Bachelorarbeit
eingereicht im: August 2007
von: Simon Ausländer
geboren am 23. Februar 1985 in Tübingen
Betreuer: Alexandra Heussner
Universität Konstanz
Arbeitsgruppe für Human- und Umwelttoxikologie Prof. Dr. Daniel R. Dietrich
D – 78464 Konstanz
Telefon: +49- (0)7531 / 88-3171, Fax +49- (0)7531 / 88-3170 Internet: http://www.umwelttoxikologie.uni-konstanz.de/
Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URL: http://www.ub.uni-konstanz.de/kops/volltexte/2007/3925/
URN: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-39259
Erklärung der Selbständigkeit
Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfasst, andere als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die aus anderen Quellen entnommenen Stellen als solche gekennzeichnet habe.
Konstanz, 30. August 2007 Simon Ausländer
Ein herzliches Dankeschön geht an ...
• ... Prof. „Dan“ Dietrich, für die Bereitstellung des Themas, die gute Betreuung und die Begutachtung dieser Arbeit.
• ... Alex, für die sehr gute Betreuung. Deine immer vorhandene Diskussionsbereitschaft und methodische Beratung hat mich sehr weiter gebracht!
• ... Evelyn (fürs DEnglisch verbessern), Marijke, Jasmin, Kerstin, Susanne, Nicola, Venus, Heiko, Andi und Daniel für die lustige Zeit - auch nach dem Arbeiten!
• ... die AG Bürkle für die Bereitstellung der CCD Kamera!
• ... meine Familie, für den Zusammenhalt, jegliche Unterstützung und die Ermöglichung des Studiums. Insbesondere danke ich meinem Zwillingsbruder David, der immer für eine kurze Diskussion und n schnelles Pils zu haben ist! ;)
• ... meine Freunde, die mich durchs Leben begleiten!
• ... meine geliebte Freundin Caro. Vielen Dank für die Motivation, Korrektur der Arbeit und dass Du immer für mich da bist.
Abstract
Ochratoxins are a mycotoxin family produced by a number of moulds (Aspergillus andPenicil-
lium species) under certain conditions. The toxins are common contaminants of human food and animal feed. OTA has been intensively researched, because it is said to be the most toxic member. However, a simple method to analyze contamination with OTB is lacking.
A monoclonal antibody which binds specifically to OTB would be a promising improvement.
Such antibodies were produced in this workgroup by means of the hybridoma technique, but these were still unpurified and only a partial characterization has been carried out.
The objective of this thesis was the purification of these antibodies with subsequent charac- terization. Hereby, the antibodies were first be purified by affinity chromatography with protein G sepharose and afterwards their concentration was determined via Bradford assay. The confir- mation of the purification was carried out using SDS-PAGE and staining with AgNO3. This was yielded a standardized antibody pool, which will be tested for use in additional applications such as immunoblotting. The cross-reactivity with OTA was determined by means of specific ELISAs.
Ochratoxine sind Mykotoxine, das bedeutet von Schimmelpilzen produzierte, für den Menschen und andere Tiere giftige Substanzen, welche in vielen Lebensmitteln gefunden werden. Die Toxizität und Kontamination von Ochratoxin A (OTA) ist bereits intensiv erforscht, da geeignete Detektions- und Quantifizierungsmethoden zur Verfügung stehen. Für OTB fehlt hingegen eine günstige und einfache Methode zur Untersuchung der Kontamination.
Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch an OTB bindet, wäre ein aussichtsreicher Fortschritt.
In dieser Arbeitsgruppe wurde daher ein solcher Antikörper bereits hergestellt. Dieser lag jedoch in unaufgereinigter Form vor und wurde bisher nur teilweise charakterisiert.
Ziel dieser Arbeit war die Aufreinigung dieses Antikörpers mit anschließender Charakterisierung.
Dabei wurde der Antikörper zuerst über eine Säule mit Protein G Sepharose aufgereinigt und die Konzentration an Antikörper nach Bradford bestimmt. Mit Hilfe einer SDS-PAGE und AgNO3-Färbung wurde die Reinheit überprüft und es entstand ein konstanter Antikörper-Pool, dessen Einsatzmöglichkeiten getestet wurden. Beispielsweise wurde die Kreuzreaktivität zu OTA und anderen Substanzen mittels ELISA bestimmt.
Tabellenverzeichnis
1.1 Orale LD50 und t1/2 unterschiedlicher Spezies für OTA . . . 6
1.2 Unterschiedliche Isotypen der Immunoglobuline . . . 10
2.1 Verwendete Chemikalien . . . 16
2.2 Bindungspuffer . . . 18
2.3 Elutionspuffer . . . 18
2.4 Tris-HCl-Puffer . . . 18
2.5 Puffer, Lösungen und Gelherstellung für die SDS-PAGE und Silbernitratfärbung 20 2.6 Puffer und Lösungen für ELISA . . . 21
2.7 Puffer und Lösungen für Dot Blot und Western Blot . . . 21
2.8 Verwendete Antikörper . . . 22
2.9 Verwendete Kunststoffwaren . . . 22
2.10 Verwendete technische Geräte . . . 22
2.11 Ablauf der Affinitätchromatographie . . . 23
2.12 Technische Daten der HiTrap™ Protein G HP Säule . . . 24
2.13 Verdünnungsreihe für das Bestimmen der Standardkurve . . . 26
2.14 Vergleich der Färbemethoden zur Proteindetektion . . . 29
2.15 Vorgehen bei der Silberfärbung von Polyacrylamidgelen . . . 30
2.16 Vergleich der Substrate für HRP . . . 34
3.1 Aufgereinigte Hybridomaüberstände . . . 40
3.2 Vergleich der Antikörper-Pools . . . 43
3.5 Kenndaten der Ochratoxinkonjugate . . . 53 3.6 Kenndaten des Dot Blots . . . 55 3.7 Eingesetzte Mengen an Ochratoxinkonjugaten im Western Blot . . . 55
Abbildungsverzeichnis
1.1 Überblick der Mykotoxine . . . 2
1.2 Struktur der Ochratoxine . . . 4
1.3 Struktur eines Antikörpers . . . 9
1.4 Fragmentierung eines Antikörpers . . . 11
1.5 Mögliche Oberflächenstruktur von Ochratoxin A und B . . . 14
2.1 Ablauf der Affinitätschromatographie . . . 25
2.2 Ablauf des indirekten, kompetitiven ELISA-Assay . . . 32
2.3 Dot Blot Apparatur . . . 34
2.4 Exemplarische Kalibrierkurve eines kompetitiven ELISA . . . 38
3.1 Standardkurve mitγ-Globulin-Lösung . . . 41
3.2 Aufreinigung der ersten Säule . . . 42
3.3 Aufreinigung der zweiten Säule . . . 43
3.4 Nicht-reduzierende SDS-PAGE . . . 44
3.5 Reduzierende SDS-PAGE . . . 46
3.6 Vergleich der eingesetzten Konzentrationen des Primärantikörpers im ELISA . 47 3.7 Spezifität des Primärantikörpers im ELISA . . . 48
3.8 ELISA mit Hybridomaüberstand . . . 50
3.9 Vergleich der Plattenbeschichtung . . . 51
3.10 ELISA mit anderen OTA/OTB-Chargen . . . 52
3.11 Dot Blot mit 10µg/mL Primärantikörper . . . 53
3.14 Vergleich der Detektionsmethoden beim Western Blot . . . 57 4.1 Einsatzmöglichkeiten des aufgereinigten Antikörpers . . . 66
Verzeichnis der Abkürzungen
aw Wasseraktivität
AP Alkalische Phosphatase BCR B-Zellrezeptor
BEN endemische Balkannephropathie BSA bovine serum albumin
CDR complementary determining region DAB 3,3’-Diaminobenzidin
ECL enhanced chemiluminescence
EDAC 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Fab Fragment, antigen binding
FAO UN Food and Agriculture Organization Fc Fragment, crystallizable
Fd Fragments of domain GOX Glucoseoxidase
HAT Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin HC heavy chain
HGPRT Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase HRP Meerrettichperoxidase
HyÜ Hybridomaüberstand
KM Michaelis-Konstante KLH Keyhole limpet hemocyanin
LC light chain
LD50 mittlere letale Dosis
MHC Major Histocompatibility Complex OAT organic anion transporter
OD optische Dichte
PAK Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe PVDF Polyvinyldifluorid
Rf Retentionsfaktor
scFv single chain Fragment of variable region SD Standard-Abweichung
SDS-PAGE sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis SEM Standardfehler des Mittelwertes
THP-1 Human acute monocytic leukemia cell line TMB 3,3,5,5-Tetramethylbenzidin
Inhaltsverzeichnis
1 Theorie 1
1.1 Mykotoxine . . . 1
1.2 Ochratoxine . . . 3
1.2.1 Vorkommen, Produktion und Struktur . . . 3
1.2.2 Toxizität . . . 5
1.3 Immunoglobuline (Antikörper) . . . 8
1.3.1 Struktur . . . 9
1.3.2 Produktion . . . 11
1.3.3 Anwendungsmöglichkeiten monoklonaler Antikörper . . . 13
1.3.4 Epitop-Paratop-Wechselwirkungen . . . 13
1.4 Zielsetzung . . . 15
2 Material und Methoden 16 2.1 Chemikalien . . . 16
2.2 Puffer und Lösungen . . . 17
2.2.1 Affinitätschromatographie . . . 17
2.2.2 SDS-PAGE, AgNO3-Färbung . . . 19
2.2.3 ELISA . . . 19
2.2.4 Dot Blot und Western Blot . . . 19
2.3 Antikörper . . . 22
2.4 Kunststoffwaren . . . 22
2.5 Technische Ausstattung . . . 22
2.6 Aufreinigung des Antikörpers . . . 23
2.6.1 Aufreinigung: Protein G Sepharose . . . 23
2.6.2 Konzentrationsbestimmung: Bradford-Assay . . . 25
2.6.3 Reinheitsüberprüfung: SDS-PAGE, AgNO3 Färbung . . . 26
2.7 Charakterisierung des Antikörpers . . . 31
2.7.1 ELISA . . . 31
2.7.2 Dot Blot und Immunodetektion . . . 33
2.7.3 Western Blot . . . 35
2.8 Auswertung . . . 37
2.8.1 Datenanalyse . . . 37
2.8.2 Sensitivität . . . 37
2.8.3 Spezifität . . . 39
2.8.4 Normalisierung . . . 39
3 Ergebnisse 40 3.1 Aufreinigung der Immunoglobuline . . . 40
3.1.1 Standardkurve Bradford-Assay . . . 41
3.1.2 Gesamtergebnis der Affinitätschromatographie . . . 41
3.1.3 Antikörper-Pool-Herstellung und Reinheitsüberprüfung . . . 43
3.2 Charakterisierung des Antikörpers . . . 47
3.2.1 ELISA . . . 47
3.2.2 Dot Blot . . . 52
3.2.3 Western Blot . . . 55
3.3 Zusammenfassung . . . 58
4 Diskussion 59 4.1 Aufreinigung . . . 59
4.2 Charakterisierung . . . 61
4.2.1 Spezifität und Epitopunterschied . . . 61
4.3 Zusammenfassung und Ausblick . . . 64
KAPITEL 1
Theorie
1.1 Mykotoxine
Mykotoxine sind sekundäre, natürliche Stoffwechselprodukte aus Schimmelpilzen, die schon in geringsten Mengen giftige Wirkungen im Menschen und in anderen Warmblütern erzeugen können (Abb. 1.1). Im Gegensatz zu primären Stoffwechselprodukten findet man Mykotoxine nicht bei allen Organismen, sondern sie sind charakteristisch für den Produzenten. Neben Antibiotika stellen Mykotoxine die zweite große, von Mikroorganismen synthetisierte Gruppe dar. Bisher kennt man weit mehr als 300 unterschiedliche Mykotoxine, welche ungefähr 25 Strukturtypen zugeordnet sind. Zu den bekanntesten gehören Aflatoxine, Ochratoxine, Mut- terkornalkaloide, Fusarientoxine und Patulin. Bis heute ist allerdings nicht bekannt, welche Funktion die Mykotoxine im Metabolismus der Pilze einnehmen. Sie entstehen meist nur unter bestimmten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen. Auch das Nährstoffangebot und die Entwicklungsphase des Pilzes spielen eine große Rolle bei der Produktion des Mykotoxins.
