(Prof. Dr. med. L. Trümper)
der Medizinischen Fakultät der Universität Göttingen
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Die Bedeutung der Modulation der Exosomensekretion durch den ABC-Transporter A3 für die intrinsische
Zytostatikaresistenz von aggressiven B-Zell-Lymphomen
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INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät der Georg-August-Universität zu Göttingen
vorgelegt von
Thiha Aung
aus
Taungoo (Myanmar)
Göttingen 2020
Dekan: Prof. Dr. med. W. Brück
Betreuungsausschuss
Betreuer/in: Prof. Dr. med. G. G. Wulf Ko-Betreuer/in: Prof. Dr. med. M. Oppermann
Prüfungskommission
Referent/in: Prof. Dr. med. G. G. Wulf Ko-Referent/in: Prof. Dr. med. M. Oppermann
Datum der mündlichen Prüfung: 10. Juni 2020
Hiermit erkläre ich, die Dissertation mit dem Titel "Die Bedeutung der Modulation der Exosomensekretion durch den ABC-Transporter A3 für die intrinsische Zytostatikaresistenz von aggressiven B-Zell-Lymphomen“ eigenständig angefertigt, und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet zu haben.
Göttingen, den ……… ………
(Unterschrift)
Die Daten, auf denen die vorliegende Arbeit basiert, wurden publiziert in:
Aung T, Chapuy B, Vogel D, Wenzel D, Oppermann M, Lahmann M, Weinhage T, Menck K, Hupfeld T, Koch R, et al. (2011): Exosomal evasion of humoral immunotherapy in aggressive B-cell lymphoma modulated by ATP-binding cassette transporter A3. Proc Natl Acad Sci USA 108, 15336-15341
Koch R, Aung T, Vogel D, Chapuy B, Wenzel D, Becker S, Sinzig U, Venkataramani V, von Mach T, Jacob R, et al. (2016): Nuclear Trapping through Inhibition of Exosomal Export by Indomethacin Increases Cytostatic Efficacy of Doxorubicin and Pixantrone.
Clin Cancer Res 22, 395-404
I
Tabellenverzeichnis ... III Abkürzungsverzeichnis ... IV
1. Einleitung ... 1
1.1. Diffuse großzellige B-Zell-Lymphome – Pathogenese und Therapieoptionen ... 1
1.2. Exosomen – Entstehung und Funktion ... 2
1.3. ABC-Transporter und Multidrogenresistenz ... 3
1.4. Hypothesen und Zielsetzung ... 4
2. Material, Methoden und Patientenproben ... 5
2.1. Material ... 5
2.2. Methoden ... 13
2.3. Patientenproben ... 17
3. Ergebnisse ... 18
3.1. Die Bedeutung der Modulation der Exosomensekretion durch den ABC-Transporter A3 für die intrinsische Zytostatikaresistenz von aggressiven B-Zell-Lymphomen 18 3.1.1. Bindung des Anti-CD20-Antikörpers an Exosomen von B-Zell-Lymphomzellen ... 18
3.1.2. Absorption des Anti-CD20-Antikörpers Rituximab und Verbrauch von Komplementfaktoren an Exosomen von B-Zell-Lymphomen in vitro und in vivo. . 21
3.1.3. Effekte von Exosomen auf die Rituximab-vermittelte komplementinduzierte Zelllyse ... 24
3.1.4. Rituximab stimuliert die Lymphomzellen durch Abschnürung TCC-beladener Exosomen ... 25
3.1.5. Inhibition des ABC-Transporters A3 und der Exosomenbildung durch Rapamycin, Indometacin und U18666A ... 28
3.1.6. Bedeutung von ABCA3 für die Freisetzung von Exosomen ... 30
3.2. Erhöhung der Wirksamkeit der Zytostatika Doxorubicin und Pixantron durch Inhibition des exosomalen Exports (nuclear trapping) ... 33
4. Diskussion ... 38
4.1. Die Bedeutung von Exosomen für die intrinsische Zytostatikaresistenz von aggressiven B-Zell-Lymphomen ... 38
4.2. Erhöhung der Wirksamkeit der Zytostatika von Doxorubicin und Pixantron durch Inhibition des exosomalen Exports im 3D-in-vivo-Tumor-Modell ... 41
5. Zusammenfassung ... 43
6. Literaturverzeichnis ... 44
II
Abb. 1: Charakteristiken der Patienten. ... 17 Abb. 2: Bindung des therapeutisch wirksamen, monoklonalen Anti-CD20-Antikörpers an
Exosomen von B-Zell-Lymphomzellen. ... 20 Abb. 3: Absorption des Anti-CD20-Antikörpers Rituximab und Verbrauch von
Komplementfaktoren an Exosomen von B-Zell-Lymphomen in vitro und in vivo. . 23 Abb. 4: Rituximab-vermittelte komplementinduzierte Zelllyse kann durch die Bildung von
Exosomen verhindert werden. ... 25 Abb. 5: Rituximab stimuliert die Lymphomzellen durch Abschnürung TCC-beladener
Exosomen. ... 27 Abb. 6: Rapamycin, Indometacin und U18666A führen durch Inhibition des ABC-
Transporters A3 zur Hemmung der Abschnürung der Exosomenbildung und damit zu einer verstärkten CDC-Aktivität. ... 29 Abb. 7: Bedeutung von ABCA3 für die Freisetzung von Exosomen und Anti-CD20-
vermittelte komplementabhängige Zytolyse. ... 32 Abb. 8: CAM-Model ... 34 Abb. 9: Indometacin steigert die Wirksamkeit von Doxorubicin und Pixantron in vivo. ... 35 Abb. 10: Indometacin Behandlung verstärkt sowohl den Verbleib von Doxorubicin im
Tumor als auch die medikamentinduzierte Gewebeverformung und verschiebt Doxorubicin (DXR) aus dem Zytoplasma in den Zellkern. ... 36 Abb. 11: Indometacin Behandlung verstärkt den zellulären Verbleib von Pixantron im
Tumor und verschiebt Pixantron aus dem Zytoplasma in den Zellkern. ... 37 Abb. 12: Übersicht der Interaktion zwischen DLBCL-Zellen, Exosomen, ABCA3 und Rituximab………..42
III
Tabelle 1: Geräte ... 5
Tabelle 2: EDV ... 7
Tabelle 3: Verbrauchsmaterialien ... 7
Tabelle 4: Chemikalien... 7
Tabelle 5: Enzyme ... 10
Tabelle 6: Kits ... 10
Tabelle 7: Primärantikörper ... 11
Tabelle 8: Sekundärantikörper ... 11
Tabelle 9: Zelllinien ... 11
Tabelle 10: Kulturmedien für Zellkultur ... 12
Tabelle 11: Vektoren und Plasmide ... 12
Tabelle 12: shRNA-Sequenzen ... 14
IV
ABC-Transporter ATP-Binding-Cassette-Transporter
ABCA3 ATP-Binding-Cassette Subfamily A Member 3 ADCC Antibody-dependent Cell-mediated Cytotoxicity B-NHL B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome
CAM Chicken Chorioallantoic Membrane CD Cluster of Differentiation
CDC Complement-dependent Cytotoxicity
DXR Doxorubicin
FACS Fluorescence-activated Cell Sorting MAC Membrane Attack Complex
MVB Multivesicular Body shRNA Short-hairpin RNA
TCC Terminal Complement Complex
1
1. Einleitung
1.1. Diffuse großzellige B-Zell-Lymphome – Pathogenese und Therapieoptionen
Das diffuse großzellige B-Zell-Lymphom (diffuse large B-cell lymphoma, (DLBCL)) zählt zu den aggressiven Lymphomen (Beham-Schmid 2017; Grimm und O'Malley 2019). Es handelt sich um das weltweit am häufigsten vorkommende Non-Hodgkin-Lymphom, das bei männlichen Patienten vermehrt auftritt. Das durchschnittliche Alter der betroffenen Patienten liegt bei ca. 64 Jahren. Die Mehrheit der Patienten mit DLBCL kann durch die aktuellen Immuntherapien gut therapiert werden (Coiffier et al. 2002; Keating 2010;
McLaughlin 1999), jedoch ist die Prognose für Patienten mit primär resistenten oder rezidivierenden Lymphomen häufig sehr schlecht (Gisselbrecht 2008; Pfreundschuh et al. 2014; Glass et al. 2017; Zou et al. 2019). Die Kombination aus Rituximab, Cyclophosphamid, Doxorubicin, Vincristin und Prednisolon (R-CHOP) stellt das Gerüst des Behandlungsschemas dar. Durch die Hemmung der Topoisomerase II im Zellkern der Tumore tragen Anthrazykline, wie z. B. Doxorubicin, zur zytostatischen Effizienz bei (Shipp et al. 1995). Aus der Gruppe der Aza-Anthracendione führt Pixantron, ein Inhibitor der Topoisomerase II, zu einer zytostatischen Wirkung mit im Vergleich zu anderen Anthrazyklinen reduzierter Kardiotoxizität (Papadatos-Pastos und Pettengell 2013;
Pettengell et al. 2012).
Der Anti-CD20-Antikörper Rituximab war der erste monoklonale Antikörper, der bei malignen B-Zell-Lymphomen eine hohe klinische Effizienz gezeigt hat und somit zum Standard der humoralen Immuntherapie bei dieser Erkrankung wurde (Maloney et al.
1994). Rituximab übt seine zytolytischen Effekte nach Bindung an das B-Lymphozyten- Antigen CD20 aus, indem es (i) die Apoptose induziert, (ii) komplementabhängige Zytolyse (CDC) auslöst und (iii) zur antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC) führt (Manches et al. 2003). Dabei variieren die unterschiedlichen Beiträge zur Zytotoxizität in Abhängigkeit von der B-Zell-Lymphomentität. Dabei erfordert die Initiation der Zytolyse immer die Bindung des Antikörpers an die Zelloberfläche des Tumors.
Kürzlich wurde beschrieben, dass GA101/Obinutuzumab, der Nachfolger des Rituximabs, eine höhere Effektivität in ADCC zeigt und einen größeren direkten Apoptose-Effekt über Calcium-vermittelte Signalwege bei B-Zell-Lymphomen ausübt.
Jedoch weist der Antikörper einen schwächeren CDC-Effekt verglichen mit Rituximab auf (Latour et al. 2019; Tobinai et al. 2017).
2
1.2. Exosomen – Entstehung und Funktion
Im Jahr 1987 wurde der Begriff der Exosomen in der Literatur geprägt (Johnstone et al.
