Struktur, Transportmechanismus und Bedeutung
Eine Übersicht
Abschlußarbeit im PGS Toxikologie der Universität Leipzig
Vorgelegt von
Dr. Dipl.-Biol. Vivien Lange Dortmund
Januar 2012
Abkürzungsverzeichnis ...3
1. Einleitung...5
2. Allgemeine Charakteristika und Bedeutung der ABC-Transporter....5
3. Allgemeiner Aufbau der ABC-Transporter ...7
3.1 Die Architektur der ABC-Transporter...7
3.2. Die integralen Membrandomänen der ABC-Transporter...9
3.2.1 Allgemeiner Aufbau und Konformation der TMDs... 9
3.2.2 TMDs in ABC-Importern des Typ I und Typ II... 11
3.3. Die Nukleotid-bindenden Domänen der ABC-Transporter...12
3.3.1 Konservierte Regionen der NBDs... 13
3.3.2 NBD-Dimerisierung und Interaktion mit den TMDs... 15
4. ATP-Hydrolyse und Transportzyklus der ABC-Transporter ... 16
5. Funktion der ABC-Importsysteme... 17
5.1 Substrat-Bindeprotein-abhängige ABC-Importer...17
5.1.1 Die extrazellulären SBPs der ABC-Importer... 17
5.1.2 Mechanismus und Bedeutung SBPs-abhängiger ABC-Importer... 20
5.2 Energy coupling factor-ABC-Importer...24
5.3 ABC-Importsysteme in Eukaryoten...25
6. Funktion der ABC-Exportsysteme...26
6.1 Verbreitung und Bedeutung der ABC-Exporter...26
6.2 Die Rolle der ABC-Exporter in der Biotransformation...28
6.3 Mechanismus der ABC-Exporter...29
7. ABC-Proteine ohne Transportfunktion... 31
8. Zusammenfassung und Perspektiven für die Zukunft...33
Literaturverzeichnis...34
ABC ATP-binding cassette
ADP Adenosindiphosphat
ALDP Adrenoleukodystrophie
AMP-PNP Adenylyl- β,γ-Imido-Diphosphat
ATP Adenosintriphosphat
ATPase Adenosintriphosphatase
PDB Proteindatenbank
CTFR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
DNA Desoxyribonukleinsäure
ECF energy coupling factor
NBD Nukleotid-bindende Domäne
SBP Substrat-Bindeprotein
SUR suphonyl urea receptor
TMD Transmembrandomäne
TMH Transmembranhelix
1. Einleitung
Die Zellen aller Organismen sind von einer Membran umgeben, die das Cytoplasma vom extrazellulären Milieu abgrenzt. Diese Cytoplasmamembran stellt gleichzeitig eine hochselektive Permeabilitätsbarriere dar, über die der essentielle Stoffaustausch zwischen dem Zellinneren und der extrazellulärem Umgebung stattfindet. Die selektive Permeabilität der Membran beruht auf eingelagerten Transportproteinen, die die spezifische Nahrungsaufnahme sowie die Sekretion von Stoffwechselprodukten und Toxinen zur Abwehr gewährleisten. Darüber hinaus ermöglichen sie den Export und Import von Signalmolekülen für die interzelluläre Kommunikation und unterstützen die Aufrechterhaltung des elektrochemischen Gradienten. Diese Transportvorgänge erfolgen entweder passiv durch Diffusion entlang des elektrochemischen Gradienten oder aktiv unter Energieverbrauch gegen den Konzentrationsgradienten. Überdies unterscheidet man zwischen primär und sekundär aktivem Transport. Die primär aktiven Transportsysteme beziehen ihre Energie direkt aus der Hydrolyse von Adenosintriphophat (ATP) oder durch die Absorption von Licht, wohingegen die sekundär aktiven Transporter den elektrochemischen Gradienten über der Membran zur Energetisierung nutzen (Krämer, 1994; Saier, 2000).
Die ATP-binding cassette (ABC)-Transporter gehören zu den primär aktiven Transportsystemen. Sie nutzen die Energie aus der ATP-Hydrolyse für die unidirektionale Translokation diverser Substrate über biologische Membranen und sind in zahlreiche physiologische Prozesse involviert. Einige Vertreter dieser Proteinfamilie sind von großer medizinischer und pharmakologischer Relevanz.
