Zur quantitativen immunologischen Bestimmung von Serumproteinen

Lamcrz, Fateh-Moghadam u. Knedel: Zur quantitativen immunologischen Bestimmung von Serumprotcincn 491 Z. Klin. Chcm. Klin. Biochem.

11. Jg. 1973, S. 491—500

Zur quantitativen immunologischen Bestimmung von Serumproteinen

Von R. LAMERZ, A. FATEH-MOGHADAM und M.

/. Medizinische Klinik (Direktor: Prof. Dr. med. H. Scbwiegk) der Universität München nnd Kliniscb-Cbemsches Institut (Chefarzt: Priv.-Do^. Dr. tned. M. Knedel) am Städtischen Krankenhaus München-Harlachlng

(Eingegangen am 23. Januar/13. April 1973)

Es wird über ein verbessertes Auswertevcrfahren der einfachen radialen Immunodiflusion nach der Methode von MANCINI (Jmmuno- chemistry 2, 235 — 254 (1965)) anhand der Auswertung von 1053 Partigcn platten der Fa. Behringvverke bei 10 Scrumprotcinen berichtet.

Die Auswertung erfolgte mit Hilfe einer Standardgcradcn durch Erstellung einer linearen Rcgrcssionsglcichung aus den Standard-Kon- zentrationen mit zugehörigen Präzipitatsflächen. Aufgrund des direkten Vergleichs der einzelnen Regressionsgcradcn für die verschiedenen Scrumproteine und unter Berücksichtigung der Chargen muß für jede Partigcnplatte eine eigene Regressionsglcichung gefordert wer- den. Bei Prüfung der Genauigkeit der Methode ließ sich eine Gesamtstrcuung zwischen 2,4% (Transfcrrin) und 7,1% (IgG) feststellen.

Verschiedene andere Auswertungsverfahren erwiesen sich dem von uns beschriebenen als unterlegen. Neben diesen Befunden werden Tripartigenplatten (IgG, IgA, IgM) der Fa. Behringwerke und Immunopiates der Fa. Hyland für 8 Serumproteine verglichen. Dabei zeigte sich, daß die auf Immunoplatcs durchgeführte Auswertung nach der Methode von FAHEY (J. Immunol. 94, 84 — 90 (1965), lineare Beziehung zwischen Durchmesser des Präzipitats und dem Logarithmus der Konzentration) der MANCiNi-Methode (lineare Beziehung zwischen Präzipitatsflächc und der Konzentration) an Genauigkeit durchaus ebenbürtig und ebenso für Kleinrechner programmierbar ist.

Die im Vergleich zur MANCiNi-Methode auf Partigcnplattcn gefundenen Unterschiede waren nicht methodisch bedingt, sondern auf die nicht vergleichbaren unterschiedlichen Konzentrationsangabcn der Standards beider Firmen zurückzuführen.

The quantitative immnnologcal determination of serum proteins

An improved evaluation procedure for the simple radial immunodiffusion method of MANCINI (Immunochemistry 2, 235 — 254(1965)) is reported for 10 serum proteins, using 1053 Partigcn plates from Behringwerke. A calibration line was established from the linear regression of the standard concentration and the corresponding areas of precipitation. A regression anatysis was performed for each Partigcn plate by the direct comparison of the individual regression lines for the different scrum proteins, taking the differences between batches into account.

The results showed a scatter of between 2.4% (transferrin) and 7.1% (IgG). Other methods of evaluation were found to be less accurate.

The Tripartigen plates (IgG, IgA, IgM) from Behringwerke and Immunoplatcs from Hyland were also compared for 8 serum proteins. It was found that the evaluation on Immunopiates by the method of FAMEY (J. Immunol. 94, 84 — 90 (1965)) (linear relationship between diameter of precipitation and logarithm of the concentration) and by the MANCINI method (linear relationship between precipitation area and con- centration) are equally accurate, and both can be programmed on a calculating machine. The method on Partigcn plates showed differences from the MANCINI method, which were not due to a lack of agreement between the two methods, but to differences in the stated con- centrations of the standards from the two firms,

Die Methode der einfachen radialen Immunodiffusion Rechenmaschine beschrieben. Ferner wird ein Vergleich wird in zwei Modifikationen angewandt, für die auch mit Tripartigen-PJatten sowie Immuno-Plates der handelsübliche Immunodiffusionsplatten erhältlich sind. Fa. Hyland/Travenol und derer Standards gezogen.

Nach den Verfahren von MANCINI (1) besteht zwischen

der terminalen Präzipitationsfläche und der Antigen- Methodik konzentration eine lineare Beziehung. Nach diesem Ver- Prinzip

fahren werden die Partigenplatten der Fa. Behring- i^m Pri^ip diffundieren bei der einfachen radialen Immunodiffusion werke ausgewertet. Die Modifikation von FAHEY (2) die Antigenmoleküle radial von einem runden Startloch aus in nützt die lineare Beziehung zwischen dem Präzipitats- eine mit homologem spezifischen Antiserum vermischte Agargel- Durchmesser eines noch diffundierenden Antigens und ^schi(:^ht» ^{wobci s}.ie einen mifc der Zeit konzentrisch wachsenden

i T . , j · · T·· Präzipitationszylindcr bilden, dessen innerer Rand vom Antigen- dem Logarithmus der Antigenkonzentraüon aus. Eine bchä/ter gebildyct wkd und'desscn äußcrc Begrenzung der be- Anwendung dieses Verfahrens erfolgt mit den handels- sonders gut sichtbare Präzipitationsring darstellt. Dieser wandert üblichen Immunopiates der Fa. Hyland/Travenol. konzentrisch bis zur Ausbildung eines stabilen Gleichgewichts In der vorliegenden Arbeit wird über unsere Erfah- dc* Äquivalenz von Antigen- und Antikörperkonzentration rungen mit der einfachen radialen Immunodiffusions- J. ^h* ^bis, ^alk? diffundicrcndc *"*** ™m homologen Anti-