1987). Exosomen sind Vesikel endosomalen Ursprungs, die Transferrin beinhalten und entstehen, wenn Retikulozyten zu Erythrozyten reifen (Pan und Johnstone 1983). Der Transferrin-Rezeptor ist an der Plasmamembran von Retikulozyten lokalisiert und wird bei deren Reifung zu Erythrozyten in Form von Exosomen aus der Zelle ausgeschieden.
Bei Exosomen handelt es sich um extrazelluläre, sekretorische Vesikel mit einer charakteristischen Morphologie im Elektronenmikroskop, einer Größe von ca. 50-100 nm und einer Dichte von ca. 1,15 g/ml in der Sucrose-Dichtegradientenzentrifugation (Thery et al. 2002). Exosomen können durch Ultrazentrifugation bei 100.000 x g präpariert werden. Die Exosomen entstehen aus multivesikulären Körperchen (Multivesicular Bodies (MVB)) im späten endosomalen Kompartiment. Sie werden durch Fusion von MVB mit der Plasmamembran in den Extrazellulärraum freigesetzt (Stoorvogel et al.
2002). Exosomen werden in einer Vielzahl von unterschiedlichen Zellarten freigesetzt.
Unter physiologischen Bedingungen werden Exosomen sowohl von erythroiden Progenitorzellen während der Zellreifung hämatopoetischer Progenitorzellen als auch von B-Lymphozyten und dendritischen Zellen freigesetzt. Exosomen wurden auch in den Überständen von verschiedenen Tumorzelllinien nachgewiesen, u. a. in der T- Lymphoblasten-Zelllinie Jurkat.
Prinzipiell können Exosomen Proteine, Lipide und (micro)RNAs enthalten (Colombo et al. 2014; Valadi et al. 2007). Exosomen exprimieren häufig Tetraspanine (u.a. CD9, CD63, CD81 und CD82), die von Bedeutung für lokale Inflammationsprozesse und Metastasierung sind. Zu den biologischen Funktionen von Exosomen, die von Tumoren stammen, zählen Immunsuppression, Stimulation der Angiogenese und Modulation des Tumorstromas (Andreola et al. 2002; Liu et al. 2006; Bobrie et al. 2012; Osaki et al.
2019). Weiterhin können Exosomen durch lokale Immunsuppression prä-metastatische Tumor-Nischen einleiten (Peinado et al. 2012; Osaki et al. 2019). Tumoren können über Exosomen eine Interaktion mit dem Immunsystem herstellen; da Exosomen Antigene präsentieren können, sind sie von großer Bedeutung bei der Induktion und Aufrechterhaltung der Tumorimmunität (Whiteside 2017).
Die Freisetzung von Exosomen trägt möglicherweise auch zu den Resistenzmechanismen von Medikamenten bei. Tumorzellen können einige Medikamente, wie z. B. Anthrazykline, nach Aufnahme in die Zelle in subzelluläre Kompartimente sequestrieren. Von dort wurde ein vesikulärer Transportweg, der über
3
Exosomen zum Export der Zytostatika führt, beschrieben (Chapuy et al. 2008; Chapuy et al. 2009)(Safaei et al. 2005).
Obwohl Exosomen bereits vor 40 Jahren erstmals beschrieben wurden, hat das Verständnis über die biologische Bedeutung und mögliche Einsatzgebiete von Exosomen in der Medizin in den letzten Jahren deutlich zugenommen. So gab es in den letzten Jahren Überlegungen zur möglichen klinischen Anwendung von Exosomen, u.a.
bei der Liquid Diagnostic, bei der Körperflüssigkeiten wie Blut für diagnostische Zwecke analysiert werden (Osaki et al. 2019). Auch Exosomen, die von Tumorzellen stammen, wurden erfolgreich in der Diagnostik von Kolonkarzinom eingesetzt, um im Blut vorkommende Exosomen, die von Kolonkarzinom-Zellen abstammen, zu detektieren (Yoshioaka et al. 2014).
1.3. ABC-Transporter und Multidrogenresistenz
Die ABC(ATP-Binding-Cassette)-Transporter gehören zu den primär aktiven Transportern und zeichnen sich durch eine katalytische Einheit, welche ATP binden kann, aus, weshalb sie auch als membranständige ATPasen bezeichnet werden. Die dadurch freisetzbare Energie wird in den aktiven Transport von Lipiden, Aminosäuren, Vitaminen, Ionen sowie Xenobiotika umgesetzt (Dean et al. 2001). Anhand der Substratbindungsspezifität werden den ABC-Transportern unterschiedliche Funktionen zugeordnet und sie werden in sieben Untergruppen (ABC A-G) klassifiziert (Kaminski et al. 2006). Sie erfüllen unterschiedliche Funktionen in epithelialen Zellen, Stromazellen und Parenchymzellen. Während sie im Immunsystem bei der Antigenpräsentation mitbeteiligt sind, sorgen sie im Nervensystem für die Lipidhomöostase. Beim Menschen wurden Mutationen in den ABC-Transporter-Genen beschrieben, die beispielweise Zystische Fibrose oder Adrenoleukodystrophie hervorrufen.
Nach der initialen Entdeckung der Mitglieder ABCA1 und ABCA2 der ABC-Transporter- Familie wurde 1996 ein drittes homologes Protein, bezeichnet als ABCA3, beschrieben:
Die Arbeitsgruppe von Klugbauer und Hofmann klonierte ABCA3 aus einer human medullären Schilddrüsenkarzinom-Zelllinie. Aufgrund der Homologie mit ABCC1 und ABCB1 wurde eine Bedeutung von ABCA3 für Zytostatikaresistenz postuliert (Klugbauer und Hofmann 1996). Yamano et al. (2001) wiesen die Lokalisation von ABCA3 auf Chromosom 16p13.3 nach und klonierten daraus das 190 kDa große Protein. (Yamano et al. 2001).
In der normalen Physiologie wird ABCA3 in der Lunge, im Gehirn und im Pankreas exprimiert und ist für den Lipidtransport zuständig (Hallman 2004; Kaminski et al. 2006;
Klugbauer und Hofmann 1996). Ultrastruktur-Untersuchungen zeigten, dass ABCA3 in
4
der Lunge ausschließlich in Lamellar Bodies von Alveolar-Typ-II-Pneumozyten exprimiert ist (Yamano et al. 2001). Die Hauptfunktion von ABCA3 in Melanosomen und Lamellar Bodies ist der Transport von Phospholipiden und Cholesterol (Hallman 2004;
Mulugeta et al. 2002; Raposo und Marks 2007; Yamano et al. 2001).
Die subzelluläre Sequestrierung bestimmter Chemotherapeutika, die damit verbundene Detoxifikation, Chemoresistenz sowie das Therapieansprechen und das Gesamtüberleben korrelierte in der akuten myeloischen Leukämie mit dem Expressionsniveau von ABCA3 (Chapuy et al. 2008; Hirschmann-Jax et al. 2005;
Hirschmann-Jax et al. 2004; Norwood et al. 2004; Steinbach et al. 2006; Wulf et al.
2001).
1.4. Hypothesen und Zielsetzung
Um die Therapie von Patienten mit aggressiven B-Zell-Lymphomen zu verbessern, ist es wichtig, die Resistenzmechanismen gegen therapeutische Antikörper und vesikulär transportierte Zytostatika zu verstehen. Die vorliegende Arbeit sollte daher Rolle von Exosomen in der Resistenz von Lymphomzellen gegenüber humoraler Immunchemotherapie adressieren.
Die daraus abgeleiteten Fragen der Arbeit waren:
1) Bilden B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome Exosomen?
2) Welche Rolle spielt das Komplementsystem im Zusammenhang mit der Antikörpertherapie und Exosomenbildung?
3) Welche Rolle spielen ABC-Transporter in der Biogenese und Funktion sekretorischer Vesikel?
4) Zur Inhibition der Biogenese und der Ausschüttung sekretorischer Vesikel als therapeutisches Prinzip: Ermöglicht die Inhibition des vesikulären Transports durch Hemmung der ABC-Transporter die Resistenz von Tumorzellen gegenüber Zytostatika zu durchbrechen?
5
2. Material, Methoden und Patientenproben
2.1. Material
2.1.1. Geräte Tabelle 1: Geräte
Art des Gerätes Firma
Absaugsystem EcoVac Schütt Labortechnik
Analysenwaage Sartorius, Göttingen
Casy Cell Counter® Schärfe System, Reutlingen
CO2-Inkubator HERA Cell Heraeus, Osterode CSC-Kamera, Intelligent Dark Box II FujiFilm, Düsseldorf
Dampfsterilisator Varioklav ® H.u.P. Labortechnik, Oberschleißheim
Laminiergerät Perkin Elmer, Rodgau-Jügesheim
Eismaschine ZIEGRA, Isernhagen
Elektrophorese-Apparaturen:
- Electrophoresis Power Supply (Consort EV202)
- Electrophoresis Power Supply (EPS 500/400)
- Elektrophoresis Power Supply (PowerPad Basis)
- Electrophoresis Power Supply (EPS 500/400) - für LDS/SDS-Gele, XCell SurelockTM - für Agarosegele
Invitrogen, Karlsruhe
Pharmacia Fine Chemicals, Schweden
BioRad, München
Pharmacia Fine Chemicals, Schweden Invitrogen, Karlsruhe
ELISA, Model iMark ELISA, Model 680
BioRad, München BioRad, München Flüssigkeitsszintillationszähler, Typ 1450
MicroBeta Trilux
PerkinElmer, Rodgau-Jügesheim
FACScan FACSCantoII Fujifilm LAS – 4000
Becton Dickinson, Heidelberg Becton Dickinson, Heidelberg Fujifilm, Düsseldorf
Gefrierschränke:
-80°C, -150°C -20°C
SANYO, Wiesloch Liebherr, Biberach Liebisch, Bielefeld
Heizblock Heraeus, Osterode
Heizofen Heidolph, Bremen
Horizontalrotierer, Rotamax 120 Janke & Kunkel, Staufen Magnetrührer IKA-COMBIMAG RCT Hamilton, Schweiz
6
Art des Gerätes Firma
Mikroskope:
- Axiovert 100 - LABOVERT FS - Standard 25
Zeiss, Oberkochen Leitz, Oberkochen Zeiss, Oberkochen
Mikrowellenherd AEG Micromat, Stockholm
Neubauer-Zählkammer, 0,0025mm² Brand Gläser, Wertheim
Nukleofektor TM II Amaxa AG, Köln
Pipetten:
- Einfach-Pipetten, 10µl, 200µl, 1000µl - Mehrkanal-Pipetten, 50µl, 300µl - Multipette, Combitips
- Multipipette Accu-jet ® pro
Eppendorf, Hamburg
Thermo Labsystems, Egelsbach Eppendorf, Hamburg
Brand, Wertheim Photometer, 8,5mm Lichtstrahlhöhe Eppendorf, Hamburg
pH-Meter, pH211 HANNA Instruments, Kehl am Rhein
Rotationsmischer 5432; 3300 Eppendorf, Hamburg Rotoren:
- VTI65.1 - TL-100.3 - SW-Ti 32
BECKMANN, München
Skalpell (11er, 15er, 21er) AESCULAP, Tuttlingen
Sterilbank HERA safe Heraeus, Osterode
Taqman-Reader 7500 HAT (ABI PRISM) Applied Biosystems
Tecan SLT Spectra Tecan Deutschland GmbH
Thermocycler T3000 Biometra, Göttingen
Trockenschrank Memmert, Schwabach
Vortex Genie 2 Scientific Industries
Wasserbad (250 V, 0,5 AMP-T) Köttermann, Hänningse
Wipptisch, SSL4 (Stuart) Barloworld Scientific, Staffordshire, UK Zentrifugen:
- Biofuge pico
- Multifuge 3, Aussschwingmotor - Tischzentrifuge Centrifuge 5415 D - Tabletop Ultrazentrifuge TL-100 - Ultrazentrifuge L80
- Zytospin-Zentrifuge
Heraeus, Osterode Heraeus, Osterode Eppendorf, Hamburg Beckmann, München Beckmann, München Shandon, Frankfurt
7 2.1.2. EDV
Tabelle 2: EDV
Programm Firma
Adobe Photoshop 7.0.1 Adobe Systems Inc, San Jose(USA)
AxioVision Zeiss, Oberkochen
Cell Quest Version 3.3 Cell Quest Pro 5.2
Flowjo Pro Version 5.7.2 Tree Star Inc.