2. Allgemeine Charakteristika und Bedeutung der ABC-Transporter
ABC-Transporter sind in allen drei Reichen des Lebens, Bakterien, Archaea und Eukaryoten, vertreten und bilden eine der größten Familien von homologen Proteinen. Die meisten Mitglieder dieser Familie sind Membranproteinkomplexe, die die freiwerdende Energie der ATP-Hydrolyse zur unidirektionalen Translokation diverser Substrate über biologische Membranen nutzen. Während eukaryotische ABC-Transporter ausschließlich Exportsysteme sind, finden sich in Prokaryoten auch importierende Transportsysteme. Bei den Importsystemen gibt es zwei Unterteilungen: die Substrat-Bindeprotein (SBP)- abhängigen ABC-Transportsysteme (Boos und Lucht, 1996) und die energy coupling factor (ECF)-Transporter, die ohne ein Bindeprotein auskommen (Eitinger et al., 2011). ABC- Transportsysteme zeichnen sich durch ihr breites Spektrum an transportierten Substanzen
aus. Importer vermitteln in Prokaryoten die Aufnahme von Nährstoffen. Die dabei transportierten Substrate sind sehr vielfältig und reichen von Ionen über Zucker, Vitamine, Aminosäuren, Peptide, Eisen-Siderophore bis hin zu Opinen. Die Exportsysteme sind involviert in die Sekretion der verschiedensten Moleküle wie Peptide, Lipide, hydrophobe Arzneimittel, Polysaccharide, Proteine und Toxine (zur Übersicht siehe Eitinger et al., 2011).
Seitdem im Jahre 1982 erstmals die Gene des ABC-Importers HisQMP2 aus Salmonella typhimuriumkloniert und sequenziert wurden (Higginset al.,1982), nahm die Zahl der bekannten ABC-Transportsysteme ständig zu. In Escherichia coli wurden bis heute annähernd 80 verschiedene ABC-Transporter gefunden, deren Gene fast 5 % des gesamten Genoms ausmachen (Higgins, 2001; Moussatova et al., 2008). Auch die Genome von Pflanzen kodieren eine große Anzahl an ABC-Transportern, in Arabidopsis thaliana und Oryza sativabeispielweise mehr als 120 verschiedene Systeme (Rea, 2007). Im menschlichen Genom wurden 48 ABC-Exporter identifiziert (Chen und Tiwari, 2011), die anhand von Vergleichen der Gensequenzen in sieben Subfamilien – ABCA bis ABCG – eingeteilt wurden. Einige Vertreter dieser Proteinfamilie sind von großer medizinischer und pharmakologischer Bedeutung. Zum einen sind ABC-Transporter für den Export der während der Biotransformation Phase 3 (siehe Abschnitt 5.2) in der Leber umgewandelten Fremdstoffe und Konjugate aus der Zelle verantwortlich (Leslieet al., 2007). Zum anderen spielen ABC-Exporter eine Rolle bei der Entwicklung von Multiwirkstoffresistenzen (multidrug resistance, MDR) gegen Chemotherapeutika von Tumorzellen (siehe Abschnitt 5.1). Der bekannteste Vertreter ist das P-Glykoprotein (oder MDR1), das eine Vielzahl von Substraten transportieren kann (Cascorbi, 2011).
Zur Familie der ABC-Proteine gehören neben den Importern und Exportern auch Vertreter, die keine aktiven Transportsysteme sind. Dercystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) beispielsweise besitzt keine aktive Transportfunktion, sondern stellt einen Nukleotid-regulierten Ionenkanal dar (Hanrahan et al., 2003). Dazu gehört ebenfalls das suphonyl urea receptor (SUR)-Protein, das in ähnlicher Weise einen Kaliumkanal reguliert (Inagaki et al.,1995; Matsuo et al.,2003), sowie Proteine, die in die Chromatinorganisation (Hirano, 2006) oder in die DNA-Reparatur (Hopfneret al.,2000) involviert sind.