Das Wachstum der Pilze ist nicht auf die Oberfläche des befallenen Lebensmittels beschränkt, sondern der Pilz dringt tief hinein. Mykotoxine können ausgeschieden oder aber in den Zellen
eingelagert werden und werden erst dann freigesetzt, wenn das Myzel auseinanderbricht. Meist entsteht eine ganze Familie strukturähnlicher Verbindungen. Penicillium undAspergillus produ- zieren zum Beispiel drei Typen von Ochratoxinen. Der Weg der Mykotoxine in die menschliche Nahrungskette kann auf drei unterschiedliche Arten erfolgen:
Abb. 1.1: Überblick der Mykotoxine(22)
1. Primärkontamination
Lebensmittel, wie z.B. Getreide, werden von Schimmelpilzen befallen und vergiftet. Nach der Verarbeitung ist das Pilzmyzel nicht mehr sichtbar und somit der Befall nicht mehr erkennbar.
2. Sekundärkontamination
Fertig hergestellte Lebensmittel (z.B. Kaffee) verschimmeln und werden mit Mykotoxinen kontaminiert. Diese Kontamination ist oft sichtbar, da sich die Pilzkolonie durch Koni- dienbildung verfärbt.
3. Carry-Over
Nutztiere (z.B. Schweine) nehmen toxinhaltige Futtermittel auf und akkumulieren Myko- toxine in bestimmten Organen. Tierische Lebensmittel wie Milch, Eier und Fleisch können somit Mykotoxine enthalten, ohne dass das Produkt selbst verschimmelt ist.
1.2 OCHRATOXINE 3
Man ist erst nach einer Reihe von Nutztiererkrankungen auf Mykotoxine aufmerksam geworden.
Mit Schimmelpilzen infiziertes Tierfutter war z.B. der Auslöser für das Östrogensyndrom bei Schweinen. Erst als weitere Untersuchungsmethoden entwickelt wurden, war man in der Lage, auch Lebensmittel auf Kontamination zu untersuchen. Heute weiß man, dass die Mykotoxinver- breitung ein weltweites Problem darstellt. Laut UN Food and Agriculture Organization(FAO)
sind 25% des weltweit produzierten Getreides mit Mykotoxinen kontaminiert(1). Vor allem in warmen und feuchten Gebieten (Tropen und Subtropen) ist das Risiko einer Kontamination deutlich höher. Der Hauptfaktor hierfür ist das Klima, aber auch mangelhafte Lagertechnik, niedriger Standard der Nahrungsmittelproduktion und Unwissenheit erhöhen die Gefahr einer Kontamination. Über Exporte erreichen auch hoch kontaminierte Lebensmittel die EU und die USA. Jedoch wird hier die maximal erlaubte Mykotoxinkonzentration gesetzlich geregelt, um das Kontaminationspotential zu verringern.
Wirtschaftlich gesehen besteht großes Interesse darin, Methoden zu entwickeln um Myko- toxine zu identifizieren und Lebensmittelkontaminationen nachzuweisen. Mit Mykotoxinen hochkontaminierte Produkte, die z.B. in Südostasien produziert werden, können von den Haupt- abnehmern (EU und USA) nicht importiert werden, da der Schwellenwert überschritten wird.
Die Auswirkungen auf die Wirtschaft und vor allem die Agrarwirtschaft ist dramatisch. Der Schaden geht in die Millionenhöhe (US$)(1).
1.2 Ochratoxine
1.2.1 Vorkommen, Produktion und Struktur
Zu den Ochratoxin produzierenden Schimmelpilzen gehören die Mitglieder der Pilzgattungen Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Claviceps und Alternaria. Vor allem die Pilzgattungen Aspergillus undPenicillium, hauptsächlich Aspergillus ochraceus, produzieren unter bestimmten Bedingungen (21-25°C fürPenicillium, 25-28°C fürAspergillus, aw>0.7) Ochratoxine(20). Diese Bedingungen können zu Feld- und Lagerkontamination von Getreide und Mais führen. Über
Carry-Over werden auch Nutztiere und Menschen vergiftet. In Lebensmitteln wie Kaffee, Müsli und Wein konnten ebenfalls Ochratoxine nachgewiesen werden. Eine Vermeidung der Aufnahme von Ochratoxinen ist praktisch nicht möglich, da sehr viele Getreideprodukte mit Ochratoxinen kontaminiert sind.
Die Familie der Ochratoxine besteht aus drei Mitgliedern: Ochratoxin A (OTA), Ochratoxin B (OTB) und Ochratoxin C (OTC). In ihrer Struktur sind sie sich sehr ähnlich. Allerdings haben die kleinen Unterschiede einen großen Einfluss auf ihre Toxizität und Wirkungsweise.
Es handelt sich um Dihydroisocoumarin-Derivate, welche mit der 7-Carboxylgruppe über eine α-Amidbindung mit der Aminosäure L-Phenylalanin gebunden ist. OTA besitzt im Gegensatz
zu OTB und OTC am C5-Atom ein Chloratom. OTC unterscheidet sich von OTA und OTB durch einen Ethylester an der Carboxylgruppe der L-Phenylalanin-Unterstruktur (Abb. 1.2).
Ochratoxine sind schwache, organische Säuren und relativ hitzestabil. Für das schwach saure Verhalten ist die phenolische Hydroxylgruppe im Dihydroisocoumarin und die Carboxylgruppe des Phenylalanin verantwortlich. Selbst durch Rösten und Backen können Ochratoxine nicht zersetzt werden. Da OTA die größte Toxizität aufzeigt, wurde der Forschungsschwerpunkt auf dieses Ochratoxin gesetzt. Im Metabolismus von Warmblütern werden aus OTA die Isomere
Abb. 1.2: Struktur der Ochratoxine
(4S)-Hydroxyochratoxin und (4R)-Hydroxyochratoxin gebildet(20). Ein weiterer wichtiger Schritt im Metabolismus ist die Spaltung der Peptidbindung durch die bakterielle Mikroflora, die z.B. in Pansen von Widerkäuern gefunden wird. Entscheidend sind dabei die Enzyme Carboxypeptidase
1.2 OCHRATOXINE 5
A und Chymotrypsin(21). Hierbei entstehen als Produkte das L-Phenylalanin und das freie Dihydroisocoumarin, welches als OTAα oder OTBα bezeichnet wird. Diese enzymatische Reaktion ist wichtig für die Detoxifizierung und auch der Grund für die niedrigere Ochratoxin- Kontamination von Rindfleisch im Gegensatz zu Schweinefleisch.
1.2.2 Toxizität
OTA gilt als das Mitglied der Ochratoxin Familie mit der höchsten Toxizität. Für OTB wurdein vivo undin vitroeine zehn- bis zwanzigfach schwächere Toxizität nachgewiesen und OTC gilt als sehr schwach toxisch. Jedoch wurde vor kurzer Zeit für OTC eine höhere Toxizität als für OTA und OTB bei der humanen Monozyten Zelllinie THP-1 nachgewiesen(20). Auch OTB ist nach neuenin vitro-Untersuchungen toxischer als bisher angenommen(11). OTA ist im Gegensatz zu OTB und OTC sehr gut toxikologisch untersucht. Daher wird in den nachfolgenden Punkten hauptsächlich auf OTA verwiesen.