GraphPad Prism 5.03 für Windows
Becton Dickinson
Becton Dickinson, Heidelberg Tree star Inc, Ashland (USA)
GraphPad Software, San Diego California (USA)
ImageReader LAS 4000 Pro V 2.1 ImageJ 1.41
FujiFilm, Düsseldorf
W.Rasband, National Institut of Health (USA)
MAC OS 9 Apple Macintosh, USA
Microplate Manager 2.6 BioRad, München
Office XP Microsoft, Redmond, USA
SDS 2.1 Applied Biosystems, USA
Windows 7 Microsoft, Redmond,USA
2.1.3. Verbrauchsmaterialen Tabelle 3: Verbrauchsmaterialien
Material Firma
Ampuwa ® Fresenius Kabi, Bad Homburg
Deckgläschen, rund, Ø 1cm Menzel Gläser, Braunschweig
Eindrückstopfen Sarstedt, Braunschweig
Einfrierboxen Nalgene, Herford, UK
Einmalkanülen:
- BD Microlance 0,45x13mm; 26G1/2 - mit Lanzettenschliff, 2x70mm
Becton Dickinson, Heidelberg
EHRHARDT Söhne GmBH, Geislingen Einmalspritzen:
- Omnifix ® 10ml, Schraubverschluss - Omnifix ® 1ml/40i.U. Insulinspritze
Braun, Melsungen Braun, Melsungen Gewebekulturflaschen, 25cm², 75cm²,
175cm²
Sarstedt, Braunschweig
8
Material Firma
Gewebekulturschalen:
- Ø 35mm - Ø 10cm - Ø 15cm
greiner bio-one, Nürtingen Sarstedt, Braunschweig greiner bio-one, Nürtingen Multi-Well-Platten:
- 6-Well-Platte - 24-Well-Platte
- 96-Well-Platte (Rund-, Flachboden) - 386-Well-Platte
greiner bio-one, Nürtingen Becton Dickinson, Heidelberg Sarstedt, Braunschweig Abgene, Hamburg Nitrozellulosemembran, HybondTM-c extra,
0,2µM
Amersham-Buchler, Braunschweig
Objektträger, 76x26mm, Mattrand Knittel Gläser, Braunschweig
Parafilm ® American National CanTM, Chicago
Pipetten:
- Pasteurpipetten, 230mm
- Serologische Pipetten, 5ml, 10ml, 25ml
Brand, Wertheim Sarstedt, Braunschweig - Pipettenspitzen 10µl, 200µl, 1000µl Sarstedt, Braunschweig - Reaktionsgefäße, 0,5ml, 2ml Eppendorf, Hamburg Röhrchen:
- Für Casy® 18-ml-Röhrchen
- Für FACS-Analysen 5-ml-Röhrchen - Polystyrol-Rundbodenröhrchen 5ml - Für Ultrazentrifuge Polycarbonat- Zentrifugenröhrchen, 2ml
Zentrifugenröhrchen, 15ml Zentrifugenröhrchen, 30ml - Kryoröhrchen, 1,8ml
- Sterile Plastikröhrchen, 15ml, 50ml
Sarstedt, Braunschweig Sarstedt, Braunschweig Becton Dickinson, Heidelberg Beckmann, München
Nalgene, Herford, UK Sarstedt, Braunschweig Serologische Pipetten, 5ml, 10ml, 25ml Sarstedt, Braunschweig
Sterifilter Sarstedt, Braunschweig
Szintillationsflüssigkeit PerkinElmer, Rodgau-Jügesheim
Zellschaber; 25mm Sarstedt, Braunschweig
Zellsieb; 70µm Becton Dickinson, Heidelberg
Zellsieb: 0,25 Becton Dickinson, Heidelberg
9 2.1.4. Chemikalien
Tabelle 4: Chemikalien
Substanz Firma
Agar Sigma, Deisenhofen
Amilorid Sigma, Steinheim
Bromphenolblau BioRad, München
Calciumchlorid (CaCl2) Merck, Darmstadt
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck, Darmstadt Dithiothreitol (DTT, 0,1M) Invitrogen, Karlsruhe
dNTP Mix (2,5mM) Invitrogen, Karlsruhe
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma, Deisenhofen
FACSFlowTM Becton Dickinson, Heidelberg
Glycin Roth, Karlsruhe
Imidazol Merck, Darmstadt
Indometacin Sigma, Steinheim
Isopropanol J.T.Baker, Griesheim
LB Broth Base Invitrogen, Karlsruhe
Lade-Pufer (6x) peqlab, Erlangen
Magermilchpulver BioRad, München
Methanol J.T.Baker, Griesheim
MgCl2 Invitrogen, Karlsruhe
ß-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt
4-Nitrophenyl N-acetyl-ß-DGlucosaminid (ß-Hexosaminidase-Substrat)
Sigma, Deisenhofen
NuPAGE® Antioxidant Invitrogen, Karlsruhe
NuPAGE® LDS Sample Buffer (4x) Invitrogen, Karlsruhe NuPAGE® SDS Running Buffer Invitrogen, Karlsruhe NuPAGE® Transfer Buffer Invitrogen, Karlsruhe NuPAGE® 4-12% Bis-Tris Gel Invitrogen, Karlsruhe
Rapamycin LC Laboratories, Woburn, USA
RNAse-Free DNAse Set QIAGEN, Hilden
RNase Out™ (5.000 U, 40 U/μl) U18666A
Invitrogen, Karlsruhe Sigma, Steinheim
10
Substanz Firma
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Merck, Darmstadt
TritonX-100 Merck, Darmstadt
Trizma® Acetat Sigma, Deisenhofen
Trypan-Blau (0,4%) Sigma, Deisenhofen
Trypsin/EDTA, 0,05% Invitrogen, Karlsruhe
Tween® 20, SigmaUltra Sigma, Deisenhofen
Universal Agarose peqlab, Erlangen
2.1.5. Enzyme Tabelle 5: Enzyme
Name des Enzyms Firma
Superscript™ II RT (10.000 U; 200 U/μl) Invitrogen, Karlsruhe Taq-DNA Polymerase (500 U, 5 U/μl) Invitrogen, Karlsruhe
2.1.6. Fertige Kits zur Bearbeitung von RNA, DNA und Proteinen Tabelle 6: Kits
Name des Kits Firma
Dako REAL™ Detection System Dako, Hamburg
DC Protein Assay BioRad, München
ECL™ Western Blotting Detection Reagents Amersham-Buchler, Braunschweig
SYBR® Green Kit QIAGEN, Hilden
QIAprep® Spin Midiprep Kit QIAGEN, Hilden QIAprep® Spin Miniprep Kit (250) QIAGEN, Hilden
QIAprep® Maxiprep Kit QIAGEN, Hilden
Rneasy® Mini Kit QIAGEN, Hilden
Cellline Nucleofector Kit V Amaxa AG, Köln
11 2.1.7. Primärantikörper
Tabelle 7: Primärantikörper Antigen,
Bezeichnung des AK
Spezies Verdünnung Herkunft/Referenz
WB IF
CD20 (Klon: 2H7) Maus 1:1000 1:50 BD Pharmingen CD46 (Klon: E4.3) Maus 1:1000 1:50 BD Pharmingen CD55 (Klon: IA10) Maus 1:1000 1.50 BD Pharmingen CD59 (Klon: p282) Maus 1:1000 1:50 BD Pharmingen CD63 (Klon: H5C6) Maus 1:1000 1:50 BD Pharmingen CD9 (Klon: M-L13) Maus 1:1000 1:50 BD Pharmingen
Flotillin-2 (Klon: 29) Maus 1:1000 1:50 BD Tansduction Laboratories
GAPDH Maus 1:10000 Sigma Aldrich
2.1.8. Sekundärantikörper Tabelle 8: Sekundärantikörper
Konjugat Spezies Verdünnung Herkunft/Referenz
WB II
HRP-Konjugat Ziege anti Maus 1:10000 Santa Cruz, CA, USA
2.1.9. Eukaryotische Zelllinien Tabelle 9: Zelllinien
Zelllinie Charakteristika Herkunft Referenz
Balm3 DLBCL B.Glass Lok et al. 1979
HEK293T Humane Nierenzelllinie Cheong et al. 2006 Graham et al. 1977 Cheong et al. 2006 HEK293-
ABCA3/eGFP
Humane Nierenzelllinie mit stabiler ABCA3-Expression
Cheong et al. 2006 Cheong et al. 2006
HEK293A Humane Nierenzelllinie zur Produktion des Adenovirus Ad5F35
CLONTECH Graham et al. 1977 Aiello et al. 1979
HL-60 Zelllinie einer myeloischen
Leukämie
DSMZ, Braunschweig
SuDHL4 DLBCL DSMZ,
Braunschweig
Epstein et al. 1976
OCI Ly1 DLBCL Dana Farber
Cancer Institute
12 2.1.10. Kulturmedien für die Zellkultur Tabelle 10: Kulturmedien für Zellkultur
Zelllinie Medium Firma
HEK293 DMEM (1x), 1% L-Glut,
1% Pen/Strep, 10% FCS
Invitrogen, Karlsruhe
HEK293-ABCA3/eGFP DMEM (1x), 1% L-Glut,
1% Pen/Strep, 10% FCS, 100µg/ml G418
Invitrogen, Karlsruhe
HEK293A DMEM (1x), 1% L-Glut,
1% Pen/Strep, 10% FCS
Invitrogen, Karlsruhe
HL-60, Balm-3, SU-DHL-4 RPMI-1640 (1x), 1% L-Glut, 1% Pen/Strep, 10% FCS
Biochrom AG, Berlin
OCI-Ly-1 IMDM 1640 (1x), 1% L-Glut,
1% Pen/Strep, 10% FCS
Invitrogen, Karlsruhe
2.1.11. Vektoren und Plasmide Tabelle 11: Vektoren und Plasmide
Name Bezugsquelle
pEGFP-N1+ABCA3 Cheong et al. 2006
pLKO.1-puro Open Biosystems, Lafayette, USA
pLKO.1-GFP Addgene, Boston, USA
pMD.G-VSV-G Addgene, Boston, USA
pCMV-dR8.91 Addgene, Boston, USA
13
2.2. Methoden
2.2.1. Präparation und Quantifizierung von Exosomen
Die Präparation der Exosomen erfolgte mittels differentieller Zentrifugation nach Standardprotokollen (Valadi et al. 2007). Nachdem 5 x 107 Lymphomzellen für 48 h in exosomenfreiem Medium inkubiert worden waren, wurden die Zellen und größere Zellreste durch Zentrifugation (10 min, 500 x g, 4°C) entfernt. Der Überstand wurde erneut zentrifugiert (20 min, 10,000 x g, 4 °C; Beckman L8-55 Ultrazentrifuge, Rotor Ti32), um die Partikel mittlerer Größe zu entfernen. Anschließend wurde der Überstand filtriert und zentrifugiert (240 min, 120,000 x g, 4 °C; Beckman L8-55 Ultrazentrifuge, rRotor Ti32), um ein Exosomen-Pellet zu bekommen, das in PBS gewaschen und in 50 µl PBS resuspendiert wurde. Die Quantifizierung der Exosomen erfolgte durch Bestimmung des Gesamtproteins (Bio-Rad DC Protein Assay) und die Western BlotAnalyse mit Detektion von Flotillin-2 und CD63 im Vergleich zu Kontroll-Exosomen- Präparationen (Savina et al. 2005) oder AChE-Aktivität (Safaei et al. 2005).
