Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung von hochdruckbehandelten, frischen Wels- und mildgeräucherten Forellenfilets auf den sensorischen,
physikalischen und mikrobiellen Status, insbesondere auf Listeria monocytogenes
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin – Doctor medicinae veterinariae –
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Ruth Anna Lisa Perihan Mengden Hamburg
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Günter Klein
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Günter Klein 2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Frerk Feldhusen Tag der mündlichen Prüfung: 12.05.2014
Diese Arbeit wurde durch das Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV) vertreten durch die Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung (BLE) unter dem Kennzeichen 511-06.01-28-1-63.021-07 gefördert.
Teilergebnisse dieser Dissertation wurden an folgenden Stellen veröffentlicht:
A. Kastner, G. Klein (2010):
„Mikrobiologische Qualität von Fischerzeugnissen nach Hochdruckbehandlung“
(Poster mit erweitertem Abstract)
In: 51. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebensmittelhygiene“ der DVG e.V., Garmisch-Partenkirchen vom 28.09. bis 01.10., Sonderausgabe Amtstierärztlicher Dienst, ISSN 0945-3296
A. Kastner, R. Mengden, N. Sudhaus, G. Klein (2011):
„Einfluss der Hochdruckbehandlung auf Listeria monocytogenes nach Inokulation in frischen Welsfilets“ (Poster mit erweitertem Abstract)
In: 52. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebensmittelhygiene“ der DVG e.V., Garmisch-Partenkirchen vom 27.09. bis 30.09., Sonderausgabe Amtstierärztlicher Dienst, ISSN 0945-3296
R. Mengden, A. Röhner, G. Klein (2012):
„Sensorische Begutachtung von mild geräuchertem Forellenfilet sowie von frischem Welsfilet nach Hochdruckbehandlung“ (Poster mit erweitertem Abstract)
In: 53. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebensmittelhygiene“ der DVG e.V., Garmisch-Partenkirchen vom 25.09. bis 28.09., Sonderausgabe Amtstierärztlicher Dienst, ISSN 0945-3296
Sowie In: Trialog 2012 zwischen Wissenschaft, Wirtschaft und Überwachung, Zentrum für Tiergesundheit und Lebensmittelqualität, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover am 27.11.2012
A. Röhner, R. Mengden, G. Klein (2012):
„Reduktion von L. monocytogenes und E. coli in mild geräucherten Forellenfilets mittels Hochdruckbehandlung“ (Poster mit erweitertem Abstract)
In: 53. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes „Lebensmittelhygiene“ der DVG e.V., Garmisch-Partenkirchen vom 25.09. bis 28.09., Sonderausgabe Amtstierärztlicher Dienst, ISSN 0945-3296
INHALTSVERZEICHNIS
V Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis………...………V Abkürzungsverzeichnis………VIII
1 EINLEITUNG ... 1
2 SCHRIFTTUM ... 3
2.1 Hygiene und Gefahren des Lebensmittels Fisch ... 3
2.1.1 Wels ... 5
2.1.2 Forelle ... 6
2.2 Mikroorganismen ... 7
2.2.1 Listeria monocytogenes ... 7
2.2.2 Escherichia coli ... 10
2.2.3 Weitere Mikroorganismen ... 11
2.3 Das Hochdruckverfahren ... 14
2.3.1 Geschichte ... 14
2.3.2 Funktionsweise und Technologie ... 15
2.3.3 Anwendungsgebiete und –möglichkeiten hinsichtlich Lebensmittel .... 17
2.3.4 Rechtlicher Hintergrund ... 19
2.4 Auswirkungen der Hochdruckbehandlung auf Mikroorganismen ... 20
Listeria monocytogenes ... 21
Escherichia coli ... 23
Aerobe mesophile Gesamtkeimzahl und weitere Mikroorganismen ... 23
2.5 Auswirkungen der Hochdruckbehandlung auf physikalische Eigenschaften ... 25
3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN ... 30
3.1 Materialien ... 30
3.1.1 Fischfilets ... 30
3.1.2 Mikroorganismen ... 30
INHALTSVERZEICHNIS
VI
3.2 Methoden ... 31
3.2.1 Herstellung der Suspensionen ... 31
3.2.2 Beimpfung, Verpackung und Lagerung ... 31
3.2.3 Hochdruckanlagen ... 33
3.2.4 Hochdruckbehandlung ... 35
3.2.5 Übersicht der Untersuchungen ... 37
3.2.6 Mikrobiologische Untersuchungen ... 39
3.2.7 Physikalische Untersuchungen ... 47
3.2.8 Sensorische Untersuchungen ... 49
3.3 Statistische Auswertungen ... 52
4 ERGEBNISSE ... 53
4.1 Mikrobiologische Untersuchungen ... 53
4.1.1 Quantitativer Nachweis von Listeria monocytogenes ... 53
4.1.2 Qualitativer Nachweis von Listeria monocytogenes ... 57
4.1.3 Quantitativer Nachweis von Escherichia coli ... 57
4.1.4 Quantifizierung der aeroben mesophilen Gesamtkeimzahl ... 59
4.1.5 Quantitativer Nachweis weiterer Mikroorganismen ... 62
4.2 Physikalische Untersuchungen ... 65
4.2.1 pH-Wert ... 65
4.2.2 aw-Wert ... 67
4.2.3 Farbwerte ... 68
4.3 Sensorische Untersuchungen ... 71
5 DISKUSSION ... 77
5.1 Diskussion von Material und Methoden ... 77
5.2 Diskussion der Ergebnisse ... 80
5.2.1 Untersuchung auf Listeria monocytogenes ... 80
5.2.2 Untersuchung auf Escherichia coli ... 84
5.2.3 Aerobe mesophile Gesamtkeimzahl ... 85
5.2.4 Weitere Mikroorganismen ... 87
5.2.5 pH-Wert ... 89
INHALTSVERZEICHNIS
VII
5.2.6 Farbwerte und sensorische Befunde ... 91
5.2.7 Abschließende Diskussion und Ausblick ... 95
6 SCHLUSSFOLGERUNGEN ... 98
7 ZUSAMMENFASSUNG ... 100
8 SUMMARY ... 103
9 LITERATURVERZEICHNIS ... 106
10 ANHANG ... 131
10.1 Geräte, Verbrauchsmaterialien und Medien ... 131
10.2 Tabellenverzeichnis ... 141
10.3 Abbildungsverzeichnis ... 144
10.4 Tabellenanhang ... 146
11 DANKSAGUNG ... 159
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
VIII
Abkürzungsverzeichnis:
aw Freies Wasser
BfR Bundesinstitut für Risikobewertung BHI Brain Heart Infusion = Hirn-Herz-Bouillon
BMELV Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz
BVL Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit DGHM Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie
DIL Deutsches Institut für Lebensmitteltechnik
DSM-Nummer Nummer eines Keimes vergeben durch die DSMZ
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
E. coli Escherichia coli
EFSA European Food Safety Authority = Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit
et al. et alii = und andere
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations = Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen
FDA United States Food and Drug Administration
FIZ Fischinformationszentrum e.V.
GKZ Gesamtkeimzahl
°C Grad Celsius
H Stunde
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
IX HPP High-Pressure-Processing = Hochdruckbehandlung
lg Dekadischer Logarithmus
L. m. Listeria monocytogenes
LFGB Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuch KbE/g bzw. ml Kolonie-bildende Einheiten pro Gramm bzw. Milliliter
MAP modified atmosphere packaging = unter Schutzgasatmosphäre verpackt
Min Minute(n)
MPa Mega Pascal
MRI Max Rubner-Institut
MRS Agar nach deMan, Rogosa und Sharpe n Anzahl
NaCl Natriumchlorid OCLA OXOID chromogenic Listeria agar
pH pondus hydrogenii
RKI Robert Koch Institut
RTE ready-to-eat = verzehrsfertig/tafelfertig spp. Subspezies
St. I Standard I-Agar
TBX Tryptone Bile X-Glucuronide-Agar US Untersuchung VO Verordnung
EINLEITUNG
1 1 EINLEITUNG
Fisch ist bekannt für seine hohe ernährungsphysiologische Wertigkeit. Er ist leicht verdaulich, reich an essentiellen Aminosäuren sowie an Omega-3-Fettsäuren, Spurenelementen und Vitaminen. Aus heutiger Sicht ist es sinnvoll, mehr Fisch in den persönlichen Speiseplan zu integrieren, da seine Inhaltsstoffe zu einer gesunden, ausgewogenen Ernährungsweise beitragen.
Fisch ist aber auch ein leichtverderbliches Lebensmittel und damit darauf angewiesen, schnell verzehrt zu werden oder einen haltbarmachenden Prozess zu durchlaufen. Die wertgebenden Bestandteile gilt es dabei zu bewahren.
Als geeignetes Verfahren stellt sich die Hochdrucktechnologie dar. Mit ihr ist es möglich, Lebensmittel haltbar zu machen und gleichzeitig die wertvollen Inhaltsstoffe wie Vitamine, Spurenelemente und ungesättigte Fettsäuren zu schonen.
Um der Distribution von Fisch und Fischerzeugnissen weitere Wege zu ermöglichen, wird in dieser Arbeit die Anwendbarkeit der Hochdrucktechnologie auf frisches Wels- und mildgeräuchertes Forellenfilet untersucht. Ziel ist es dabei, den Frischecharakter und die produkttypischen Eigenschaften beizubehalten, gleichzeitig jedoch eine Verlängerung der bisherigen Haltbarkeit der Produkte zu erwirken.
Das Verfahren der Hochdruckbehandlung von Lebensmitteln ist seit vielen Jahren etabliert. Es findet beispielsweise Anwendung bei der Herstellung und Haltbarmachung von Fruchtsäften, Fleischerzeugnissen und Guacamole.
Die erheblichen Vorteile der Hochdruckbehandlung (high pressure processing; HPP) sind die schonende, aber effektive Einwirkung auf das Lebensmittel und das Erzielen der Haltbarmachung ohne dabei Fremdstoffe zuzuführen oder den Frischecharakter stark zu verändern. Einige Produkte weisen sogar eine Verlängerung ihrer Haltbarkeit auf, ohne dass dabei qualitätsbestimmende Parameter in ihrem Charakter geschwächt werden.
