Etablierung des Ammoniaktest

Hierzu wurde ein System der Firma Roche, das Ammoniak mit Hilfe einer enzymatischen Reaktion nachweist, verwendet. Das System beruht auf der enzymatischen Reaktion von 2-Oxoglutarat zu L-Glutamat in Anwesenheit von Ammoniak (NH4), wobei die gleichzeitige Oxidation von NADH zu NAD⁺ photometrisch bestimmt wird.

Die Reaktionsgleichung lautet:

GldH

2-Oxoglutarat + NADH + NH₄⁺ L-Glutamat + NAD⁺ + H₂O

Abbildung 2 Reaktionsgleichung des Roche Ammoniak Test

Anhand des Extinktionskoeffizienten von NADH bei 340 nm läßt sich mittels einer Formel der Ammoniakgehalt berechnen.

Die Ammoniakbestimmungen sollten in Minimalnährmedium (MB-Medium) mit Arginin und ADS-Zusatz durchgeführt werden. Daher wurden zunächst verschiedene Konzentrationen von Ammoniak in verändertem MB-Medium (ohne NH4Cl-Zusatz in den Grundsalzen) bestimmt.

Es wurde mit dem von Boehringer bei unbekannter Ammoniakkonzentration empfohlenen Probevolumen von 1 ml begonnen. Die Ammoniakkonzentration einer Verdünnungsreihe wurde gegen die gemessene Extinktionsdifferenz aufgetragen, um den linearen Bereich abzuschätzen. In Abbildung 3 ist der gemessene Extinktionskoeffizient bei einem Probevolumen von 1 ml im Verhältnis zu einer Ammoniakverdünnungsreihe aufgetragen.

vorgegebene Menge Ammoniak in MB-Medium in µmol/l

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Extinktionsdifferenz

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

Abbildung 3 Linearität der Ammoniakmessung bei v = 1 ml

Bei dieser ersten Messung mit einem Probevolumen von 1 ml zeigte sich, dass der Test in einem Bereich zwischen 100 µM und 1 mM linear ist, obwohl die Messung nicht in klarem Medium durchgeführt wurde. Die Trübung des MB-Medium beeinflußt den Test nicht signifikant, da der Extinktionskoeffizient des mitgeführten Leerwertes (MB-Medium) abgezogen wird. Da laut Boehringer der lineare Bereich bis ∆E = 1,0 verwertbar ist, kann somit mit einem Probevolumen von 1 ml ein Bereich von 100 µM bis ca. 750 µM Ammoniak gemessen werden.

Um Werte außerhalb dieses Bereiches messen zu können, wurde bei einer Ammoniakkonzentration oberhalb von 750 µM das Probenvolumen reduziert (minimal: 0,1 ml), bzw. unterhalb von 100 µM das Probevolumen erhöht.

Das maximale Probevolumen beträgt 2 ml, wodurch sich eine Sensitivität von ca. 30 µM ergab. Das heißt, dass mit einem Probevolumen von 2 ml Ammoniakkonzentrationen ab ca.

30 µM erfasst werden konnten. Der lineare Bereich lag bei einem Probevolumen von 2 ml etwa zwischen 30 µM und 300 µM. Da auch hier ∆E-Werte über 1,0 nicht verwertet werden konnten, konnten mit einem Probevolumen von 2 ml Ammoniakgehalte von 30 µM bis 250 µM detektiert werden (s. Abbildung 4).

vorgegeben Menge Ammoniak in MB-Medium in µmol/l

0 200 400 600 800 1000 1200

Extinktionsdifferenz

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

Abbildung 4 Linearität der Ammoniakmessung bei v = 2 ml

Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen genügte der Nachweis einer maximalen Konzentration von 30 mM.

Die Messung einer solchen Konzentration im linearen Bereich wurde durch eine Verdünnung der Probe erreicht (das minimale Probevolumen v = 0,1 ml wurde als 1:10-Verdünnung verwendet). Es wurden also 100 µl der zu bestimmenden Flüssigkeit 1:10 in MB-Medium verdünnt und 100 µl der Verdünnung im Test verwendet. Der Verdünnungsfaktor ging in die Formel zur Berechnung des Ammoniakgehaltes ein (s.

Abbildung 5).

vorgegebene Menge Ammoniak in MB-Medium in µmol/l

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000

Extinktionsdifferenz

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

Abbildung 5 Linearität der Ammoniakmessung bei v = 0,1 ml (1:10)

Diese Versuche zeigen, dass dieses enzymatische Testsystem in MB-Medium, das neben Albumin und Glycerol auch das Detergens Tween enthält, Ammoniak in einem Bereich

zwischen 3 µM und 30 mM nachweisen kann. Wie weit die Linearität bei einer weiteren Verdünnung der Probe reicht, wurde nicht ausgetestet, da für die gewünschten Untersuchungen eine Detektion einer Ammoniakkonzentration von 30 mM ausreichend war.