3. Allgemeiner Aufbau der ABC-Transporter
3.1 Die Architektur der ABC-Transporter
ABC-Transporter besitzen trotz ihrer großen Komplexität in Funktion und Substratspezifität eine gemeinsame Architektur, die schon im Jahr 1986 von Higgins et al.
beschrieben wurde (Abbildung 1). Ein typischer ABC-Transportkomplex besteht aus vier Untereinheiten: zwei integrale, hydrophobe Transmembrandomänen (TMDs), die die Translokationspore für ein spezifisches Substrat bilden, und zwei cytoplasmatisch assoziierte Nukleotid-bindende Domänen (NBDs) die den Translokationsvorgang durch die Hydrolyse von ATP energetisieren (Higgins, 1992). Diese hoch konservierte ATP- hydrolysierende Untereinheit wird durch drei spezifische Sequenzmotive charakterisiert:
das Walker A- und Walker B-Motiv sowie die ABC-Signatur, die hinter Walker B liegt (siehe Abschnitt 3.3.1). Alle diese drei Bereiche sind in die Nukleotidbindung und - hydrolyse involviert (Schneider und Hunke, 1998).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des einheitlichen Aufbaus der Mitglieder der ABC-Superfamilie. ABC-Transporter werden in Exporter, Importer und in Nicht-Transporter unterschieden. Dabei bestehen die Exporter und die Substrat- Bindeprotein (SBP) abhängigen Importsysteme aus zwei Transmembran- domänen (TMDs) und zwei Nukleotid-bindenden Domänen (NBDs). In Exportsystemen gelangt das zu transportierende Substrat (dargestellt als gefüllter roter Kreis), in Abhängigkeit zu seinen chemischen Eigenschaften entweder von der cytoplasmatischen Seite oder direkt aus der Membran in den Translokationskanal. ABC-Importer benötigen ein extrazelluläres SBP (als blaues Oval dargestellt), das das jeweilige Substrat spezifisch bindet und an die TMDs abgibt. Dieenergy coupling factor (ECF)-artigen Importsysteme bestehen aus einer Substrat-spezifischen TMD und einer zweiten, kleineren TMD (S- und T- Komponente) sowie zwei NBDs. Den Nicht-transportierenden ABC-Proteinen fehlen die TMDs; sie sind aus zwei NBDs und zusätzlichen Domänen (in lila dargestellt) zusammengesetzt (nach Licht und Schneider, 2011).
Prokaryotische Importsysteme besitzen zusätzlich ein extrazelluläres SBP (in Abbildung 1 in hellblau dargestellt) (Boos und Lucht, 1996). Einige prokaryotische ABC- Transportsyteme sind darüber hinaus mit speziellen Porinen ausgestattet, die die Diffusion der Substrate in den periplasmatischen Raum gramnegativer Bakterien erleichtern (Nikaido und Vaara, 1985; Nikaido, 1994). Als Beispiel sei hier das Porin LamB des Maltose- Importers MalFGK2genannt (Boos und Shuman, 1998).
Eine neue und vielfältige Unterfamilie der ABC-Importer, die ECF- Transportproteine, wurde erst 2007 durch bioinformatische Analysen der Genome von Bakterien und Archaea identifiziert (Hebbeln et al., 2007; Rodionov et al., 2009). Ihre Architektur unterscheidet sich dabei deutlich von der der SBP-abhängigen ABC-Importer.
Die ECF-Importer bestehen aus einem Energie-koppelnden Modul, das eine konservierte TMD (T-Komponente) und zwei NBDs (A-Komponente) umfasst (Abbildung 1). Die Substratspezifität wird durch ein Transmembranprotein (S-Komponente) vermittelt, das so den Import von Mikronährstoffen wie Vitamine und bestimmte Übergangsmetalle ermöglicht (Übersicht in Eitingeret al., 2011).
Die Organisation der einzelnen Untereinheiten in den ABC-Transportern kann dabei vielfältig sein (Abbildung 2). Die Importsysteme bestehen meist aus separaten Proteinen (BtuCD-F und MalFGK-E), wobei es aber auch Beispiele gibt, bei denen die TMDs oder die NBDs fusioniert vorliegen (FhuBC-D, RbsCA-B und OppABCDF). Exportierende Transporter können sogenannte Halb-Transporter sein (Sav1866 und TAP1/TAP2), in dem eine TMD mit je einer NBD fusioniert ist, oder Voll-Transporter, bei denen sich alle vier Untereinheiten auf einer Polypeptidkette befinden (MDR1 und CFTR).
