zweck wurde pCR7 mit AscI-/XbaI-Restriktionsendonukleasen behandelt. Diese Enzyme
schnitten das Konstrukt in ein großes Fragment (9.156 bp), das zu pCR9 religiert wurde, und ein kleines Fragment (1.110 bp), das die unerwünschte Deletion enthielt.
pCR7
großes Fragm ent (9156 bp) lacZ
pCR9
Die 4 bp mehr resultieren aus dem Abdauen der Überhänge. pCR9 erwies sich als für die Site-directed-mutagenesis zu groß und mit für eine Deletionsklonierung ungeeigneten Sites ausgestattet. Daraufhin wurde das EcoRI-Fragment (1.610 bp) aus pCR9 in pBSK- kloniert.
Das daraus resultierende Plasmid wurde mit pCR10 bezeichnet. Hierbei blieb auch ein Teil des arcA-Gens im verbliebenen pCR9-Fragment zurück.
pCR10
das zu pCR16 religiert wirdEcoRV EcoRI
Das EcoRI-Fragment mit der Deletion (1.058 bp) aus pCR16 dem 7550 bp-Fragment aus pCR9 (beide EcoRI)
zu pCR17 ligiert.
pCR17
8608 bp
EcoRV
EcoRI EcoRV
EcoRI
-2 arcA -1 '+1
lacZ
ColE1 origin Ampicillin
Aus pCR17 wurde 3x ein Fragment unterschiedlicher Größe in die PacI-Restriktionsstelle des Suicide-Vektor pMP62 kloniert.
Das erste Fragment besaß 2 kleine Flanken, das zweite 2 große Flanken und das dritte 1 große und 1 kleine Flanke (Flanken als Region markiert):
pMP62
9917 bps PacI PacI
OriE
Cos Cos amp
Hygromycin 'groEL
sacB
sacR groEL'
0 1 kb
kleine Flanken-Insert (1042 bp EcoRV-/
MluI-Fragment) aus pCR17
1 große, 1 kleine Flanke (2287 bp BclI-/MluI-Fragment) aus pCR17
Das Konstrukt pMP62 mit dem die Suicide-Plasmide erstellt wurden, ist ein nicht-replikativer Vektor (9917 bp). Es enthält eine Hygromycinresistenz und eine Ampicillinresistenz, ein sacB-Gen und ein OriE, d.h. es repliziert in E. coli. Es besitzt jedoch keinen „Origin of replication“ für Mykobakterien (OriM), ist also nicht in der Lage, sich in Mykobakterien zu replizieren. Der Sinn der Transformation von nicht-replikativen Plasmiden besteht darin, dass es nach der Transformation zur Integration des Plasmides im Bakteriengenom kommt (Single-crossing-over). Durch weitere Manipulation wird ein Double-crossing-over (Verlust des Wildtypgen) provoziert.
Diese das arcA-Gen mit der Deletion enthaltenden Suicide-Plasmide wurden in M. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis Erdmann und M. bovis BCG transformiert. Hierbei
zeigte sich keine von der Flankengröße abhängige Transformationseffizienz.
Zur Erzeugung von ∆arcA-Mutanten waren folgende Schritte nötig:
• Selektion für das Plasmid zum Auffinden der Transformanten
• Integration des Plasmids im Genom (Rekombination)
• Kontrolle der Rekombination mittels PCR
• Kontrolle der Homologen Rekombination mittels Southern Blot-Hybridisierung
• Elimination des Wildtypgen
• Kontrolle der Elimination des Wildtypgen mittels Sucrosesubkultur
• Bestätigung der Elimination durch Ausplattieren auf AB-haltigem Nährboden und
• Kontrolle der Mutanten in der Southern Blot-Hybridisierung.
4.2.7 Positive Selektion für das Insert
Die Plasmid-Klonierungsvektoren waren in Besitz eines Gens, das den Wirtszellen Hygromycinresistenz verlieh. Auf diese Weise konnte davon ausgegangen werden, dass
sämtliche, nach 4-6 Wochen auf hygromycinhaltigem Nährboden gewachsenen Kolonien der Transformation plasmidhaltig waren.