Toxikokinetik
Ochratoxine werden oral aufgenommen und schnell im Magen und Darm über Diffusion in der nicht-dissoziierten Form resorbiert, da sie lipophil vorliegen. Im Leerdarm von Ratten konnte sogar eine Aufnahme gegen den Konzentrationsgradienten beobachtet werden(20). Dies lässt vermuten, dass OATs (organic anion transporter) präsent sind, welche eine hohe Affinität zu OTA besitzen. Tatsächlich konnte für OAT1 und OAT3 ein KM von 0,42µM und 0,75µM zu OTA nachgewiesen werden(13). Diese Transporter spielen für die Zytotoxizität von OTA eine wichtige Rolle. Sie sind hauptsächlich für die Akkumulation des Toxins in Nierenzellen verantwortlich und stellen einen möglichen Angriffspunkt für die Detoxifizierung dar. Die Expression dieser Transporter ist abhängig von Geschlecht, Art und Alter(20).
Im Blut wird OTA an zwei Bindungsstellen von Serumalbumin mit hoher Affinität und an ein 20 kD großes Protein, welches noch nicht bekannt ist, gebunden. Das bedeutet, dass zwei mol OTA von einem mol Serumalbumin gebunden werden. OTB hat eine geringere Affinität zu Serumalbumin als OTA(4). Nur 0,2%-1% OTA liegen im Blutkreislauf ungebunden vor(9). Die Proteinbindung ist also der entscheidende Faktor für die lange Halbwertszeit von
OTA im Körper. Dieses Reservoir an OTA wird langsam abgegeben. Somit wird eine schnelle Eliminierung des Toxins verhindert, da OTA beim Menschen hauptsächlich über den Urin ausgeschieden wird. Das freie und das gebundene Ochratoxin werden durch den Blutkreislauf im Körper verteilt, treten jedoch hauptsächlich in stark durchbluteten Organen, wie Niere und Leber auf. Das gebundene Toxin kann nicht glomerulär gefiltert werden, sondern verlässt die Blutbahn durch renale Sekretion. In Untersuchungen des Blutserums von Menschen, die ausserhalb der Problemgebiete leben, betrug die Ochratoxinkonzentration weniger als 1 nM(20). Im Gegensatz dazu wurde bei Schweinen eine Ochratoxinkonzentration im Serum von bis zu 6 nM nachgewiesen(20). Dies konnte durch die Verabreichung von kontaminiertem Futter sogar auf 3,9 µM erhöht werden(20). Diese Versuche zeigen, dass Blut ein großes Reservoir für Ochratoxine darstellt. Die starken Unterschiede in der Halbwertszeit korrelieren je nach Spezies mit den oralen LD50-Dosen (Tab. 1.1). Chu verwendete [13C]-OTA zur Untersuchung
Tab. 1.1: Orale LD50 und t1/2unterschiedlicher Spezien für OTA, ergänzt nach(20). Spezies orale LD50(mg/kg KG) t1/2 (p.o.) Ref.
Mensch – 35,5 Tage (20)
Affe – 21 Tage (20)
Schwein 1,0-6,0 72-120 h (20)
Schaf 2,0 – (16)
Truthahn 5,9 – (16)
Meerschweinchen 8,1-9,1 – (16)
Ratte 20-30 55-120 h (20)
Maus 48-58 40 h (20)
der Ausscheidung in Ratten(5). Nach 1 mg i.v. Injektion erhöhte sich die Konzentration an OTA im Blutserum sehr schnell und es wurde insgesamt 50% sekretiert. Dies geschah jedoch in einem unterschiedlichen Verhältnis. 41% befanden sich im Urin und nur 9% im Kot. Man fand hauptsächlich OTAα und weniger OTA. OTA verlässt den Körper also über die Niere.
Dabei kann das gebundene OTA jedoch nicht, wie bereits erwähnt, glomerulär gefiltert werden, sondern verlässt die Blutbahn durch renale Sekretion. Das bedeutet, dass OTA durch das Zytoplasma der Tubuluszelle transportiert wird oder diffundiert, um die Zelle wieder durch die apikale Membran zu verlassen. Für OTA konnte gezeigt werden, dass es in den Tubuluszellen
1.2 OCHRATOXINE 7
akkumuliert und dort seine toxische Wirkung entfaltet(20). Eine Schlüsselrolle nehmen dabei vor allem die Transporter für organische Anionen ein. Bei der Expression und Art der OATs gibt es je nach Geschlecht, Alter und Art Unterschiede(20). Weitere Untersuchungen der OATs könnten helfen, das Risiko, das von Ochratoxinen ausgeht, besser abzuschätzen und letztendlich dazu beitragen, Strategien für die Detoxifizierung zu entwickeln.
Akute Toxizität
Wie in Tabelle 1.1 bereits gezeigt, spielt die akute Toxizität im Vergleich zur chronischen Toxizität eine geringere Rolle. Die Menge an Ochratoxin, die über die Nahrung aufgenommen wird, ist relativ gering und löst keine akute Toxizität aus. Allerdings gibt es große Unterschiede bei den Halbwertszeiten und LD50-Werten zwischen den unterschiedlichen Spezies. Das bedeutet, dass die Gefahr von chronischen Erkrankungen, die durch Ochratoxine ausgelöst werden, beim Menschen sehr wahrscheinlich höher liegt, als bei anderen Spezies.
Chronische Toxizität
Für Ochratoxine wurden bisher immunotoxische, hepatotoxische, teratogene, nephrotoxische und kanzerogene Wirkungen beschrieben.
Vor allem bei der Entwicklung von Nephropathien spielt OTA eine große Rolle. OTA steht möglicherweise im Zusammenhang mit der endemische Balkannephropathie (BEN), bei der unter anderem eine Häufung von Karzinomen im Urothelialtrakt beobachtet wird. Es handelt sich um eine chronische, progressive Nierenkrankheit, die von tubulärer Atrophie ausgeht und
über Degeneration und Nekrose des Nierenepithels mit Nierenversagen endet(20). Epidemiologi- sche Studien zeigten eine Korrelation der OTA-Serumkonzentration mit einer höheren Anzahl
an Nephropatien und Karzinomen im Urothelialtrakt. Funktionelle Veränderungen traten in Form von verminderter Inulinausscheidung, Polyurie, Glukosurie, verminderter Urinosmolarität und geringerer p-Aminohippuratausscheidung auf(20). Allerdings ist umstritten, dass OTA die Ursache dieser Krankheit ist. Möglicherweise ist die erhöhte OTA-Konzentration bei BEN- Patienten ein Sekundäreffekt, der auf die verminderte Leistungsfähigkeit der Niere bei diesen Patienten zurückzuführen ist. In diesem Zusammenhang werden auch andere Substanzen (z.B.
Schwermetalle und PAKs) diskutiert.
Die Zusammenhänge zwischen chronischer OTA-Exposition und Schädigung der Harnwege deuten auf eine mögliche kanzerogene Wirkung hin. In Kanzerogenesestudien mit Ratten und
Mäusen wurde festgestellt, dass vor allem Männchen Nierenkarzinome aufzeigen(20). Aufgrund mehrerer Studien dieser Art klassifizierte die IARC (International Agency for Research on Cancer) OTA als mögliche kanzerogene Substanz (Stufe 2B) für den Menschen. Als Ursachen
der Nierentumorbildung werden sowohl genotoxische als auch epigenetische Mechanismen in Betracht gezogen.
1.3 Immunoglobuline (Antikörper)
Immunoglobuline sind Proteine und gehören zu der Klasse der Globuline. Sie sind bei Wirbeltieren ein wichtiger Bestandteil des humoralen Immunsystems und werden als Immunantwort auf ein Antigen von Plasmazellen produziert. Antigene sind meist Makromoleküle, die vom Immunsystem als Fremdkörper erkannt werden und die Bildung von spezifischen Immunoglobulinen induzieren.
Jedes Immunoglobulin erkennt eine spezifische, antigene Determinante (Epitop) und bindet mit der spezifischen Antigenbindungsstelle (Paratop) daran. Ein Antigen besitzt mehrere Epitope und gegen jedes Epitop kann ein Antikörper gebildet werden. Eine Mischung aus mehreren Antikörpern, die unterschiedliche Epitope eines Antigens spezifisch binden, nennt man polyklonal.
Ein monoklonaler Antikörper bindet hingegen spezifisch an ein einziges Epitop eines Antigens.
Immunoglobuline findet man in zwei verschiedenen Formen im Körper vor: Einerseits im Blut und in der Gewebsflüssigkeit in einer sekretierten, löslichen Form und andererseits als membrangebundene, an die Oberfläche von B-Zellen gebundene Form. Die membrangebundene Form nennt man B-Zellrezeptor (B-cell receptor, BCR). Dieser BCR übernimmt einen wichtigen Teil der B-Zellentwicklung und Differenzierung.
1.3 IMMUNOGLOBULINE (ANTIKÖRPER) 9
1.3.1 Struktur
Immunoglobuline besitzen an ihren Aminosäureresten N-Glykosilierungen und O-Glykosilierungen und sind daher Glykoproteine. Sie bestehen aus vier Polypeptidketten: zwei identischen schweren Ketten (heavy chain, H) mit ungefähr 50 kDa und zwei identischen leichten Ketten (light chain, L) mit ungefähr 25 kDa. Diese Ketten sind über kovalente Disulfidbrücken verbunden und haben die Form eines Y. Jede Kette besitzt eine variable Region VL (variable Region der leichten Kette) und VH (variable Region der schweren Kette)). Des Weiteren besitzt die schwere Kette mehrere konstante Regionen (CH1, CH2, CH3). Die leichte Kette hingegen besitzt nur eine konstante Region (CL) (Abb. 1.3).
