Archiv "Geschlechterkonflikt im frühen Embryo: Elternspezifische Reprogrammierung des väterlichen und mütterlichen Erbguts nach der Befruchtung" (05.09.2003)

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ie alle höheren Lebewesen besitzt der Mensch ein diploides somatisches Genom. Das Genom ist die Summe aller DNA-Se- quenzen eines Individuums. Bei der Befruchtung werden ein väterliches und ein mütterliches Genom vereinigt und bilden damit einen neuen Orga- nismus. Kerntransferexperimente im Modellorganismus Maus haben erst- mals die funktionelle Nichtäquivalenz der beiden elterlichen Genome für die embryonale Entwicklung gezeigt (24, 35). Androgenetische Embryonen mit zwei männlichen Genomen (Grafik 1) sind im Wachstum stark retardiert, während Trophoblast und Dottersack relativ gut ausgebildet sind. Dagegen entwickeln sich gynogenetische Em- bryonen mit zwei weiblichen Geno- men relativ normal bis zur Schwanger- schaftsmitte, haben aber kaum extra- embryonales Gewebe. In beiden Fäl- len kommt es zum vorzeitigen Abster- ben der Schwangerschaft. Ursache ist die elternspezifische Prägung (Im-

printing) von einigen Genen, die aus- schließlich von den väterlichen beziehungsweise mütterlichen Chromoso- men exprimiert werden (4, 6, 36). Eine normale Entwicklung und ein normaler Phänotyp erfordern deshalb nicht nur einen diploiden Chromosomen- satz, sondern auch eine biparentale (väterliche und mütterliche) Verer- bung.

Bei uniparentalen Disomien (UPD) stammen beide Chromosomen eines Paarlings, zum Beispiel beide Chromo- somen 15 von einem Elternteil, während alle übrigen Chromosomen in einer väterlichen und einer mütterli- chen Kopie vorliegen. Uniparentale Disomien kommen wahrscheinlich dadurch zustande, dass Embryonen, die aufgrund von Chromosomenfehlver- teilungen in der mütterlichen oder vä- terlichen Meiose beispielsweise eine Trisomie 15 oder eine Monosomie 15

aufweisen, durch den zufälligen Ver- lust eines überzähligen Chromosoms 15 beziehungsweise eine Chromoso- menduplikation in einer der ersten Tei- lungen nach der Befruchtung „gerettet“ werden (Grafik 2). Mit Ausnahme der Geschlechtschromosomen führt das Fehlen eines Chromosoms immer zum Schwangerschaftsverlust. Triso- mien sind nur für die Chromosomen 21 (Down-Syndrom), 13 (Pätau-Syn- drom) und 18 (Edwards-Syndrom) sowie für die Geschlechtschromosomen überlebensfähig. Entsteht durch solche embryonalen „Rettungsversuche“ aus aneuploiden Zellen eine maternale oder paternale UPD 15, beobachtet man sehr unterschiedliche Krankheits- bilder (11, 15). Das Prader-Willi-Syn- drom infolge maternaler UPD 15 ist durch Stammfettsucht und kurze Ex- tremitäten mit kleinen Händen und Füßen charakterisiert. Im Neugebore- nenstadium beobachtet man eine Mus- kelhypotonie und Trinkschwäche, die nach etwa einem Jahr in eine Fress-

Geschlechterkonflikt im frühen Embryo

Elternspezifische Reprogrammierung des väterlichen und mütterlichen Erbguts nach der Befruchtung

Zusammenfassung

Im frühen Säugerembryo findet eine epigene- tische Reprogrammierung von väterlichem und mütterlichem Genom statt. Um die Toti- potenz der embryonalen Zellen wiederherzu- stellen, müssen die elternspezifisch modifi- zierten Erbanlagen aus Spermium und Eizelle für die somatische Entwicklung kompetent gemacht werden. Genomweite Veränderun- gen der DNA-Methylierung spielen dabei eine entscheidende Rolle. In der befruchteten Ei- zelle kommt es innerhalb weniger Stunden zu einer aktiven Demethylierung des väterlichen Genoms, während das mütterliche Genom erst nach dem Zweizellembryonalstadium schrittweise demethyliert wird. Diese Asym- metrie ist Ausdruck eines Geschlechterkon- fliktes. Die Eizelle, das heißt das mütterliche Genom, versucht aus der männlichen Keim- bahn vererbte Methylierungsmuster, die das Embryowachstum im väterlichen Sinne be- einflussen, weitgehend auszulöschen. Stö-

rungen bei diesem hoch koordinierten Prozess sind wahrscheinlich eine wichtige Ursache für den Verlust von Embryonen und abnormale Entwicklungen. Langzeitstudien zur Abschät- zung des epigenetischen Risikos für das Auf- treten von Reprogrammierungsfehlern bei künstlicher Fortpflanzung sind dringend not- wendig.