Theoretisch wäre aufgrund der vorliegenden Tests, sofern man den Verdünnungsfehler berücksichtigt, in MB-Medium eine unendliche Verdünnung möglich. Der Beginn des linearen Meßbereichs liegt bei diesem Probevolumen bei ca. 5 mM. Das nicht ausgetestete Ende des linearen Bereiches (∆E = 1,0) läge rechnerisch bei 45 mM. Im nächsten Experiment (s. Abbildung 6) wurde die anaerobe Desaminierung von Arginin und 17 weiteren Aminosäuren durch M. bovis BCG unter anaeroben Bedingungen verglichen. Hierbei sollte festgestellt werden, ob alle Aminosäuren eine ähnliche Ammoniakakkumulation verursachen.

Tag

Abbildung 6 Ammoniakbildung unter anaeroben Bedingungen von M. bovis BCG (OD600:0,25) mit 10 mM Aminosäuren-Zusatz

Nach 30 Tagen war in den Kulturen mit Arginin, Asparagin, Glutamin, Aspartat und Leucin Ammoniak akkumuliert worden. Lediglich aus Arginin schien kontinuierlich Ammoniak gebildet zu werden. Bei den anderen Aminosäuren beobachtete man zunächst einen steilen Anstieg, gefolgt von einem Plateau. Dieses Plateau lag in den Kulturen mit Glutamin und Asparagin zwischen 5 mM und 6 mM. Bei Leucin und Aspartat war es mit 2 mM deutlich niedriger. Aus den anderen Ansätzen mit Aminosäuren war weniger oder keine Ammoniakbildung zu messen. Dieser Testansatz wurde mit verschiedenen Aminosäuren unter anaeroben und unter aeroben Bedingungen untersucht, um festzustellen, ob sich die Ammoniakbildung unter aeroben und unter anaeroben Bedingungen grundsätzlich unterscheidet (s. Abbildung 7 und 8). Aufgrund zu erwartender höherer Ammoniakakkumulation (und somit kürzerer Versuchsansätze) wurde hierbei eine OD600 von 0,5 gewählt.

Tag

0 10 20 30 40

Ammoniakgehalt in µmol/l

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000

BCG ohne AS Arginin Asparagin Glutamin

Abbildung 7 Ammoniakbildung aus ausgewählten Aminosäuren durch M. bovis BCG, anaerobe Bebrütung, OD 600: 0,5; 10 mM Aminosäurenzusatz

Tag

0 10 20 30 40

Ammoniakgehalt in µmol/l

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

BCG ohne AS Arginin Asparagin Glutamin

Abbildung 8 Ammoniakbildung aus ausgewählten Aminosäuren durch M. bovis BCG, aerobe Bebrütung, OD ⁶⁰⁰: 0,5; 10 mM Aminosäurenzusatz

Die bisher gezeigten Experimente sollten lediglich eine grobe Orientierung über die Desaminierung verschiedener Aminosäuren durch Mycobacterium bovis BCG liefern.

Wegen der langen Dauer und des relativ großen Materialaufwandes wurde auf eine Wiederholung zu statistischen Zwecken verzichtet. Stattdessen wurden die Ansätze im weiteren Verlauf dieser Arbeit ausschließlich auf aerobe und anaerobe Desaminierung von Arginin beschränkt. Darüber hinaus wurde neben dem Impfstamm M. bovis BCG nun auch der Erreger der Tuberkulose, M. tuberculosis, miteinbezogen.

Die folgenden beiden Experimente zeigen die anaerobe und aerobe Desaminierung von L-Arginin durch M. bovis BCG und M. tuberculosis im direkten Vergleich (s. Abbildung 9 und 10).

Die Wildtypen von M. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis Erdman und M. bovis BCG unterscheiden sich nicht nennenswert in der Ammoniakbildung. Auch ein wesentlicher Unterschied zwischen aeroben und anaeroben Bedingungen ist nicht belegbar.

Tag

0 5 10 15 20 25

Ammoniakgehalt in µmol/l

-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000

H37Rv Erdmann BCG

Negativkontrolle

Abbildung 9 gemessene Ammoniakbildung der Wildtypen mit Standardabweichung, anaerobe Bebrütung, OD 600: 0,5; 10 mM Argininzusatz

Tag

0 5 10 15 20 25

Ammoniakgehalt in µmol/l

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

H37Rv Erdmann BCG

Negativkontrolle

Abbildung 10 gemessene Ammoniakbildung der Wildtypen mit Standardabweichung, aerobe Bebrütung, OD 600: 0,5; 10 mM Argininzusatz

Da diese Versuchsansätze keinerlei Unterschiede in Bezug auf die Negativkontrollen und keine Verfälschungen der Testergebnisse zeigen, bestand somit ein geeigneter Funktionsnachweis, um zu testen, ob eine Deletionsmutante im Bereich des arcA-Gens einen Einfluss auf die Ammoniakbildung aus Arginin besitzt.

Daraufhin wurde eine Deletionsmutante erstellt.