Abb. 1.3: Struktur eines Antikörpers
Diese Regionen besitzen bestimmte Immunoglobulindomänen mit ungefähr 110 Aminosäuren. Die Immunoglobulindomäne existiert in vielen Proteinen des Immunsystems und besteht aus mehreren β-Strängen, welche unterschiedlich angeordnet sind. Man unterscheidet hierbei zwischen den Vier-
plus-drei-Strängen der konstanten Region und den Vier-plus-fünf-Strängen der variablen Region.
Dieβ-Stränge sind antiparallel gepackt und werden von einer Disulfidbrücke zusammengehalten.
Gemeinsam bilden sie eine zylinderförmige Struktur mit flexiblen Schleifen an der variablen Domäne. Hier befindet sich die aminoterminale Sequenz, welche für die Antigenbindung und für die starke Diversität der Antikörper verantwortlich ist. Die hypervariablen Bereiche werden auch complementary determining regions (CDR) genannt. Mit Hilfe eines komplizierten, genetischen Umlagerungsprozesses, VDJ-Rekombination genannt, kann eine große Vielfalt an Paratopen erzeugt werden. Zusätzlich können die unterschiedlichen Typen der schweren und der leichten Kette kombiniert werden. Somit stehen insgesamt 1,92 Millionen verschiedene Möglichkeiten der Antikörperbildung zur Verfügung. Die konstante Region ist hingegen entscheidend für die Effektorfunktion des Antikörpers.
Fünf unterschiedliche Arten der schweren Kette werden in Säugetieren gefunden. Diese Arten
definieren auch die Klasse der Immunoglobuline (Tab. 1.2). Die konstante Region der leichten Kette (CL) wird hingegen nur in zwei unterschiedliche Typen eingeteilt. Man unterscheidet hier zwischen dem λ-Typ und dem κ-Typ.
Tab. 1.2:Unterschiedliche Isotypen der Immunoglobuline Klasse CH-Typ Form Vorkommen
IgA α Dimer Schleimhäuten, Schutz vor Pathogenen
IgD δ Monomer Coexpression mit IgM als BCR auf reifen, naiven B-Zellen IgE ε Monomer hauptsächlich membrangebunden an Mastzellen, Schutz
vor Parasiten und Würmer
IgG γ Monomer Antikörper wird erst in der späten Phase einer Infektion produziert, durchdringt Plazentabarriere
IgM µ Pentamer Erstkontakt-Antikörper, Aktivierung des Komplement- systems
Antikörper können enzymatisch in unterschiedliche Fragmente gespalten werden, die jeweils eine bestimmte Funktion haben. Das Fab-Fragment (fragment, antigen binding) besteht aus einer konstanten und einer variablen Region von jeder Kette (Abb. 1.4). Der FC-Teil (fragment, crystallizable) des Antikörpers besteht aus der Basis der zwei schweren Ketten und beinhaltet bis zu drei konstante Regionen. Der FC-Teil bindet an unterschiedliche Rezeptoren (zum Beispiel
1.3 IMMUNOGLOBULINE (ANTIKÖRPER) 11
an den FC-Rezeptor von Makrophagen) und hat eine wichtige Funktion in der Immunantwort.
Das F(ab‘)2-Fragment setzt sich aus den beiden Fab-Fragmenten zusammen. Diese werden von einer Disulfidbrücke zusammengehalten, da Pepsin unterhalb der Gelenkregion die Peptidketten spaltet. Der FC-Teil wird hierbei in mehrere kleinere Fragmente zerlegt. Bei der enzymatischen Verdauung mit Papain entstehen zwei identische Fab-Fragmente und ein vollständiges FC- Fragment.
Abb. 1.4: Fragmentierung eines Antikörpers
1.3.2 Produktion
Plasmazellen sind differenzierte B-Zellen, die sich funktionell und morphologisch von den naiven, ruhenden B-Zellen unterscheiden. Sie sind dafür zuständig, große Mengen an freien Antikörpern zu produzieren und diese zu sezernieren. Im Gegensatz zur naiven B-Zelle besitzt die Plasmazelle wenig Oberflächen-Ig und keine MHC-Klasse-II-Moleküle. Das Wachstum ist eingeschränkt und da sie bereits eine somatische Hypermutation und einen Klassenwechsel durchgemacht hat, besitzt sie nun keine Fähigkeit mehr dazu. Zehn bis zwanzig Prozent aller synthetisierten Proteine sind Immunoglobuline und die Plasmazelle hat sich an diese starke Proteinproduktion angepasst. Sie besitzt sehr viel Cytoplasma, mit vielen Schichten an rauem endoplasmatischem
Reticulum. Um den Zellkern herum ist ein großer Golgi-Apparat zu erkennen. Die Lebensdauer von Plasmazellen ist abhängig von der Antigenbindung und kann stark variieren.
Mit der Hybridoma-Technik ist es möglich, gezielt monoklonale Antikörper gegen eine gewünsch- te Substanz herzustellen(15). Auch gegen Haptene können monoklonale Antikörper hergestellt werden, da diese an Proteine gekoppelt werden können und somit eine Immunantwort auslösen.
Hierbei wird eine Maus mit dem Antigen über längere Zeit immunisiert und anschliessend entnimmt man ihr die Milz. Die B-Zellen aus der Milz werden mit Myeloma-Zellen fusioniert und es entstehen Hybridoma-Zellen. Diese besitzen einerseits die Eigenschaft der B-Zellen, nämlich den gewünschten Antikörper zu produzieren und andererseits die Eigenschaft der Myeloma- Zellen, unsterblich zu sein. Allerdings entstehen bei der Fusion nicht nur Hybridomazellen, sondern auch andere Zellen fusionieren miteinander. Deshalb ist es wichtig, die Hybridomazellen zu selektieren. Im selektiven HAT-Medium (Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin) überleben nur Hybridomazellen, da diese von den B-Zellen das Enzym HGPRT (Hypoxanthin-Guanin- Phosphoribosyl-Transferase) für die Nukleotidsynthese und von den Myelomazellen die Eigen- schaft der Unsterblichkeit besitzen. Die überlebenden Zellen werden mit ELISA darauf getestet, ob sie den gewünschten Antikörper produzieren. Positive Zellen werden kloniert und ihr Hybri- domaüberstand wird für die Aufreinigung des Antikörpers benutzt.
Eine alternative und fortgeschrittenere Methode zur Produktion von monoklonalen Antikörpern stellt das Phagen-Display dar(12). Der Vorteil dieser Methode ist, dass die Selektion des Anti- körpers nicht mehr auf der Immunisierung von Versuchstieren beruht und dass mit Hilfe der Gentechnik unterschiedliche Bindungsstellen entworfen werden können. Die Klonierung von einzelnen Antikörpergenen in entsprechenden Vektoren ermöglicht die Expression verschiedener Antikörper an der Oberfläche von Phagen. Somit können auch monoklonale Maus-Antikörper humanisiert werden und sind dann für eine Therapie im Menschen verwendbar. Es wurden sogar gegen hochgiftige Substanzen, mit denen eine Immunisierung von Versuchstieren nicht möglich gewesen wäre, Antikörper hergestellt(6). Durch diese Technik können auch weitere therapeutisch interessante Antikörperfragmente, wie z.B. scFv, hergestellt werden (Abb. 1.4).
1.3 IMMUNOGLOBULINE (ANTIKÖRPER) 13
1.3.3 Anwendungsmöglichkeiten monoklonaler Antikörper
In vivo binden Antikörper an bakterielle Toxine und Viren, um diese zu neutralisieren. Sie maskieren ihre Oberfläche und üben eine Schutzfunktion aus. Doch erst mit der Zusammenarbeit von weiteren Zellen des Immunsystems erlangen sie eine enorme Wirksamkeit. Die konstante Region eines Antikörpers bindet an unterschiedliche Rezeptoren und aktiviert so bestimmte Effektorfunktionen, wie z.B. die Aktivierung des Komplementsystems.
Somit ist es möglich, monoklonale Antikörper vielseitig anzuwenden. Ihre Bindungsspezifität an der variablen Region und der Effektorfunktion am Fc-Teil des Antikörpers machen ihn zu einem sehr nützlichen Werkzeug in der gesamten Biologie. Die konstante Region kann mit Enzymen
oder anderen Molekülen, die unterschiedliche Funktionen aufweisen, gekoppelt werden. Diese nennt man sekundäre Antikörper, welche in vielen Anwendungen zum Einsatz kommen.
1.3.4 Epitop-Paratop-Wechselwirkungen
An der Antigen-Antikörper-Reaktion sind verschiedene Kräfte beteiligt. Hierbei spielen die Bedingungen eine große Rolle. Die Salzkonzentration, der pH-Wert, Detergenzien und die Temperatur beeinflussen die Bindung des Antikörpers an ein Antigen. Es handelt sich um nicht-kovalente, reversible Bindungen. Diese werden durch elektrostatische Kräfte, van-der- Waals-Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Kräfte hervorgerufen. An den Antigenbindungsstellen von Antikörpern befinden sich oft aromatische, unpolare Reste, die haupt- sächlich an van-der-Waals-Wechselwirkungen und hydrophoben Wechselwirkungen beteiligt sind.
Aber auch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen polarisierten Atomen und elektrostatische Bindungen zwischen geladenen Seitenketten tragen zur Epitop-Paratop-Wechselwirkung bei. Die Mutation einer Aminosäure kann die Affinität des Antikörpers zum Antigen extrem beeinflussen.