JL j u - · j *j"i j-£i *· korper gebunden ist.

methode nach MANCINI m der Mikromodifikation von ^{Nach dcr} Modifikation von MANCINI steht die nach vollständig AUGENER (3) anhand der Auswertung von 1050 handels- beendeter Diffusion erreichte terminale Präzipitatsfläche in direkter üblichen Partigen-Platten berichtet, die im Vergleich linearer Beziehung zur vorgegebenen Antigenmengc:

mit selbst hergestellten Platten eine gute Überein-

Stimmung zeigten (4). Dabei wird ein verbessertes und '> P* A*°^tcn *md Mitglieder des SFB 37 „Restitution und . „ i ö . v ' x_ Substation innerer Organe" München.

vereinfachtes Auswerteverfahren unter Verwendung 2) Das hicr vcrwcndetc Konsentrationsmaß iQ-2g/l entspricht eines Meß-Mikroskops und einer elektronischen mg/100 ml.

Z. Klin, Chem. Klin. Biochem, / 11. Jahrg. 1973 / Heft 12 ⁶⁴*

492

Lamerz, Fateh-Moghadam u. Knedel: Zur quantitativen immunologischen Bestimmung von Serumproteinen F^G =F⁰ + cQ^Ag

F G — Prsusipitatfläche + Antigen-Reservoir-Fläche

= Antigenmenge.

Die grafische Darstellung der .Funktionsgleichung ist eine Gerade mit der Steigung c und dem Ordinatenabschnitt F0.

Nach den Untersuchungen von MANCINI (1) ist die Steigung c eine Funktion der Antiserumkonzentration. Je höher die ver- wendete Antikörperkonzentration, desto kleiner die Steigung c.

Der Wert F⁰ (Ordinatenabschnitt) hängt mit der Größe der Antigenbehälterfläche zusammen: Je größer das Antigen-Re- servoir, um so größer auch der F⁰-Wert. Auch wachsende Lö- sungsmittelvolumina führen zu einem Anstieg des F0-Wertes.

Die Zeit bis zum Erreichen der terminalen Präzipitatsfläche ist u. a. vom Molekulargewicht des untersuchten Antigens und damit von seinem Difrusionskoeffizienten abhängig: die bis dahin ver- strichene Diffusionszeit hängt auch von der Temperatur ab: eine höhere Temperatur bewirkt ein schnelleres Wandern der Antigen- moleküle.

Nach MANCINI ließ sich die Empfindlichkeit der einfachen ra- dialen Immunodiffusion zu 10 — 20 %/\ bestimmen. Die Gesetz- mäßigkeiten der MANCiNi-Modifikation treffen zum Teil auch für die FAHEY-Modifikation zu. Hier besteht eine lineare Beziehung zwischen dem zu einem bestimmten Zeitpunkt während der Diffusion gemessenen Präzipitatdurchmesser und dem Loga- rithmus der Antigenkonzentration. Da jedoch unter Diffusion gemessen wird, können entsprechende Platten nach oft wesentlich kürzeren Diffusionszeiten abgelesen werden.

Vorbereitung und Beschickung der Platten• *

Zur Füllung der Antigenbehälter verwendeten wir eine Hamilton- Mikroliterspritze mit Dosiervorrichtung. Eingefüllt wurden genau 2 \ Standard- bzw. Analysenlösung in die Partigen- sowie 5 \ in die Tripartigen- bzw. M-Partigen-Platten und die vergleichs- weise untersuchten Immuno-Plates der Fa. Hyland. Zur Her- stellung einer Konversionsgeraden wurden 3 — 4 unterschiedliche Standardserum- Verdünnungen pro Platte benutzt. Nach dem Füllen der Antigen-Reservoirs mit Standard- bzw. Analysenlösung wurden die Platten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur auf einer horizontalen Ablage für 24 bzw. 48 h (z. B. höhermole- kulare Antigene IgM, oc²-Makroglobulin) aufbewahrt und im

Korrelationskoeffizient Txy-Nxy V(Ix^z-Nx²)(Iy^?-Ny²)

Methode nach Mancini

Standardgerade (lineare Regressionsgerade) y=A+Bx (y:Präzipitatflache in mm²

x: Konzentration in mg/100 ml A = y - B x

Konzentration Flachet t

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Antigenkonzentration [mg/100ml]

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Fp

Anschluß daran zur Präzipitatsmessung herangezogen. Bei den im Vergleich untersuchten Immuno-Plates betrugen die Diflfusions- zeiten 4 h bei 37°C für IgG, Transferrin und Albumin sowie 16h bei Raumtemperatur für Coeruloplasmin, a²-Makroglobu!in,

IgA und IgM.

Konzentrationsbereiche

Die für die Serumproteinbestimmung auf ImmunodifTusions- Platten brauchbaren Konzentrationsbereiche gehen aus Tabelle l hervor. '

Auswertung

Für die Auswertung der Partigen- bzw. Tri- oder M-Partigen- Platten muß nach beendeter Diffusion die terminale Präzipitats- fläche oder das Quadrat des Durchmessers bestimmt werden. Wir bestimmen die exakte Präzipitationsfläche aus den gemessenen drei Teilstrecken des Durchmessers a, b, c und den darauf senk- recht stehenden Teilstrecken a^ b' und c⁷ (Abb. 1). Diese Werte wurden in ein Auswerteformular zusammen mit den Konzen- trationen der Standards und den Bezeichnungen der Analysen,