Diese Transformanten wurden eine Woche in Flüssigkultur mit Antibiotikumzusatz inkubiert.
Mit einer Frequenz von 1 x 10-4 wird in dieser Zeit das Plasmid über ein „Single-crossing-over“ in das Bakteriengenom integriert.
Zur Kontrolle wurden mit Hilfe der PCR (Primer Arg1 und ArcA7) aus der genomischen DNA der Transformanten Amplifikate erstellt. Hierbei wurde aus dem Wildtyp ein 1.329 bp großes Amplifikat gebildet. Sofern ein „Single-crossing-over“ stattgefunden hatte, wurde zusätzlich zu diesem ein 777 bp großes Amplifikat aus dem Plasmid generiert. In diesem Fall war die Amplifikationsbande des Wildtyps auf dem Gel nur noch schemenhaft erkennbar, da das kleinere DNA-Stück des Plasmids bevorzugt amplifiziert wurde (s. Abbildung 22).
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 L w p L
1,6 kb 1 kb
Abbildung 21 PCR zur Überprüfung der Rekombination. Zusätzlich zu den Amplifikaten der zu testenden Kolonien, wurde zur Kontrolle ein 1-kb-DNA-Ladder, genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (g) zum Ausschluss des Wildtyps und pCR20 (w) zur Kontrolle der gewünschten Amplifikatgröße.
Im gezeigten Gelbild wird deutlich, dass aus Kolonie Nr. 2, 3, 5 und 12 ein 777 bp großes Amplifikat gebildet werden konnte. In diesen Kolonien hatte demnach ein „Single-crossing-over“ stattgefunden. Aus den übrigen Kolonien wurde nur die Wildtypbande vom Amplifikat auf dem Gel sichtbar. Diese Kolonien konnten demnach nicht weiter verwendet werden.
4.2.8 Überprüfung auf homologe Rekombination
Bei diesen Rekombinanten musste nun zwischen erwünschter homologer Rekombination (Integration am Genort) und unerwünschter homeologer Rekombination (Integration irgendwo im Genom) unterschieden werden.
Die in der PCR detektierten Rekombinanten wurden in der Southern Blot-Hybridisierung auf homologe Rekombination überprüft. Hierzu wurde ein im Plasmid nicht schneidendes Enzym ausgewählt (EcoNI) und die genomische DNA der Rekombinanten damit geschnitten.
Das arcA-Gen enthaltende EcoNI-Fragment des Wildtyps war bei der Integration am Genort/homologer Rekombination um die Größe des Plasmid-Klonierungsvektors (13.440 bp bei pCR20) vergrößert. Es entstand ein großes Fragment.
Bei einer Rekombination außerhalb des Genortes entstanden zwei von der arcA-Sonde detektierte Fragmente: das Wildtyp-Fragment (6.007 bp) und ein weiteres Fragment unbekannter Größe (Größe des Plasmid-Klonierungsvektors + Größe des EcoNI-Fragmentes, an dem es integriert hat).
Ein Verschwinden der Wildtyp-Bande (nur eine Bande auf dem Röntgenfilm der Southern Blot-Hybridisierung sichtbar) konnte also als Beweis einer homologen Rekombination angesehen werden (s. Nr.4 und 16 in Abbildung 23).
g 1 3 4 16 78 116 118 141 153
19 kb
6 kb
Abbildung 22 Southern Blot-Hybridisierung zur Überprüfung auf homologe Rekombination (EcoNI).
Zur Kontrolle wurde genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (g) mitgeführt, um die unerwünschte Wildtypbande bestimmen zu können.
Aus dem gezeigten Blot wird ersichtlich, dass es oft nicht deutlich zu erkennen ist, bei welchen Klonen eine legitime Rekombination stattgefunden hat. Im vorliegenden Blot wurden nur Nr. 4 und Nr. 16 als homolog eingestuft (eindeutig nur eine Bande) und weiterverwendet.