Mit Hilfe gentechnischer Methoden kann so durch gezielte Mutagenese die Affinität erhöht werden. Proteine besitzen meist ein Epitop aus sechs bis acht Aminosäuren. Im Gegensatz dazu sind Haptene niedermolekular und bestehen selten aus Aminosäuren. In Abb. 1.5 kann man einen deutlichen Unterschied in der Oberflächenstruktur von OTB erkennen, welches durch die Substitution des Wasserstoffatoms am C5-Atoms des Dihydroisocoumarin-Ringes hervorgerufen
Abb. 1.5: Mögliche Oberflächenstruktur von Ochratoxin A und B
wird. Auch der induktive Effekt (-I-Effekt) des Chloridions ist in OTB nicht mehr vorhanden, was sich auch auf den Rest des Moleküls auswirkt. Wenn der Antikörper nicht zwischen OTA und OTB differenzieren kann, ist auszuschliessen, dass das Epitop in der Nähe des C5-Atoms des Dihydroisocoumarinringes liegt. Der Antikörper wird mit freiem OTB/OTA und an BSA gekoppeltes OTB/OTA getestet. Die Ochratoxinkonjugate sind mit der Carboxylgruppe des L-Phenylalanin kovalent an BSA gebunden. Wenn der Antikörper auch die gebundene Form des Ochratoxin erkennt, dann liegt das Epitop wahrscheinlich nicht an dieser Carboxylgruppe, da diese für die Epitop-Paratop-Wechselwirkung sterisch gehindert ist. Allerdings ist es notwendig, die Aminosäuresequenz der hypervariablen Bereiche zu kennen, um die Bindungsstelle des Antikörpers genauer untersuchen zu können. Mit dieser Sequenz ist es möglich Aussagen über intermolekulare Wechselwirkungen zu machen und das Epitop genauer zu definieren.
Bei der Herstellung von Antikörpern gegen OTB wurde zur Immunisierung der Mäuse OTB-KLH verwendet(19). Die Selektion der positiven Klone wurde mit OTB-BSA durchgeführt. Darum ist es eventuell möglich, dass die Proteine einen Einfluss auf die Epitop-Paratop-Wechselwirkungen haben.
1.4 ZIELSETZUNG 15
1.4 Zielsetzung
In dieser Arbeit sollte der Überstand des Hybridomaklons 2F1.E10 mittels Affinitätschromato-
graphie aufgereinigt werden. Die Reinheit der gewonnenen Fraktionen sollte mit Hilfe der reduzierenden und nicht-reduzierenden SDS-PAGE mit anschliessender Silbernitratfärbung über- prüft werden. Schliesslich sollte ein Antikörper-Pool hergestellt werden. Die Spezifität und die Kreuzreaktivität des aufgereinigten Antikörpers sollten mit unterschiedlichen Konzentrationen an Antikörper und verschiedenen Kompetitoren in einem indirekten, kompetitiven ELISA untersucht werden. Neben Ochratoxin A sollten noch die Untergruppen der Ochratoxine (L-Phenylalanin und Coumarin) und der Katalysator (EDAC) für die BSA-Konjugat-Bildung als Kompetitoren
eingesetzt werden. Außerdem sollten das Detektionslimit und die Kreuzreaktivität (IC50) zu anderen Substanzen bestimmt werden. Zusätzlich sollte die Anwendung für die Dot Blot- und Western Blot-Analyse überprüft werden.
Das Ziel dieser Arbeit war die Bildung eines standardisierten Antikörperpools, der für Applika- tionen, bei denen monoklonale Antikörper nötig sind, anwendbar ist.
Material und Methoden
2.1 Chemikalien
Es wurden stets analysenreine (pro analysi, p.a.) Chemikalien verwendet.
Tab. 2.1:Verwendete Chemikalien
Substanz Summenformel Hersteller/Art-Nr.
CAS/CAT-Nr.
Acrylamid Gel 30 Roth/3029
APS (Aminoperoxidisulfat) (NH4)2S2O8 Roth/9592 7727-54-0
Bradford Reagenz – BIO-RAD/500-0006
BSA (bovine serum albumin) – Sigma
9048-46-8
Casein aus Rindermilch – Sigma
009000719
Coumarin C9H6O2 Sigma
91-64-5 DL-Phenylalanin C6H5CH2CH(NH2)COOH Sigma
150-30-1
EDAC C8H17N3 Sigma
25952-53-8
ECL Plus Western Blotting – GE Healthcare / RPN2132
Detection System
γ-Globulin – Sigma
9007-83-4
2.2 PUFFER UND LÖSUNGEN 17
Glycerol C3H8O3 Merck/818709
56-81-5
Glycin C2H5NO2 Riedel-deHäen
56-40-6 Natriumdihydrogenphosphat NaH2PO4*H2O Merck
-Monohydrat 10049-21-5
Ochratoxin A C20H18ClNO6 U.S. FDA
303-47-9
Ochratoxin B C20H19NO6 U.S. FDA
4825-86-9
OTA-BSA – Sigma/O-3007
OTB-EDAC-BSA – eigene Synthese
(19)
Ponceau S Na4C22H12N4O13S4 Sigma P-3504
Schwefelsäure H2SO4 Roth
7664-93-9 SDS (Sodiumdodecylsulfat) C12H25NaO4S Roth / 2326.3
151-21-3
TEMED C6H16N2 Roth
110-18-9
TMB-Lösung C16H20N2 Sigma/T-4444
Trizma® Base NH2C(CH2OH)3 Sigma 77-86-1
Tween 20 C58H114O26 Roth
9005-64-5
2.2 Puffer und Lösungen
Alle Puffer und Lösungen wurden mit H2O [MQ], also zweifach entionisiertem Wasser mit einem Widerstand von 18,2 MΩ, hergestellt.
2.2.1 Affinitätschromatographie
Alle Puffer und Lösungen, die für die HiTrap™ Protein G HP Säule benutzt werden, müssen mit einem 0,45µm Filter aufgereinigt werden, um die Säule nicht zu beschädigen.
Bindungspuffer (20 mM Natriumdihydrogenphosphat, pH 7,0)
Tab. 2.2:Bindungspuffer (20 mM Natriumdihydrogenphosphat, pH 7,0) Substanz Molekulargewicht (g/mol) Konzentration (mM) Menge (g/L)
NaH2PO4xH2O 137,99 20 2,76
Das Natriumdihydrogenphosphat wird in entionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert auf 7,0 mit 1,0 M Natriumhydroxid-Lösung eingestellt. Das Volumen wird auf 1 L aufgefüllt und die Flasche bei 4°C gelagert.
Elutionspuffer (0,1 M Glycin-HCl, pH 2,7)
Tab. 2.3:Elutionspuffer (0,1 M Glycin-HCl, pH 2,7) Substanz Molekulargewicht (g/mol) Konzentration (mM) Menge (g/L)
Glycin 75,07 100 7,5
Das Glycin wird in entionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert auf 2,7 mit 1,0 M Salzsäure- Lösung eingestellt. Das Volumen wird auf 1 L aufgefüllt und die Flasche bei 4°C gelagert.
Tris-HCl-Puffer (1 M Tris-HCl, pH 9,0)
Tab. 2.4:Tris-HCl-Puffer (1 M Tris-HCl, pH 9,0)
Substanz Molekulargewicht (g/mol) Konzentration (M) Menge (g/100 mL)
Tris Base 121,1 1 12,1
Das Tris Base wird in entionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert auf 9,0 mit 1,0 M Salzsäure-Lösung eingestellt. Das Volumen wird auf 100 mL aufgefüllt und die Flasche bei 4°C gelagert.
2.2 PUFFER UND LÖSUNGEN 19
Lagerlösung (20% EtOH (v/v))
200 mL Ethanol (p.a.) wird mit 800 mL entionisiertem Wasser vermischt. Die Flasche wird bei 4°C gelagert.
2.2.2 SDS-PAGE, AgNO3-Färbung
SDS-PAGE Standard Molekulargewichtsmarker
Bio-Rad, Nr.: 161-0317, Lagerung bei 20°C, vor Gebrauch fünf Minuten bei 95°C denaturiert Endkonzentration: 2,25 µg Protein/1µL Puffer, Einsatzbereich: 6,5 kDa - 200 kDa
2.2.3 ELISA
Der pH-Wert wird überprüft und gegebenenfalls mit NaOH oder HCl eingestellt. Siehe Tabelle 2.6 auf Seite 21.
2.2.4 Dot Blot und Western Blot
Der pH-Wert wird überprüft und gegebenenfalls mit NaOH oder HCl eingestellt. Siehe Tabelle 2.7 auf Seite 21.