Tab. l

Konzentrationsbereiche bei der linearen radialen Immunodiffusion in 10-² g/l

Protein Partigen-Platten Immunopiates Albumin

a^-Antitrypsin

«2-Haptoglobin (Xj-Makroglobulin Coeruloplasmin Transferrin

^A-Olobulin IgG IgA IgM

15—40 10-^40 10—60 15—80 15--405—20 10—405—40 10—120*

10-^10 10—100*

5—30 10^-100*

18—710 65—390 9,5—55

80-^440 60—360 280—2000

60—400 18—130 Tripartigen

Korrelationskoeffizient

Methode nach Fahey

Standardgerade (lineare Regressionsgerade) y=A+Bx (y: Präzipitatdurchmesser mrom

Logarithmus der Konzentration) A=y- Bx

Xxy-Nx

log.Konzentration Durchmesser

12

0 1,0 2.0 3,0 4,0 5,0J L Antigenkonzeritrat'ion [log mg /100ml]

Uogarithmieren der Standard-Konzentrations-Werte

^Berechnung der linearen Regressionsgeraden

3.Entlogarithmieren der logärithmierten Konzentrafrionswerte Abb. l

Quantitative immunologische Proteinbestimmung ^ach der einfachen radialen Immunodiffusion. Vorgehen bei der Berechnung nach der

Auswertemethode von MANCINI bzw. FAHEY

Z. Klin. Chem. Klin. Biochem.'/ 11. Jahrg. 1973 / Heft 12

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494

Lamer2, Fatch-Moghadam u. Knedel: Zur quantitativen immunologischen Bestimmung von Serumproteinen Chargcn-Nr. und Paticntenscrum-Verdünnungsfaktoren einge-

tragen.

Für die Auswertung der Immuno-Plates nach dem FAHEYschen Verfahren werden lediglich zwei, einfache senkrecht aufeinander- stellende Durchmesser der Präzipitatsringe zu den festgesetzten Zeitpunkten gemessen.

Die Messungen wurden mit Hilfe eines Leitz-Meßkomparators und eines von uns entwickelten Dunkelfeldadapters durchge- führt.

Üblicherweise trägt man die zusammengehörigen Wertepaare:

Präzipitatsflächenwert oder Quadrat des Durchmessers mit zugehöriger Standard-Konzentration (Partigen-Platten) bzw.

Durchmesser und zugehörigen Logarithmus der Standard-Antigen- konzentration (Immuno-Plates) auf linearem mm-Papier auf.

Nach der FAHEY-Methode kann man auch die Antigenkonzen- tration auf dem logarithmischen Schenkel und den Durchmesser auf dem linearen Schenkel eines semilogarithmischen mm-Papiers auftragen. Anschließend legt man durch die erhaltenen Punkte eine „von Auge" angepaßte Gerade. An dieser Bezugsgeraden werden dann die Konzentrationen der untersuchten Analysen- lösungen innerhalb der niedrigsten und höchsten Standard- Punkte abgelesen.

Rechnerisches Verfahren

Die mehr oder weniger subjektive Anpassung an die Standard- punkte läßt sich aber durch Ermittlung einer linearen Regres- sionsgeraden für diese Punkte nach dem Prinzip der kleinsten Abweichungsquadrate besser durchführen.

Sämtliche statistischen Auswertungen (t-Test für Paardifferenzen,

2-Vierfeldertest, Mittelwert, Standard-Abweichung, Variations- koeffizient, lineare Regressionsgerade, Korrelationskoeffizient (5)) sowie die Berechnung der Serumkonzentration wurden an einem Olivetti Tischcomputer Programma P 101 mit zumeist eigenen Programmen durchgeführt. Das von uns für die Partigen- bzw.

Tripartigen-Platten entwickelte Auswerteprogramm (Abb. 2) führt folgende Rechenoperationen durch:

Pro Präzipitat werden 2 Flächenwerte nach der in Abbildung l wiedergegebenen Formel aus den gemessenen Werten a, b, c bzw. a7, b' und c' berechnet, gemittelt und zusammen mit den zugehörigen drei bis vier Standard-Konzentrationswerten zur Berechnung der Regressionsgeraden verwandt. Die Kennwerte der Regressionsgleichung

y = A (Ordinatenabschnitt) + B (Steigung der Geraden) · werden daraufhin errechnet und zur weiteren Bestimmung von Ordinatenbeispielen gespeichert. Als zusätzliche Kenngrößen wer- den noch der lineare Korrelationskoeffizient r und der sy . x-Wert (Standardfehler der y-Schätzung) ausgedruckt.

In der Abbildung 2 ist auch ein Rechenbeispiel wiedergegeben.

Daraus geht hervor, daß im Anschluß an den unbedingten Sprung- befehl „V" nach Eingabe der gemessenen Teilstrecken eines Standard-Präzipitates jeweils der berechnete Flächenwert und nach zwei Flächenwerten eines Standard-Präzipitates der zugehörige Mittelwert automatisch ausgedruckt wird. Nach Eingabe der zugehörigen Standardkonzentrationen wiederholt sich das Rechen- schema für die Standards II bis III bzw. IV. Die Standardwerte können auch getrennt direkt mit dem entsprechenden gemittelten Präzipitatflächemvert eingegeben werden. Schließlich wird das Programm mit dem unbedingten Sprungbefehl „W" unter- brochen und die zweite Programmkartenhälfte ohne Löschung eingegeben. Ein neuer Sprungbefehl „V" führt zu Berechnung und Ausdruck des Korrelationskoeffizienten r, des sy. x-Wertes sowie der Kennwerte für die lineare Regressionsgleichung A und B. Nun werden nach der berechneten Regressionsgleichung unter Eingabe der zuvor gemittelten Präzipitatflächen der Standards die zugehörigen Konzentrationen als Ordinatenbeispiele der linearen Regressionsgleichung berechnet und mit den vorgegebenen Aus- gangskonzentrationen der Standards verglichen. Erst dann wird entschieden, ob die berechnete Regressionsgleichung akzeptabel ist. Nun werden die Präzipitatflächen und -konzentrationen der Patientenseren (Analysenlösungen) berechnet. Vor dem end- gültigen Ausdruck der Konzentrationen können durch Eingabe des zugehörigen Verdünnungsfaktors diese noch entsprechend

multipliziert werden. Insgesamt dauert die Auswertung einer einzigen Partigen-Platte 3—5min und liefert am Schluß einen übersichtlich angeordneten Rechenstreifen, der zusammen mit dem Auswerteformular dokumentationsgerecht abgeheftet werden kann.