Schlüsselwörter: DNA-Methylierung, früher Em- bryo, genomische Prägung, Genomreprogram- mierung, künstliche Fortpflanzung

Summary

The Battle of the Sexes in the Early Embryo: Parent-Specific Reprogramming of the Paternal and Maternal Genomes after Fertilization

In the early diploid mammalian embryo, the paternal and maternal genomes undergo epigenetic reprogramming of the two very

different gamete nuclei for somatic develop- ment and formation of totipotent embryonal cells. Genome-wide opposing patterns in DNA methylation are fundamental to this process.

Active demethylation of the paternal genome occurs within a few hours in the fertilized egg, whereas similar demethylation of the maternal genome occurs passively step by step after the two-cell embryo stage. This asymmetry can be viewed as a battle of the two sexes, in which the egg which carries the maternal genome tries to strip off male germ- line-derived methylation patterns. Disturb- ances in this highly coordinated process may contribute to pregnancy failure and abnormal development. Long-term follow up studies are needed to estimate the epigenetic risk of reprogramming defects associated with assisted reproductive technologies.

Key words: DNA methylation, early embryo, genomic imprinting, genome reprogramming, assisted, reproductive technology,

Institut für Humangenetik (Direktor: Prof. Dr. med. Tho- mas Haaf), Johannes Gutenberg-Universität Mainz

Thomas Haaf

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sucht übergeht. Kinder mit Angelman- Syndrom infolge paternaler UPD 15 werden wegen der ataktischen pup- penartigen Bewegungen, des lachen- den Gesichtsausdrucks und der inad- äquaten Lachanfälle auch als „happy puppet“ beschrieben. Sie entwickeln meist keine Sprache und leiden an pro- gredienten Krampfanfällen. Die men- tale Retardierung ist sehr viel schwerer als beim Prader-Willi-Syndrom. In der für Prader-Willi- und Angelman-Syn- drom kritischen Chromosomenregion 15q11-13 liegt eine Gruppe von väter- lich beziehungsweise mütterlich ge- prägten Genen. Das Fehlen der väterli- chen Genexpression bei maternaler UPD 15 bewirkt den Prader-Willi-Phä- notyp, während das Fehlen der mütter- lichen Genexpression bei paternaler UPD 15 mit dem Angelman-Syndrom einhergeht.

Eine andere geprägte Region liegt auf Chromosom 11p15. Bei paternaler UPD 11 bewirkt die Überexpression des väterlich exprimierten embryonalen Wachstumsfaktors Igf2 (insulin like growth factor 2) einen prä- und post- natalen Gigantismus, das so genannte Beckwith-Wiedemann-Syndrom. Wei- tere Auffälligkeiten sind Exomphalos, Makroglossie, Viszeromegalie und ein akzeleriertes Knochenwachstum. Die geistige Entwicklung ist dagegen normal. Etwa 10 Prozent der Beckwith- Wiedemann-Patienten entwickeln embryonale Mischtumoren der Niere.

Für die meisten menschlichen Chro- mosomen wurden inzwischen UPD gefunden.

Bisher sind aber nur die paternale UPD 6 (transienter neonataler Diabe- tes), die maternale UPD 7 (Russell-Sil- ver-Syndrom, Wachstumsstörungen), die paternale UPD 11, die maternale und paternale UPD 14 (multiple Fehl- bildungen und Entwicklungsstörun- gen), sowie die maternale und paternale UPD 15 mit charakteristischen Krankheitsbildern verknüpft (10, 21).

Bei manchen Chromosomen, zum Bei- spiel 13, 21 und 22, scheinen UPD keine phänotypischen Auswirkungen zu haben. UPD, die sehr früh in der Schwangerschaft zum Abort führen oder nur mit relativ unspezifischen Merkmalen (zum Beispiel Wachstums- störungen, Fertilitätsprobleme oder er-

höhtes Krebsrisiko) einhergehen, sind allerdings nur sehr schwer nachzuwei- sen. Andererseits zeigen nur einige Dutzend bis 100 der 30 000 bis 40 000 menschlichen Gene eine elternspezifische Aktivität. Da diese relativ wenigen Gene nicht zufällig im Genom verteilt, sondern in Gruppen angeord- net sind (4, 6, 36), müssen nicht auf al- len Chromosomen geprägte Regionen vorhanden sein.