Tab. 2.5:Puffer, Lösungen und Gelherstellung für die SDS-PAGE und Silbernitratfärbung (a) 4 % Polyacrylamid-Sammelgel
Substanz Menge
H2O 6,1 mL
0,5M Tris-HCl 2,5 mL 10 % SDS-Lösung 100 µL Acrylamidlösung 30 1,33 mL 10 % APS Lösung 50 µL
TEMED 5 µL
(b) Polyacrylamid-Trenngel
Substanz 7,5 % 10 % 12 %
H2O 4,85 mL 4,02 mL 3,35 mL
1,5M Tris-HCl 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 10 % SDS-Lösung 100 µL 100 µL 100 µL Acrylamidlösung 30 2,5 mL 3,33 mL 4,0 mL 10 % APS Lösung 50 µL 50 µL 50 µL
TEMED 5 µL 5 µL 5 µL
(c) 5x Elektrophorese-Probenpuffer
Substanz Endkonzentration Menge
H2O – 42 mL
1,5M Tris-HCl 187,5 mM 10 mL
Glycerol 10 % (v/v) 8 mL
10 % (w/v) SDS 2 % (w/v) 16 mL 2-Mercaptoethanol 20 % (w/v) 4 mL
(d) 5x Elektrophorese-Laufpuffer
Substanz Endkonzentration Menge Tris Base 24,77 mM 15 g
Glycin 191,8 mM 72 g
SDS 3,47 mM 5 g
(e) Fixierlösung
Substanz Menge
Ethanol 100 mL
Essigsäure 25 mL ad H2O [MQ] 250 mL
(f) Sensitivierlösung
Substanz Menge
Ethanol 75 mL
Glutardialdehyd 25 % (w/v) 1,25 mL Natriumthiosulfat 5 % (w/v) 10 mL
Natriumacetat 17 g
ad H2O [MQ] 250 mL
(g) Silberfärbelösung
Substanz Menge
Silbernitrat 2,5 % (w/v) 25 mL
Formaldehyd 100 µL
ad H2O [MQ] 250 mL
(h) Entwicklungslösung
Substanz Menge
Natriumcarbonat 6,25 g Formaldehyd 100 µL ad H2O [MQ] 250 mL
(i) Stopplösung
Substanz Menge
EDTA 3,65 g
ad H2O [MQ] 250 mL
2.2 PUFFER UND LÖSUNGEN 21
Tab. 2.6: Puffer und Lösungen für ELISA (a) 10x PBS (pH=7,4; 0,1 M)
Substanz Endkonzentration Menge NaH2PO4xH2O 17 mM 2,35 g/L Na2HPO4x2H2O 84 mM 15,0 g/L
NaCl 1,5 M 87,7 g/L
(b) Beschichtungspuffer (pH=9,6)
Substanz Endkonzentration Menge
Na2CO3 32 mM 1,7 g/L
NaHCO3 70 mM 2,9 g/L
(c)Blockpuffer (1 % (w/v) Casein/PBS)
Substanz Menge Casein 1g/100 mL 1x PBS 100 mL
(d)Waschpuffer (0,05 % (v/v) Tween 20/PBS)
Substanz Menge Tween 20 1 mL/2 L 1x PBS 2 L
(e) Stammlösungen (1mM in 1x PBS)
Substanz Menge
OTA 4,04 mg/10 mL
OTB 2,7 mg/10 mL
EDAC 1,9 mg/10 mL
Coumarin 1,5 mg/10 mL Phenylalanin 1,7 mg/10 mL
Tab. 2.7: Puffer und Lösungen für Dot Blot und Western Blot (a) TTBS
Substanz Endkonzentration Menge
Tris-HCl 100 mM 15,67 g
NaCl 0,9 % (w/v) 9 g
Tween 20 0,1 % (v/v) 1 mL
ad H2O 1000 mL
(b) TBS
Substanz Endkonzentration Menge
Tris-HCl 100 mM 15,67 g
NaCl 0,9 % (w/v) 9 g
ad H2O 1000 mL
(c) Blockpuffer
Substanz Menge Casein 1mg/100 mL 1x PBS 100 mL
(d) Blotpuffer
Substanz Endkonzentration Menge
Tris base 25 mM 6,06 g
Glycin 192 mM 28,8 g
Methanol 20 % (v/v) 400 mL
ad H2O 2000 mL
(e) Ponceau S Lösung
Substanz Menge
Ponceau S 0,5 g/1 mL Essigsäure ad H2O 100 mL
2.3 Antikörper
Tab. 2.8:Verwendete Antikörper
Antikörper Hersteller LOT
HRP-konjugiert, AffiniPure Ziege Anti-Maus IgG Dianova 55711 Fcγ-Fragment spezifisch
HRP-konjugiert, Hase Anti-Maus IgG DAKO 101 HRP-konjugiert, AffiniPure Ziege Anti-Maus IgG Jackson 63999 F(ab’)2-Fragment spezifisch
2.4 Kunststoffwaren
Tab. 2.9:Verwendete Kunststoffwaren
Produkt Hersteller Bezeichnung
25mm Spritzenvorsatzfilter VWR (0,45 µm) Celluloseacetat Membran 96 well-Platten VWR Nunc-Immuno™ MaxiSorp
2.5 Technische Ausstattung
Tab. 2.10: Verwendete technische Geräte
Gerät Hersteller Bezeichnung
ELISA Reader SLT 340 ATTC
Feinwaage Mettler AT261 DeltaRange® FACT
CCD Kamera Fujifilm LAS-1000
HiTrap™ Protein G HP GE Healthcare HiTrap affinity column
Magnetrührer Heidolph MR2002
pH-Meter Metrohm AG Typ 691
Photometer Beckmann DU-600 Spektrophotometer
Pipetten Eppendorf Research®
Brand Transferpette®
Waage Mettler PB3002 DeltaRange® TOLEDO
Wasseraufbereitungsanlage Millipore Milli-Q Plus
2.6 AUFREINIGUNG DES ANTIKÖRPERS 23
2.6 Aufreinigung des Antikörpers
Der Antikörper wird über eine Protein G Sepharose Säule aufgereinigt und anschliessend wird von jeder gesammelten Fraktion die Proteinkonzentration nach Bradford gemessen(2). Die positiven Fraktionen werden vereinigt und ihre Reinheit überprüft. Hierzu wird das Protein über SDS- PAGE aufgetrennt und mit Silbernitrat (AgNO3) angefärbt. Am Ende steht ein standardisierter Antikörper-Pool zur Verfügung, der dann auf die Kreuzreaktivität und Einsetzbarkeit für weitere Methoden getestet wird.
2.6.1 Aufreinigung: Protein G Sepharose
Bei der Affinitätschromatographie werden Proteine auf der Basis von reversiblen Interaktionen mit der Trägermatrix aufgetrennt. Die Selektivität wird dadurch erreicht, dass es für das Zielprotein einen geeigneten Liganden gibt, welcher an die Trägermatrix gebunden ist. Protein G ist ein Oberflächenrezeptor von streptococci und bindet selektiv an die Fcγ-Region von Immunoglobulinen der Klasse G (IgG). Der aufzureinigende Antikörper ist von der Klasse IgG1 und besitzt demnach eine hohe Affinität zu Protein G. Die Wechselwirkungen zwischen dem Zielprotein und dem Liganden können von elektrostatischer und hydrophober Natur sein.
Allerdings können auch van-der-Waals-Kräfte und Wasserstoffbrückenbindungen auftreten.
Das Schema in Tabelle 2.11 gilt allgemein für die Affinitätschromatographie.
Tab. 2.11: Ablauf der Affinitätchromatographie Schritt Puffer Beschreibung
1 Bindungspuffer Säulenmatrix wird auf Bindungspuffer äquilibriert
2 Probe auftragen Bedingungen werden so gewählt, dass die Wechselwirkungen zwischen Ligand und Zielprotein stark und spezifisch, aber reversibel sind
3 Bindungspuffer Entfernen von ungebundenen Substanzen
4 Elutionspuffer Durch Veränderung der Bedingungen (pH-Wert, Ionenstärke, Polarität) wird die Wechselwirkung zwischen Ligand und Zielprotein so schwach, dass sich dieses vom Ligand löst.
5 Bindungspuffer Re-Äquilibrierung
HiTrap™ Protein G HP Säule
Bei diesem Versuch wird eine 1 mL Säule vom Typ HiTrap™ Protein G HP der Firma GE Healthcare verwendet. Tab. 2.12 stellt die Herstellerangaben über die Charakteristika der Säule zusammen. Die Durchflussrate beträgt 0,94 mL/min und das Totvolumen 7,32 mL.
Tab. 2.12: Technische Daten der HiTrap™ Protein G HP Säule(8)
Säulenvolumen 1 mL
Säulendimension 0,7x2,5 cm (1 mL)
Ligand Rekombinantes Protein G ohne Albumin-Bindungsregion, M=17 000, pI=4,1
Substitutionsgrad 2 mg Protein G/mL Medium Bindungskapazität >25 mg humanes IgG/mL Medium
Partikelgröße 34µm
max. Druck 0,3 MPa, 3 bar
Matrixstruktur hochvernetzte, sphärische Agarose max. Durchflussrate 4 mL/min
empfohlene Druchflussrate 1 mL/min
pH-Stabilität 2-9
Lagerung 4°C in 20% EtOH
Ablauf
Die Säule wird bei 4°C in 20% EtOH gelagert und vor Benutzung mit 30 mL Bindungspuffer (pH 7,0) gewaschen und auf Raumtemperatur erwärmt. Um anschliessend die Ausbeute bestimmen zu können, werden vor und nach der Aufreinigung Proben des Überstandes genommen. Der Hybri- domaüberstand wird mit äquivalentem Volumen Bindungspuffer verdünnt und als Endlosschleife an die Säule angeschlossen. Da über Nacht aufgereinigt wird, passiert der Überstand mehrmals die Säule. Der Elutionspuffer (pH 2,7) wird zum Eluieren des Antikörpers angeschlossen. Durch- schnittlich werden zwölf Proben mit einem Volumen von 1 mL in Eppendorf-Reagiergefäßen, in denen 50 µL Tris-HCl (pH 9,0) vorgelegt werden, aufgefangen. Anschliessend wird die Säule mit 30 mL Bindungspuffer und 30 mL Lagerlösung (20% EtOH) gewaschen (Abb. 2.1).
2.6 AUFREINIGUNG DES ANTIKÖRPERS 25
Abb. 2.1: Ablauf der Affinitätschromatographie
2.6.2 Konzentrationsbestimmung: Bradford-Assay
Der Bradford-Assay dient zur Konzentrationsbestimmung von Proteinen in Lösungen(2). Dieser kolorimetrische Test beruht auf einer Bindung des Farbstoffes Coomassie Blue an Proteine in saurer Lösung. Das Absorptionsmaximum des Farbstoffes wird von 465 nm auf 595 nm erhöht. Coomassie Blue bindet stöchiometrisch an bestimmte Aminosäuren des Proteins. Zu diesen Aminosäuren gehören einerseits das hydrophile Arginin und andererseits die hydrophoben Aminosäuren Phenylalanin, Tryptophan und Prolin. Der freie, ungebundene Farbstoff liegt protoniert vor und hat sein Absorptionsmaximum bei 465 nm. Bei der Bindung mit den oben genannten Aminosäuren geht der Farbstoff in den anionischen Zustand über und kann nun bei 595 nm detektiert werden. Die gemessene optische Dichte bei 595 nm (OD595) ist sowohl proportional zu der Konzentration an den gebundenen Aminosäuren, als auch proportional zu der Konzentration an Protein in Lösung. Mit Hilfe einer Standardkurve kann die Konzentration
der Proteinlösung bestimmt werden.