Anhand von Genanalysen wurden die Mitglieder der ABC-Transporterfamilie in drei Untergruppen oder Klassen unterteilt, die den funktionellen Unterteilungen in Importer, Exporter und Nicht-Transporter nahekommen (Davidson et al., 2008): In der Klasse 1 sind Transportsysteme mit fusionierten TMDs und NBDs zusammengefasst, wozu die meisten der Exporter gehören. Klasse 2 umfasst ABC-Proteine, denen die TMDs fehlen und die somit keine Transportfunktion besitzen. Klasse 3-Transporter sind hauptsächlich aus separaten Untereinheiten aufgebaut, wie die SBP-abhängigen Importsysteme und einige der bakteriellen Exportsysteme.
Abbildung 2: Domänenorganisation von ABC-Transportern. Beispielhaft dargestellt sind die aus je vier (fünf mit dem SBP, blau dargestellt) getrennten Untereinheiten organisierten Vitamin B12- und Maltose-Transporter, in denen die TMDs als Homo- (BtuC2) oder Heterodimer (MalFG) auftreten, der aus getrennten NBDs und fusionierten TMDs bestehende Eisen-Hydroxamat-Transporter FhuBC, der aus fusionierten NBDs und separaten TMDs aufgebaute Ribose-Transporter RbsCA und der Oligosaccharid-Transporter OppBCDF, bestehend aus verschiedenen TMDs und NBDs sowie dem SBP OppA, das in grampositiven Bakterien in der Zellmembran verankert ist. In der unteren Reihe sind Beispiele für ABC-Exporter gezeigt: LmrA, ein aus zwei homodimeren TMD-NBD- Kombinationen aufgebauter bakterieller Multiwirkstoff-ABC-Transporter, und TAP1/TAP2, ein Peptid-Exporter, der aus zwei unterschiedlichen TMDs und homodimeren NBDs zusammengesetzt ist. Beides sind sogenannte Halb- Transporter. MDR1 und CFTR sind Beispiele für sogenannte Voll-Transporter, die jeweils aus einer Polypeptidkette mit vier Domänen bestehen (nach Licht und Schneider, 2011).
3.2. Die integralen Membrandomänen der ABC-Transporter 3.2.1 Allgemeiner Aufbau und Konformation der TMDs
Die TMDs der ABC-Transportsysteme formen den Translokationsweg für die Substrate und bestehen aus α-Helizes, die die Cytoplasmamembran mehrfach durchspannen. Die Anzahl der Transmembranhelizes (TMH) variiert innerhalb der verschiedenen Untergruppen der ABC-Transporter stark und liegt zwischen vier und zehn
α-Helizes pro TMD. Die Mehrzahl der TMDs besteht aus sechs TMHs, deren C- und N- Termini in das Cytoplasma gerichtet sind (Boos und Lucht, 1996).
Die hohe Substratdiversität der ABC-Transporter spiegelt sich in der geringen Sequenzkonservierung der TMDs innerhalb der Proteinfamilie wider. In den bisher veröffentlichten Kristallstrukturen der vollständigen ABC-Transporter ist zu erkennen, dass die TMDs verschiedene Konformationen einnehmen können (Abbildung 3). Der aus den TMDs geformte Translokationskanal ist dabei entweder zur cytoplasmatischen oder zur extrazellulären Seite der Membran geöffnet (Higgins und Linton, 2004; Hollenstein et al., 2007; Dawson und Locher, 2007).
Abbildung 3: Beispiele für die unterschiedlichen Konformationen der TMDs. In der linken Kristallstruktur des Wolframat/Molybdat-Transporters ModBC aus Archaeoglobus fulgidus(Proteindatenbank (PDB) Code 2ONK) sind die TMDs zur cytosolischen Membranseite geöffnet. Dagegen zeigt die Kristallstruktur des Exporters Sav1866 aus Staphylococcus aureus (PDB Code 2HYD) die Membranproteine in einer zum extrazellulären Raum geöffneten Konformation.