Passwort-Kodierung der elterlichen Genome durch DNA-Methylierung

Die elternspezifische Prägung von Ge- nen und Genomen findet in der väter- lichen und mütterlichen Keimbahn statt. Während der Reifung der Ge- schlechtszellen erhalten die Chromo- somen beider Elternteile verschiedene Kodierungen in Form von DNA-Me- thylierung, die kritisch für die Regula- tion der väterlichen und mütterlichen

„Interessen“ bei der Entwicklung des Embryos in der nächsten Generation sind. Durch enzymatische Methylie- rung bestimmter Cytosinbasen wird die Chromatinstruktur und damit die Zugänglichkeit von Genen für die Transkriptionsmaschinerie gezielt be- einflusst (2, 30). Im Gegensatz zu Mu- tationen, welche die Basenabfolge im DNA-Molekül irreversibel verändern, wird durch Methylierung die „Lesbar- keit“ der Gensequenz reversibel modi- fiziert. Dieses Phänomen wird als Epi- genetik bezeichnet. In Analogie zu Computerdatenbanken, in denen das Zugriffsrecht auf elektronisch abge- speicherte Informationen durch Pass- worte reguliert wird, verteilt die DNA- Methylierung die Leserechte für genetische Informationen. Durch das Setzen von Methylierungsmustern werden Gene oder ganze Genomab- schnitte für den „User“, das heißt die Zelle, lesbar beziehungsweise unlesbar gemacht. Eine Leberzelle benötigt andere Informationen aus dem gesamten genetischen Repertoire (Genom) eines Organismus als eine Muskelzelle.

Die zelltypspezifische Methylierungs- kodierung ist in der Regel stabil und wird bei der Zellteilung an beide Toch- terzellen weitergegeben („vererbt“).

Entwicklungs- und Differenzierungs- prozesse sind aber nur möglich, wenn die dazu benötigten passwortgeschütz- ten Gene durch Demethylierung wieder lesbar gemacht und nicht mehr re- levante Gene durch Methylierung inaktiviert werden. Die Methylierungs- muster und damit das genetische Pro- gramm einer Zelle müssen also verän- derbar sein(Grafik 3).

Epigenetische

Reprogrammierung im frühen Säugerembryo

Der Einzellembryo (befruchtete Ei- zelle, Zygote) wird von zwei sehr unterschiedlichen Arten von Chromatin gebildet. Die Spermien-DNA ist durch Protamine in eine fast kristalline Struk- tur kondensiert. Protamine sind sehr kleine basische DNA-Verpackungspro- teine, die in den Spermienchromoso- men die Histonproteine ersetzen. In somatischen Zellen und in der Eizelle besitzt das Chromatin eine nukleoso- male (perlenkettenförmige) Struktur.

Jeweils zwei Histonproteine H2a, H2b, H3 und H4 bilden das Nukleosom, um das sich die DNA-Doppelhelix windet.

Die histonverpackten Chromosomen A

A2302 Deutsches ÄrzteblattJg. 100Heft 365. September 2003

Herstellung von uniparentalen Embryonen durch Kerntransfer. Die befruchtete Eizelle enthält ein väterliches (blau) und ein mütter- liches (rot) Genom, die im Vorkernstadium durch eigene Kernmembranen voneinander getrennt sind. Entfernt man mit einer Pipette den mütterlichen Vorkern und transplantiert den väterlichen Vorkern aus einer anderen befruchteten Eizelle, erhält man einen andro- genetischen Embryo mit zwei männlichen Ge- nomen. In analoger Weise können gynogene- tische Embryonen mit zwei weiblichen Geno- men hergestellt werden.

Grafik 1

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der Eizelle sind sehr viel weniger kondensiert als die Spermienchromoso- men und im zweiten meiotischen Me- taphasestadium arretiert. Erst nach der Befruchtung komplettiert die Ei- zelle die Meiose durch Ausstoßung des zweiten Polkörperchens (27). In der befruchteten Eizelle und den darauf folgenden frühen Embryonalstadien findet eine dramatische Reprogram- mierung von Spermien- und Eizellge- nom in ein neues diploides somatisches Genom statt. Dadurch wird die Totipo- tenz, das heißt die Fähigkeit der embryonalen Zellen, ein ganzes Individu- um zu bilden, wieder hergestellt. Bei diesem Prozess spielen genomweite Ver- änderungen der DNA-Methylierung eine entscheidende Rolle.

Mit Ausnahme der wenigen gepräg- ten Gene, deren keimbahnspezifische Methylierungsmuster die gesamte Ent- wicklung hindurch erhalten bleiben, kommt es im frühen Embryo zu einer genomweiten Demethylierung der vä- terlichen und mütterlichen Erban- lagen. Diese postzygotische Demethy- lierung ist wahrscheinlich notwendig,

um die in der männlichen und weiblichen Keimbahn erworbenen eltern- spezifischen DNA-Modifikationen weitgehend auszulöschen und die embryonalen Zellen für eine somatische Ent- wicklung zu reprogrammieren. Erst nach Entfernung der keimbahnspezi- fischen epigenetischen Modifikatio- nen werden entwicklungsspezifische somatische Methylierungsmuster gesetzt. Interessanterweise gibt es bei der Methylierungsreprogrammierung Unterschiede zwischen den Spezies.