Ein Nachteil dieser Methode ist, dass der Anteil der Aminosäuren, welcher von Coomassie Blue gebunden wird, die Konzentrations-Absorptionskurve beeinflusst. Das hängt davon ab, wie groß der Anteil dieser Aminosäuren im Protein ist. Deshalb sollte bei der Standardisierung unbedingt ein Protein gewählt werden, welches einen ähnlichen Gehalt an diesen Aminosäuren besitzt.
Standardkurve
Die quantitative Bestimmung der Proteinmenge erfolgt anhand einer Kalibriergerade mit bovinem γ-Globulin in H2O [MQ], die im Bereich von 0 mg/mL bis 14 mg/mL einsetzbar ist (Tab. 2.13).
Hierbei ist es wichtig, dass die Proben sehr gut gemischt werden. Pro Verdünnung werden zwei
Tab. 2.13: Verdünnungsreihe für das Bestimmen der Standardkurve
VF Stamm 2 4 8 16 32 64 128
cend in mg/mL 14 7 3,5 1,75 0,875 0,438 0,219 0,109
Messungen durchgeführt und jeweils 50 µL in zwei Eppendorf-Reagiergefäße überführt. Diese werden mit 1 mL verdünnter Bradford-Lösung (1:5) versetzt und mindestens 15 Minuten inkubiert.
Anschliessend wird mit Hilfe eines Photometers der OD595-Wert bestimmt. Daraufhin wird der Mittelwert der zwei Messungen pro Verdünnung bestimmt und eine nichtlineare Regression durchgeführt. Die Gleichung der nichtlinearen Regression wird für die Konzentrationsbestimmung der nachfolgenden Proben verwendet.
Proteinbestimmung der Proben
10µL der Probe wird mit 40 µL H2O verdünnt und anschliessend für den Bradford-Assay mit 1 mL verdünnter Bradford-Lösung (1:5) versetzt. Nach 15 Minuten Inkubationszeit wird der OD595-Wert der Proben bestimmt.
2.6.3 Reinheitsüberprüfung: SDS-PAGE, AgNO3 Färbung
SDS-PAGE ist die Abkürzung für sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis und ist eine analytische Methode, die in der Biochemie zur Trennung von Molekülen im elek-
2.6 AUFREINIGUNG DES ANTIKÖRPERS 27
trischen Feld eingesetzt wird. Die Moleküle wandern durch eine hochvernetzte Struktur aus Polyacrylamid von der Anode zur Kathode und werden dabei der Größe und Ladung nach aufgetrennt. Die Porengröße, das Gelpuffersystem und das Proteingemisch, welches getrennt werden soll, sind variabel. Die Poren entstehen durch die Vernetzung der Polyacrylamidketten mit N,N‘-Methylenbisacrylamid. Die Porengröße ist somit abhängig von der Monomerkonzentration an Acrylamid. Charakterisiert werden die Gele mit der Totalacrylamidkonzentration %T, wel- che für die Prozentzahl der Monomere an eingewogenem Acrylamid und Bis-Acrylamid zum Gesamtvolumen stehen (Gleichung (2.1)). Es gilt: Je höher %T, desto kleiner die Porengröße.
%T = m(Acrylamid) +m(N,N‘-Methylenbisacrylamid)·100%
V(Gesamt) (2.1)
Ein weiterer Faktor, der bei der Charakterisierung des Gels eine Rolle spielt, ist das Verhältnis von N,N‘-Methylenbisacrylamid zu Acrylamid in der eingesetzten Monomerenlösung. Dieser Faktor steht für den Vernetzungsgrad %C und kann mit Gleichung (2.2) berechnet werden.
%C= m(N,N‘-Methylenbisacrylamid)·100%
m(Acrylamid) +m(N,N‘-Methylenbisacrylamid) (2.2) Für den Vernetzungsgrad wird meistens ein Wert von 2,67%C gewählt. %T variiert stark (zwischen 7,5% und 20%), da je nach Molekulargewicht der Proteine eine unterschiedliche Porengröße gewählt werden muss. Es ist auch möglich einen Gradienten an %T im Gel zu erstellen.
Um eine optimale Trennung des Proteingemisches zu erreichen, wird ein Retentionsfaktor Rf-Wert zwischen 0,55-0,6 gewählt. Dieser lässt sich mit Gleichung (2.3) berechnen.
Rf = Strecke zwischen Startlinie und Substanzzone
Strecke zwischen Startlinie und Fließmittelfront (2.3) Die Polymerisation der Monomere verläuft nach dem Mechanismus der radikalischen Po- lymerisation. Der Polymerisationsstart erfolgt durch Zugabe eines Radikalbildners, wie z.B.
Ammoniumperoxiddisulfat (APS), und eines Radikalstabilisators, wie z.B. Tetramethylethylen- diamin (TEMED). Ohne die Zugabe von N,N‘-Methylenbisacrylamid entstehen lange, unver-
netzte Ketten aus Polyacrylamiden. Die Poren erhält man erst durch Zugabe des Vernetzers.
Das Gelpuffersystem beeinflusst einerseits die benötigte Spannung und andererseits die Trennung im Gel. Es wird unterschieden zwischen kontinuierlichen und diskontinuierlichen Puffersystemen.
Beim Ersteren ist im ganzen System der pH-Wert und die Ionenkonzentration gleich. Bei diskontinuierlichen Systemen befinden sich hingegen unterschiedliche Ionen im Gel und in dem Elektrodenraum. Häufig wird ein System benutzt, welches nach U.K. Laemmli benannt wurde(17). Bei diesem System kommen unterschiedliche Gele zum Einsatz. Die Proben werden
auf ein Sammelgel (pH 6,8) aufgetragen, welches größere Poren als das Trenngel (pH 8,8) hat.
Am Übergang zwischen Sammel- und Trenngel werden die Proteine zu einer dünnen Bande zusammen gepresst, welche sich im Trenngel zu unterschiedlichen Banden auftrennt. Hierbei werden die Proteine zwischen den Chloridionen mit hoher Mobilität und Glycin mit niedriger Mobilität aufkonzentriert. Erst wenn das Gemisch das Trenngel erreicht, erhöht sich die negative Ladung des Glycins und die Proteine im Gel werden überholt. Somit wandert nun jedes Protein, der Größe entsprechend schnell, im Trenngel.
Außerdem werden die Proben vor dem Auftragen mit dem anionischen Detergenz SDS und 2-Mercaptoethanol (β-ME) bei 95°C denaturiert. Dabei wird die Eigenladung der Proteine über- deckt und die Quartär-, Tertiär- und Sekundärstruktur zerstört. Dies geschieht, da SDS mit den hydrophoben Bereichen der Proteine interagiert und diese entfaltet. Nahezu alle nichtkovalenten Bindungen werden gelöst und die Proteinkomplexe zerfallen in ihre Untereinheiten. SDS bindet sehr effektiv an Proteine im Verhältnis von 1 SDS : 1,4 Aminosäuren. Die Proteine bewegen sich nun im Trenngel annährend proportional zu ihrer Größe. Somit ist die Bestimmung des Molekulargewichts und der Anzahl an Untereinheiten von unbekannten Proteinen möglich.
Bei der Gelelektrophorese gelten im Wesentlichen zwei fundamentale Gesetze der Elektrizitäts- lehre:
U =R·I (2.4)
P =U·I (2.5)
2.6 AUFREINIGUNG DES ANTIKÖRPERS 29
Bei konstanter Spannung U verringert sich die Wanderungsgeschwindigkeit ohne zusätzliche Wärmeentwicklung. Bei konstanter Stromstärke I bleibt die Wanderunsgeschwindigkeit konstant, da diese proportional zur Stromstärke ist, wobei es jedoch zur Wärmeentwicklung kommt.
Nach der Auftrennung werden die Proteine auf dem Gel mit Hilfe der Fixierlösung fixiert, um Diffusion zu vermeiden. Nun ist es möglich unterschiedliche Färbungen der Proteine vorzunehmen.
Die Coomassie- und die Silberfärbung sind die zwei am häufigsten verwendeten Methoden zur Proteindetektion auf Polyacrylamidgelen. Ein Vergleich zwischen den beiden Methoden ist in Tabelle 2.14 zu finden. Für diesen Versuch wurde die Methode der Silberfärbung gewählt,
Tab. 2.14: Vergleich der Färbemethoden zur Proteindetektion Methode Coomassie Blue Silbernitrat
Dauer 13-18 Stunden 3-4 Stunden
Sensitivität 40-50 ng 1-5 ng
Elution der Proteine möglich nicht möglich Quantifizierung geeignet nicht geeignet
da hier die Untersuchung der Reinheit des Antikörpers im Vordergrund steht. Hierbei wird eine höhere Sensitivität erreicht und selbst geringe Kontaminationen können nachgewiesen werden. Bei der Inkubation mit Silbernitrat lagern sich Ag+-Ionen an bestimmte Aminosäuren an, welche während der Inkubation mit Entwicklungslösung zu elementarem Silber reduziert werden. Dabei stören Ionen und Detergenzien die Anlagerung. Deshalb muss vor dem Färben unbedingt das Gel mit H2O [MQ] gewaschen werden. Bei der Entwicklung der Färbelösung oxidiert das Formaldehyd zu Ameisensäure. Die Reduktion des ionischen Silbers zu elementarem Silber läuft jedoch nur unter alkalischen Bedingungen ab. Darum enthält die Entwicklungslösung Natriumcarbonat, welches die entstandene Ameisensäure abfängt. Diese Reaktion wird durch Veränderung des pH-Wertes in ein saures Milieu mit einer EDTA-Lösung gestoppt. Anschliessend wird das Gel in einer wässrigen Glycerinlösung inkubiert und zwischen Cellulanfolien getrocknet.