Dem Wunsch der Mehrheit der Verbraucher nach qualitativ hochwertigen, frischen, aber zugleich sicheren und haltbaren Lebensmitteln wird durch Anwendung der HPP Rechnung getragen.
EINLEITUNG
2
In der vorliegenden Arbeit werden Proben von frischen Welsfilets und geräucherten Forellenfilets mit sechs unterschiedlichen Druck-Zeit-Kombinationen behandelt und an verschiedenen Tagen nach der Behandlung mikrobiologisch, physikalisch sowie sensorisch untersucht.
Da es sich bei den Forellenfilets um mittels Räucherung vorbehandelte Produkte handelt, deren Haltbarkeit bereits bei 21 Tagen liegt, sollen jene über einen Lagerungszeitraum von 41 Tagen untersucht werden. Die Welsfilets dagegen sind frisch und somit schnellverderblich und sollen über einen Zeitraum von einer Woche untersucht werden.
Um auch ein Aussage bezüglich des Inaktivierungspotentials der Hochdruckbehandlung gegenüber Listerien, die für den Menschen schon in geringen Mengen gesundheitsgefährdend sein können, feststellen zu können, sollen Proben von Wels- und Forellenfilets mit Listeria monocytogenes beimpft, hochdruckbehandelt und anschließend mikrobiologisch untersucht werden.
Zusätzlich soll auch der Hygieneindikatorkeim Escherichia coli auf die Forellenfilets inokuliert und untersucht werden.
SCHRIFTTUM
3 2 SCHRIFTTUM
2.1 Hygiene und Gefahren des Lebensmittels Fisch
Fisch ist ein gesundes, ernährungsphysiologisch hochwertiges Lebensmittel. Durch seinen geringen Anteil an Bindegewebe ist er leicht verdaulich und gut bekömmlich.
Er ist reich an Vitaminen (A, B und D) sowie an Spurenelementen, wie etwa Jod, Zink, Kalzium, Phosphor oder Selen (DUNAJSKI 1980; PEDROSA-MENABRITO u.
REGENSTEIN 1988; BMELV 2011).
Die in großen Mengen im Fischfett enthaltenen ungesättigten Omega-3-Fettsäuren sind für den menschlichen Körper essentiell und können das Risiko für Herz- Kreislauf-Erkrankungen verringern (NAIR 1996; OOMEN et al. 2000; SIDHU 2003).
Fisch erfreut sich zunehmender Beliebtheit. Die Produktion hat sich in Europa seit Anfang der sechziger Jahre etwa verdoppelt (FAO 2010). In Deutschland lag der Konsum im Jahr 2011 bei 15,6 kg Fanggewicht pro Person. Der Anteil an Süßwasserfisch betrug im Jahr 2009 3,8 kg Fanggewicht und hat sich damit seit 1992 (1,7 kg) mehr als verdoppelt (FAO 2013a). Es wird davon ausgegangen, dass dieser Trend anhält und auch in den kommenden Jahren mit einem steigenden Absatz von Fisch und -produkten gerechnet werden kann (FIZ 2010).
Fischfleisch gehört wegen seines hohen pH-Wertes und Wassergehaltes - der aw- Wert von Frischfisch liegt bei 0,99 - dem geringen Anteil an Bindegewebe und dem hohem Gehalt an freien Aminosäuren zu den leicht verderblichen Lebensmitteln (GRAM u. HUSS 1996; LEROI 2010). Für mikrobielle Abbauprozesse ist er somit leicht angreifbar und verdirbt im Vergleich zu Säugetiermuskelfleisch schneller (PEDROSA-MENABRITO u. REGENSTEIN 1988).
Auch anhand ihrer mikrobiologischen Flora lassen sich Süßwasser- und Seewasserfische, sowie Fische aus warmen oder gemäßigten Gewässern voneinander unterscheiden. Es gilt zwischen der Primärflora, die in und auf lebenden Fischen anzutreffen ist, und der Sekundärflora, die sich nach Fang und Schlachtung etabliert, zu differenzieren (YORDANOVA ANDONOVA 2010). Grundsätzlich ist frisches Fischmuskelfleisch als weitgehend keimfrei anzusehen (MRI 2008). So
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4
wurde bei Untersuchungen an frischem Wittling das Fischgewebe bis zum vierten oder fünften Lagerungstag nach dem Fang als steril erkannt (MEYER u.
ÖHLENSCHLÄGER 1996).
Die Besiedelung mit Keimen geschieht vornehmlich nach gelöster Totenstarre über die Fischhaut und die im Darm enthaltenen Bakterien, v.a. mit Pseudomonas spp.
(bei Süßwasserfischen) und Shewanella putrefaciens (bei Seefischen) (FERNÁNDEZ-SALGUERO u. MACKIE 1987; GRAM u. DALGAARD 2002; LEROI 2010). Werden die Fische bereits vorher von fachkundiger Hand ausgenommen und filetiert, treten mögliche prozessbedingte Kontaminanten in den Vordergrund des Verderbnisgeschehens. Je nach Endprodukt folgt auf den Fang eine Vielzahl von Bearbeitungsschritten (Schlachten, Ausnehmen, Häuten, Zuschneiden, Waschen, Sortierung, Klassifizierung, Wiegen, Einfrieren und Verpacken), die einen Einfluss auf die mikrobielle Beschaffenheit nehmen können (NOSEDA et al. 2012). Eine gute Hygienepraxis während des Bearbeitungsprozesses ist somit ein grundlegender Faktor für ein mikrobiologisch sauberes und gesundheitlich unbedenkliches Produkt.
Durch Kühlung, Einfrieren, Räuchern oder ähnliche, haltbarmachende Prozesse wird versucht, dem mikrobiellen Verderb entgegenzuwirken oder seinen Beginn zu verzögern. Denn, so beschrieben es PEDROSA-MENABRITO und REGENSTEIN (1988), etwa 10 % des frischvermarkteten Fisches gehen allein durch Verderb verloren.
Neben den ökonomischen Beweggründen der Keimelimination stehen besonders die möglichen gesundheitsgefährdenden Aspekte im Fokus. Vom Verzehr von Fischfleisch können die unterschiedlichsten Gefahren ausgehen. So könnten Schwermetalle (z.B. Blei, Quecksilber, Cadmium) oder Schadstoffe (z.B. Rückstände von Pflanzenschutzmitteln) ebenso wie Parasiten oder Mikroorganismen über die Nahrung in den menschlichen Körper gelangen (MRI 2008). Zu letzteren gehören beispielweise Bakterien wie Clostridium botulinum Typ E, Clostridium perfringens, Vibrio parahaemolyticus und andere Vibrioarten, Staphylokokken, Salmonellen sowie Shigellen (NOVOTNY et al. 2004). Diese führen zu unterschiedlich schweren Krankheitsbildern. Zu einem tödlichen Krankheitsverlauf kann es bei Menschen und Tieren durch eine Infektion mit Listeria monocytogenes kommen. Insbesondere
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5 diesem Keim, der häufiger auf Fischerzeugnissen, v.a. auf Räucherfisch, anzutreffen ist, sollte erhöhte Wachsamkeit entgegengebracht werden (EMBAREK 1994; GRAM 2001; MĘDRALA et al. 2003; GRAM 2004; DOMENECH et al. 2012).
2.1.1 Wels
Der europäische Wels, Silurus glanis Linneaus 1758, auch Waller genannt, ist einer der größten reinen Süßwasserfische Europas und wird seit mehr als hundert Jahren in Zentral- und Osteuropa kultiviert (HECKER 2005). Der Bekanntheitsgrad und die Verfügbarkeit dieses Fisches als Lebensmittel waren in den vergangenen Jahren dennoch gering, was potentiell auf den Endverbraucherpreis von ca. 20 €/kg Filet zurückzuführen ist (LINHART et al. 2002; OTTO-LÜBKER 2003). Neben der Gewinnung durch das Angeln einzelner Tiere hat sich v.a. die Haltung und Zucht in Aquakultur etabliert. Deutschland belegt innerhalb der Europäischen Union nach Rumänien und Ungarn Platz drei in der Reihe der Wels-Produzenten (FAO 2012).
Waren es in Deutschland im Jahr 2003 noch 12 t, wurden schon im Jahr 2010 238 t europäischer Wels in Kreislauf- oder Teilkreislaufanlagen produziert. Über die Hälfte davon (125 t) stammten aus Niedersachsen (BRÄMICK 2011; FAO 2012). Auch auf europäischer Ebene hat die Produktion deutlich zugenommen und ist innerhalb von zehn Jahren (2000 bis 2010) von gut 8.000 t auf über 13.000 t angestiegen. Im internationalen Vergleich ist Europa mit deutlichem Abstand führend, da die Produktionsmenge 2010 weltweit bei etwas mehr als 17.000 t Wels lag (FAO 2012).
Der europäische Wels wird v.a. als frisches Filet angeboten, kann aber auch geräuchert werden (MANTHEY et al. 1985; LINHART et al. 2002). Als Tiefkühlware eignet er sich weniger, da der Gefrier-Auftauprozess zerstörenden Einfluss auf die Filetqualität hinsichtlich Muskelstruktur hat sowie zu einer beschleunigten Fettoxidation führt (BENJAKUL u. BAUER 2001).
Das Fleisch vom Wels ist weiß, saftig, enthält keine Zwischenmuskelgräten und weist ein mildes bis neutrales, aber schmackhaftes Aroma auf. Zudem ist er schuppenfrei und lässt sich somit leicht verarbeiten. Mit einem Fettgehalt von 6-8 %, bzw. 3,7 g Fett in 100 g Filet gehört er zu den mittelfetten Fischen (MANTHEY et al. 1985;
LINHART et al. 2002; HALLIER et al. 2007). ÖZYURT et al. (2009) ermittelten dagegen einen Fettgehalt von 1,12g/100g. Der Fettgehalt kann allerdings je nach
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6
Fütterung variieren und steigt mit dem Alter der Tiere an (FAUCONNEAU u.