Im Prinzip wurde bei der Auswertung der Immuno-Plates nach der FAHEY-Methode ähnlich verfahren. Mit von uns entwickelten Rechenprogrammen werden zunächst die Standard-Konzentra- tionen logarithmiert, und dann zusammen mit zwei aufeinander senkrecht stehenden gemessenen Durchmessern der zugehörigen Präzipitate in das Auswerteprogramm eingegeben. Daraufhin erfolgt die Berechnung der linearen Regressionsgeraden y (Durch- messer) = A + B · (logarithmierte Antigen-Konzentration) und des zugehörigen Korrelationskoeffizienten. Die dann berechneten Logarithmen der Analysen-Antigen-Konzentrationen werden automatisch entlogarithmiert und nach Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor als Endkonzentration ausgedruckt.

Ergebnisse und Diskussion

Präzision der Methode auf Partigen-Platten Messung

Beim Vergleich der Messungen zwischen Meß-Mikro- skop, -Lupe und-Schablone im t-Test für Paardifferenzen konnten signifikante Meßwertunterschiede gefunden werden. Sie waren für die Quadrate der bestimmten Durchmesser deutlicher als bei Berücksichtigung der errechneten Konzentrationen. In einer weiteren Ver- suchsanordnung wurde die individuelle Meßstreuung bei der Auswertung einer Partigen-Platte von 5 Ver- suchspersonen untersucht. Die Variationskoeffizienten schwankten bei Bestimmung des Durchmesserquadrats zwischen 1,4 und 4,4%, bei Berücksichtigung der anhand der jeweiligen Regressionsgeraden bestimmten Konzentrationen jedoch nur zwischen 0,3 und 2,1%.

Regressionsgerade

Ein Maß für die Genauigkeit, mit der die zur Aus- wertung verwandten Standardpunkte um die Re- gressionsgerade streuen, ist die Größe des Korre- lationskoeffizienten r. Er sollte mindestens einen Wert von > 0,95, besser aber von > 0,98 betragen. Als weiterer Parameter zur Beurteilung der Regressions- geraden beachten wir neben dem sy.x-Wert den Grad der Konzentrationsabweichung vom vorgegebenen Standardwert, wenn man die nicht an die Regressions- gerade angepaßten gemessenen Flächenwerte der Stan- dardpunkte zur Konzentrationsberechnung verwendet.

Je größer der Wert von r, desto geringer ist die Ab- weichung vom erwarteten Konzentrationswert.

Vergleich der Regressionsgeraden mehrerer Partigen-Platten Es wurde untersucht, ob die für eine Partigen-Platte berechnete Regressionsgerade auch für andere Hatten des gleichen Proteins verwendbar ist. Dazu wurden die Eichgeraden für 10 Serumproteine von insgesamt 881 einfachen 20 M- und 152 Tri-Partigen-Platten mit einem Korrelationskoeffizienten über 0,95 auf die Streuung ihrer Kennwerte A (Ordinatfenabschnitt) und B (Steigung) verglichen.

Es ließ sich zeigen, daß die Streuung um den Mittelwert von A extrem hoch liegt, während sie für die Steigung B deutlich geringer, aber ausgeprägt bestand (Vari-

Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. / 1. Jahrg. 1973 / Heft 12

Lamer/, Fatch-Moghadam u. Knedcl: Zur quantitativen immunologischen Bestimmung von Scrumprolcincn

495

Tab. 2

Vergleich von 6 AuBWcrtungsverfahren der einfachen radialen Immunodlffueion nach MANCINI. Mittelwert (R), Standardabwcichung is) und Variationskoeffizient (V%) von Mehrfachbestlmmungen bei Auswertung derselben Partigenplatte nach Verfahren a, b, c, d und u f eiche Text).

* signifikante Unterschiede der Varianzen (s*) zur Varianz der Methode c. Konzentration in 10 ' g/1 Protein a b c d e 1*0

n -6 IßA n -6 n ·~5IgM Albumin n -4

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ationskoeffizient V zwischen 9,6 und 75%). Berück- sichtigt man nur die Platten gleicher Charge, (9 Serum- proteine, insgesamt 16 Chargen) ändert sich das Ausmaß der Streuung der A-Werte kaum, während die Streuung der Steigungen B deutlich abnimmt (V zwischen 6,3 und 24,8%). Aus diesen Untersuchungen folgt, daß für jede einzelne Partigen-Platte eine eigene Rcgressions- gerade ermittelt werden muß.

Vergleich verschiedener Aunverteverfabren

Fünf unterschiedliche Auswerteverfahren wurden mit- einander verglichen (Tab. 2):

a) Messung des Durchmessers mit Meß-Schablone und grafische Auswertung

b) Messung des Durchmessers mit Meß-Mikroskop und grafische Auswertung

c) Messung des Durchmessers mit Meß-Mikroskop und Konzcntrationsberechnung mit Computer (y:

Durchmesser)

d) Messung des Durchmessers mit Mcß-Mikroskop und Konzentrationsberechnung mit Computer (y:

Quadrat des Durchmessers)

c) Messung des Durchmessers mit Meß-Mikroskop und Konzentrationsberechnung mit Computer nach dem eigenen Verfahren (y : Präzipitatsfläche).