Der Kontakt und somit die Signalübertragung zwischen den Membranproteinen und den NBDs wird über eine sogenannte Kopplungshelix der TMDs hergestellt (Mourez et al., 1997). Dafür ragt die Kopplungshelix in eine Grube, die von dem jeweilig zugehörigen NBD-Monomer gebildet wird (Abbildung 4) (Hollensteinet al., 2007). Diese Helix befindet sich in der vierten cytoplasmatischen Schleife fast aller TMDs von bakteriellen ABC- Importsystemen (Dassa und Hofnung, 1985; Saurin et al., 1994). Das ist eine der wenigen konservierten Bereiche in der Sequenz der TMDs – das sogenannte EAA-Motiv (EAA-x3- G-x9-I-x-LP, wobei x für eine beliebige Aminosäure steht). Dieses Sequenzmotiv wurde in ABC-Exportsystemen bisher nicht gefunden. In dem Multiwirkstoff-Exporter Sav1866 aus
Staphylococcus aureus wird der Kontakt zwischen NBD und TMD über eine Schleife vermittelt, die durch die Sequenz TEVGERG charakterisiert ist. Ähnliche Motive wurden auch in anderen Exportern identifiziert (Dawson und Locher, 2006; Jumpertzet al., 2009).
Abbildung 4: Darstellung des Kontaktbereiches zwischen den TMDs und NBDs des Molybdat-Transporters ModBC-A (PDB Code 2ONK; Hollensteinet al., 2007).
Die Interaktionsfläche zwischen den beiden Untereinheiten wurde aus der Struktur von ModBC-A vergrößert (A) und um 90° gedreht (B) dargestellt. Die Membranproteine sind in orange und die NBDs in grau abgebildet (Kunert, 2011).
3.2.2 TMDs in ABC-Importern des Typ I und Typ II
Je nach Anzahl der TMHs werden die prokaryotischen ABC-Importsysteme in Typ I und Typ II unterteilt (siehe auch Abschnitt 6.1, Abbildung 10) (Locher, 2009). Typ I- Importer wie der Maltose-Transporter MalKGK2-E besitzen in beiden TMDs insgesamt zehn bis 14 TMHs, wohingegen Typ II-Transporter wie der Vitamin B12-Transporter BtuCD-F insgesamt bis zu 20 TMHs aufweisen.
In den Kristallstrukturen der Typ I-ABC-Importsysteme (Abbildung 5) zeigen die TMDs jeweils eine ähnliche Faltung, in deren Inneren sechs TMHs scheinbar doppelt- symmetrisch angeordnet sind (Hollenstein et al., 2007; Oldham et al., 2007; Gerber et al., 2008; Kadaba et al., 2008; Khare et al., 2009). In dem Molybdat-Transporter ModBC interagieren die TMDs ModB jeweils über ihre sich überkreuzenden N-terminalen Helizes miteinander (Hollenstein et al., 2007). Auch das Membranprotein MalG des Maltose- Importers MalFGK2nutzt die N-terminale Helix, um die gegenüberliegende TMD MalF zu kontaktieren (Oldham et al., 2007; Khareet al., 2009). Ein Überlappen der TMDs mit den
NBDs wie in den Exportsystemen ist bei den Typ I-Importsystemen nicht vorzufinden. In der TMD MalF des Maltose-Transporters wurde erstmals eine Substrat-Bindestelle identifiziert (Oldham et al., 2007), über die eine Interaktion zwischen dem Membranprotein und dem Substrat stattfindet.
Die homodimeren Typ II-ABC-Importsysteme sind im Gegensatz zu den Typ I- Importern größer und ihre TMDs bestehen aus jeweils zehn dicht gepackten TMHs, zwischen denen sich der Translokationskanal befindet (Abbildung 5). Zu diesen Transportern gehören der Vitamin B12-Transporter BtuCD-F aus E. coli (Locher et al., 2002) und der Metall-Chelat-Transporter HI1470/71 aus Haemophilus influenzae (Pinkett et al.,2007).
Abbildung 5: Darstellung der unterschiedlichen Organisation der TMDs in Typ I- und Typ II-Importern. Gezeigt sind beispielhaft der Molybdat-Transporter ModBC-A, der zu den Typ I-Importsystemen gehört, und der Vitamin B12- Transporter BtuCD, der zusammen mit dem Metall-Chalet-Transporter HI1470/71 zu den Typ II-Importern gezählt wird. (nach Davidsonet al., 2008).