4.2.9 Entfernung des Wildtypgens mittels „Ausloopen“ („Double-crossing-over“)
Die legitimen Rekombinanten wurden ohne Antibiotikumzusatz in 7H9-Medium kultiviert. In dieser Kultur wird nach ca. 14 Tagen ohne Selektionsdruck der positive Selektionsmarker (Hygromycinkassette) und mit ihm das Wildtypgen und ein negativer Selektionmarker (sacB-Gen) „ausgeloopt“, das heißt, das nicht benötigte Gen für Antibiotikumresistenz und mit ihm das sacB-Gen werden aus dem Genom eliminiert.
Die Kontrolle der Elimination dieser Gene (des „Ausloopens“) erfolgte durch das Ausplattieren auf Saccharose- (Sucrose-) haltigem Nährboden. Wenn das Wildtypgen (und somit auch das sacB-Gen) nicht „ausgeloopt“ wurde, bildete die Rekombinante mit dem sacB-Gen aus der Sucrose Levansäuren, die cytotoxisch wirkten. Es handelte sich somit um eine Selektion gegen den Vektor (sacB = negativer Selektionsmarker). Alle auf Sucrose gewachsenen Kolonien mussten somit „ausgeloopt“ haben und eine Deletion im arcA-Gen besitzen.
4.2.10 Ausplattieren zur Bestätigung der Elimination des Wildtypgens
Die Bestätigung erfolgte zunächst durch „Pick&Patch“ der auf Sucrose gewachsenen Kolonien. Hierzu wurden die jeweiligen Kolonien etwa in der Mitte geteilt und auf 7H10/OADC-Platten mit und ohne Hygromycinzusatz ausplattiert.
An dieser Stelle funktionierte die Hygromycinresistenz als negativer Selektionsmarker, denn nur die Kolonien, die die Hygromycinresistenz ausgeloopt hatten, hatten auch das Wildtypgen verloren. Die Kolonien, die nicht mehr in der Lage waren, auf hygromycinhaltigem Nährboden zu wachsen, wurden durch Southern Blot-Hybridisierung kontrolliert.
4.2.11 Überprüfung der Mutanten in der Southern Blot-Hybridisierung
Hierbei wurde zunächst ein PvuI-Verdau gewählt, bei dem das erwartete Fragment für die Mutante größer war (1.406 bp) als das Fragment des Wildtyp (1.111 bp), da beim Wildtyp eine Enzymschnittstelle vorhanden war, die im Bereich der Deletion lag und somit bei der Mutante fehlte.
Hierzu wurde eine neue Sonde verwendet (Sonde 2), die außerhalb der Deletion bindet. Die Herstellung der Sonde verlief analog zur Herstellung von Sonde 1, jedoch mit den Primern ArcASeq3 und ArcA8. Die verwendete Sonde 2 und die entsprechenden Enzyme sind schematisch in der folgenden Abbildung 24 dargestellt:
PvuI 1896 EcoRI 2122
PvuI 2738 EcoRI 3732 PvuI 3849
0 1 2 Deletion 3 4 5 kb
Rv0999 Rv1000 arcA Rv1002c
Sonde2
Abbildung 23 Lage der Enzymschnittstellen für die Southern Blot-Hybridisierung zur Überprüfung der Mutanten
Nachfolgend wurden alle Mutanten, die in der Lage waren, auf Sucrose, jedoch nicht auf Hygromycin zu wachsen, untersucht. Die folgende Southern Blot-Hybridisierung (s.
abbildung 25) detektiert die arcA-Mutanten. Mitgeführt wurde genomische DNA von M.
tuberculosis H37Rv, um die Mutanten deutlich vom Wildtyp unterscheiden zu können:
g 4 5 11 16 19 22
1,6 kb
1 kb
Abbildung 24 Southern Blot-Hybridisierung der Mutanten (PuvI), zur Kontrolle wurde genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (g) mitgeführt.
Nr. 5, 11, 19 und 22 zeigten hierbei die für die Mutante erwartete Bande von 1.406 bp, alle anderen entsprachen dem Wildtyp (1.111 bp großes Fragment).