Nach drei Tagen erhält man ein dünnes, stabiles Gel, welches sich gut für die Photographie eignet.
Ablauf
Bei der für die Gelelektrophorese verwendeten Apparatur handelt es sich um die Mini-PROTEAN® II Electrophoresis Cell von Bio-Rad, München. Zu Beginn wird das Trenngel zwischen zwei Glas- platten gegossen und mit EtOH (70%) überschichtet, um eine scharfe Oberkante zu bekommen.
Nach der Polymerisation wird dasselbe mit dem Sammelgel wiederholt. Das Gel wird vertikal in die Apparatur eingebaut und diese mit 1x Laufpuffer gefüllt. 20µL jeder Probe werden mit 5 µL 5x Elektrophorese-Probenpuffer gemischt und bei 95°C fünf Minuten denaturiert. 20 µL
werden von jeder Probe und 10µL des Proteinmarkers aufgetragen. Die angelegte Spannung für die SDS-PAGE beträgt 200 V und die durchschnittliche Dauer liegt bei 60 Minuten.
Für die nicht-reduzierende Gelelektrophorese wird ein 7,5% Trenngel verwendet und für die reduzierende SDS-PAGE ein 12% Trenngel. Die Dicke der Gele liegt bei ungefähr 1 mm.
Nach der Auftrennung wird das Gel nach dem Schema in Tabelle 2.15 mit Silbernitrat angefärbt.
Tab. 2.15: Vorgehen bei der Silberfärbung von Polyacrylamidgelen Inkubationslösung Inkubationszeit
Sensitivierlösung 30 min
H2O [MQ] 3x 5 min
Silbernitratlösung 20 min
H2O [MQ] 2x 1 min
Entwicklungslösung 1-5 min
Stopplösung 10 min
H2O [MQ] 3x 5 min
wässrige Glycerinlösung 30 min
2.7 CHARAKTERISIERUNG DES ANTIKÖRPERS 31
2.7 Charakterisierung des Antikörpers
2.7.1 ELISA
ELISA steht im Englischen für Enzyme Linked Immunosorbent Assay und bezeichnet ein immu- nologisches Nachweisverfahren, welches auf einer enzymatischen Nachweisreaktion basiert(18). In diesem Assay können Proteine, Viren und niedermolekulare Substanzen, wie z.B. Hormone und Toxine in einer Probe (Urin, Serum oder andere Flüssigkeiten) nachgewiesen werden. Hierbei ist es wichtig, dass ein spezifischer Antikörper vorhanden ist, welcher an ein bestimmtes Epitop der zu untersuchenden Substanz bindet. An diesen primären Antikörper bindet daraufhin ein sekundärer Antikörper. Dieser ist mit einem Enzym gekoppelt, welches bei Substratzugabe das Substrat umsetzt und dadurch eine Farbveränderung hervorruft. Gemessen wird dann die Absorption des Farbstoffes. Meist wird als Enzym HRP (Meerrettichperoxidase) gewählt, aber auch AP (Alkalische Phosphatase) oder GOX (Glucoseoxidase) können eingesetzt werden. HRP oxidiert die chromogene Substanz TMB (3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin) und setzt dabei H2O2
um. Der Farbstoff wird blau und die Reaktion kann durch Zugabe von Schwefelsäure (2 M) gestoppt werden. Es tritt eine Gelbfärbung ein und die optische Dichte kann bei 450 nm (OD450) gemessen werden. Das Detektionslimit im ELISA liegt in einem Bereich von Pikogramm bis Nanogramm.
Es gibt unterschiedliche ELISA-Techniken. Der indirekte, kompetitive ELISA und der Sandwich ELISA sind die am häufigsten verwendeten Techniken.
Indirekter, kompetitiver ELISA
Abbildung 2.2 zeigt den Ablauf des indirekten, kompetitiven ELISA. Die 96-well-Mikrotiter-Platte wird zuerst mit BSA-OTB (OTB ist kovalent an bovines Serumalbumin gebunden) beschichtet (Abb. 2.2(a)). Die Inkubation von 100 µL BSA-OTB (196µg/mL) findet bei 4°C über Nacht statt. Die Mikrotiterplatte wird dreimal mit 200 µL Waschpuffer (0,05% Tween 20 in PBS (0,01 M)) und zweimal mit 200 µL PBS (0,01 M) gewaschen. Die Platten können in PBS bei 4°C gelagert werden.
Abb. 2.2: Ablauf des indirekten, kompetitiven ELISA-Assay
Anschliessend werden nicht beschichtete Bereiche der Platte mit Blockpuffer abgesättigt.
Hierzu werden je 300 µL Blockpuffer pro Probe eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Daraufhin werden 50µL je Kompetitorlösung und 50µL primäre Antikörperlösung zugegeben (Abb. 2.2(b)). In der Lösung konkurriert nun das an die Platten gebundene BSA-OTB mit dem freien Kompetitor um die Antikörperbindung. Je nach Kompetitor bindet mehr oder weniger Antikörper an das BSA-OTB. Inkubiert wird eine Stunde bei 37°C. Danach wird die Mikrotiterplatte dreimal mit 200 µL Waschpuffer (0,05% Tween 20 in PBS (0,01 M)) und zweimal mit 200 µL PBS (0,01 M) gewaschen.
Der an das BSA-OTB gebundene, primäre Antikörper wird von dem sekundären Ziege anti-Maus Antikörper an der Fc-Region gebunden (Abb. 2.2(c)). Dabei werden je 100 µL Antikörperlösung (1:5000, 160 ng/mL) eine Stunde bei 37°C inkubiert. Der sekundäre Antikörper ist an das Enzym HRP gekoppelt, welches im nächsten Schritt die Farbreaktion hervorruft.
Nach Zugabe von 50µL Substrat (TMB und H2O2) verfärbt sich die Lösung je nach Enzymgehalt von farblos zu blau (Abb. 2.2(d)). Nach fünfzehn Minuten wird die Reaktion mit 50 µL Schwefelsäure (2 M) gestoppt. Die Lösung verfärbt sich gelb und im ELISA-Reader wird die OD450 gemessen.
2.7 CHARAKTERISIERUNG DES ANTIKÖRPERS 33
IgG-Titerbestimmung mit Sandwich ELISA
Die Mikrotiterplatte wird mit je 100µL eines Fcγ-Fragment spezifischen Antikörpers (1µg/mL) über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach dem Waschvorgang (3x Waschpuffer und 2x PBS) wird
300µL Blockpuffer eine Stunde inkubiert. Die Proben und der IgG-Standard (1-100 ng/mL) werden seriell verdünnt und jeweils 100µL aufgetragen. Der Bindungsvorgang dauert eine Stunde bei 37°C. Anschliessend werden nicht gebundene Substanzen gewaschen (3x Waschpuffer und 2x PBS) und der Sekundärantikörper (F(ab’)2-Fragment spezifisch, 16 ng/mL) hinzugegeben.
Nach einem weiteren Waschvorgang (3x Waschpuffer und 2x PBS) werden 50 µL Substrat (TMB und H2O2) zugegeben und nach fünfzehn Minuten die Reaktion mit 50µL Schwefelsäure (2 M) gestoppt. Die Lösung verfärbt sich gelb und im ELISA-Reader wird die OD450 gemessen.
Die Konzentration des IgG-Standards wird gegen die Absorption aufgetragen und eine Kalibrier- gerade erstellt. Mit Hilfe der Gleichung der Regressionsgeraden kann nun der IgG-Titer jeder Probe bestimmt werden.
2.7.2 Dot Blot und Immunodetektion
Der Dot Blot Assay ist im Gegensatz zum ELISA eine semi-quantitative Methode, gehört aber
auch zur Gruppe der Immunoassays. Dabei werden Proteine auf eine Membran getüpfelt oder per Vakuum transferiert (Abb. 2.3). Als Membran dient Nitrozellulose oder PVDF (Polyvinyldifluorid).
Die Proteine haften aufgrund hydrophober Wechselwirkungen auf der Membran und behalten
ihre Struktur bei. Das heisst, dass sie für weitere Methoden zugänglich sind. Verschiedene Proteinfärbemittel können eingesetzt werden, aber auch Immunodetektion mit Antikörpern ist möglich. So können spezifische Proteine, die sich z.B. in einem Gemisch befinden, nachgewiesen werden. Wenn bei einem Dot Blot Assay zusätzlich noch ein Standard aufgetragen wird, kann diese Methode auch zur Quantifizierung verwendet werden.
Immunodetektion
Bei der Immunodetektion werden nur die gewünschten Substanzen angefärbt. Der Primär- antikörper bindet spezifisch an das Epitop des Antigens. Der Sekundärantikörper, der an ein
Abb. 2.3: Dot Blot Apparatur
Enzym gekoppelt ist, bindet an die Fc-Region des Primärantikörpers. Dieses Enzym kann nun
ein Substrat in eine detektierbare Substanz umsetzen. Das Enzym HRP kann mehrere Substrate umwandeln. Eine sehr sensitive Methode ist die Detektion mit ECL (enhanced chemilumine- scence). Dabei wird bei einer chemischen Reaktion Energie freigesetzt, die wiederum gemessen
werden kann. In Tabelle 2.16 sind die in dieser Arbeit verwendeten Substrate aufgelistet.
Tab. 2.16: Vergleich der Substrate für HRP Substrat Farbe Eigenschaften
TMB Blau stabiles, unlösliches, farbiges Produkt, eignet sich für kolorimetrische Messungen DAB Braun unlösliches Produkt, sensitive Methode
ECL Chemilumniszenz Chemilumniszenz, wenig Hintergrundrauschen, sehr sensitiv