3.3. Die Nukleotid-bindenden Domänen der ABC-Transporter
Die NBDs oder ABC-Proteine sind in den ABC-Transportsystemen für die Kopplung der aus ATP-Bindung und -Hydrolyse freiwerdenden Energie mit der Translokation des Substrats verantwortlich (Ames, 1992; Higgins, 1992; Schneider und Hunke, 1998). Die NBDs sind als Homo- oder Heterodimer auf der cytoplasmatischen Seite an die Membrandomänen assoziiert. Sie sind typischerweise aus zwei Subdomänen aufgebaut, der helikalen und der katalytischen (auch RecA-ähnlichen) Domäne.
3.3.1 Konservierte Regionen der NBDs
Im Gegensatz zu den TMDs sind in den ATPase-Untereinheiten zahlreiche konservierte Bereiche zu finden (Abbildung 6). Innerhalb der Proteinfamilie weisen sie eine Sequenzidentität von mehr als 30 % auf, wobei die pro- oder eukaryotische Herkunft der NBD und die Art des transportierten Substrat unerheblich sind (Pinkettet al.,2007). Diese charakteristischen, hoch konservierten Sequenzmotive (Higgins et al., 1986) sind an der Bindung und Hydrolyse von ATP beteiligt. Zu diesen Sequenzbereichen gehören die Walker A- und Walker B-Motive, die für viele ATP-abhängige Proteine charakteristisch sind, die ABC-Signatur (auch C-Schleife genannt), die D-Schleife, die H-Schleife und die strukturell-diverse Region. Diese enthält wiederum die X-Schleife, ein Motiv, das nur bei Exportsystemen zu finden ist (Dawson und Locher, 2006).
Die Walker A-Region ist in die Bindung von ATP involviert und durch die Konsensus-Sequenz G-x2-G-x-G-K-T/S gekennzeichnet (x steht für eine beliebige Aminosäure, Walker et al., 1982). Hinter dem Walker A-Motiv befindet sich in der NBD- Sequenz die D-Schleife (Konsensus-Sequenz SALD), die an der Kommunikation der beiden NBD-Monomere miteinander beteiligt ist (Jumpertz et al., 2009). Das Walker B- Motiv besteht aus der Aminosäuresequenz h4-D (h stellt dabei eine hydrophobe Aminosäure dar) (Walker et al., 1982) und bildet einen Teil des Phosphatbindemotivs für die Nukleotide (Vetter und Wittinghofer, 1999). Vor dem Walker B-Motiv ist die ABC- Signatur lokalisiert (Konsensus: LSGGQ; Schmitt und Tampé, 2002). Sie ist innerhalb der Proteinfamilie hoch konserviert und kann in jeder NBD gefunden werden, gelegentlich mit geringen Abweichungen wie beispielsweise in BtuD von Q zu E. Veränderungen oder Mutationen in der Sequenz der ABC-Signatur führen zu einem totalen Verlust der ATPase- Aktivität und damit der Transportfähigkeit des Transporters (Schmeeset al., 1999). Weitere bedeutende Motive sind die Q-Schleife und die Pro-Schleife, die die beiden Subdomänen der NBDs gelenkartig miteinander verbinden. Die Q-Schleifen sind ebenfalls die Kontaktbereiche beider NBD-Monomere im Dimer und an der Interaktion zu den TMDs beteiligt (Dawsonet al.,2007).
Die Vielzahl der konservierten Bereiche und Motive der NBDs, die an der Nukleotidbindung und -hydrolyse beteiligt sind, wirken auf den ersten Blick verwirrend, doch betrachtet man sie innerhalb der dreidimensionalen Struktur, wird ihre Anordnung klarer (Abbildung 6). Vom N-Terminus des NBD-Monomers ausgehend ist das Walker A- Motiv der erste konservierte Bereich auf der katalytischen Domäne. Der nächstfolgende ist die Q-Schleife, die als Verbindung zwischen der katalytischen und helikalen Domäne dient.
Auf der helikalen Domäne folgt direkt nach der strukturell-diversen Region die ABC-
Signatur. An diese schließt sich die Pro-Schleife, die als zweites Gelenk für die Bewegungen der helikalen Domäne verantwortlich ist. Das Walker B-Motiv, die D-Schleife und die H- Schleife sind im C-terminalen Bereich der helikalen Domäne lokalisiert.