Nach Tabelle 2 nimmt bei Vergleich von Mchrfach- bestimmungen die Streuung bzw. der Variations- kocffizient von a nach e in der Regel ab. Die Zahlen mit Sternchen weisen auf einen signifikanten Unter- schied zur Methode e hin.

Eigenes Auswerteverfahren

Zur Bestimmung der Präzision der Methode bei An- wendung des eigenen Auswertcverfahrens wurden die Konzentrationen aus Mehrfachbestimmungen von Stan-

dardserum-Verdünnungen für 10 Scrumprotcinc in 3 — 4 Konzentrationen von 470 Partigen-Plattcn (312 einfachen, 138 Tri-, 20 M-Partigcn) mit einem Korrc- lationskocffizientcn von 0,98 und größer miteinander verglichen (Tab. 3). Dabei zeigte sich, daß die Streuung der Mittelwerte mit zunehmender Verdünnung an- steigt. Die Gesamt-Variationskoeffizienten aller Stan- dardserum-Vcrdünnungen nach Rückrechnung auf die Ausgangskonzentration schwankten für die unter- suchten Proteine zwischen 2,4% (Transferrin) und 7,1% (IgG). Die berechneten Mittelwerte selbst weichen kaum von den erwarteten Werten ab.

A u s w e r t u n g auf Tripartigcnplatten

Die seit einiger Zeit im Handel befindlichen Tripartigen- Plattcn verfügen über einen größeren Antikörpergchalt und erlauben die Einfüllung größerer Volumina (5 \).

Nach Angabe der Hersteller sollen sie für normale IgA- und IgM-Spiegcl mit unverdünntem sowie für normale IgG-Spicgel mit 1:10 verdünntem Serum beschickt werden können.

Ein wichtiger Vorteil für Routine-Untersuchungen ist, daß laut Angabe der Hersteller auf die Erstellung einer Eichgcraden verzichtet werden kann, da wegen des standardisierten Antikörpcrgehalts sowie präziser Rc- produzierbarkeit von Antigen-Reservoir und Schicht- dicke anhand einer mitgegebenen Konversionstabelle direkt von jedem beliebigen Durchmesscrquadrat des Prazipitats auf die zugehörige Konzentration ge- schlossen werden kann. Die Überprüfung der Brauch- barkeit der einzelnen Platten ist heute durch Verwen- dung von Präzisions- und Richtigkeitskontrollsercn möglich. Für besonders exakte Bestimmungen sind aber auch für die Tripartigen-Pktten Standard-Tmmun- globuline für je drei verschiedene Konzentrationen erhältlich.

2. Klin. Chcm. Kim. Biochcm. / 11. Jahrg. 1973 / Heft 12

496 Lamcrz, Fatch-Moghadam u. Knedel: Zur quantitativen immunologischen Bestimmung von Serumproteinen Tab. 3

Präzision der einfachen radialen lmmunodiffusion nach MANCINI auf Partigenplatten (Fa. Behringwerke) aus Mehrfachbestimmungen von Stan- dardprotein-Lösungen in 3—4 Konzentrationen. Unter unv. wurden die Konzentrationen sämtlicher Standardverdünnungen auf die unverdünnte Ausgangskonzentration zurückgerechnet und gemittelt. (Ausnahme: *Tripartigeri-IgG-IgA, -IgM und Haptoglobin-M-Partigen). Mittelwert x,

Standardabweichung s, Variations-Koeffizient V. Konzentrationen in l O-2 g/l Protein

IgG

IgA

IgM

Albumin

«2-Haptoglobin

.sa-Haptoglobin*' '»

IgG*

Coeruloplasmin

«i-Antitrypsin

'2-Makroglobulin

Transferrin

0,A-Globulin

IgA*

IgM*

N 128

34 34 26 34 104 26 26 26 26 129 34 34 27 34 30 10 10 10 147 38 36 36 36 20 20 20 99 36 20 27 16 136 35 31 35 35 62 17 17 15 13 -77 21 18 19 19 90 22 2321 24 280 73 72 71 64 51 51 49 51 50 51

Verdünnung unv.

:20 :30 :40 unv.:50 :3 :5 :8 :10 unv.

1:2 1:4 1:6 1:8 unv.

-1:1001:80 1:150 unv.

1:3 1:5 1:101:15

unv.

unv.unv.

unv.

I.:IO 1:15 1:20 1:40unv»

unv, 1:2

!:3 1:4unv, 1:4 1:6 1:8 1:10unv.

1:2 1:4 1:6 1:8 unv.

1:81:10 1:12 1:15unv.

1:2 1:5 1:8 1:10unv.

unv.unv.

unv.unv.

unv.

Erwarteter Wert 645

32,321,5 16,112,9 11538,3 2314,4 11,5 60 30 15 10 7,5 267033,4

26,7 17,8 175

58,3 35 17,511,6 266 136 68 1290 129 86 64,5 32,322 22

11 7,5 5,5 160

40 26,6 20 16 125 62,5 31,320,1 15,6 265

26,533,1 22,1 7517,6 37,5 15

9,4 7,5 322 173 68 258 135 46

Gefunden 641,8 32,221,8 16,012,6 115,2

38,5 22,6 14,611,6 59,7 29,815,6 10,1 2670,77,1 27,633,1 174,317,4 58,434,9 17,5 266,2,5 135,6 1292,268,3 129,4 85,1 33,164,3 22,022,0 11,2 7,3 5,4 160

40,126,3 20,1 124,816,2 31,162,5 20,515,9 264,7 33,1 26,821,6 17,8 74,737,4 15,4 9,6 325,87,0 164,0 259,273,3 132,2 47,6