LAROCHE 1996; LINHART et al. 2002). Die Wachstumskapazität des Welses ist eine der höchsten unter den Fischen. In freier Natur sind Körperlängen bis zu drei Meter bei einem Gewicht von bis zu 200 kg möglich (COCHE u. EDWARDS 1990;
FISCHLEXIKON 2011). Das Speisefischgewicht dagegen hat er nach zehn Monaten in Kreislaufanlagen mit etwa 1,5 kg bereits erreicht (OTTO-LÜBKER 2003).
2.1.2 Forelle
Eine der ältesten und populärsten Formen der Fischproduktion ist die Kultivierung von Forellen. Weltweit wird die Regenbogenforelle, Oncorhynchus mykiss (Walbaum 1792), als Farmfisch in Monokultur gehalten. Die Nachfrage an Süßwasserfischen ist in den vergangenen Jahren gestiegen und so hat sich auch die weltweite Jahresproduktion von Forellen von rund 283.000 t im Jahre 1990 auf etwa 730.000 t im Jahre 2009 gesteigert. Die Produktion teilen sich zu je fast einem Drittel Amerika, Asien und Europa mit 200.000 bis 260.000 t im Jahr 2010. Besonders deutlich haben die Produktionsmengen in Asien, von knapp 70.000 t im Jahre 2000 auf über 200.000 t 2010, zugenommen. Auch in Nord- und Südamerika gibt es Zunahmen, in Europa dagegen sinken die Produktionszahlen in den letzten Jahren (FAO 2012). In Deutschland liegt die Forelle auf Rang sieben der bedeutendsten See- und Süßwasserfische; und ist damit der wichtigste Süßwasserfisch. Außerdem macht die Forelle über die letzten zehn Jahre mit durchschnittlich etwa 22.000 t Jahresproduktion in Deutschland über die Hälfte der Gesamtmenge an Fisch aus der Binnenfischerei aus, wobei auch hier ein abnehmender Trend festzustellen ist. Etwa die gleiche Menge wird zusätzlich importiert (FIZ 2011a; FAO 2012). (BRÄMICK 2010, 2011) vom Institut für Binnenfischerei e.V. Potsdam-Sacrow dagegen berichtet von einem anhaltenden Höchstergebnis der Regenbogenforelle von über 25.000 t in den Jahren 2009 und 2010 und einer jährlichen Importmenge von über 33.000 t.
Die Vertriebsmöglichkeiten für Forellen sind vielfältig. Neben dem direkten Verkauf von Frischfischen ist vor allem die Angebotsform als Räucherfisch bei den Konsumenten beliebt. Dabei lassen sich auch länderspezifische Unterschiede ausmachen. Während die Verbraucher in den USA eher ein weißliches Fleisch bevorzugen, präferieren Europäer und Bewohner der übrigen Erdteile eine rosa bis
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7 pinke Fleischfarbe, dies gilt vor allem in Bezug auf Räucherware. Grundsätzlich zeichnet sich das mittelfette Forellenfleisch durch seinen weichen und zarten Charakter und sein mildes Aroma aus (WÜNNENBERG 2008; FAO 2011; FIZ 2011b).
Besonders die Vertriebsform als Räucherware, aber auch andere Veredelungsverfahren, die den Fisch in ein Produkt verwandeln, das zum direkten Verzehr geeignet ist, sind für Rekontamination anfällig (GRAM 2001; MĘDRALA et al. 2003; DI CICCIO et al. 2012).
2.2 Mikroorganismen
2.2.1 Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) gehört zur Gattung Listeria und ist ein Gram-positives, bewegliches, nichtsporenbildendes und fakultativ anaerobes Stäbchen. Listerien sind ubiquitär in der Umwelt, beispielsweise im Kot von Tieren, und können als Kontamination auch auf Lebensmitteln vorkommen (FARBER u.
PETERKIN 1991). Listerien sind sehr widerstandsfähig gegenüber Umwelteinflüssen.
So überleben sie bei niedrigen pH-Werten und können sich sogar noch bei Kühlschranktemperaturen vermehren (GANDHI u. CHIKINDAS 2007; BFR 2011).
Insbesondere Letzteres macht sie zu einer Gefahr für den Menschen, da die Erregeraufnahme hauptsächlich durch den Verzehr kontaminierter Lebensmittel stattfindet (ANONYM 2010). Doch nicht jede infizierte Person erkrankt an einer Listeriose, die hauptsächlich durch L. monocytogenes ausgelöst wird. Bei immunkompetenten Menschen ist meist keine oder nur eine schwache Reaktion in Form von uncharakteristischen, grippeähnlichen Symptomen zu beobachten.
Während es bei immungeschwächten Personen, wie z.B. älteren Menschen oder chronisch Kranken, zu einer manifesten Ausprägung der Listeriose kommen kann.
Diese ist gekennzeichnet durch eine Gastroenteritis, einhergehend mit starken Durchfällen und Übelkeit. Nicht selten kommt es zu einer Septikämie und Meningoencephalitis. Bei gefährdeten Personen besteht eine hohe Mortalitäts- und Letalitätsrate (BFR 2008; EFSA 2011).
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8
Bei Schwangeren kann eine auf das Ungeborene übergehende Infektion eine Früh- oder Totgeburt auslösen. Auch das Überleben des Kindes ist möglich, allerdings führt eine Infektion nach der Geburt bei Neonaten häufig zu einer Meningitis. Sie sind die am häufigsten betroffene Gruppe, gefolgt von Personen im Alter von über 60 Jahren (FARBER u. PETERKIN 1991).
Besonders Lebensmittel, die roh oder gering erhitzt verzehrt werden sollen, sogenannte ready-to-eat (RTE) Lebensmittel, gelten als Überträger für Listerien.
Dazu gehören Rohmilchprodukte, rohes Fleisch und Erzeugnisse daraus, rohes Geflügel sowie roher bzw. geringfügig behandelter Fisch (EFSA 2011). So warnte das Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) im Jahre 2013 (BVL 2013) vor dem Verzehr von geräucherten, abgepackten Forellenfilets eines bestimmten Herstellers, da L. monocytogenes darin nachgewiesen worden waren.
Werden in lebensmittelverarbeitenden Betrieben die Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen falsch oder ungenügend durchgeführt, so lassen sich auch in erhitzten oder anders haltbar gemachten Produkten Listerien auffinden.
Dieser Weg der Kontamination ist u. a. auch für Räucherfisch und Graved Lachs von Bedeutung (BFR 2008; PORSBY et al. 2008). So untersuchten beispielsweise MĘDRALA et al. (2003) in einem Betrieb Lachs und Forelle vor und nach der Prozessierung und Verpackung im Hinblick auf die Kontamination mit Listerien. Sie fanden heraus, dass die Kontaminationsrate bei der bearbeiteten Ware mit bis 77,8 % deutlich höher war als die der Rohware mit bis zu 15,4 %. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen auch schon RORVIK (2000) und AUTIO et al. (1999). Zudem konnten DI CICCIO et al. (2012) mittels einer Langzeitstudie zeigen, dass es sich bei den rekontaminierenden L. monocytogenes um Stämme handelte, die als Nischenkeime über Jahre in der Betriebsstätte präsent waren, obwohl auch aus dem Rohmaterial (Lachs) teilweise (24 %) L. monocytogenes isoliert wurden.
GRAM (2001) hat kaltgeräucherten Fisch als Produkt mit hoher Prävalenz und ergo hohem Gefahrenpotential in Bezug auf Listeriose bezeichnet. Die absolute Zahl der Listerien in den Endprodukten ist typischerweise gering, allerdings kann sich die Zahl der Listerien im verzehrfertigen Produkt erhöhen. Die Vermehrungsfähigkeit ist dabei
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9 abhängig vom pH-Wert, der Wasseraktivität sowie der Lagerungstemperatur (ANONYM 2010).
Auch heißgeräucherte Fischprodukte, darunter auch Forellenfilets (BVL 2013), können mit L. monocytogenes kontaminiert sein (BFR 2011). Der Nachweis von L. monocytogenes auf heißgeräucherten Forellen nach Inokulation war bei JEMMI und KEUSCH (1992) abhängig von der Lagerungstemperatur. So beschreiben sie einen signifikanten Anstieg der Listerienanzahl bei einer Lagerung über 20 Tage bei 8-10 °C. Eine Lagerung bei 4 °C ergab jedoch weder einen Anstieg noch einen Abfall. In derselben Studie erbrachte eine Heißräucherung von inokulierten Forellen eine Reduktion der Listerienanzahl um 5,9 lg-Stufen; es waren keine Listerien mehr auffindbar. Auch DILLON et al. (1994) fanden sowohl in kalt- wie auch in heißgeräucherten Fischen Listerien. L. monocytogenes war jedoch nur in zwei von neun untersuchten Fischarten vertreten; dabei gehörte die Forelle in diesen Untersuchungen zu den L. monocytogenes-freien Arten.
Die europäische Union (EU) hat mit ihrer Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel Grenzwerte für L. monocytogenes geschaffen. So heißt es darin, dass „verzehrfertige Lebensmittel“ während ihrer Haltbarkeitsdauer und sobald sie in den Verkehr gebracht worden sind, einen Grenzwert von 100 KbE/g L. monocytogenes nicht überschreiten dürfen. Zusätzlich gilt für die Zeit, die sich das Lebensmittel in der „unmittelbare[n] Kontrolle des [herstellenden] Lebensmittelunternehmers“ befindet, eine Nulltoleranzgrenze in 25 g des entsprechenden Produktes. Auch die Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) äußert sich in ihren Empfehlungen zum Vorkommen von Listerien in unterschiedlichen Produktgruppen. Für die DGHM gilt die Menge von 100 KbE/g Fisch für ganze Süßwasserfische als Warnwert. Die Überschreitung der Warnwerte ist als Hinweis auf die Verletzung der „Prinzipien einer guten Hygiene- und/oder Herstellungspraxis“ anzusehen. Im Falle von L. monocytogenes wäre eine
„Gesundheitsgefährdung des Verbrauchers nicht auszuschließen“ (DGHM 2011).
Anzuwenden und rechtlich verbindlich ist jedoch nur die VO (EG) 2073/2005.