2.2.2. Durchflusszytometrie
Zur Detektion sowohl von membrangebundener als auch von intrazellulärer Fluoreszenz wurden Standard-Protokolle für die Durchflusszytometrie benutzt. FACS-Analysen von exosomalen Oberflächenproteinen wurden durchgeführt, nachdem die Exosomen an 4- µm-Aldehyd/Sulfat Latex-Beads gekoppelt worden waren (Testa et al. 2010). Für die Fluoreszenz-Analyse von CAM-Lymphomzellen wurden die CAM-Lymphome homogenisiert, in PBS gewaschen und mit FITC-markierten anti-humanen CD20- Antikörpern (monoklonal, abcam ab46895) gefärbt. CD20-positive Zellen wurden sortiert und deren Doxorubin- oder Pixantron-Fluoreszenz analysiert. Die von Doxorubicin abgegebene Fluoreszenz nach Anregung bei 351 nm wurde bei 560 nm detektiert, die von Pixantron wurde nach Anregung bei 650 nm bei 670 nm detektiert.
2.2.3. Komplement-Analyse und Rituximab-Messungen
Um Rituximab im Medium und in Serumproben von Patienten zu detektieren und zu quantifizieren, wurde ein ELISA mit dem anti-idiotypischen, monoklonalen Antikörper MB2A4 benutzt (Andreola et al. 2002). MB2A4 wurde mit einer Konzentration von 5 µg/ml mit Coating-Puffer in 96-Well-Platten versetzt, blockiert, gewaschen, und verdünnte Rituximab-beinhaltende Proben wurden für 90 min zugegeben. Nach dem Waschen wurden die Wells mit anti-humaner Fc-Meerrettich-Peroxidase für 60 min inkubiert, bevor erneut gewaschen wurde und die Substratlösung 3,3′,5,5′-
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Tetramethylbenzidin (TMB) hinzugegeben wurde. Das Produkt wurde in einem Mikroplatten-Lesegerät bei 450/540 nm gemessen. Der Hintergrund des Mediums oder der Serumproben vor Zugabe von Rituximab wurde abgezogen; Standard- Verdünnungsreihen von Rituximab wurden parallel durchgeführt, um die Quantifizierung von Rituximab zu ermöglichen. Um CDC zu messen, wurde Rituxmab zu den Lymphomzellen in komplettem Medium mit Zusatz von humanem Serum hinzugefügt.
Nach 24 h bei 37°C wurde die Zellviabilität mittels MTT-Färbung in Triplikaten bestimmt.
Der Effekt auf die Viabilität wurde als Verhältnis der Werte der behandelten vs. der nichtbehandelten Proben ausgedrückt, d. h.: spezifische Viabilität = 100 x Absorption mit Antikörper-Behandlung / Absorption der unbehandelten Kontrolle. Um die Komplement- Dekomposition von C3 im Überstand der Exosomen (gekoppelt an Beads) zu messen, wurde der monoklonale Antikörper I3/I5 in 96-Well-Medisorp-Platten (NUNC, Medisorp, Thermo Fisher Scientific) aufgebracht, blockiert und gewaschen. Anschließend wurde ein entsprechend verdünnter Überstand des Exosomen-Bead-Komplexes für 60 min zur Platte hinzugefügt, gewaschen und mit dem Anti-C3d-Antikörper für 60 min inkubiert.
Schließlich wurde der anti-FC, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, für 60 min hinzugefügt, gewaschen und das TMB-Substrat hinzugegeben. Zymosan (Sigma) wurde als Positivkontrolle für maximale Komplement-Fixierung verwendet und die Hinzugabe von Beads ohne Exosomen diente als Negativkontrolle.
2.2.4. Lentivirale Transfektion mittels shRNA / Knockdown von ABCA3 mittels shRNA
Für den Knockdown von ABCA3 wurden zwei spezifische shRNA-Sequenzen benutzt, die in den pLKO.1-eGF-Vektor (Addgene) umkloniert wurden:
Tabelle 12: shRNA-Sequenzen
Primer TRC Klon ID TRCN0000059338:
shABCA3.38
TRC Klon ID
TRCN0000059339:
shABCA3.39 Forward-
Primer 5‘-3‘
CCGG(GCCCAGCTCATTGGGAAAT TT)CTCGAG(AAATTTCCCAATGA- GCTGGGC)TTTTTG
CCGGGCCCAGCTCATTGGG AAATTTCTCGAGAAATTTCC CAATGAGCTGGGCTTTTTG Reverse-
Primer 5‘-3‘
AATTCAAAAA(AAATTTCCCAATGA GCTGGGC)CTCGAG(GCCCAGCTC ATTG-GGAAATTT)
AATTCAAAAAGCCCAGCTCA TTGGGAAATTTCTCGAGAAA TTTCCC AATGAGCTGGGC
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Davon wurden lentivirale Partikel in HEK293-T-Zellen mit dem pCMV-∆R8.91- Plasmid und dem pMD.G-Plasmid hergestellt. Zur verstärkten Expression von ABCA3 in Lymphomzellen wurden die Plasmide pEGFP-N1-ABCA3 wt bzw. pEGFP-N1-ABCA3 N568D (Mutante mit einer Mutation in der ATP-Bindungsstelle des Transporters) benutzt. 5 x 106 Zellen in 180 µl OptiMEM (Gibco-BRL) wurden gemischt und in ein vorgekühltes Reaktionsgefäß (1,5 ml) mit 30 µg pEGFP-N1-ABCA3 wt oder pEGFP-N1- ABCA3 N568D überführt. Insgesamt wurden 100 μl der Zellen/Plasmid-Mischung in einer vorgekühlten Elektroporationsküvette elektroporiert (Multiporator, Eppendorf) (1200 V, 100 μs) und schließlich in 2 ml Wachstumsmedium über Nacht inkubiert. Für die Selektion wurden alle drei Tage 800 mg/L G418 ins Wachstumsmedium gegeben.
2.2.5. MTT-Viabilitätsassay
Die Viabilität der Zellen wurde unter Verwendung des 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid-MTT-Assays (Farbtestverfahren) untersucht. Bei MTT handelt es sich um einen membrangängigen, gelben Farbstoff, der in lebenden Zellen durch Dehydrogenasen im Mitochondrium metabolisiert wird, wodurch sich blaue MTT- Formazan-Kristalle bilden, die wasserunlöslich, nicht mehr membrangängig, sind. Diese Kristalle reichern sich in proliferierenden Zellen an; die Anzahl der blauen Kristalle ist direkt proportional zu der Anzahl an proliferierenden Zellen. Zur Durchführung des MTT- Assays wurden die Zellen als Triplikate in 96-Well-Platten in einer Dichte von 1 x 105 Zellen/Well ausgesät und mit den angegebenen Konzentrationen des spezifischen Reagenzes und einer DMSO-Kontrolle behandelt und anschließend bei 37°C inkubiert.
24 h danach wurde MTT in PBS zum Zellkulturvolumen von 100 µL dazugegeben, um eine finale Konzentration von 0,5 mg/ml zu erreichen. Nach 4 h Inkubation wurden die suspendierten Zellen abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 33 % DMSO und 5 % Ameisensäure aufgelöst. Die Lichtabsorption wurde im Tecan Plattenphotometer gemessen. Die Effekte auf die Viabilität der Zellen wurden als Verhältnis der Werte von behandelten vs. unbehandelten Proben ausgedrückt; IC50
wurde bestimmt als Konzentration, die zur 50 % Inhibition des Zellwachstums führte, verglichen mit der unbehandelten Kontrolle.