S

• 45,35 0,63 1,451,22 '4,771,24 0,46 0,581,17 0,52 3,87 0,290,92 0,420,56 107,1

0,811,15 0,517,66 0,731,60 0,85 0,660,88 2,51 44,521,65 2,471,13 2,511,78 0,970,15 0,490,30 0,344,69 0,35 0,890,65 0,54 5,340,33 1,201,02 6,370,90 0,260,63 0,610,39 4,780,21 0,610,61 0,562,13 2,975,08 2,225,33 3,06

V[%]

7,1 1,9 ' ' 6,7 7,6 9,8 4,1 5,21,2 4,0 4,5 6,5 1,0 5,9 4,2 7,9 4,0 2,5 4,2 2,9 4,4 4,61,2 4,8 5,7 0,3 1,9 2,4 3,4 0,9 2,9 3,9 5,4 4,4 0,7 4,4 4,1 6,3 2,9 0,9 3,4 3,2 3,3 4,3 0,5 3,9 5,0 5,7 2,4 0,8 2,3 2,8 2,2 6,4 . 0,6 4,0 6,4 8,0 0,7 3,1 ..

4,1 0,9 . 4,0 6,4

Wir untersuchten 4 IgG-, IgA- und IgM

:

Tripartigen- Platten mit einer Standard-Protein-Verdünnungsreihe und verglichen die berechneten Regressionsgeraden mit den Geradengleichungen der vorgegebenen Eichkurven

bzw. -tabellen. Ein Beispiel der grafischen Darstellung

der Auswertung einer IgG-Tripartigen-Platte zeigt

Abbildung 3. Für IgG und IgM ließ ^sich eine gute

Übereinstimmung unserer Regressionsgleichungen mit

Z. Klin. Chem. Klin. Biochem./ll. Jahrg. 1973 / Heft 12

Lamerz, Fateh-Moghadam u. Knedel: Zur quantitativen immunologischen Bestimmung von Serumproteinen 497

10 -

IgG [mg7100 ml]200 ³⁰⁰ Abb. 3

Grafische Darstellung der Standardgeraden einer IgG-Tripartigen- platte (OP-Nr. 886, Fa. B eh ringwerke). Bestimmung der Präzipitat- flächen verschiedener Standardserum-Verdünnungen in Abhängigkeit

von der Diffusionszeit.

Vorgegebene Regressionsgerade ( ) y = 3,90-1-0,389 Berechnete Regressionsgerade (- ) y = 2,16+0,463 x;

r = 0,997

Senkrechte Linie = Bereich der Übereinstimmung der Regres- sionsgleichungen

Auswertung auf M-Partigen-Platten

In Anlehnung an die Tripartigen-Platten sind seit kurzem M-Partigen-Platten auch für die übrigen Serum- proteine im Handel. Als Beispiel untersuchten wir ein Kollektiv von 20 Haptoglobin-M-Partigen-Platten und fanden besonders niedrige Variationskoeffizienten des A- (24,6%) und B-Wertes (8,5%) sowie für die Dreifach- Standards (Tab. 3, zwischen 0,3 und 2,4%).

Auswertung auf Immuno-Plates

Wir konnten feststellen, daß das von uns entwickelte Auswerteprogramm sich auch hervorragend zur Aus- wertung von Immunodiffusionsplatten (Immuno-Plate) eignet. Ein Beispiel für die grafische Darstellung der aus den Regressionsgeraden von 3—4 Platten er-

•mittelten Gesamt-Regressionsgeraden für die Immun- globuline IgG, IgA und IgM zeigt Abbildung 4.

Wir untersuchten auf je 2—6 Immunopiates für 8 ver- schiedene Serumproteine die Standardseren der Fa.

Hyland und Fa. Behringwerke (Standard-Humanserum stabilisiert) und bestimmten für jede Platte die aufgrund der Hyland- bzw. Behringwerke-Standardkonzentration ermittelte Standard-Regressionsgerade. Mittelwert, Streuung und Variationskoeffizient der A- und B-Werte sowie die Gleichung der Gesamt-Regressionsgerade mit Korrelations-Koeffizient und Streuung sy.x gehen aus Tabelle 4 hervor. Außerdem sind in der letzten Spalte noch die Maximal-Ab weichungen der aufgrund der Standard-Regressionsgeraden ermittelten unter- suchten Standard-Konzentrationen von den angege- benen Konzentrationswerten aufgeführt. Der Tabelle ist zu entnehmen, daß die Streuungen der A-Werte (Ordinatenabschnitt) oft sehr groß sind und zwischen 3,7% und 121% (VK) schwanken, während die Va- riationskoeffizienten der B-Werte (Steigung) nur

den vorgegebenen in einem Konzentrationsbereich von 10-120 mg/100 ml (IgG) und 10-100 mg/100 ml (IgM) feststellen. Für IgA zeigten die 4 untersuchten Platten eine stärkere Streuung der Steigungen B.

Wir bestimmten auf 50 IgG-, 51 IgA- und 51 IgM-Tri- partigen-Platten eigene Regressionsgeraden mit einem Standard-Humanserum (IgG) bzw. einem Dreifach- Tripartigen-Standard (Standard Immunglobulin für IgA- bzw. IgM-Standard). Dabei lagen die Variations- Koeffizienten der -Werte zwischen 30 und 70%, die der B-Werte (Steigung) zwischen 9,6 und 21,1%.

Unter Berücksichtigung der Platten gleicher Charge (N zwischen 21 und 26) zeigte sich keine wesentliche Änderung der Streuung beider Parameter. Aufgrund der Untersuchungen empfiehlt es sich, auch für Tri- partigen-Platten Immunglobulin-Standards zur Her- stellung einer Eichgeraden zu verwenden, wenn es auf größere Genauigkeit ankommt. Die Präzision der Methode für Tripartigen-Platten geht aus Tabelle 3 -hervor. Danach beträgt die Gesamt-Streuung für die untersuchten IgG-Tripartigen-Platten 3,4% (V), für die IgA-Platten steigt sie bis 4,1%, für IgM bis 6,4% an.