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2.2.2 Escherichia coli
Escherichia coli (E. coli) ist als Umwelt- und Kontaminationskeim bekannt. Die Gram- negativen, fakultativ anaeroben Stäbchen-Bakterien gelten als Indikatorkeime für den Hygienestatus von diversen Lebensmitteln (KLEIN 2007).
Einige Stämme dieses Keimes können für Menschen sowie Tiere pathogene Eigenschaften aufweisen. Typischerweise lösen sie bei Kindern darmassoziierte Beschwerden, wie Diarrhoe oder Dysenterie, aus. Daneben sind aber auch extraintestinale Erkrankungen wie die Neugeborenen-Enzephalitis, Septikämien, Nieren- oder Wundinfektionen zu beobachten (BELL u. KYRIAKIDES 1998; RKI 2011). Eine Infektion mit darmassoziierten E. coli verläuft in den meisten Fällen nicht tödlich. Es können jedoch durch einige toxinbildende Stämme gravierende Krankheitsgeschehen mit letalem Ausgang hervorgerufen werden; wie dies beispielsweise während der Epidemie 2011 in Deutschland mit dem hämolytisch- urämischen Syndrom durch verotoxinbildende E. coli geschehen ist (BFR 2013b).
E. coli sind auch ein Teil der gesunden Darmflora von Menschen und Tieren und werden regulär mit dem Kot ausgeschieden (AUTENRIETH 2003). Bei Fischen hingegen gehören E. coli nicht zur Normalflora und sind aus diesem Grund ein Anzeichen für Kontamination und Verunreinigung von außen (BURAS et al. 1987;
AYULO et al. 1994). Sowohl das Wasser aus dem Habitat der Fische als auch die Weiterverarbeitung der geschlachteten Tiere können als Eintragswege für die Keime fungieren. Über das Wasser können die Keime in den Magendarmtrakt der Tiere gelangen; im Blut und der Muskulatur sollten sie jedoch zu keiner Zeit anzutreffen sein. Auf eine strikte Hygiene bei der Bearbeitung von Fischen ist deshalb zu achten.
Rechtlich festgesetzte Grenzwerte oder Höchstmengen, wie es sie für L. monocytogenes gibt, existieren für E. coli bislang nicht für Fischerzeugnisse, dagegen aber für eine Vielzahl von Fleisch- und Milcherzeugnissen (ANONYM 2005). Für Süßwasserfische können bei der Untersuchung von ganzen Fischen die empfohlenen Richt- und Warnwerte der DGHM zu Rate gezogen werden. Demnach liegen der Richtwert bei 1x101 KbE/g und der zugehörige Warnwert bei 1x102 KbE/g (DGHM 2011).
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11 2.2.3 Weitere Mikroorganismen
Aerobe mesophile Gesamtkeimzahl
Die aerobe mesophile Gesamtkeimzahl (GKZ) ist ein Maß für die allgemeine mikrobielle Belastung oder Verunreinigung, die ein Produkt erfährt. Mit ihrer Erhebung werden Bakterien, Hefen und Schimmelpilze erfasst, die unter aeroben und mesophilen Bedingungen wachsen (GESUNDHEITSAMT SOLOTHURN 2011).
Um eine Bewertung der gewonnen Daten durchführen zu können, bedarf es Grenz- oder zumindest Richtwerten. Für Fischfleisch gibt es von der DGHM Richtwerte für ganze Süßwasserfische und Seefische, für Filetware von Seefischen sowie für die Fischerzeugnisse Räucherlachs und Graved Lachs (Tab. 1).
Tab. 1: Richtwerte der DGHM (2011) für die aerobe mesophile GKZ bei Fisch Richtwert (KbE*/g)
Süßwasserfisch (ganz)/
Räucherlachs/ Graved Lachs a) 1 x 106 Seefisch (ganz/Filet) 5 x 105
a) Mit Ausnahme der Milchsäurebakterien
*KbE: Koloniebildende Einheit
Für das Ende der Haltbarkeit von frischem Fisch ist v.a. die Besiedelung mit Keimen verantwortlich. Zwar gilt frisches Fischmuskelfleisch als keimfrei, doch durch Weiterverarbeitung oder Verpacken können verschiedene Keime auf den Fisch oder seine Teilstücke gelangen und diese kontaminieren (NOSEDA et al. 2012). Im Jahr 1974 untersuchten dazu HUSS et al. die mikrobielle Belastung von Fisch nach dem Fang und zeigten, dass der Hygiene der Weiterbehandlung eine bedeutende Rolle zukommt. So kann schon der Kontakt mit dem Schiffsdeck oder der
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Arbeitsausrüstung sowie die Verwendung alter Fisch-Boxen zu einem 10-100 fachen Anstieg der Bakterienzahl auf dem Fisch führen (HUSS et al. 1974).
Fischfilets verderben, im Gegensatz zu ganzen Fischen, bei einer Lagerungstemperatur von 0 °C erheblich schneller. Wenn die Filets jedoch in Vakuum verpackt sind, können sie die Haltbarkeitsdauer ganzer Fische erreichen, wobei sich die Bakterienflora durch den Luftausschluß anders zusammensetzt (JØRGENSEN et al. 1988).
In einer Untersuchung zur Mikrobiologie von Forellen zeigten CHYTIRI et al. (2004), dass die mesophile GKZ von ganzen, unausgenommenen und filetierten Fischen bei 2,5 bzw. 3,8 lg KbE/cm² lag. Eine GKZ von 7,0 lg KbE/cm² erreichten die ganzen Forellen nach 18 Tagen, die Filetstücke hingegen bereits an Tag 10.
Laktobazillen
Die Gruppe der Laktobazillen besteht aus Gram-positiven, milchsäurebildenden, kokkoiden oder stäbchenförmigen Bakterien und gehört zur physiologischen Darmflora sowohl bei Menschen als auch bei Fischen (RINGØ u. GATESOUPE 1998).
Aufgrund ihrer Fähigkeit des Wachstums unter anaeroben bzw. mikroaeroben Bedingungen sind sie meist der dominierende Teil der klassischen Verderbskeime von verpackten (z.B. in Vakuum oder CO2-Begasung) Fleisch- und Fischprodukten (GRAM u. HUSS 1996; GONZÁLEZ-RODRı́GUEZ et al. 2002). Bei Pangasiusfilet in Vakuumverpackung stellten NOSEDA et al. (2012) zum Ende der Haltbarkeit einen hohen Gehalt von Laktobazillen fest. STILES und HOLZAPFEL (1997) zählen marinierten Fisch zu einem Habitat von Laktobazillen. Bei Verderb von auf Schmelzeis gelagertem, frischem Fisch jedoch stehen andere Keime, wie etwa Pseudomonas spp. und Shewanella putrefaciens im Vordergrund (JØRGENSEN et al. 1988; JØRGENSEN u. HUSS 1989; FELDHUSEN 2000).
Pseudomonaden
Die Gram-negativen, lipo- und proteolytischen Stäbchenbakterien, Pseudomonaden, sind beim Fischverderb in hohem Maße anzutreffen. Sie gelten als typische Wasserbakterien, kommen aber ebenso in feuchtem Milieu oder Boden vor (KLEIN
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13 2007). Den für Pseudomonas spp. typischen, süßlich-fruchtigen Verderbsgeruch konnten OLAFSDOTTIR et al. (2006) an in Styropor-Boxen gelagerten Schellfischfilets feststellen.
Da einige Pseudomonaden auch unter Kühltemperaturen, jedoch nur unter strikt aeroben Bedingungen, wachsen, spielen sie v.a. als Verderbniserreger von frischem, unverpacktem bzw. nicht luftdicht-verpacktem Fisch eine große Rolle. Zudem bietet Fisch mit seinem geringen Zuckeranteil und dem vergleichsweise hohen postmortalen pH-Wert (über 6) den pH-sensitiven Pseudomonaden einen geeigneten Nährboden (GRAM u. HUSS 1996; LEROI 2010). So fanden CHYTIRI et al. (2004) in filetierten Regenbogenforellen nach 10 Tagen Eislagerung im Kühlschrank (2 ± 0,5 °C) mit 7,0 lg KbE/cm² einen verdoppelten Pseudomonadengehalt im Vergleich zum Beginn der Lagerung. Außerdem wiesen die Filets einen konstant höheren Gehalt von etwa 2,5 – 2,8 lg-Stufen auf als ganze, unausgenommene Forellen. Pseudomonaden waren, neben H2S-produzierenden Bakterien (z. B.
Shewanella putrefaciens und Brochothrix thermosphacta), die vorherrschenden Mikroorganismen während der Eislagerung (CHYTIRI et al. 2004).
Hefen und Schimmelpilze
Das Wachstum von Schimmelpilzen und Hefen auf Lebensmitteln ist, bis auf wenige Ausnahmen wie etwa Käse oder Rohwurst, als Anzeichen des Verderbs zu werten.
Sie finden in wasser- und nährstoffreichen Lebensmitteln eine gute Wachstumsgrundlage, so liegt ihr Minimum des Bedarfs an frei verfügbarem Wasser bei einem aw-Wert von 0,8 (HEESCHEN 2007). Zudem können sie in kühler Umgebung und im pH-Wertebereich von 1,5 bis 8,5 bei Hefen und bis 9,5 bei Schimmelpilzen wachsen. Ein starker Befall, auch auf Fischfilets, ist jedoch Zeichen einer zu warmen oder zu langen Lagerung (VAN DEN BROEK et al. 1984).
Laut GONZÁLES-RODRÍGUEZ et al. (2002) ist eine Verderbsbesiedelung durch Hefen bei vakuumverpackten, kalt-geräucherten Fischprodukten durchaus häufig anzutreffen. Des Weiteren erwähnen GRAM und HUSS (1996) Hefen als Teil der Verderbniserreger von im Fass gesalzenem Fisch.
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2.3 Das Hochdruckverfahren 2.3.1 Geschichte
Die Anwendung von Hochdruck als Konservierungsmethode ist bereits über 100 Jahre bekannt. Schon HITE behandelte im Jahre 1899 Milch mit Hochdruck und untersuchte diese anschließend auf ihre sensorischen Veränderungen. Er konnte zeigen, dass die behandelten Milchproben später sauer wurden als unbehandelte und damit eine längere Haltbarkeit aufwiesen.