2.2.6. Konfokale Mikroskopie
Zur Durchführung der konfokalen Mikroskopie wurden die Zellen mit 3,7 % Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur fixiert. Zum Blockieren unspezifischer Bindungen wurde 50 mM NH4Cl für 15 min verwendet und zur Permeabilisierung 0,05 % Triton X-100 in PBS für 15 min. Die primären Antikörper wurden 1:100 in PBS verdünnt
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und für 1 h inkubiert. Nach zweimaligem Waschen in PBS und Inkubation in 10 % Ziegenserum wurden die primären Antikörper mittels der sekundären Antikörper (1:500 in PBS) visualisiert. Die Proben wurden in Fluoromount (DAKO) eingedeckelt und mit dem TCS-2 AOBS konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Leica) analysiert.
2.2.7. TIRF Mikroskopie
Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) wurde an einem Leica AM TIRF MC Setup (Leica LAS AF Software) durchgeführt. Die Zellen befanden sich zum Mikroskopieren in einer Zellkulturschale mit Glasboden (WillCo dish®, 0,17 mm dünn) und waren mit einem Deckgläschen abgedeckt.
2.2.8. CAM-Assay
Zur Vorbereitung des CAM (Chorionallantoismembran)-Assays wurden befruchtete Eier in einen Hühnereier-Brutschrank (Humidität 80 %, Temperatur 37°C) bei stündlicher Rotation inkubiert. Am 3. Tag wurde die Eihülle mechanisch mit einer Feile oder mit Hilfe eines Kugelfräsers geöffnet (Fenstergröße ca. 1 cm x 1 cm). Die Schale wurde mit einer scharfen Pinzette vorsichtig angehoben und die obere Membran langsam abgehoben, so dass die Chorion-Allantois-Membran sichtbar wurde. Die befruchteten Eier zeigten zu diesem Zeitpunkt vaskuläre Strukturen. Das geöffnete Fenster wurde mit weißem Pflasterverband (Cellotape) wieder verschlossen und die Eier wurden weiter im Brutschrank inkubiert. Nach weiteren 5 Tagen (8. Tag) wurden die Lymphomzelllinien SU-DHL-4, OCI-Ly1 oder OCI-Ly3 vorbereitet und in Matrigel vermischt, um ein Gel zu bilden, und anschließend auf die Chorion-Allantois-Membran aufgetragen. 2 x 106 SU- DHL-4 Lymphomzellen wurden in 50 µl Zellkulturmedium mit 50 ml vorgekühltem Matrigel gemischt und für 15 min bei 37°C inkubiert, um ein Gel zu bilden (Papoutsi et al. 2000). Anschließend wurden die Lymphome mit 1 ml 10 µmol/l Indometacin oder 1 ml PBS inkubiert. Mit Hilfe einer 32-Chariere-Nadel wurden entweder 50 µg Doxorubicin oder Pixantron in ein Blutgefäß, das die Chorionallantoismembran kreuzt, injiziert.
Danach wurde die Zugabe von Indometacin oder PBS wiederholt. Um die Effekte der medikamentösen Behandlung auf das Tumorwachstum zu beurteilen, wurden die Tumore am Ende des Experiments herausgeschnitten und gewogen.
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2.3. Patientenproben
Abb. 1: Charakteristiken der Patienten.
Es sind die Eigenschaften der männlichen (M) und weiblichen (F) Lymphompatienten [diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), immunocytoma (IC), follicular lymphoma (Fl), mantle cell lymphoma (MCL), marginal zone lymphoma (MZL)] zusammengefasst und die jeweilige persönliche Identifikationsnummer (PIN) angegeben. Alle Patienten waren im aktiven Stadium der Krankheit, das nach dem Ann Arbor Staging System (Stage) klassifiziert wird.
Der „international prognostic index” (IPI) zum Zeitpunkt der Blutabnahme ist angegeben. Das Anschlagen auf die Therapie wurde folgendermaßen klassifiziert: complete response (CR), complete response unconfirmed (CRu), partial response (PR), progressive disease (PD), Patienten mit andauernder Therapie (NA). Die Immunchemotherapie bestand aus Rituximab/Cyclophosphamid/Doxorubicin/Vincristin/
Prednisolon (R-CHOP), Rituximab/ Dexamethason/Ara-C/Cisplatin (R-DHAP), Rituximab/Fludarabin/ Cyclo-phosphamid (R-FC), Rituximab/Bendamustin (R-Bendamustin) oder allogener Stammzell-transplantation (Allo tx). Abb. übersetzt aus Aung et al., 2011 (mit freundlicher Genehmigung von PNAS).
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3. Ergebnisse
3.1. Die Bedeutung der Modulation der Exosomensekretion durch den ABC- Transporter A3 für die intrinsische Zytostatikaresistenz von aggressiven B- Zell-Lymphomen
3.1.1. Bindung des Anti-CD20-Antikörpers an Exosomen von B-Zell- Lymphomzellen
Der Nachweis der Exosomenbildung erfolgte über mikroskopische und proteinbiochemische Verfahren. Um die Exosomenbildung von B-Zell- Lymphomzelllinien zu untersuchen, wurden mikrovesikuläre Strukturen durch differentielle Ultrazentrifugationsschritte aus den Zellkulturüberständen gewonnen.
Diese mikrovesikulären Strukturen wiesen die typische Morphologie und Größe von Exosomen auf (Abb. 2A). Mittels Goldpartikelfärbung in der Elektronenmikroskopie, die mit Unterstützung von Dr. Dirk Wenzel am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen durch durchgeführt wurde, ließ sich die Bindung des Anti-CD20- Antikörpers Rituximab, der mit Protein-A-Immunogoldpartikeln markiert war, auf den Exosomen nachweisen. Dazu wurde das Pellet nach den Ultrazentrifugationsschritten in PBS resuspendiert und anschließend eingebettet.
Für den Nachweis auf Ebene von exosomalen Markerproteinen wurden die durch die verschiedenen Ultrazentrifugationsschritte gewonnenen Exosomen in Lysispuffer aufgenommen; eine Verdünnungsreihe der Exosomen (beginnend bei 50 µg bis zu 10 µg Protein) wurde im Western Blot analysiert (Abb. 2B). Zunächst wurde die Bindung von Rituximab an die exosomalen Proteine mittels des anti-Idiotyp monoklonalen Antikörpers gegen Rituximab (MB2A4) gezeigt. Es ließen sich die typischen Exosomenmarker (Alix, Flotillin-2) detektieren. CD20, welches Rituximab bindet, wurde ebenfalls deutlich nachgewiesen.
In Abb. 2C sind die Ergebnisse einer FACS-Analyse dargestellt, wobei die Exosomen an Beads gekoppelt wurden. Dabei ließen sich CD20, Flotillin-2, die Tetraspanine (CD9 und CD63) sowie Rituximab und GA101 im FITC-Kanal nachweisen.
In weiteren FACS-Analysen wurden bei SU-DHL-4-, Balm-3- und OCl-Ly1- Lymphomzelllinien die Expression von CD20 sowie die Expression der Komplement- Regulatorproteine (CRPs: CD46, CD55, CD59) nachgewiesen (Abb. 2D). In den von allen drei Lymphomzelllinien gebildeten Exosomen, die an Beads gekoppelt waren, ließ
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sich CD20 Expression nachweisen. Ebenso waren die CRPs auf den Exosomen hochreguliert. Bei Su-DHL-4 und OCL-Ly-1 Zellen war die Expression von CRPs bei den Exosomen deutlich höher als bei den Zellen.
Zusammenfassend zeigen die in Abb. 2 dargestellten Ergebnisse, dass Lymphomzellen Exosomen bilden, auf denen sich das Antigen CD20 und Tetraspanine befinden, die auch als Exosomenmarker benutzt werden; Rituximab bindet über das auf den Exosomen vorhandene CD20 bzw. CRPs an Exosomen.
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Abb. 2: Bindung des Anti-CD20-Antikörpers an Exosomen von B-Zell-Lymphomzellen.
(A) Mikrovesikuläre Strukturen von typischer Größe und Morphologie von Exosomen der B-Zell- Lymphomzelllinie Balm-3 wurden mittels differentieller Ultrazentrifugation aus Zellkulturüberständen gewonnen. Die Exosomen zeigten Bindung des Anti-CD20-Antikörpers Rituximab, der mit Protein-A-Immunogoldpartikeln markiert worden war. Die Pfeilspitze stellt die Immunogold-Färbung dar (Maßstab, 100 nm.) (B) Bindung von Rituximab an die exosomalen Proteine – dargestellt mittels Western Blot unter Verwendung eines anti-Idiotyp monoklonalen Antikörpers gegen Rituximab (MB2A4). Parallel dazu wurden die typischen Exosomen-Marker, CD20, Alix und Flotillin-2m untersucht. (C) Die Bindung der therapeutisch wirksamen monoklonalen Antikörper Rituximab und GA101 sowie CD20, Flotillin-2, CD63 und CD9 wurde auch mittels FACS an aufgereinigten Exosomen (SU-DHL-4), die an Beads gekoppelt waren, dokumentiert. (D) CD20- und CRP- (CD46, grün; CD55, türkis; CD59, braun; Isotyp (isot.) Kontrolle, rot) positive Zellen und Exosomen, die an Beads gekoppelt waren, wurden mit fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern mittels FACS analysiert. Abb. übersetzt aus Aung et al., 2011 (mit freundlicher Genehmigung von PNAS).
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3.1.2. Absorption des Anti-CD20-Antikörpers Rituximab und Verbrauch von Komplementfaktoren an Exosomen von B-Zell-Lymphomen in vitro und in vivo.
Um zu untersuchen, ob Exosomen lösliches Rituximab „abfangen“ und dadurch weniger Rituximab bei den Tumor-/Lymphomzellen ankommt, wurde ein spezieller ELISA mit einem anti-idiotypischen MB2A4 Antikörper etabliert, mit dem man lösliches und exosomengebundes Rituximab nachweisen kann (Cragg et al. 2004; Hampson et al.
2010) (Abb. 3A). Dazu wurde ein konzentrationsabhängiger Effekt von Exosomen auf die Bindung von Rituximab unter Verwendung von SU-DHL-4-Zellen analysiert. Es zeigt sich, dass mit steigender Exosomenzahl (Exosomen von SU-DHL-4 Zellen an Beads gekoppelt) die lösliche Konzentration von Rituximab im Überstand abfällt. Somit fingen die Exosomen den größten Teil von Rituximab ab, so dass Rituximab dadurch die Ziel- Lymphomzellen weniger gut erreichte.