Die Mutanten wurden in einem weiteren Blot (EcoRI-Verdau) überprüft. Hierbei war das beim Wildtyp detektierte Fragment 1.610 bp groß, das entsprechende Fragment der Mutante jedoch nur 1.063 bp. Da hierbei auch Mutanten von M. bovis BCG getestet wurden, wurde zusätzlich zur genomischen DNA von M. tuberculosis H37Rv (w1) auch genomische DNA von M. bovis BCG (w2) mitgeführt. Zur Kontrolle der Bandengröße der Mutanten wurde das Plasmid pCR20 1:1.000 verdünnt (p) mitgeführt, das ebenfalls die gewünschte Deletion im Arginindeiminasegen aufweist und demnach eine mit den Mutanten identische Bandengröße besitzen muss (s. Abbildung 26).
w1 w2 p 11 22 146 148
1,5 kb 1 kb
Abbildung 25 Southern Blot-Hybridisierung der Mutanten (EcoRI), zur Kontrolle der M. tuberculosis-Mutanten wurde genomische DNA von M. tuberculosis H37Rv (w1) mitgeführt, sowie genomische DNA von M. bovis BCG (w2) zur Kontrolle der BCG-Mutanten und das 1:1.000 verdünnte Plasmid pCR20, das das gleiche signalgebende Fragment aufweisen muss wie die Mutanten.
Alle im PvuI-Blot erkannten Mutanten zeigten die erwartete 1.063 bp große Bande im EcoRI-Blot, die ebenso groß wie beim Plasmid pCR20a ist, das hier zur Kontrolle der gewünschten Bandengröße mitgeführt wurde.
4.3 Funktionsassay der Mutanten
Die Mutanten wurden auf die Bildung von Ammoniak aus Arginin unter anaeroben und aeroben Bedingungen untersucht. Hierzu wurden sie wiederum in MB-Medium (+ADS) mit 10 mM Argininzusatz aerob und anaerob bebrütet und die gebildete Menge Ammoniak gemessen (s. Abbildung 27 und 28).
Tag
0 5 10 15 20 25
Ammoniakgehalt in µmol/l
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000
MB+Arginin H37Rv
CR1 (H37Rv-Mutante) Erdmann
CR2 (Erdmann-Mutante) BCG
CR3 (BCG-Mutante) Negativkontrolle
Abbildung 26 Ammoniakbildung von Mutanten und Wildtyp, OD600, 10 mM Argininzusatz, anaerobe Bebrütung
Tag
0 5 10 15 20 25
Ammoniakgehalt in µmol/l
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
MB+Arginin H37Rv
CR1 (H37Rv-Mutante) Erdmann
CR2 (Erdmann-Mutante) BCG
CR3 (BCG-Mutante) Negativkontrolle
Abbildung 27 Ammoniakbildung von Mutanten und Wildtypen, OD600, 10 mM Argininzusatz, aerobe Bebrütung
Hierbei wurde deutlich, dass ein Zusammenhang zwischen dem arcA-Gen und der Bildung von Ammoniak aus Arginin besteht. Sämtliche ∆arcA-Mutanten bildeten Ammoniak im Referenzbereich der Negativkontrollen.
4.4 Komplementierung der ∆arcA-Mutanten von Mycobacterium tuberculosis
Zur Bestätigung, dass die verminderte Ammoniakproduktion auf der Deletion im arcA-Gen beruht, wurden die M. tuberculosis-Mutanten mit einem Plasmid komplementiert, das ein vollständiges arcA-Gen enthält (pCR5). Hierzu wurde ein 4003 bp großes EcoRv-Fragment aus pCR7 entnommen und in den EcoRV-geöffneten Vektor pMV306kanamycin kloniert.
Aufgrund der großen Flanken konnte als sicher angenommen werden, dass ein vollständiges arcA-Gen in pCR5 (gezeigt in Abbildung 29) vorhanden ist.
pCR5
pCR5