Dennoch gilt die Hochdruckkonservierung als junge Technologie für die Lebensmittelindustrie, denn diese Technik und ihr möglicher Einsatz gerieten in Vergessenheit. Sie fand in anderen Bereichen, wie der Produktion von Keramik, Stahl und synthetischen Materialien oder der Herstellung von Diamanten Verwendung (SAPPOK 1970; J. YUSTE et al. 2001).
Die ersten kommerziell erhältlichen hochdruckbehandelten Nahrungsmittel kamen Anfang der neunziger Jahre in Japan auf den Markt, nachdem es in den Achtzigern zu neuerlichem Interesse an der Anwendbarkeit für die Lebensmittelbranche gekommen war (FARR 1990; MEYER-PITTROFF et al. 2005; U.S. DEPARTMENT OF AGRICULTURE FOOD SAFETY AND INSPECTION SERVICE 2006). Diese Wiederentdeckung blieb nicht folgenlos; so konnte sich die Hochdruckbehandlung im Bereich der Behandlung von Lebensmitteln etablieren und eine Vielzahl von Produkten ist mittlerweile erhältlich (Tab. 2).
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15 Tab. 2: Markteinführung ausgewählter HPP-behandelter Lebensmittel
Jahr Produkt Land Quelle
1990 Marmeladen, Fruchtprodukte
Japan SCHWARZENBOLZ (2009) 1991 Grapefruitsaft
1994 Reiswein CHEFTEL (1995)
1995 Orangensaft Frankreich
SCHWARZENBOLZ (2009)
1997 Guacamole USA
1998 Roher und gekochter
Schinken Spanien
1999 Austern USA SCHWARZENBOLZ (2009),
CAMPUS et al. (2010) - Gekochte Hühnerbrust Kanada www.maplelodgefarms.com/s
afety-hpp.php (2012)
- Milch England LORENZ u. STEGER (2008)
2004 RTE-Fisch: Lachs, Hecht Spanien
CAMPUS et al. (2010) Entsalzener Dorsch Italien
2005 Geräucherter Schinken Deutschland CAMPUS et al. (2010)
2.3.2 Funktionsweise und Technologie
Für „high pressure processing“, der Prozessierung mittels Hochdruck, hat sich die Abkürzung HPP etabliert. Sie benennt, wie auch UHP (= „ultra high pressure“) oder HHP (= „high hydrostatic pressure“), die dahinter stehende Funktionsweise. Unter HPP ist die Anwendung von hohen hydrostatisch wirkenden Drücken zu verstehen.
Das heißt der Druck wirkt in alle Richtungen gleichmäßig, ohne Gefälle und ist unabhängig von der Produktgröße, -form oder -zusammensetzung (FARR 1990;
PATAZCA et al. 2007). In kommerzieller Nutzung im Lebensmittelbereich kommen Drücke zwischen 100-800 MPa (1000-8000 bar) zum Einsatz.
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Die Hochdruckbehandlung versteht sich als nicht-thermische Technologie, da hohe Temperaturen, wie sie beispielsweise bei der Pasteurisierung genutzt werden, nicht nötig sind. Während der Druckerzeugung kommt es dennoch zu reversiblen Temperaturveränderungen durch adiabatische Erwärmung (PATAZCA et al. 2007).
Abhängig von der Lebensmittelzusammensetzung und der Anfangstemperatur steigt die Temperatur um etwa 3 °C/100 MPa (CHEFTEL 1995; A. A. MATSER et al. 2004;
PATAZCA et al. 2007; YORDANOV u. ANGELOVA 2010).
Das Zielprodukt befindet sich während einer Behandlung verpackt oder unverpackt in einem Hochdruckbehälter. Der Behälter enthält außerdem ein Medium zur hydrostatischen Druckübertragung, meist in Form von Wasser oder –gemischen (z.B.
Glykol). Die Druckerzeugung kann entweder direkt oder indirekt (Abb. 1) erfolgen.
Letztere hat dabei den Vorteil, dass die Behandlungskammer in ihren Abmessungen nicht von der Kolbengröße, und damit der Materialmenge und -stabilität, abhängig ist.
Während der eigentlichen Behandlungsphase, der so genannten Haltezeit, ist sowohl bei der direkten als auch bei der indirekten Druckerzeugung keine zusätzliche Energieaufwendung notwendig (FARR 1990).
Die Druckeinwirkung kann von einigen Millisekunden mittels oszillierender Pumpen bis zu mehreren Minuten andauern (HEINZ u. BUCKOW 2010).
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17 Abb. 1: Schematische Darstellung der indirekten Druckeinwirkung. Modifiziert nach LORENZ und STEGER (2008).
Zum Druckaufbau wird das Überträgermedium in den Hochdruckbehälter eingefüllt und dann sukzessive über einen Druckerhöher bis zum Erreichen des gewünschten Behandlungsdrucks weiter in den Behälter eingepumpt. Um die Behandlung zu beenden, wird der Druck abgelassen. Dies geschieht durch Abfließenlassen des Überträgermediums (persönliche Mitteilung von Herrn Kortschack, Fa. Hiperbaric).
2.3.3 Anwendungsgebiete und –möglichkeiten hinsichtlich Lebensmittel
Die Behandlung von Lebensmitteln mit Hochdruck wird bei unterschiedlichen Produktgruppen durchgeführt. Das Haupteinsatzgebiet der HPP-Anwendungen stellen mit über 50 % Gemüse und Fleischerzeugnissen dar (Abb. 2, (HEINZ u.
BUCKOW 2010)), Meeresfrüchte und Fisch sind mit ihrem vergleichsweise geringen Verbrauch von 15,7 kg Fanggewicht pro Kopf im Jahr 2010 mit 15 % HPP- Anwendung relativ stark vertreten (BLE u. BMELV 2012).
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Andere Produkte 7%
Meeresfrüchte und Fisch 15%
Säfte und Getränke 17%
Fleischerzeugnisse 28%
Gemüse 33%
Abb. 2: Einsatz der HPP-Konservierung in verschiedenen Bereichen der Lebensmittelindustrie, modifiziert nach HEINZ und BUCKOW (2010).
Der Schwerpunkt der HPP-Anwendung im Bereich der Lebensmittelindustrie liegt auf der erreichbaren Verlängerung der Haltbarkeit. Dies geschieht vornehmlich durch die Abtötung oder Reduzierung der Keimzahl von Verderbniserregern auf und in den Lebensmitteln (CONSIDINE et al. 2008; YORDANOV u. ANGELOVA 2010).
Ein weiterer positiver Aspekt im Rahmen der Keimabtötung bzw. –verringerung durch die Hochdrucktechnologie ist die erwirkte Erhöhung der Lebensmittelsicherheit. Denn neben den Verderbniserregern werden auch (potentiell) pathogene Keime, die zu einer Gefahr für die Verbraucher werden können, durch die HPP zum Teil bis unter die Nachweisgrenze reduziert (HAYMAN et al. 2004). Jedoch spielen die Matrix des einzelnen Produkts, eine eventuelle Vor- oder Nachbehandlung, die Art der Verpackung und nicht zuletzt die eigentlichen Parameter der Hochdruckbehandlung (Druckhöhe und Haltezeit) eine wesentliche Rolle für ihren Erfolg (SIMPSON u.
GILMOUR 1997b; LAKSHMANAN u. DALGAARD 2004; FONBERG-BROCZEK et al.
2005). Auch einzelne Stämme der gleichen Keime, beispielsweise L. monocytogenes, Staphylococcus aureus, E. coli O157:H7 oder Salmonellen, können unterschiedlich drucksensibel reagieren (ALPAS et al. 1999; HAYMAN et al.
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19 2004). SIMPSON und GILMOUR (1997a) untersuchten drei Stämme von L. monocytogenes (NCTC 11994, Scott A sowie ein Isolat aus Geflügel) in zwei unterschiedlichen Matrices (phosphatgepufferte Salzlösung, Modell-Lebensmittel aus Proteinen, Zucker und Fett) nach HPP-Behandlungen mit 300 - 450 MPa. Dabei zeigte sich, dass die Inaktivierungsrate der L. monocytogenes von der Druckhöhe, dem verwendeten Stamm und der Matrix abhängig war. So führte eine Erhöhung des Protein- und des Zuckergehaltes zur Verringerung der Inaktivierungsrate (SIMPSON u. GILMOUR 1997a). Daher lassen sich bisher erzielte Forschungsergebnisse nicht ohne weiteres auf andere Produkte übertragen, sondern müssen im Einzelnen ermittelt werden.
Während Mikroorganismen und Enzyme in ihrer Aktivität gestört werden, bleiben Vitamine, Geschmack, Aromastoffe, Pigmente und Nährwert, abhängig von der Matrix, weitestgehend geschont und als wertgebender Inhaltsstoff eines Lebensmittels erhalten und somit für den Konsumenten verfügbar (EISENBRAND 2005; BALASUBRAMANIAM et al. 2008; YORDANOV u. ANGELOVA 2010).
2.3.4 Rechtlicher Hintergrund
In der Europäischen Union gilt seit 1997 die so genannte „Novel Food Verordnung“
(Verordnung (EG) Nr. 258/97 des europäischen Parlaments und des Rates vom 27. Januar 1997 über neuartige Lebensmittel und neuartige Lebensmittelzutaten).
Sie regelt unter anderem auch das Inverkehrbringen von „Lebensmittel[n] und Lebensmittelzutaten, bei deren Herstellung ein nicht übliches Verfahren angewandt worden ist und bei denen dieses Verfahren eine bedeutende Veränderung […] der Struktur der Lebensmittel oder der Lebensmittelzutaten bewirkt hat[…]“ (ANONYM 1997). Somit erstreckt sich ihr Geltungsbereich auch auf hochdruckbehandelte Lebensmittel.
Die Produkte müssen vor Inverkehrbringen einer einheitlichen Sicherheitsprüfung unterzogen werden, die die gesundheitliche Unbedenklichkeit nachweist und sie bedarf im Anschluss einer Genehmigung. Neben der gültigen Kennzeichnungspflicht, sind Lebensmittel, die unter die „Novel Food Verordnung“ fallen, zusätzlich entsprechend zu kennzeichnen.