Außerdem wurde eine FACS-Analyse mit Verwendung des MB2A4-Antikörpers durchgeführt, um die Bindung von Rituximab an die Exosomen im Plasma von Patienten nachzuweisen (3h nach Ende der Rituximab-Infusion) (Abb. 3B). Daneben konnte unter Verwendung von Patientenplasma im ELISA gezeigt werden, dass der Hauptteil des Rituximabs an die Exosomen gebunden war und ein geringerer Anteil in löslicher Form vorlag (Abb. 3C).
Ziel des nächsten Experiments war die Detektion des Komplement-Verbrauchs (Abb.
3D). Um den Komplementverbrauch nachzuweisen, wurde ein ELISA entwickelt, bei dem das Komplementzerfallsprodukt Cd3 mittels eines polyklonalen Antikörpers (I3/15) detektiert wurde. Dieser Antikörper fängt Cd3 ab; je mehr Cd3 nachgewiesen wurde, desto höher war der Komplementverbrauch.
Dazu wurden die folgenden drei Kontrollen verwendet: Als Positivkontrolle wurde Zymosan benutzt, das maximalen Komplementverbrauch induzierte. Als Negativkontrolle wurden nur Beads (ohne Exosomen) verwendet, wobei auch hier ein geringer Komplementverbrauch stattfand (2. Balken). Eine weitere Negativkontrolle war das „leere Well“ (keine Beads, keine Exosomen) - da Komplement spontane Aktivität zeigt, war auch hier ein minimaler Komplementverbrauch zu sehen (3. Balken). Bei abfallender Konzentration von Beads (1 x105; 5 x104; 2,5 x104), gekoppelt an Exosomen, ließ sich immer weniger Komplementverbrauch nachweisen (4./5./6. Balken). Im Umkehrschluss zeigt sich, dass eine höhere Anzahl an Exosomen, gebunden an Beads, mit einem höheren Komplementverbrauch korrelierte.
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Um den terminalen Komplementkomplex (TCC) auf den Exosomen nachzuweisen, wurden die Beads, die mit Exosomen beladen worden waren, mit Rituximab in Gegenwart von aktivem humanen Serum inkubiert (Abb. 3E). Dabei zeigte sich in FACS- Analysen die Bildung des TCC auf den Exosomen, was sich durch den Anti-S5b9- Antikörpers nachweisen ließ (Balm-3, Su-DHL-4, OCl-Ly-1). Auch der Exosomenmarker Flotillin-2 konnte im FACS detektiert werden.
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Abb. 3: Absorption des Anti-CD20-Antikörpers Rituximab und Verbrauch von Komplementfaktoren an Exosomen von B-Zell-Lymphomen in vitro und in vivo.
(A) Exosomen von SU-DHL-4-Zellen wurden zum Medium gegeben, das mit Rituximab in einer initialen Konzentration von 35 ng/100 μl für 1 h bei 21 °C versetzt war. Lösliches Rituximab wurde mittels ELISA gemessen, die Mittelwerte von Triplikaten von einem repräsentativen Experiment sind als prozentualer Anteil der Kontrollgruppe (Beads, die nicht mit Exosomen gekoppelt wurden) dargestellt. Signifikanzen sind durch Sterne markiert (Mehrfach-ANOVA, Bonferroni- Post-Hoc-Test). (B) Exosomen aus dem Plasma von Patienten wurden 3 h nach Ende der Rituximab-Infusion präpariert und die Rituximab-Bindung wurde mittels eines spezifischen Antikörpers (MB2A4) und unter Verwendung von FACS detektiert. (C) Exosomen aus dem Plasma von vier Patienten wurden 3 h nach Ende der Rituximab-Infusion präpariert. Zur Quantifizierung von freiem versus exosomengebundenem Rituximab-Antikörper wurde dieser mittels ELISA gemessen. Rituximab, gebunden an Exosomen, ist in dunkelgrau dargestellt, lösliches Rituximab in hellgrau. (D) Um den Komplement-Verbrauch zu detektieren, wurden C3d- Konzentrationen mittels ELISA und Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers (I3/15) gemessen. Als Positivkontrolle dient Zymogen, als Negativkontrollen dienen sowohl Beads ohne Exosomen als auch spontaner Komplementverbrauch. Außerdem wurden drei unterschiedliche Konzentrationen an Beads, mit Exosomen gekoppelt, gemessen. Die Fehlerbalken stellen SD von Triplikaten eines repräsentativen Experiments dar (Mehrfach- ANOVA, Bonferroni-Post-Hoc-Test). (E) Beads, welche mit Exosomen beladen wurden, wurden mit 20 % humanem Serum mit Rituximab für 30 min inkubiert. Die Bildung des terminalen Komplementkomplexes (TCC) wurde unter Verwendung des primären Anti-SC5b-9- Antikörpers und des sekundären Antikörpers WI3/I5, gelabelt mit Phycoerythrin(PE), mittels FACS detektiert.
Als Kontrolle wurden Beads mit dem Exosomen-Marker Flotillin-2 gefärbt. Abb. übersetzt aus Aung et al., 2011 (mit freundlicher Genehmigung von PNAS).
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3.1.3. Effekte von Exosomen auf die Rituximab-vermittelte komplementinduzierte Zelllyse
Um einen möglichen protektiven Effekt von Exosomen zu untersuchen, wurde ein MTT- Viabilitäts-Assay mit 10 % aktivem humanen Serum durchgeführt. Dazu wurden OCl- Ly1-Lymphomzellen mit einer zunehmenden Anzahl an Exosomen (autolog) in Gegenwart von Rituximab inkubiert (Abb. 4A). In der Positivkontrolle, in Abwesenheit von sowohl Exosomen als auch Rituximab, zeigte sich die maximale Viabilität der Lymphomzellen (1. Balken). Bei Rituximab-Zugabe (ohne Anwesenheit von Exosomen) ließ sich ein deutlicher Effekt von Rituximab auf die Zellen, d.h. eine klare Abnahme der Viabilität der Zellen, nachweisen (2. Balken). Mit steigenden Konzentrationen von Exosomen (5, 10, 15 µg) wurde eine steigende Viabilität der Zellen im MTT-Assay erreicht (3./4./5. Balken).
Ziel des nächsten Experiments war es, den Effekt auf Zellviabilität bei steigenden Exosomenkonzentrationen (allogen, aus 3 Zelllinien) nachzuweisen (Abb. 4B). OCl-Ly- 1-Zellen wurden mit isolierten Exosomen aus den drei Lymphomzelllinien (OCl-Ly-1, Karpas 422, SU-DHL-4) inkubiert, um zu untersuchen, welche Exosomen die höchsten
„Abfangkapazitäten“ haben. Der MTT-Assay zeigte, dass bei steigender Exosomenkonzentration bei allen drei Zelllinien die Viabilität der Zellen stieg; dabei ließ sich die höchste Viabilität bei Zugabe von Exosomen von Karpas 422 und SU-DHL-4- Zellen nachweisen.
Darüber hinaus wurde Plasma (in An-/Abwesenheit von Exosomen) mit SU-DHL-4- Zellen (Abb. 4C) bzw. autologen Lymphomzellen (Abb. 4D) mit zunehmenden Konzentrationen von Rituximab inkubiert. Abb. 4C zeigt, dass die Viabilität der Zellen bei Depletion von Exosomen und steigender Rituximab-Konzentration (konstante Exosomenanzahl) deutlich abnahm (rote Kurve). Dagegen sank bei steigender Rituximab-Konzentration in Anwesenheit von Exosomen die Viabilität der Zellen deutlich weniger (schwarze Kurve).
Um den Effekt der Anwesenheit von Exosomen auf die Viabilität der Zellen nachzuweisen, wurde außerdem ein weiterer MTT-Assay mit Plasma (Verdünnungen von 1:2 bis zu 1:64) in An- bzw. Abwesenheit von Exosomen durchgeführt (Abb. 4D).
Die Ergebnisse zeigten, dass Zellen, die mit Plasma mit Anwesenheit von Exosomen behandelt wurden, besser überlebten. Bei der 1:2 bzw. 1:4 Verdünnung des Plasmas ließ sich eine signifikant höhere Viabilität der Zellen bei Anwesenheit von Exosomen im Vergleich zu Plasma ohne Exosomen nachweisen.
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Abb. 4: Effekte von Exosomen auf die Rituximab-vermittelte komplementinduzierte Zelllyse
(A, B) OCl-Ly1-Zellen werden mit steigender Konzentration von Exosomen (exo.) (autolog (A) bzw. allogen (B) und Rituximab (ritux.) inkubiert. Nach 1 h Inkubation bei 37°C wurde im MTT die Zellviabilität gemessen. Dargestellt sind repräsentative Beispiele von mindestens drei Replikaten mit SD-Werten (Two-way ANOVA, Bonferroni-Post-Hoc-Test). (C, D) Plasma (mit oder ohne Depletion von Exosomen) zusammen mit SU-DHL-4-Zellen (C) bzw. autologen Lymphomzellen (D) wurden mit steigender Konzentration von Rituximab behandelt. Dargestellt ist ein repräsentatives Beispiel von drei Replikaten. Signifikanzen wurden mittels Student’s T-Test berechnet. Abb. übersetzt aus Aung et al., 2011 (mit freundlicher Genehmigung von PNAS).
3.1.4. Rituximab stimuliert die Lymphomzellen durch Abschnürung TCC- beladener Exosomen
Um eine möglicherweise stärkere Exosomensekretion, die durch niedrige Rituximab- Konzentrationen stimuliert wurde, nachzuweisen, wurde eine AChE-Aktivitätsmessung durchgeführt (Abb. 5A). AChE befindet sich auf Exosomen. SU-DHL-4-Lymphomzellen wurden mit sublytischen Konzentrationen an Rituximab (22 bzw. 325 pM) in Anwesenheit von inaktivem oder aktivem 10 % Serum, d.h. Komplementsystem inaktiviert bzw. aktiv, inkubiert. Dabei zeigte sich eine signifikante Zunahme der AChE-Aktivität.
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Außerdem wurden die mit TCC-beladenen Exosomen in einer Verdünnungsreihe im Dot Blot mit sublytischen Konzentrationen an Rituximab analysiert (Abb. 5B). Die Dot Blot Ergebnisse zeigen, dass vermehrt Exosomen gebildet wurden, auf denen sich TCC befindet. Ebenso wurde auch vermehrt Komplement verbraucht und gebunden.