Bei der Maus findet die Remethylie- rung der embryonalen Zellen erst in der Blastozyste statt (Grafik 4), beim Rind dagegen bereits im 8- bis 16-Zell- stadium (26, 28). Es ist wichtig anzu- merken, dass diese dramatischen Pro- zesse im frühen Embryo beinahe oder vollständig unter mütterlicher Kon- trolle ablaufen. Im Gegensatz zum Spermium liefert die befruchtete Ei- zelle nämlich nicht nur das mütterli- che Genom, sondern auch die zellulä- re Maschinerie für die Reprogram- mierung von väterlichem und mütter- lichem Genom.

Geschlechterkonflikt beginnt unmittelbar nach der Befruchtung

Durch Antikörper gegen 5-Methylcyto- sin kann die Dynamik der Reprogram- mierungsvorgänge im frühen Mausem- bryo direkt sichtbar gemacht werden (22, 31). Das Spermienchromatin wird in der befruchteten Eizelle zunächst de- kondensiert und die Protamine werden gegen Histone ausgetauscht. Es bildet sich der väterliche Vorkern, der bei der Maus etwas größer ist als der müt- terliche. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigt, dass beide elterlichen Genome nach der Befruchtung hochmethyliert sind (Abbildung 1a, b). Väterliches und mütterliches Genom sind in der befruchteten Eizelle zunächst noch durch eigene Kernmembranen voneinander getrennt (Abbildung 1c). In diesem Vor- kernstadium wird das väterliche Ge- nom innerhalb von ein bis zwei Stunden drastisch demethyliert, während das mütterliche Genom gleichmäßig methyliert bleibt (Abbildung 1d). Da die- ser Prozess sehr rasch und noch vor der ersten DNA- Verdoppelung stattfindet, muss es sich um eine aktive Demethylierung handeln (Grafik 3). Erst im späten Einzellembryo lösen sich die Vorkernmembranen auf und väterliches und mütter- liches Erbgut kommen zum ersten Mal in direkten Kon- takt. Ab diesem Zeitpunkt gilt die befruchtete entwick- lungsfähige menschliche Ei- zelle als Embryo im Sinne des Embryonenschutzge- setzes (13). Erstaunlicher- weise kommt es nach der Kernverschmelzung aber nicht zu einer sofortigen Durchmischung von väterli- chen und mütterlichen Erb- anlagen, wie das Embryo- nenschutzgesetz unterstellt.

In der ersten Mitose liegen sich hochmethylierte müt- terliche und demethylierte väterliche Chromosomen getrennt gegenüber (Abbil- dung 1e). Der Methylie- Entstehung von uniparentalen Disomien. Die Meiose

dient der Differenzierung von haploiden Keimzellen aus diploiden Vorläuferzellen. In der ersten meioti- schen Teilung werden die homologen Chromosomen eines Paarlings getrennt, in der zweiten meiotischen Teilung die Schwesterchromatiden eines Chromo- soms. In dem gezeigten Beispiel resultiert eine Fehl- verteilung (Non-Disjunction) in der Meiose II in aneuploiden Gameten, die ein Chromosom zu viel beziehungsweise zu wenig haben. Nach Befruchtung mit einem normalen Spermium entstehen trisome beziehungsweise monosome Embryonen, die bis auf wenige Ausnahmen nicht lebensfähig sind. Kommt es in dem trisomen Embryo durch eine weitere (postzygotische) Chromosomenfehlverteilung zum Verlust eines überzähligen Chromosoms, entsteht wieder ein normaler (euploider) Chromosomensatz.

Hier gibt es wiederum zwei Möglichkeiten: Geht ei- nes der beiden aus der Eizelle vererbten Chromoso- men verloren, besitzt der Embryo ein väterliches und ein mütterliches Chromosom und wird sich voll- kommen normal weiterentwickeln. Geht aber zufäl- lig das väterliche Chromosom verloren, besitzt der Embryo zwei mütterliche, aber keine väterliche Chromosomenkopie. Dies bezeichnet man als mater- nale uniparentale Disomie. Der Embryo mit Monoso- mie kann nur „gerettet“ werden, wenn es nach der Befruchtung zu einer Duplikation des aus der väter- lichen Keimbahn vererbten Chromosoms kommt. Es entsteht ein euploider Embryo mit zwei väterlichen Chromosomenkopien, das heißt einer paternalen UPD. Das Fehlen der väterlichen oder mütterlichen Genexpression bewirkt bei der UPD 15 und einigen anderen uniparentalen Disomien schwere Entwick- lungsstörungen. UPD, uniparentale Disomie.