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In der europäischen Union wurde bislang lediglich ein Produkt im Jahre 2001 auf diesem Wege zugelassen. Hierbei handelt es sich um eine Fruchtzubereitung mit dem Hinweis „hochdruckpasteurisiert“ der Firma Danone in Frankreich (ANONYM 2001).
In Artikel 3 der Verordnung sind die Kriterien, die das Novel Food erfüllen muss, aufgeführt. Demnach dürfen sie für den Verbraucher „keine Gefahr […] darstellen, keine Irreführung […] bewirken“ oder „sich von Lebensmitteln oder Lebensmittelzutaten, die sie ersetzen sollen, nicht so unterscheiden, dass ihr normaler Verzehr Ernährungsmängel für den Verbraucher mit sich brächte“.
2.4 Auswirkungen der Hochdruckbehandlung auf Mikroorganismen
Bakterien sind unterschiedlich drucksensibel oder –resistent. Generell werden Gram- positive und kokkoide Keime als druckresistenter als Gram-negative oder stäbchenförmige Bakterien sowie Hefen und Schimmelpilze erachtet (SHIGEHISA et al. 1991; CARLEZ et al. 1994; CHEFTEL 1995; ARROYO et al. 1997; WUYTACK et al. 2002). Jedoch konnten RAMASWAMY et al. (2008) in ihrer Studie eine gegenteilige Situation feststellen. Bei Drücken oberhalb von etwa 330 MPa erwiesen sich die untersuchten Gram-negativen E. coli als resistenter als die Gram-positiven L. monocytogenes. Unterhalb von 330 MPa verhielt es sich umgekehrt.
Hitzeresistente Bakterien sind in den meisten Fällen deutlich druckresistenter als hitzesensitive (FDA 2011) und Bakteriensporen zählen auch gegenüber Druck zu den widerstandsfähigsten Formen (YORDANOV u. ANGELOVA 2010). Die Effektivität der HPP ist abhängig von der Bakterienart selbst, dem Bakterienstamm sowie der Wachstumsphase, in der sich die Bakterien befinden (STYLES et al. 1991;
MACKEY et al. 1995; RAMASWAMY et al. 2008; DEMAZEAU et al. 2010; JUCK et al. 2012). Auch die Druckhöhe, die Behandlungstemperatur und -dauer, das Medium, in dem sich die Zelle befindet, sowie sein aw-Wert beeinflussen den Erfolg der HPP (STYLES et al. 1991; CHEFTEL 1995; SIMPSON u. GILMOUR 1997b; SMIDDY et al. 2005; DEMAZEAU et al. 2010; JUCK et al. 2012). Es kann jedoch davon ausgegangen werden, dass die Höhe des einwirkenden Drucks positiv mit der Reduzierung der Keime korreliert (BRIONES et al. 2010; KARIM et al. 2011). In
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21 Kombination mit hohen Temperaturen kann dieser Effekt sogar noch verstärkt werden (JUCK et al. 2012).
Zur Hochdruckbehandlung von Fisch und Fischprodukten gibt es eine Reihe von Untersuchungen. In einer Studie von RAMIREZ-SUAREZ et al. (2006) konnte durch HPP mit maximal 310 MPa über sechs Minuten die Haltbarkeit von bei 4 °C gelagertem, zerkleinertem Thunfisch um 22 Tage verlängern werden. Auch ZARE (2004) gelang eine Verlängerung von zehn auf 19 Tage mit einer Druckbehandlung von ≥ 220 MPa und einer Haltezeit von ≥ 15 Minuten. Ebenso zeigten ERKAN et al.
(2010; 2010a), dass sich mit relativ geringen Drücken (200 – 330 MPa) die Haltbarkeit von Goldbrassen um drei und die von Streifenbarben um zwei Tage verlängern ließ. Auch mit 150 MPa für zehn Minuten bei 5 °C ließ sich die mikrobielle Stabilität von frischem atlantischen Lachs um zwei Tage erweitern (AMANATIDOU et al. 2000). Durch die Behandlung mit höheren Drücken (400 MPa) ermittelten HURTADO et al. (2000) eine um zwei Wochen verlängerte Verzehrfähigkeit für kühlgelagerten Seehecht, nach Behandlung mit 200 MPa erweiterte sie sich um eine Woche.
Listeria monocytogenes
Um die Sicherheit von Lebensmitteln zu steigern, wird die Inaktivierung von Bakterien durch Hochdruck genutzt. Insbesondere Listerien stehen dabei im Fokus (SIMONIN et al. 2012). Auch RAMASWAMY et al. (2008) beschreiben L. monocytogenes als geeigneten Keim, um die Reduzierungseffekte eines Pathogens durch Hochdruckbehandlungen von bis zu 300 MPa zu demonstrieren.
Generell lassen sich Listerien signifikant durch HPP reduzieren (EVRENDILEK u.
BALASUBRAMANIAM 2011; KRUK et al. 2011; MONTIEL et al. 2012a). Die Erhöhung des Behandlungsdrucks führt zu einer höheren Reduzierungsrate (SIMPSON u. GILMOUR 1997a). So verringerten 400 MPa für 2 Min L. monocytogenes auf Putenfleisch um 3,8 lg-Einheiten und 600 MPa für 2 Min erbrachten eine Reduzierung von 5,1 lg-Einheiten (JUCK et al. 2012). JUCK et al.
(2012) postulieren auch, dass die Temperatur während der Behandlung einen
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Einfluss auf den Behandlungserfolg hat. So erhöhte eine Temperatursteigerung von 4 auf 20 °C die Reduzierungsrate von 4,2 auf 5,0 lg-Einheiten.
KRUK et al. (2011) gelang mittels HPP (450 oder 600 MPa, 5 Min) eine Verringerung der Listerienzahl auf Hähnchenbrust von 7,35 lg KbE/g unter die Nachweisgrenze.
Nach einer 14-tägigen Lagerung bei 4 °C waren zudem keine Listerien mehr detektierbar.
Die HPP wird gleichfalls für die Behandlung von Fisch verwendet.
GUDBJORNSDOTTIR et al. (2010) inokulierten geräucherten Lachs mit einem Listeria innocua-Stamm, der häufig als ungefährlicher Modelorganismus für L. monocytogenes verwendet wird (RAFFALLI et al. 1994). Nach einer HPP mit 700 MPa für 20 s konnte Listeria innocua nicht mehr nachgewiesen werden (Nachweisgrenze bei 0,3 KbE/g). Nach 26 Tagen wurden jedoch erneut Listerien detektiert, während in der uninokulierten sowie unbehandelten Kontrolle keine auftraten. Für 91 Tage quantitativ undetektierbar blieben L. monocytogenes in einer Untersuchung von HAYMAN et al. (2004) bei verschiedenen verzehrsfertigen Fleischprodukten nach HPP (600 MPa, 20 °C, 180 s, Lagerung bei 4 °C ).
BASARAN–AKGUL et al. (2010) stellten bei zerkleinerter Regenbogenforelle nach HPP (517 MPa, initial 20 °C; 5 Min) etwa 3,0 lg KbE/g Listerien fest, und damit eine Reduzierung von über 4 lg-Stufen (Ausgangskeimgehalt bei > 8 lg-Stufen). Eine Untersuchung von LAKSHMANAN und DALGAARD (2004) mit der Anwendung von Drücken von 150 bzw. 200 MPa an vakuumverpacktem, geräuchertem Lachs zeigte, dass diese nicht zur Elimination von L. monocytogenes führte. Durch die höchste Behandlungsstufe mit 250 MPa für 20 Minuten konnte lediglich eine Verzögerung der Wachstumsphase um mehrere Tage erwirkt werden.
Wie bereits angesprochen ist eine erfolgreiche HPP von diversen Parametern abhängig. Für L. monocytogenes haben HAYMAN et al. (2008) herausgefunden, dass je niedriger der umgebende aw-Wert eingestellt wurde desto höher war das Überleben der Keime nach HPP (600 MPa, 300 s, Raumtemperatur). Daneben ist auch der Stamm von Bedeutung. So wiesen die drei von SIMPSON und GILMOUR (1997a) untersuchten L. monocytogenes-Stämme deutliche Unterschiede der Inaktivierungsraten auf.
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23 Escherichia coli
Schon 1962 beschäftigten sich ZOBELL und COBET mit der Wirkung von Druck auf E. coli. Laut ihrer Studie war das Keimwachstum nach einer Behandlung mit 50,6 MPa vernachlässigbar und nach 53,1 MPa bereits nicht mehr vorhanden. Durch Erhöhung des Drucks und Verlängerung der Haltezeit kann auch die Inaktivierung von E. coli forciert werden, wie RAMASWAMY et al. (2008) gezeigt haben. Die entsprechenden Inaktivierungskurven weisen bei höheren Drücken (350 und 400 MPa) zudem einen deutlich steileren Verlauf als bei geringeren Drücken (250 und 300 MPa) auf. Sie empfehlen daher E. coli als Zielkeim für Hochdruckbehandlungen mit höheren Drücken (> 300 MPa) anzuwenden, weil er sich resistenter als beispielsweise L. monocytogenes verhält. Auch andere Autoren (HAUBEN et al. 1997; ALPAS et al. 1999; GOLA et al. 2000) erwähnen eine Resistenzbildung unterschiedlicher E. coli-Stämme gegenüber Hochdruck, die durch wiederholte HPP-Anwendungen mit anschließender Anzucht der Überlebenden erreicht werden kann (HAUBEN et al. 1997).
Dass mit deutlich höheren Drücken auch höhere Inaktivierungsraten erreicht werden können, zeigten GOLA et al. (2000) in einer Untersuchung, in der eine Suspension aus acht E. coli-Stämmen mit Hochdruck behandelt wurde. Mit 600 MPa ließen sich Reduzierungen von E. coli um 3,2 lg-Stufen in Pufferlösung und mittels 700 MPa Reduzierungen um 5 lg-Stufen in Hackfleisch nachweisen. Die Behandlungsdauer und -temperatur unterschieden sich dabei nicht (eine Minute, 15 °C).