In Abb. 5C wurden die Dot Blot Ergebnisse densitometrisch quantifiziert. Bei steigender Konzentration von aktivem Serum mit vorhandenem Komplement nahm die Exosomenbildung zu – nachgewiesen anhand des Exosomenmarkers Flotillin-2.
Daneben zeigte sich, dass durch die Stimulation des aktiven humanen Serums auch mehr Exosomen (mit TCC beladen) detektiert wurden.
In weiteren Experimenten wurde der Effekt von ABCA3 auf die Menge der Exosomen- Bildung im Western Blot analysiert. Dazu wurden SU-DHL-4- bzw. OCl-Ly-1-Zellen verwendet, die WT-ABCA3 bzw. lentiviralen Knock-out von ABCA3 aufwiesen (Abb. 5D) und ohne bzw. mit sublytischen Konzentrationen an Rituximab behandelt wurden. Bei Gabe von sublytischen Konzentrationen an Rituximab zeigte sich sowohl bei WT- als auch bei den Lymphomzellen mit ABCA3-Knock-out eine Steigerung der Exosomenbildung. Dies konnte anhand der Exosomenmarker Flotillin-2 und CD63 nachgewiesen werden. Bei den Zellen mit Knock-out von ABCA3 ließ sich eine reduzierte Exosomenbildung im Vergleich zu den WT-Zellen nachweisen. In Zellen mit Knock-out von ABCA3 führte die anschließende Gabe sublytischer Konzentrationen von Rituximab wieder zu einem Anstieg der Exosomenbildung.
Mittels TIRF-Mikroskopie ließ sich eine Kolokalisation von TCC-Komplexen (grün) und Exosomen (rot) darstellen, wobei die Zellen mit dem Membranmarker PKH26 (rot) gefärbt waren (Abb. 5E).
Zusammenfassend zeigen die Daten in Abb. 5, dass sublytische Konzentrationen von Rituximab die Lymphomzellen zu einer stärkeren Exosomenbildung anregte und dies zu einer stärkeren Abschnürung TCC-beladener Exosomen führt.
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Abb. 5: Rituximab stimuliert die Lymphomzellen durch Abschnürung TCC-beladener Exosomen.
SU-DHL-4-Lymphomzellen wurden mit sublytischen Konzentrationen von Rituximab (22 und 325 pM) mit bzw. ohne aktives Komplementsystem inkubiert. Nach 24 h wurden die Exosomen geerntet. (A) Die geernteten Exosomen wurden mittels AChE-Aktivität gemessen (Mehrfach- ANOVA, Bonferroni-Post- Hoc-Test). (B) Entsprechend wurden die mit TCC beladenen Exosomen mittels Verdünnungsreihe im Dot-Blot für W13/15 gemessen. (C) Quantifizierung der Dot-Blot-Ergebnisse aus (B) mittels Densitrometrie. (D) Rituximab (325 pM) wurde zu SU-DHL-4 (WT bzw. ABCA3-knock out: lv shABCA.38) oder OCI-Ly1-Zellen gegeben. Exosomen wurden nach 48 h geerntet. Flottilin-2, CD63 und GAPDH wurden mittels Western Blot detektiert. Abb.
übersetzt aus Aung et al., 2011 (mit freundlicher Genehmigung von PNAS). (E) TIRF-Aufnahmen zeigen die Freisetzung von Exosomen von TCC aus Lymphomzellen.
E
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3.1.5. Inhibition des ABC-Transporters A3 und der Exosomenbildung durch Rapamycin, Indometacin und U18666A
Um die Exosomenbildung zu beeinflussen, wurden in den folgenden Experimenten Inhibitoren der Exosomen-Synthese (Rapamycin, Indometacin, U18666A) eingesetzt (Chalmin et al. 2010; Fader et al. 2008; Strauss et al. 2010). Auf den Exosomen befindet sich AChE. Die Messung der Aktivität der AChE wurde zur Quantifizierung von Exosomen eingesetzt. OCI-Ly1-Lymphomzellen wurden mit steigenden Konzentrationen (1; 5; 10 µM) der drei Inhibitoren für 24 h inkubiert und anschließend die Exosomen aus den Überständen mittels Ultrazentrifugation isoliert. Danach wurden die Exsomenpellets in PBS aufgenommen und für AChE-Aktivitätsmessungen eingesetzt (Abb. 6A). Es zeigte sich, dass bei steigenden Konzentrationen der Inhibitoren die AChE-Aktivität und damit die Exosomenkonzentration im Überstand deutlich abnahm. Bei Rapamycin und Indometacin trat eine signifikante Abnahme der Exosomenbildung bei 5 und 10 µM der Inhibitoren auf; jedoch zeigte sich eine signifikante Abnahme erst bei 10 µM U18666A.
Die Exosomenpellets wurden nach der Lyse auch im Western Blot analysiert (Abb. 6B).
So nahm die Anzahl der Exosomen, nachgewiesen an der Expression des Exosomenmarkers Flotillin-2, bei steigender Konzentration aller drei Inhibitoren ab. Bei 10 µM Rapamycin bzw. Indometacin zeigte sich kaum ein Nachweis von Flotillin-2 im Vergleich zu U18666A.
Um einen synergistischen Effekt von Rituximab + Rapamycin, Rituximab + Indometacin oder Rituximab + U18666A auszutesten, wurde ein MTT-Assay durchgeführt (Abb. 6C).
Hierbei wurde Rituximab in Gegenwart von 10 % aktivem humanen Serum und 1 bzw. 5 µM Rapamycin bzw. Indometacin bzw. U18666A untersucht. Im Vergleich zur Kontrolle (nur Rituximab) zeigte sich bei der Kombinationstherapie Rapamycin bzw. Indometacin bzw. U18666A mit Rituximab eine deutliche Abnahme der Viabilität der Zellen.
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Abb. 6: Rapamycin, Indometacin und U18666A führen durch Inhibition des ABC- Transporters A3 zur Hemmung der Abschnürung der Exosomenbildung und damit zu einer verstärkten CDC-Aktivität.
OCI-Ly1-Lymphomzellen (5 × 107) wurden mit Inhibitoren der Exosomen-Synthese versetzt. Nach 24 h wurden die Exosomen geerntet und die AChE-Aktivität gemessen (A). (B) Detektion von Flotillin-2 als Exosomenmarker. GAPDH diente als Kontrolle für die behandelten Parenteralzellen (Mehrfach-ANOVA, Bonferroni-Post-Hoc-Test). (C) Darstellung der Viabilität der Lymphomzellen nach gleichzeitiger Inkubation mit Exosomen-Synthese-Inhibitoren (zwei Konzentrationen) und Rituximab in Gegenwart von 10%igem aktiven humanen Komplement (Two-way ANOVA, Bonferroni-Post-Hoc-Test). Abb. übersetzt aus Aung et al., 2011 (mit freundlicher Genehmigung von PNAS).
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3.1.6. Bedeutung von ABCA3 für die Freisetzung von Exosomen
Um die Rolle von ABCA3 bei der Exosomenfreisetzung zu analysieren, wurde ABCA3 durch zwei verschiedene lentivirale Konstrukte (PLKO.1-shRNA.38 und .39) in den drei Lymphomzelllinien Balm-3, SU-DHL-4, OCl-Ly-1 unterdrückt (Abb. 7A). Diese WT bzw.
ABCA3-Knock-out-Zelllinien wurden im MTT-Assay eingesetzt. Dabei zeigte sich bei steigenden Konzentrationen von Rituximab mit 10 % aktivem humanen Serum eine signifikante Reduktion der Viabilität bei Abwesenheit von ABCA3 im Vergleich zur Kontrolle. Bei Balm-3 und OCl-Ly-1 zeigt sich ein größerer Viabilitätsabfall als bei SU- DHL-4.
Um die Exosomensekretion von den Zelllinien Balm-3, SU-DHL-4 und OCl-Ly-1, bei denen ABCA3 unterdrückt worden war, und der Kontrolle nachzuweisen, wurden die Überstände der Zellen nach 48 h gesammelt, die Exosomen durch Ultrazentrifugationsschritte aufgearbeitet und die Proteine gemessen. Bei allen drei Zelllinien zeigte sich ein signifikanter Abfall der exosomalen Proteine im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 7B).
Außerdem wurde die Proteinexpression des Exosomenmarkers Flotillin-2 im Western Blot in den drei WT bzw. Knock-out Zellen untersucht (Abb. 7C). Die reduzierte Expression von Flotillin-2 bei vorliegendem Knock-out von ABCA3 bestätigt eine reduzierte Exosomensekretion. Bei Verwendung des Konstrukts 39 (shABCA.39) zeigte sich bei Su-DHL-4 und OCL-Ly-1 ein deutlicher Abfall der Exsomensekretion im Vergleich zu Balm-3. Bei Einsatz des Konstrukts 38 (shABCA.38) ließ sich bei Balm-3 und Su-DHL-4 eine niedrigere Exosomensekretion verglichen mit OCL-Ly-1 nachweisen.
In Abb. 7D/E wurden die Effekte einer Überexpression von ABCA3 bzw. der Expression eines nichtfunktionellen ABCA3-Transporters (Mutation in der ATP-Bindungsstelle N568D) auf die Exosomenbildung im Western Blot mittels Nachweis der Exosomenmarker Flotillin-2 und CD63 dargestellt. Die Überexpression von ABCA3 resultierte in einer vermehrten Exosomenbildung im Überstand der Zelllinien (SU-DHL- 4 (Abb. 7D) und OCI-Ly-1 (Abb. 7E)). Jedoch war ein nichtfunktioneller ABCA3 Transporter mit Mutation in der ATP-Bindungsstelle N568D nicht ausreichend, um ähnliche Effekte zu induzieren.
Um die Überexpression von ABCA3 und die damit verbundene erhöhte Exosomensekretion und höhere Resistenz gegenüber Rituximab nachzuweisen, wurde
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ein MTT-Assay durchgeführt (Abb. 7F). Dabei wurden SU-DHL-4- und OCl-Ly-1-Zellen mit nichtfunktionellem ABCA3-Transporter, überexprimiertem ABCA3 und Kontrollzellen eingesetzt. Bei steigenden Konzentrationen von Rituximab mit 10 % aktivem humanen Serum zeigte sich bei beiden Zelllinien mit überexprimiertem ABCA3 ein besseres Überleben der Zellen im Vergleich zu den anderen beiden Gruppen (N568D und Kontrolle).