Embryo mit Monosomie Embryo mit

Trisomie eines Chromosoms

Ordnungsgemäße Segregation der

Chromosomen

Chromosomen- duplikation Befruch-

tung Non-Disjunc-

tion 2. Meiotische

Teilung

1. Meiotische Teilung

Biparen- tale Vererbung

Mater- nale UPD

Pater- nale UPD Zufälliger

Verlust eines Chromosoms Grafik 2

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rungsgrad der mütterlichen DNA bleibt von der unbefruchteten Eizelle bis zum Zweizellstadium unverändert. In beiden Zellkernen eines Zweizellembryos im- ponieren eine methylierte mütterliche und eine demethylierte väterliche Kern- hälfte (Abbildung 1f). Diese Genomse- parierung löst sich erst ab dem Vierzell- stadium schrittweise auf (23). Nach dem Zweizellstadium kommt es dann passiv zu einer graduellen Demethylierung des weiblichen Genoms. Da die enzymatische Maschinerie zur Weitergabe der Methylierungsmuster an die Tochterzel- len im frühen Embryo inaktiviert ist (5), geht bei jeder DNA-Verdoppelung die Hälfte der Methylgruppen verloren. Die Methylierung der mütterlichen

Kernhälfte ist deshalb im Vier- zellembryo deutlich schwächer (Abbildung 1g)als im Zweizel- ler. Im 16- bis 32-Zellstadium ist dann auch das mütterliche Genom nahezu vollständig demethyliert (Grafik 4).

Die befruchtete Eizelle, das heißt das mütterliche Genom, demethyliert unmittelbar nach der Befruchtung das väterliche Genom, und zwar unabhängig von der Anzahl der vorhande-

nen Genome. Da überzählige mütterli- che Genome in gynogenetischen oder parthenogenetischen Mäuseembryonen nicht demethyliert werden (1), kann die Eizelle die DNA aus der väterlichen und der mütterlichen Keimbahn offenbar unterscheiden und das mütterliche Erbgut vor der Demethylierungsakti- vität schützen. Die dramatische Deme- thylierung der paternalen zygotischen DNA kann als „Waffe“ im Geschlech- terkonflikt interpretiert werden (14, 29).

Die genetische Konflikthypothese von Moore und Haig (25) erklärt die Evolu- tion von Imprintingmechanismen bei Säugetieren mit den unterschiedlichen elterlichen Interessen bezüglich der

Entwicklung des Em- bryos. Väterlich expri- mierte Gene tendieren dazu, das Embryo- wachstum ohne Rück- sicht auf die mütterli- chen Ressourcen zu steigern. Mütterlich ex- primierte Gene wirken dem entgegen und re- duzieren das Embryo- wachstum soweit, dass auch weitere Schwan- gerschaften (eventuell mit anderen Vätern) möglich sind. Das maternale Genom benutzt aktive Demethy- lierungsmechanismen, um das väterliche epigenetische Programm weitgehend auszuschal- ten. Soweit bekannt, scheinen nur sehr wenige Methylierungen aus der männlichen Keim- bahn diesem Prozess zu entgehen (28, 29). Das väterliche Genom hat deshalb im Lauf der Evolution alter- native Strategien entwickelt, um „miss- liebige“ Gene zum Beispiel durch die Ex- pression von Antisensetranskripten zu inaktivieren.

Reprogrammierungsdefekte als Ursache für Embryoverlust und Imprintingkrankheiten

Die Methylierungsreprogrammierung der beiden elterlichen Genome im frü- hen Embryo ist ein zeitlich und topolo- gisch hoch koordinierter Prozess. So ist es nicht verwunderlich, dass es dabei zu

A

Die dynamischen DNA-Methylierungsmuster sind das Resultat von Methylierungs- und Demethylierungspro- zessen. a) Die Genome aus der männlichen und weibli- chen Keimbahn sind hochmethyliert. An die Cytosinba- sen von GC/CG-Dinukleotiden angeheftete Methylgrup- pen bewirken eine spiegelsymmetrische Methylierung beider DNA-Stränge der Doppelhelix. Bei der aktiven Demethylierung der väterlichen DNA in der befruchte- ten Eizelle entfernt eine bisher unbekannte Demethyla- se diese Methylgruppen vom DNA-Molekül. b) Die DNA in 16- bis 32-zelligen Mausembryonen ist vollkommen demethyliert. c) Bestimmte DNA-Methyltransferasen können Methylgruppen an die Cytosinbasen von unme- thylierten GC/CG-Dinukleotiden anheften. So werden in den embryonalen Zellen der Blastozyste zelltyp- und entwicklungsspezifische Methylierungsmuster gesetzt.

d) Methylcytosin kann nicht direkt in die neu syntheti- sierte DNA inkorporiert werden. Bei der DNA-Verdoppe- lung (Replikation), die der Zellteilung vorausgeht, ent- stehen deshalb hemimethylierte DNA-Moleküle, die nur im parentalen Strang Methylgruppen aufweisen. Erst nachdem die DNA-Methyltransferase wieder Methyl- gruppen an die entsprechenden Stellen im neu syntheti- sierten (grauen) Strang angeheftet hat, ist auch das Me- thylierungsmuster kopiert. Bei der passiven (replikati- onsabhängigen) Demethylierung, zum Beispiel der müt- terlich DNA im Präimplantationsembryo, ist die DNA- Methyltransferase inaktiv. Wenn keine Methylgruppen an die neusynthetisierte DNA mehr angeheftet werden, geht mit jeder DNA-Verdoppelung und Zellteilung die Hälfte der Methylierungen verloren.