MOUSSA et al. (2006) konnten bei 150 MPa für 10 Minuten bei Raumtemperatur keine signifikante Reduktion von E. coli feststellen. Bei 450 MPa konnte jedoch eine Reduktion um 5,3 lg-Stufen erzielt werden. Durch einen reduzierten aw-Wert wurde die Drucksensitivität zusätzlich signifikant abgesenkt.
Aerobe mesophile Gesamtkeimzahl und weitere Mikroorganismen
Die hochdruckinduzierte Reduktion der aeroben mesophilen Gesamtkeimzahl (GKZ) wird neben der Druckhöhe und -dauer, auch von der Ausgangskeimzahl der Matrices beeinflusst. So reichte die erwirkte Reduktion, je nach anfänglichem Keimgehalt, in Rindergehacktem durch 300 MPa von 0,5 bis 3,0 lg-Stufen. Bei der Anwendung von
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450 MPa waren es 3,0 bis 5,0 lg-Stufen, wobei weder Pseudomonaden noch Laktobazillen nachgewiesen werden konnten (CARLEZ et al. 1994). Bei 400 MPa wurden bereits Reduktionen von beiden Keimarten sowie von Koliformen in einer Höhe von z. T. über 5,0 lg-Stufen festgestellt.
Mit steigendem Druck konnte das Wachstum, der von CARLEZ et al. (1994) untersuchten Keime, nach HPP und Lagerung unter Luft oder Vakuum verzögert werden (Tab. 3).
Tab. 3: Durchschnittliche Wachstumsverzögerungen verschiedener Keime (Pseudomonaden, Laktobazillen, coliforme Bakterien, Gesamtkeimzahl) nach HPP- Behandlung (nach CARLEZ et al. 1994)
Angewandte Druckhöhe (MPa) 200 300 400 450
Verzögerung (Tage) 2-3 6-9 10-12 13-15
In einer Studie von HAYMAN et al. (2004) wurde die Verlängerung der Haltbarkeit von RTE (ready-to-eat)–Fleischprodukten durch HPP anhand verschiedener Mikroorganismen beschrieben. Sie untersuchten die Auswirkungen einer Behandlung mit 600 MPa für 3 Minuten bei 20 °C unter anderem auf die aerobe und anaerobe mesophile GKZ, Laktobazillen, Koliforme, Listeria spp. sowie Hefen und Schimmelpilze. Über eine Lagerungsdauer von 95 Tagen hinweg lagen alle Keimzahlen unterhalb der Nachweisgrenze oder zeigten nur geringes (< 200 KbE/g) Wachstum. Während der Lagerung wurde zusätzlich mittels Anreicherung auf L. monocytogenes untersucht, waren jedoch nicht nachweisbar. Laut BALASUBRAMANIAM und FARKAS (2008) lassen sich Hefen durch HPP mit 300 – 400 MPa bei 25 °C und einigen Minuten Haltezeit inaktivieren. 2002 untersuchten LOPEZ-CABALLERO et al. aus Schweinefleisch isolierte Pseudomonas fluorescens.
Mittels 400 MPa ließen sich die Pseudomonaden bis unterhalb der Nachweisgrenze inaktivieren, während der Anfangskeimgehalt bei 8 lg-Stufen lag. Nach acht Tagen waren jedoch deutliche Mengen (> 7 lg KbE/g) wiederauffindbar. Auch bei der
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25 Untersuchung von HPP-behandelten Austern (800 MPa, 5 min, 20 °C) von CRUZ- ROMERO et al. (2008) waren Pseudomonaden die einzigen Keime, die nach einer zweiwöchigen Lagerung bei 2 °C noch detektierbar waren.
Laktobazillen gelten neben Hefen und Schimmelpilzen als relativ sensibel gegenüber HPP. So konnten CAMPOS und CRISTIANINI (2007) eine Keimzahl von 1,2x107 KbE/ml von Lactobacillus plantarum in Orangensaft mit 250 MPa eliminieren.
Daneben fanden WON PARK et al. (2001) heraus, dass sich durch Drücke von 400, 500 und 600 MPa für 5 Minuten die Keimzahlen von Lactobacillus viridescens in MRS (Lactobacillus-Agar nach deMan, Rogosa und Sharpe)-Bouillon um jeweils 2, 7 bzw. 8 lg-Stufen reduzieren ließen.
2.5 Auswirkungen der Hochdruckbehandlung auf physikalische Eigenschaften
Farbe
Die Farbe bildet die Grundlage der individuellen Erwartungen gegenüber den sensorischen Eigenschaften eines Lebensmittels noch bevor dieses probiert bzw.
verzehrt wird und ist an der Entwicklung hinsichtlich einer Kaufentscheidung beteiligt (GARBER JR et al. 2003; LEE et al. 2013). Die prozessbedingten Veränderungen hinsichtlich des äußeren Erscheinungsbildes von hochdruckbehandelten Lebensmitteln spielen daher für die Anwendungs- und die Distributionsmöglichkeiten solcher Produkte eine sehr große Rolle.
Bei gekochten Würsten zeigt sich nach Hochdruckbehandlung (500 MPa, 5 bzw. 15 min, bei 65 °C) kein signifikanter Farbunterschied (MOR-MUR u. YUSTE 2003).
Hochdruckbehandelter, spanischer Schinken wies bei der Untersuchung von CAVA et al. (2009) lediglich in Bezug auf den Rotwert (a*-Wert) einen signifikanten Unterschied auf. In ihrem Vergleich zum unbehandelten Schinken war hier der Rotwert um etwa 15 % reduziert. CHEFTEL und CULIOLI (1997) schätzen in ihrer Literaturübersicht über Hochdruckbehandlung von Fleisch die zu erwartenden Farbveränderungen als einen Nachteil ein. Auch CHÉRET et al. (2005) stellten in ihrer Untersuchung an Wolfsbarsch Veränderungen der Farbwerte fest. So führten
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300 bis 500 MPa zu einer Verdopplung des Helligkeitswertes und einem gekochten Erscheinungsbild im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Sie halten dies jedoch nicht für einen großen Nachteil, da sie davon ausgehen, dass die meisten Fische vor Verzehr gekocht werden. Und dass durch das Kochen der Fische diese Unterschiede keine Rolle mehr spielen.
MATSER et al. (2000) haben eine umfangreiche Erhebung der Effekte durch HPP auf die Farbe verschiedener Fischarten durchgeführt. Eine fünfminütige Behandlung mit Drücken ab einer Höhe von 150-200 MPa und 0 °C resultierte bei allen acht untersuchten Fischarten (Köhler, Makrele, Thunfisch, Dorsch, Lachsforelle, Karpfen, Scholle und Seeteufel) in einem gekochten und damit hellerem Erscheinungsbild. Die einzige Ausnahme davon bildete Oktopus, dieser wies erst Veränderungen ab etwa 400 MPa auf. MATSER et al. führen diese optischen Veränderungen auf einen Verlust der Lichtdurchlässigkeit durch die Denaturierung der Proteine zurück. Des Weiteren erkannten sie, dass die druckinduzierte Farbveränderung von der jeweiligen Fischart abhängig war. Auch viele andere Autoren beschreiben eine opake Erscheinung des Fischfleisches von beispielsweise Räucherlachs, Lachs, Hecht, Thunfisch, Karpfen, entsalztem Stockfisch und Wolfsbarsch nach HPP (OHSHIMA et al. 1993; AMANATIDOU et al. 2000; HURTADO et al. 2000; SEQUEIRA-MUNOZ et al. 2006; LAKSHMANAN et al. 2007; ERKAN et al. 2010b; GUDBJORNSDOTTIR et al. 2010). Dabei wurden die Veränderungen v.a. in Druckbereichen oberhalb von 200 MPa oder bei längerer Haltezeit beobachtet.
Von der Denaturierung durch Hochdruckbehandlung sind unterschiedliche Proteine betroffen, deren Veränderung auch in messbaren Farbunterschieden resultiert. So kommt es zur Trennung des Hämoglobins in Häm und Globin (CARLEZ et al. 1995) sowie zu einer Spaltung der Wasserstoffbrücken, die zwischen dem Wasser der globulären Proteine (z.B. Albumin) und dem umgebenden Wasser ausgebildet sind (HAYAKAWA et al. 1996). Auch von Proteinen des Zytoskeletts (Desmin, Aktin) und sarkoplasmatischen Proteinen sind Denaturierungsvorgänge bekannt (ANGSUPANICH u. LEDWARD 1998). Die Denaturierung von Proteinen durch HPP unterscheidet sich zu der durch Hitzeeinwirkung hervorgerufenen (OHSHIMA et al.
1993; PANICK et al. 2003; YAGIZ et al. 2009), wie schon 1912 von BRIDGMAN an
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27 Albumin vermutet. YOSHOKA und YAMAMOTO (1998) stellten fest, dass das Myosin des untersuchten Karpfenmuskels erst bei höheren Drücken (300 MPa) sichtbare Veränderungen aufwies, während die Aktinfilamente bereits bei 100 MPa Vakuolen ausbildeten. Die druckinduzierte Denaturierung scheint insgesamt stärker ausgeprägt zu sein (HAYAKAWA et al. 1996).
aw-Wert
Um sich in einem Lebensmittel vermehren zu können, benötigen Bakterien und andere Mikroorganismen frei verfügbares Wasser. Je nach Keimspezies werden unterschiedliche Mengen gebraucht. Die Wasseraktivität als aw-Wert gibt den Gehalt an frei verfügbarem Wasser in einem Produkt an (HEESCHEN 2007). Die Zusammenhänge von aw-Wert und HPP sind Gegenstand von wenigen Untersuchungen.
Generell wirken proteinreiche Lebensmittel mit einem niedrigen aw-Wert schützend auf hochdruckbehandelte Zellen (CHEFTEL 1995; SIMPSON u. GILMOUR 1997b;
VAN OPSTAL et al. 2003; FDA 2011). Schon 1992 konnten OXEN und KNORR zeigen, dass sich Rhodotorula rubra bei einem aw-Wert unterhalb von 0.91 durch 400 MPa und 15 Minuten Behandlungsdauer nicht inaktivieren lassen, während ein aw-Wert von 0.96 eine Reduzierung des Hefepilzes um 7 lg-Stufen hervorrief.