Zusammenfassend zeigten diese Daten, dass der ABCA3-Transporter die Exosomen- Bildung bei B-Zelllymphomen modulierte. Diese Modulation war für die Empfindlichkeit der Lymphomzellen auf den Antikörper Rituximab von Bedeutung und kann eine Möglichkeit zur zusätzlichen pharmakologischen Intervention bieten.
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Abb. 7: Bedeutung von ABCA3 für die Freisetzung von Exosomen.
Um die ABCA3-Funktion bei der Exosomen-Freisetzung zu analysieren, wurde ABCA3 mit Hilfe von zwei unabhängigen shABCA3-Konstrukten (PLKO.1-shRNA.38 und .39) ausgeknockt und die forcierte Genexpression mit einem ABCA3-WT-Plasmid und einer nichtfunktionellen Mutante (pABCA3 N568D) untersucht. (A) Darstellung der Viabilität von Lymphomzellen (WT bzw.
PLKO.1-shRNA.38 und .39) und Rituximab in Gegenwart von 10%igem aktivem humanen Komplement (Two-way ANOVA, Bonferroni-Post-Hoc-Test). (B) Bestimmung der Proteinmenge der Exosomen von Lymphomzellen (WT bzw. PLKO.1-shRNA.38 und .39) 48 h nach Inkubation (Student’s T-Test). (C) Detektion von Flotillin-2 als Exosomenmarker von Lymphomzellen (WT bzw. PLKO.1-shRNA.38 und .39) mittels Western Blot 48 h nach Inkubation (Student’s T-Test).
(D, E) Detektion von Flotillin-2 bzw. CD63 als Exosomenmarker von Lymphomzellen (SU-DHL-4 [WT, pABCA3wt und Kontrollplasmid pABCA3N568D] und OCI-Ly1 [WT, pABCA3wt und Kontrollplasmid pABCA3N568D]) mittels Western Blot 48 h nach Inkubation. (F) Darstellung der Viabilität von Lymphomzellen (WT, pABCA3wt und Kontrollplasmid pABCA3N568D) und Rituximab in Gegenwart von 10%igem aktivem humanen Komplement (Two-way ANOVA, Bonferroni-Post-Hoc-Test). Abb. übersetzt aus Aung et al., 2011 (mit freundlicher Genehmigung von PNAS).
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3.2. Erhöhung der Wirksamkeit der Zytostatika Doxorubicin und Pixantron durch Inhibition des exosomalen Exports (nuclear trapping)
3.2.1 Behandlung mit Indometacin verstärkt den Verbleib von Pixantron / Doxorubicin in den Tumorzellen und verschiebt Pixantron / Doxorubicin aus dem Zytoplasma in den Zellkern.
Um mögliche synergistische Effekte des Cyclooxygenase-Inhibitors Indometacin auf die Zytostatika Doxorubicin und Pixantron beim diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom in vivo zu untersuchen, wurde das 3D-in-vivo-CAM-Modell (CAM: Chorion- allantoismembran) verwendet. Dazu wurden die Lymphomzellen SU-DHL-4, OCI-Ly1 auf die CAM implantiert und wachsen gelassen. Abb. 8A zeigt das Tumorwachstum von SU-DHL-4-Zellen auf der CAM nach 10 Tagen nach der Implantation. Zur Untersuchung der Effekte von Pixantron auf das Tumorwachstum wurde Pixantron in ein Blutgefäß der CAM intravenös injiziert (Abb. 8B).
Neben Pixantron wurden auch Doxorubicin intravenös injiziert und Indometacin topisch gegeben. Nach Explantation der Tumoren wurden die Effekte dieser Medikamente auf das Tumorwachstum/-gewicht bestimmt (Abb. 8C). Die Kombinationstherapie von Doxorubicin und Indometacin resultierte in einer deutlichen Abnahme des Tumorvolumens im 3D-in-vivo-CAM-Modell im Vergleich zu Doxorubicin alleine.
Die Balkendiagramme in Abb. 9 stellen die Effekte der Behandlung der Tumore mit Doxorubicin bzw. Pixantron in An-/Abwesenheit von Indometacin auf das Tumorgewicht und Tumorwachstum (von SU-DHL-4- bzw. OCl-Ly-1-Zellen) dar. Die Behandlung mit Indometacin alleine zeigte keinen Effekt auf das Tumorwachstum/-gewicht; dagegen wies die Kombinationstherapie von Indometacin mit Doxorubicin bzw. Pixantron eine synergistische Wirkung auf und steigerte die Wirksamkeit, gemessen an der Abnahme der Tumormasse, gegenüber der Monotherapie von Doxorubicin bzw. Pixantron (Abb.
9).
Die Tumore, die im CAM-Modell, aus den SU-DHL-4-Zellen gewachsen waren, wurden 24 h nach Doxorubicin-Behandlung (-/+ Indometacin) mittels konfokaler Fluoreszenz- Mikroskopie analysiert. Bei der Kombination von Doxorubicin mit Indometacin zeigte sich sowohl eine deformierte Architektur der Tumoren als auch eine signifikante Reduktion der Tumorzelldichte. Weiterhin konnte bei der Kombinationstherapie eine verstärkte Retention von Doxorubicin in den Tumorzellen als auch eine erhöhte Akkumulation von
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Doxorubicin im Zellkern im Vergleich zu Doxorubicin alleine nachgewiesen werden (Abb.
10A/B).
Darüber hinaus wurden die Effekte einer Kombinationstherapie von Pixantron mit Indometacin untersucht (Abb. 11). Wie auch bei der Kombinationstherapie mit Doxorubicin beschrieben, war eine verstärkter Verbleib von Pixantron in den Tumorzellen sichtbar (Abb. 11A). Bei den mit Indometacin vorbehandelten Lymphomen zeigte sich ein signifikant stärkeres Signal von Pixantron im Kern verglichen mit den Zellen mit nur Pixantron (Abb. 11B). Ohne Vorbehandlung mit Indometacin ließ sich im Zytoplasma der Lymphomzellen kaum Pixantron nachweisen. Bei den vorbehandelten Tumoren war jedoch eine deutliche Akkumulation von Doxorubicin und Pixantron im Zytoplasma nachweisbar (Abb. 10B, 11B). Bei den Lymphomzellen ließ sich mittels FACS-Analyse eine signifikante Zunahme der Pixantron-Fluoreszenz bei Indometacin- vorbehandelten Lymphomen im Vergleich zu nur Pixantron nachweisen (Abb. 11 C).
Abb. 8: CAM-Model.
(A) Wachstum von Lymphomzellentumor auf der Chorionallantoismembran am Tag 10 nach Implantation von SU-DHL-4 Zellen. (B) IV-Gabe von Pixantron (blaue Flüssigkeit) im CAM-Model.
(C) Beispiele von Tumoren nach Behandlung mit Doxorubicin (DXR) -/+ Indometacin. Abb.
übersetzt aus Koch, Aung et al., 2016 (mit freundlicher Genehmigung des AACR-Verlags).
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Abb. 9: Indometacin steigert die Wirksamkeit von Doxorubicin und Pixantron in vivo.
SU-DHL-4- und OCI-Ly1-Lymphomzellen wurden auf einer CAM-Membran ausgesät. Nach sieben Tagen wurden die Lymphomzellen mit 50 ng Doxorubicin oder Pixantron intravenös behandelt. Als Negativkontrolle wurden die Zellen mit PBS behandelt bzw. mit 1 ml 10 µmol/L Indometacin für 24 h vorbehandelt (Student’s T-Test; *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001).
Abb. übersetzt aus Koch, Aung et al., 2016 (mit freundlicher Genehmigung des AACR-Verlags).
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Abb. 10: Indometacin Behandlung verstärkt sowohl den Verbleib von Doxorubicin im Tumor als auch die medikamentinduzierte Gewebeverformung und verschiebt Doxorubicin (DXR) aus dem Zytoplasma in den Zellkern.
SU-DHL-4 CAM-Tumore wurden 24 h nach Doxorubicin-Behandlung mit oder ohne Indometacin- Vorbehandlung mittels konfokaler Mikroskopie analysiert, wobei DXR mittels Fluoreszenz nach Anregung bei 560 nm mit DAPI-Kofärbung dargestellt wurde. Doxorubicin-Behandlung führte zu einer Deformation des Lymphomgewebes, wobei diese nach Indometacin-Behandlung signifikant verstärkt war (offene Pfeilspitzen in A). Indometacin-Vorbehandlung ging mit einer verstärkten DXR-Retention in den Tumorzellen einher (A) und mit einer Verschiebung der Doxorubicin- Fluoreszenz aus dem Zytoplasma in den Zellkern (B). Abb. übersetzt aus Koch, Aung et al., 2016 (mit freundlicher Genehmigung des AACR-Verlags).
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Abb. 11: Indometacin Behandlung verstärkt den zellulären Verbleib von Pixantron im Tumor und verschiebt Pixantron aus dem Zytoplasma in den Zellkern.
SU-DHL-4-CAM-Tumore wurden 24 h nach Pixantron-Behandlung mit oder ohne Indometacin Vorbehandlung mittels konfokaler Mikroskopie analysiert, wobei DXR mittels Fluoreszenz nach Anregung bei 650 nm mit DAPI-Kofärbung dargestellt wurde. Pixantron-Vorbehandlung ging mit einer verstärkten DXR-Retention in den Tumorzellen einher (A) und mit einer Verschiebung der Doxorubicin-Fluoreszenz aus dem Zytoplasma in den Zellkern (B; Pfeilspitzen deuten die entsprechenden Stellen an). Lymphomgewebe der SU-DHL-4- und der OCl-Ly1-Zellen wurde entnommen, mit anti-hCD20-FITC gefärbt und der Mittelwert des Fluoreszenzsignals mittels CD20-positiven Zellen im FACS bei 670 nm quantifiziert. (C) PBS: Kontrolle mit PBS; I: Kontrolle mit 1 ml 10 µmol/l Indometacin; P: 50 µg Pixantron; IþP: 1 ml 10 µmol/l Indometacin und 50 µg Pixantron; SU-DHL-4 n=6; OCI-Ly1 n=4; *, P < 0,05; ***, P < 0,001; Mehrfach-ANOVA, Bonferroni-Post-Hoc-Test). Abb. übersetzt aus Koch, Aung et al., 2016 (mit freundlicher Genehmigung des AACR-Verlags).