Grafik 3

Methylierungsreprogrammierung im frühen Säugerembryo. Zum Zeitpunkt der Befruch- tung sind beide Genome hochmethyliert.

Das väterliche Genom (blau) wird noch in der Zygote aktiv demethyliert. Der Methylie- rungsgrad des weiblichen Genoms (rot) bleibt bis zum Zweizellstadium unverändert hoch und reduziert sich dann mit jeder Zell- teilung (DNA-Verdoppelung) um die Hälfte.

Bei der Maus sind die embryonalen Zellen bis zum Blastozystenstadium maximal demethy- liert, das heißt mit Ausnahme einiger weni- ger geprägter Gene ist die gesamte Erbinfor- mation lesbar gemacht. Aus der inneren Zell- masse der Blastozyste können embryonale Stammzellkulturen etabliert werden.

Grafik 4

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Fehlern kommt, die nicht mit einer normalen Entwicklung vereinbar sind. Ungefähr 10 Prozent normal befruchteter Mäuseembryonen zeigen im Zweizellstadium abnormale Methylierungsmuster. In einem Teil der Zellkerne wurde das müt- terliche Genom vorzeitig demethyliert (Abbildung 2a, b), in anderen Zellkernen ist die zygotische Demethylierung des väterlichen Genoms ausgeblieben (Abbildung 2c, d). Die Häufigkeit von solchen Embryonen mit androgenetischen (rein männlichen) oder gynogenetischen (rein weiblichen) Methy- lierungsmustern korreliert mit der Anzahl der Embryonen, die sich in Kultur nicht zur Blastozyste weiterentwickeln (33). Bei Superovu- lation der Mausweibchen verdop- peln sich die Inzidenz abnormal methylierter Embryonen und die Embryoverlustrate. Die Kulturbe- dingungen von in vitro fertilisier- ten (IVF) Mäuseembryonen haben ebenfalls erheblichen Ein- fluss auf die Häufigkeit von Re- programmierungsdefekten. Die unterschiedlichen Embryoverlustra- ten in Mäusestämmen mit verschiede- nem genetischem Hintergrund weisen darauf hin, dass auch genetische Fakto- ren eine Rolle spielen.

Störungen der Methylierungsrepro- grammierung sind wahrscheinlich für den häufigen Verlust von menschlichen Embryonen nach normaler und künstli- cher Befruchtung mitverantwortlich.

Im Vergleich zur Keimbahn, in der ebenfalls genomweite elternspezifische Umprogrammierungsprozesse stattfin- den (28), ist der Präimplantationsem- bryo relativ schlecht vor Umweltein- flüssen geschützt. Zu keinem anderen Zeitpunkt in der Entwicklung ist die Epigenetik eines Individuums so anfäl- lig gegenüber der Umwelt. Es besteht begründeter Verdacht, dass Imprinting- krankheiten, wie zum Beispiel Beck- with-Wiedemann- (9) und Angelman- Syndrom (7) bei Kindern, die durch IVF oder intrazytoplasmatische Sper- mieninjektion (ICSI) gezeugt wurden, gehäuft vorkommen. Das erniedrigte Geburtsgewicht bei künstlicher Be- fruchtung (32) passt ebenfalls gut zu einer Fehlregulation von geprägten Ge-

nen, welche das Embryowachstum steu- ern. Tierexperimentelle Studien haben bereits gezeigt, dass die Kulturbedin- gungen und Manipulation von in vitro kultivierten Embryonen die Expression von geprägten Genen und das fetale Wachstum beeinflussen können (12, 20). Außerdem scheint die Fehlbil- dungsrate bei ICSI erhöht (16), wobei man allerdings berücksichtigen muss, dass die Eltern oft älter und/oder genetisch vorbelastet sind. Langzeitstudien bei einer größeren Zahl von IVF- und ICSI-Kindern sind für die Abschätzung des genetischen und epigenetischen Ri- sikos bei den modernen Reprodukti- onstechnologien unbedingt erforder- lich. Geprägte Gene beeinflussen nicht nur das Wachstum von Fetus und Pla- zenta, sondern spielen auch für die Ent- wicklung von kognitiven Fähigkeiten und Verhalten, sowie bei der Krebsent- stehung eine wichtige Rolle (11, 15, 36).

Vor einer künstlichen Befruchtung soll- te das erhöhte Risiko für Imprinting- störungen und größere Fehlbildungen mit den Eltern im Rahmen einer genetischen Beratung besprochen werden.