Jl

§3_ivl

*o

*2 1

>IgG

:gM

0,1 1.0 2.0 3.0

Immunglobulin [log mg /100ml) ^4.0

Abb. 4

Grafische Darstellung der Gesamt-Standardgeraden (lineare Gesamt- Regressionsgerade) für je 4 bzw. 3 Immunopiates (I « O, II = A, I I I = O, IV « A) zur Bestimmung der Immunglobuline IgM,

IgA und IgG

Auswertung nach der Methode von FAHEY IgA: y ^3 ,7 x — 1,5; syx - 0,104 r = 0,997 (n = 4) IgG: y «l .7 + 2,7; Syx = 0,051 r = 0,997 (n = 3) IgM: y «1,9 + 1,4; SyX » 0,109 r = 0,988 (n = 4)

Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. / 11. Jahrg. 1973 / Heft 12 65

498

Laraerz, Fateh-Moghadam u. Knedel: Zur quantitativen immunologischen Bestimmung von Serumproteinen

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zwischen 1,5% und 8,9% streuen. Die aus bis zu 6 Einzelgeraden ermittelten Gesamtregressionsgeraden wiesen eine sehr gute Korrektion (0,9788—0,9968) und relativ kleine Streuungen auf (s

y

.

x

zwischen 0,063 und 0,169).

Vergleich ^wischen Behring- und Hyland-Standards

a) Bestimmung auf Immuno-Plajtes

Wie aus der letzten Spalte der Tabelle 4 hervorgeht, konnten bei der Bestimmung der Standards eines Her- stellers unter Verwendung der Standards des anderen Herstellers als Standardserum betr chtliche Abwei- chungen vom Nennwert festgestellt werden. Die Extremabweichungen von den vorgegebenen Konzen- trationen der untersuchten Standards waren am st rksten ausgepr gt bei Albumin, i

A

-Globulin, IgM, w hrend sie am geringsten bei #

2

-Makroglobulin, Transferrin, IgG und IgA ausfielen.

b) Bestimmung auf Partigen-Platten

In einer weiteren Untersuchung wurden die Hylarid- Standardkonzentrationen der einzelnen Proteine auf entsprechenden Partigen-Platten der Fa. Behringwerke bestimmt. Als Standard-Konzentration zur Bestimmung der Standard-Konzentrationsgeraden diente Standard- Humanserum stabilisiert der gleichen Firma (Tab. 5).

Wie die Tabelle zeigt, sind die Abweichungen der be- stimmten Konzentrationen von dem vorgegebenen Hyland-Standard f r Albumin stark wechselsinnig schwankend, f r IgM am st rksten positiv ( ber + 50%), f r Coeruloplasmin und /?

1A

-Globulin etwa gleicherma en stark negativ (um ^35%), f r IgA weniger ausgepr gt negativ, w hrend sie f r Trans- ferrin, /x

2

-Makrpglobulin und IgG am geringsten sind

(um ±15%).

Aus dieser Zusammenstellung ist zu entnehmen, da man die mit den beiden Plattentypen bestimmten Serumproteinkonzentrationen nicht ohne weiteres mit- einander vergleichen kann. Die gefundenen Unter- schiede beruhen aufgrund unserer Untersuchungen nicht auf methodischen Fehlern, sondern sind einwand- frei auf die nicht vergleichbaren Konzentrationsan- gaben f r die Standards beider Herstellerfirmen zu- r ckzuf hren.

Transformationen

Wir haben deshalb untersucht, ob sich aufgrund der vergleichenden Untersuchungen f r beide Immuno- diffusionsplattentypen und die verschiedenen Stan- dards eine lineare Beziehung zwischen den jeweils bestimmten Standard-Konzentrationen (gefundener Wert = y) und den angegebenen Konzentrations- Werten (Soll-Wert = x) herstellen l t. Eine solche Beziehung m te sinngem auch auf* Analysen- L sungen bertragbar sein. Die so erhaltenen linearen Regressionsgeraden-Gleichungen sind zusammen mit den zugeh rigen Korrelations-Koeffiziepten und Streu- ungen s

y

.

x

sowie unter Angabe der Anzahl der benutzten

Z, Klin. Chem. Klin. Biochem. /11. Jahrg. 1973 / Heft 12

Lamcrz, Fateh-Mogbadara u. Knedel: Zur quantitativen immunologischen Bestimmung von Serumproteinen

499

Tab. 5

Konzentrationsbestimmung der Standards von Immunopiates (Fa. Hyland) auf Partigenpiatten (Fa. Behringwerke) unter Verwendung von Standards der Fa. Behringwerke (Standard-Humanserum stabilisiert) aus Mehrfachbestimmungen (Anzahl N). Zusammenstellung der jeweiligen angegebenen Konzentrationen der Standards der Fa. Hyland sowie der bestimmten gemlttelten Konzentration (*) mit Standard-Abweichung (s) und Variationskoeffizienten (VK), ferner Angabe der Abweichung der bestimmten gemittelten Konzentrationswerte von den angegebenen

Konzentrationen. Konzentrationen in 10-· g/l. »gleiche Untersuchungen mit einem Richtigkelts-Kontrollserum der Fa. Behringwerke Protein