HAYMAN et al. (2008) vermuten, dass der niedrige aw-Wert stabilisierend auf Proteine wirkt und damit eine Denaturierung mit konsekutivem Zelltod verhindert.
Auch MOUSSA et al. (2006) unterstützen die Annahme, dass ein niedriger aw-Wert schützend auf Zellen wirkt, bzw. sie dem Einfluss der HPP entzieht. Sie behandelten E. coli mit niedrigem (aw= 0,850) und hohem (aw= fast 1) aw-Wert in Druckbereichen von 50 bis 450 MPa bei 25 °C bzw. -20 °C. Bei niedrigem aw-Wert zeigte sich eine signifikante Reduzierung der Drucksensibilität von E. coli, dagegen bewirkte der hohe aw-Wert eine sehr viel geringere Reduzierung und somit eine deutlichere Stabilität gegenüber der Druckeinwirkung.
Des Weiteren untersuchten KOSEKI und YAMAMOTO (2007) den Einfluss verschiedener Pufferlösungen, die Natriumchlorid, Saccharose bzw. Phosphat enthielten, sowie unterschiedlicher aw-Werte auf die Inaktivierung von L. monocytogenes. Sie warnen davor, den aw-Wert als eine Messzahl für die HPP-
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induzierte Inaktivierung zu nutzen. Sie fanden bei gleichhohem aw-Wert, je nach untersuchtem Puffermedium, unterschiedlich hohe Inaktivierungen. Der Einfluss des keimumgebenden Mediums scheint demnach eine größere Rolle zu spielen als der vorherrschende aw-Wert. Auch die Food and Drug Administration der Vereinigten Staaten Amerikas (FDA) sieht Schwierigkeiten darin, die Auswirkungen des aw- Wertes, während einer HPP, in ihrer Gesamtheit vorherzusagen. Sie verweist darauf, dass Mikroorganismen zwar durch einen niedrigen aw-Wert geschützt werden, dieser Effekt jedoch dadurch verfälscht wird, dass gleichzeitig subletal geschädigte an einem Wachstum gehindert werden (FDA 2011). Diese subletale Schädigung ließe sich im Rahmen des Hürdenprinzips nutzen, bei dem zwei oder mehrere antimikrobiell wirksame Methoden miteinander kombiniert werden, um einen verbesserten Gesamteffekt zu erreichen (LEISTNER u. GORRIS 1995).
pH-Wert
Auch der pH-Wert eines Produktes beeinflusst das Wachstum und Überleben von Mikroorganismen darin. Für die meisten Erreger liegt das Optimum im neutralen Bereich um pH 7. Eine Ausnahme sind die Laktobazillen, deren Optimum im sauren Bereich von pH 5 liegt (HEESCHEN 2007).
Im Zusammenhang mit Hochdruck wirkt sich ein niedriger pH-Wert förderlich auf die keimreduzierende Wirkung der HPP aus (BALASUBRAMANIAM et al. 2008). Ein höherer pH-Wert scheint Mikroorganismen vor der Inaktivierung durch HPP zu schützen. Dazu testeten LINTON et al. (1999) das Überleben von E. coli O157:H7 in Orangensaft mit unterschiedlichen pH-Werten nach Hochdruckbehandlung. Je höher der pH-Wert war, desto geringer war der Inaktivierungseffekt durch die HPP. Bei niedrigem pH-Wert konnten sich subletal-geschädigte Zellen scheinbar kaum regenerieren und starben während der Lagerung schneller ab.
Auch STEWART et al. (1997) berichten, dass die Letalität durch die HPP, hier gegenüber L. monocytogenes CA, bei niedrigem pH-Wert (4,0) mit 350 MPa um 3 lg- Stufen größer war als bei einem pH-Wert von 6,0. Für ALPAS et al. (2000) stellt die Kombination eines niedrigen pH-Werts mit sanfter Hitze und Hochdruckanwendung die effektivste Methode dar, um die untersuchten Staphylokokken, Listerien, E. coli und Salmonellen zu inaktivieren. Bei je zwei der vier von ihnen untersuchten
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29 Stämmen zeigte sich bei niedrigem pH-Wert eine deutlich stärkere Reduktion der Keimzahlen (um 1,0 bis 3,3 lg-Stufen bei pH 4,5 gegenüber 6,5). Laut HAYERT et al.
(1999) sinkt der pH-Wert von sauren Lösungen (Phosphorsäure, Essigsäure, Orthophosphorsäure) unter steigendem Druck aufgrund von Dissoziation der schwachen Säuren. Sie konstatieren jedoch eine nicht-lineare Beziehung zwischen Druckanstieg und pH-Wert-Senkung aufgrund von Dissoziationsunterschieden der Puffersubstanzen. Dies bestätigen Untersuchungen von SAMARANAYAKE und SASTRY (2013), in denen die getesteten Flüssigkeiten (Grapefruitsaft, Ranch Dressing, Hühnerbrühe, Milch u.a.) unterhalb von 100 MPa einen deutlicheren pH- Wert-Abfall zeigten als oberhalb. Bei der ebenfalls untersuchten Guacamole hingegen kam es oberhalb von 100 MPa zu keiner Veränderung des pH-Wertes.
CARLEZ et al. (1995) stellten sogar einen pH-Wert-Anstieg bei Hackfleisch von 5,55 auf 5,77-5,79 nach HPP-Behandlung mit 400 bzw. 500 MPa fest. Sie begründen dies wiederum mit der hochdruckinduzierten Instabilität der Ionen (GROSS u. JAENICKE 1994).
EIGENE UNTERSUCHUNGEN
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3 EIGENE UNTERSUCHUNGEN
3.1 Materialien 3.1.1 Fischfilets
Für die Untersuchungen wurden zum einen frische Welsfilets von der Ahrenhorster Edelfisch GmbH & Co. KG (Badbergen/Vehs) auf Schmelzeis an das Deutsche Institut für Lebensmitteltechnik (DIL) geliefert. Die Mindesthaltbarkeitsdauer der Welsfilets betrug nach Herstellerangaben sieben Tage.
Zum anderen wurden mildgeräucherte Forellenfilets von der Firma Ternäben (Lembruch) in Packungseinheiten zu je zehn Einzelpackungen untersucht, die an das Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit geliefert worden sind. Eine Packungseinheit enthielt 125 g. Am Tag der Lieferung waren die Filets bereits seit fünf Tagen verpackt. Es handelte sich dabei um die Sorte „Natur“, in MAP- Verpackung (Schutzgasatmosphäre) mit einer Mindesthaltbarkeitsdauer von 21 Tagen. Das Attribut „mildgeräuchert“ verweist dabei auf den durch die Heißräucherung erzielten milden Geschmack.
3.1.2 Mikroorganismen
Der Listeria monocytogenes-Stamm (ATCC 15313/ NCTC 10357/ DSM 20600), ursprünglich isoliert aus Kaninchen, mit dem Serovar 1/2 a wurde der Stammsammlung des Instituts für Lebensmittelqualität und -sicherheit entnommen.
Gelagert wurden die Listerien bei -80 °C in MicrobankTM-Cryogefäßen (Art.-Nr.
291702, Mast Diagnostica GmbH, Reinfeld).
Für die Inokulation der geräucherten Forellenfilets wurde zusätzlich zu L. monocytogenes der Escherichia coli-Stamm mit der DSM-Nummer 10754 verwendet. Der Keim wurde 1979 in Bristol aus den Faeces eines gesunden Menschen isoliert und weist den Serotyp O1:K1 auf.
EIGENE UNTERSUCHUNGEN
31 3.2 Methoden
3.2.1 Herstellung der Suspensionen
Sowohl die Wels- als auch die Forellenfilets wurden in fein zerkleinertem Zustand mit L. monocytogenes inokuliert. Für die Herstellung der Suspension zur Inokulierung der Fischproben wurde der Stammsammlung ein Cryo-Kügelchen entnommen und in 10 ml Halb-Fraser-Bouillon (HF; Art.-Nr. BO 0350 S, Fa. OXOID, Wesel) überführt.
Nach einer 24-stündigen Wachstumsphase bei 30 °C erfolgte ein Ösenausstrich auf einer Blutagarplatte (Art.-Nr. PB 5039 A, Fa. OXOID, Wesel). Von dieser Agarplatte wurden nach 24-stündiger Bebrütung bei 37 °C einige Kolonien abgenommen und in 500 ml HF eingebracht. Die Suspension wurde 24 h bei 30 °C bebrütet und stand daraufhin zur Inokulation der Fischmasse bereit.
Der E. coli-Stamm wurde als gefriergetrocknete Kultur von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH bezogen und nach einer 24-stündigen Erholungsphase bei 37 °C in Brain Heart Infusion-Bouillon (BHI; Art.- Nr. 110493, Fa. Merck, Darmstadt) auf Blutagarplatten (Art.-Nr. PB 5039 A, Fa.
OXOID, Wesel) ausgestrichen. Von den Platten wurden Kolonien in MicrobankTM- Cryogefäße (Art.-Nr. 291702, Mast Diagnostica GmbH, Reinfeld) überführt und bei - 80 °C eingelagert.
Für die Herstellung der Keimsuspension wurde ein Cryo-Kügelchen dem MicrobankTM-Kryogefäß entnommen und in ein Reagenzglas mit 10 ml BHI-Bouillon überführt. Es folgte eine Bebrütung für 24 h bei 37 °C. Um die Keimreinheit zu überprüfen und zu gewährleisten wurde anschließend von dieser Bouillon eine Öse auf einer Blutagarplatte ausgestrichen und für 24 h bei 37 °C bebrütet. Von dieser Platte wurden mehrere Kolonien in 500 ml BHI-Bouillon überführt. Nach einer 24- stündigen Bebrütung bei 37 °C konnte die hergestellte Suspension zur Inokulation verwendet werden.
3.2.2 Beimpfung, Verpackung und Lagerung
Die Welsfilets, die nicht für die Inokulationsversuche vorgesehen waren, wurden im DIL in Teilstücke (100 bis 150 g) zerkleinert und zu mehreren Stücken mit dem