Für alle neugeborenen Kinder besteht ein allgemeines Basisrisiko von 3 bis 5 Prozent, dass bei Geburt eine nicht vor- hersehbare Störung oder Erkrankung vorliegt. Dieses Risiko ist bei ICSI-Kin- dern wahrscheinlich verdoppelt.

Medizinische

Unverantwortlichkeit der Embryoklonierung

Dass die reproduktive Klonierung von Säugerembryonen – wenn auch mit einer geringen Effizienz – möglich ist, wurde an bisher acht Spezies gezeigt, darunter Schaf, Rind, Schwein und Maus. Bei der Klonierung wird das di- ploide Spendergenom einer Körperzel- le in eine aktivierte entkernte Eizelle eingesetzt. Abhängig von Spezies und Spenderzelltyp entwickeln sich aber nur sehr wenige (0,1 bis 3 Prozent) Klo- ne bis zur Geburt (34). Plazenta und Fetus sind häufig zu groß (Large- offspring-Syndrome) und erinnern an epigenetischen Gigantismus, wie er zum Beispiel beim Beckwith-Wiedemann- Abbildung 1: Elternspezifische Methylie- rungsreprogrammierung im frühen Maus- embryo. Methylierte DNA-Sequenzen sind durch Immunfluoreszenz mit einem Anti- 5-Methylcytosin-Antikörper grün markiert, demethylierte Sequenzen erscheinen durch die Gegenfärbung mit DAPI blau. a) Befruch- tete Eizelle mit Spermienkern (m), mütterli- chem Chromosomensatz (w) und zweitem Polkörperchen (Pk). b) Weiblicher (w) und männlicher (m) Chromosomensatz sind ein bis drei Stunden nach der Befruchtung hochmethyliert. c) Phasenkontrastaufnahme eines Vorkernstadiums. Weiblicher (w) und männlicher (m) Vorkern liegen sich in der Zy- gote getrennt gegenüber. d) Die Immunflu- oreszenzfärbung einer vergleichbaren Zygo- te zeigt mehrere Stunden nach Befruchtung einen vollkommen demethylierten väterli- chen Vorkern (m). Mütterlicher Vorkern (w) und zweites Polkörperchen bleiben hochme- thyliert. e) Erste Mitose nach der Kernver- schmelzung etwa 20 Stunden nach Befruch- tung. Hochmethylierte mütterliche und de- methylierte väterliche Chromosomen sind nicht durchmischt. f) Zweizellembryo etwa 30 Stunden nach der Befruchtung. Jeder Zell- kern hat eine hochmethylierte mütterliche (w) und eine demethylierte väterliche (m) Hälfte. g) Vierzellembryo etwa 45 Stunden nach der Befruchtung. Der Methylierungs- grad der mütterlichen Kernhälfte hat deut- lich abgenommen. Das zweite Polkörper- chen bleibt unverändert hoch methyliert und dient als Färbekontrolle.

a b

c d

e f

g

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Syndrom durch die gesteigerte Akti- vität des väterlich exprimierten Wachs- tumsfaktors Igf2 verursacht wird. Die perinatale Sterblichkeit ist erhöht, und auch bei Geburt scheinbar normale Klone haben später häufig Probleme, unter anderem Lungenversagen, Le- berfibrose, Nierenfibrose, Kardiomyo- pathien, Anämien und Immundefekte.

Da diese Erkrankungen im Allgemei- nen nicht an die Nachkommen von klonierten Tieren weitervererbt werden, liegt die Ursache wohl nicht in genetischen Veränderungen (Mutationen) sondern epigenetischen Störungen (17, 37).

Die Reprogrammierungsmaschinerie der befruchteten Eizelle erwartet zwei unterschiedlich modifizierte Keimzell- genome und ist darauf spezialisiert, aus der männlichen Keimbahn vererbte Methylierungsmuster auszulöschen. Die väterlichen und mütterlichen Chromo- somen einer transplantierten Körper- zelle zeigen im Vergleich zu Spermium und Eizelle weitgehend identische DNA- Modifikationen (nur geprägte Gene haben ihre Keimbahn-spezifischen Muster beibehalten), sodass die Methylierungs- reprogrammierung nicht ordnungsge- mäß ablaufen kann. Tatsächlich haben mehrere Studien die inkomplette und sehr variable Demethylierung des di-

ploiden Spendergenoms in klonierten Rinderembryonen gezeigt (3, 8, 19). In den meisten Fällen sind diese Re- programmierungsdefekte offenbar nicht mit einer normalen Entwicklung bis zur Geburt vereinbar.