Albumin Coeruloplasmin

,-Makroglobulin 0iA-Globulin Transferrin IgO IgA IgM

Bezugsgröße Standard/Abweichung

*±sn / V K Standard/Abweichung

K±s n / V K Standard/Abweichung

xrfcs n / V K Standard/Abweichung

x±s n / V K Standard/Abweichung

XdbS

n / V K . Standard/Abweichung

x±s n / V K Standard/Abweichung

X±s n / V K Standard/Abweichung

*±s n / V K

Standard 1 (18)— 25,40/0 13,4 ±0,38

2/2,8%

(9,5)— 37,2%

6,0 ±0,02 2/0,3%

(65)— 15,6%

54,9 ±0,55 3/1,0%

(60)— 38,9%

36,6 ±0,36 3 / 1,0%

(80)4-2,5%

82,0 ±1,08 3/1,3%

(280)4-6%

296,7 ±1,7 2/0,6%

(60)-4,8%

57,1 ±0,41 2 / 0 , 7 % (18)4-85,5%

33,4 ±0,48 2 / 1,4%

Standard II (65)+8,6%

70,6 ±0,73 2 / 1,0%

(24)-31,2%

16,5 ±1,21 2/7,3%

(190)— 2,0%

186,2 ±0,80 2/0,4%

(185)— 37,4%

115,9 ±0,12 2 / 0,1 % (240)— 7,2%

222,8 ±2,90 2/1,3%

(1000)— 4,7%

953,0 ±22,4 2 / 2 , 4 % (200)— 19,6%

160,9 ±1,08 2 / 0 , 7 % (58)4-76,1%

102,1 ±2,09 2 / 2 , 1 %

Standard I I I (285)4-41,4%

402,9 ±0,78 2 / 0 , 2 %

(390)— 1,7%

383,5 ±2,71 3/0,7%

(360)— 39,1 % 219,4±7,03

3/3,2%

(440)4-13,9%

500,9 ±3, 16 3/0,6%

(2000)— 12,3%

1753,6 ±17,7 2 / 1 % (400)— 22,2%

311,3±2,10 2 / 0 , 7 % (130)4-51,7%

197,2 ±1,15 2 / 0 , 6 %

Standard IV (710)4-54,2%

1095,2 ±18,87 2 / 1,7%

(1250)*— 3,7%

1204,1 ±54,5 2 / 4 , 5 % (285)*4-3,4%

294,6 ±9,9 2 / 3 , 4 % ( 5)*— 6,2%

107,9 1

Tab. 6

Transformation zwischen Standard-Konzentrationen der Fa. Behring (Partigenplatten, Standard-Humanserum stabilisiert) und der Fa. Hyland (Immunopiates) bei der einfachen radialen Immunodiffusion. Beispiel: Albumin-Hyland-Standard mit Konzentrationswert 1000 · 10~2 g/l läßt

im Mittel auf einer Partigenplatte unter Verwendung des Behring-Standards einen Wert (erwarteter = gefundener Wert) von y = 1,57 · 1000—28,38 (10~* g/l) erwarten. P gemittelter Koordinatenpunkt (x, y) zur Ermittlung der linearen Regressionsgeraden Verwendete Platten

und Standards Partigen-Platten Standard Behring y: Gefunden für Hyland x: Sollwert Hyland Immunopiates Standard Hyland y: Gefunden für Behring x: Sollwert Behring

Verwendete Platten und Standards Partigen-Platten Standard Hyland y: Gefunden für Behring

"x: Sollwert Hyland Immunopiates Standard Hyland y: Gefunden für Behring x: Sollwert Behring

Albumin y=l,57x— 28,38

r =0,9996 (3 P.) syx = 17,218

y =0,87x+32,68 r =0,9999 (4 P.) syx =5,21 7

IgG y =0,90x4- 48,52

r =0,9965 (6 P.) Syx =66,285

«,-MakrogIobuIin y = I,01x— 8,70 r =0,9998 (3 P.)

Syx =4,051

y = l, 10x4-4,43 r =0,9999 (3 P.)

Syx«l,104

IgA y =0,72x4- 6,86

r =0,9930 (6 P.) syx = 14,903

y=0,96x— 4,0 r =0,9994 (3 P.>

syx =4,624

Transferrin y = l,17x— 28,61

r =0,9924 (3 P.) syx =37,174

y = l,21x— 20,53 r =0,9998 syx =3,277

IgM y = 1,45x4- 11 ,63

r =0,9975 (3 P.) syx =8,225

y=0,57x— 7,10 r =0,9963 (3 P.) Syx =2,778

jffiA-GlobuIin y =0,61x4- 1,36

r =0,9998 (3 P.) syx =2,526

y = l,46x-f 9,63 r =0,9982

Syx = 3,440

Coeruloplasmin

y =0,96x4- 3,83 r =0,9948 (3 P.)

Syx = 1,060

Wertepaare (x; y) in Tabelle 6 zusammengestellt. Alle Geraden besitzen einen Korrelations-Koeffizienten von über 0,99. Die Geradenstreuungen sind unterschiedlich groß und schwanken zwischen 1,060 und in einem extremen Fall 66,285 (IgG).

Aufgrund der gefundenen Werte lassen sich anhand der Tabelle für die einzelnen Proteine und Plattentypen sowie bei Verwendung der einzelnen Standards die zu erwartenden Konzentrationen mit einer oft erheblichen Schwankungsbreite abschätzen.

2. Klin. Chem. Klin. Biochem. / 11. Jahrg. 1973 / Heft 12 _65*

500 Lamerz, Fateh-Moghadam u. Knedel: Zur quantitativen immunologischen Bestimmung von Serumproteinen

Literatur

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Dr. R. Lamerz ,

Priv. Doz. Dr. A. Fateh-Moghadam

1. Medizinische Klinik der Universität München 8000 München 2

Ziemssenstr. l a

Priv. Doz. Dr. M. Knedel

Klinisch-Chemisches Institut am Stadt. Krankenhaus München-Harlaching

8000 München 90 Sanatoriumsplatz 2

Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. / 11. Jahrg. 1973 / Heft 12