Bei Klonierungsexperimenten in der Maus wiesen die wenigen bis zur Ge- burt überlebenden Klone abnormale Genexpressionsmuster in somatischen Geweben (Leber) und Plazenta auf (18). Der immense Verlust von Schwan- gerschaften und die abnormalen Phä- notypen bei klonierten Säugetieren be- weisen, dass die korrekte Reprogram- mierung eines somatischen Zellkerns durch die aktivierte Eizelle ein extrem seltenes Ereignis ist oder, wenn man die korrekte Expression des gesamten Ge- noms als Maßstab nimmt, gar nicht möglich ist. Allein aus medizinischen Gründen ist die reproduktive Klonie- rung eines menschlichen Embryos deshalb in höchstem Maße unverantwort- lich.

Glossar

Blastozyste:Frühes Embryonalstadium aus 64 bis 128 Zellen, das beim Menschen etwa am fünften Tag nach der Befruchtung beginnt. Die Zellen nisten sich in die Ge- bärmutterschleimhaut ein. Die Blastozyste ist bereits in eine innere Zellmasse (Embryoblast) und eine äußere Zellschicht (Trophoblast) differenziert.

Chromatin:Das Material (DNA, chromosomale Prote- ine und geringe Mengen RNA), aus dem die Chromoso- men bestehen. Durch basische Histonproteine und sau- re Nicht-Histone wird der (in menschlichen Körperzel- len) auf 46 Chromosomen verteilte und insgesamt etwa zwei Meter lange DNA-Faden in höhergeordnete Struk- turen verpackt und dabei um einen Faktor von etwa 10 000 kondensiert.

Embryoklonierung:Herstellung von Embryonen mit dem Erbmaterial aus somatischen Zellen unter Umge- hung der Keimbahn. Durch Kerntransfer wird das diploi- de Spendergenom einer Körperzelle in eine aktivierte entkernte Eizelle eingesetzt. Beim therapeutischen Klo- nieren wird der in vitro kultivierte Embryo zur Herstel- lung von individualspezifischen embryonalen Stamm- zellen benutzt. Beim reproduktiven Klonieren wird der Embryo in den Uterus einer Leihmutter implantiert, um ein mit dem Spender genetisch identisches Individuum zu erzeugen.

Embryonale Stammzellen:Undifferenzierte pluri- potente Zellen eines Embryos (innere Zellmasse der Bla- stozyste), die noch jeden beliebigen Zelltyp, aber kein ganzes Individuum mehr bilden können.

Epigenetik:Mitotisch oder meiotisch vererbbare Ver- änderungen des genetischen Informationsgehaltes einer Zelle, die ihre Grundlage in reversiblen Modifikatio- nen der Erbinformation haben, jedoch keine konstanten Veränderungen (Mutationen) der genetischen Informa- tion darstellen.

Genom:Alle DNA-Sequenzen eines Individuums oder im weiteren Sinn einer Spezies. Transkribierte und/oder proteinkodierende Sequenzen (Gene) repräsentieren nur wenige Prozent des menschlichen Genoms, wäh- rend repetitive Sequenzen ohne direkte Funktion über 50 Prozent des Genoms ausmachen. Im Rahmen des Humangenomprojektes wurden die etwa 3,1 Milliar- den Basenpaare des menschlichen Genoms entschlüs- selt.

Genomische Prägung (Imprinting):Im Gegensatz zu den Mendelschen Regeln, nach denen elterliche Alle- le unabhängig voneinander segregieren und phänoty- pisch aktiv sind, weisen einige Gene eine klare eltern- abhängige Aktivität auf, das heißt nur die väterliche oder die mütterliche Genkopie wird exprimiert.

Parthenogenetische Embryonen:Durch die expe- rimentelle Aktivierung einer unbefruchteten Eizelle wird die Ausstoßung des zweiten Polkörperchens verhindert.

Der sich entwickelnde Embryo besitzt zwei mütterliche Genome (aus Eizelle und Polkörperchen).

Totipotenz:Die Eigenschaft von undifferenzierten Zel- len eines frühen Embryos (Vier- bis Achtzellstadium), ein komplettes Individuum zu bilden.

Manuskript eingereicht: 1. 4. 2003, revidierte Fassung angenommen: 10. 6. 2003

❚Zitierweise dieses Beitrags:

Dtsch Arztebl 2003; 100: A 2300–2308 [Heft 36]

Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf das Literatur- verzeichnis, das beim Verfasser erhältlich oder im Internet unter www.aerzteblatt.de/lit3603 abrufbar ist.

Anschrift des Verfassers:

Prof. Dr. med. Thomas Haaf Institut für Humangenetik

Johannes Gutenberg-Universität Mainz Langenbeckstrasse 1

55131 Mainz

E-Mail: haaf@humgen.klinik.uni-mainz.de

A

Abbildung 2: Reprogrammierungsdefekte in zweizelligen Mausembryonen. a, b) Vorzeitige De- methylierung des weiblichen Genoms in einem oder beiden Zellkernen. c, d) Fehlende Deme- thylierung der väterlichen Chromosomen. Abnormale Methylierungsmuster sind Zeichen einer frühen Entwicklungsstörung.