Abbildung 6: Konservierte Regionen in der NBD. A) Lineare Darstellung einer NBD, in der die konservierten Bereiche farblich gekennzeichnet und beschriftet sind. B) Hier ist die monomere Struktur der isolierten NBD des ABC-Transporters HlyB (PDB Code 1MT0) gezeigt. Die konservierten Sequenzmotive sind farblich hervorgehoben und bezeichnet. Die katalytische Subdomäne ist in hellgelb und hellgrau, die helikale Domäne in hellbraun dargestellt. (modifiziert nach Zaitsevaet al., 2005b).
Als erste Kristallstruktur einer isolierten NBD wurde 1998 die des HisP der Histidin- Permease aus S. typhimurium von Hung et al. beschrieben. Seitdem sind zahlreiche weitere dreidimensionale Strukturen von NBDs in unterschiedlichen funktionellen Zuständen bestimmt worden. Die Kristallstrukturen bestätigen die mehr oder weniger L-förmige Grundstruktur der NBDs sowie den Aufbau aus den beiden Subdomänen (Diederichset al., 2000; Gaudet und Wiley, 2001; Schmitt et al.,2003). Während die katalytische Domäne ein in ATPasen verbreitetes Strukturmotiv ist, kommt die helikale Domäne nur in NBDs von
A
B
ABC-Transportern vor (Davidson et al., 2008; Eitinger et al., 2011). Die katalytische Subdomäne besteht aus zwei β-Faltblättern und sechs α-Helizes, wohingegen die helikale Domäne aus drei bis vier α-Helizes gebildet wird (Davidson et al., 2008). Bei einigen ABC- Transportern, wie beispielsweise MalFGK2-E, ist die NBD um eine C-terminale Domäne erweitert, die eine regulatorische Funktion besitzt (Boos und Böhm, 2000; Gerber et al., 2008).
3.3.2 NBD-Dimerisierung und Interaktion mit den TMDs
Unter physiologischen Bedingungen müssen die NBD-Monomere ein Dimer bilden, um die an der ATP-Hydrolyse beteiligten Reste in räumliche Nähe zueinander zu bringen (van Veenet al., 2000; Fetch und Davidson, 2002; Moodyet al., 2002; Linton, 2007). Auch einige der Kristallstrukturen zeigen die NBDs in dimerisiertem Zustand (Smith et al.,2002;
Zaitseva et al., 2005b). Im Dimer sind die monomeren NBDs invers zueinander ausgerichtet, in einem sogenanntenhead-to-tail arrangement(siehe Abbildung 7). Dabei liegen sich jeweils das Walker A-Motiv des einen Monomers und die ABC-Signatur des anderen gegenüber, so dass in der Innenseite des Dimers zwei Nukleotid-Bindetaschen gebildet werden (Chenet al., 2003; Zaitsevaet al., 2005a; Hollensteinet al., 2007).
Abbildung 7: Struktur eines NBD-Dimers. Dargestellt ist ein Dimer aus NBDs, die zueinander entgegengesetzt orientiert sind und zwischen sich zwei ATP- Moleküle gebunden haben. Das NBD-Dimer ist von der Membranseite gesehen abgebildet. Die Monomere sind in Blau- bzw. Gelbtönen gezeigt. Die katalytischen Subdomänen sind in dunkelblau bzw. orange, die helikalen Subdomänen in hellblau bzw. gelb dargestellt. Es verdeutlich die gegenständige Anordnung der NBD-Monomere im Dimer, die durch die Bindung des ATP stabilisiert wird (Linton, 2007).
Durch die Bindung von ATP schließt sich das Dimer wie eine Pinzette (Chenet al., 2003). Das ist notwendig, da die ATP-Hydrolyse nur im geschlossenen Dimer stattfindet.
Zur Veranschaulichung ist in Abbildung 7 ein NBD-Dimer im ATP-gebundenen Zustand, also in einer geschlossenen Konformation, dargestellt. Die ATP-Bindung und -Hydrolyse an den NBDs erfolgt kooperativ (Chen et al., 2003; Davidson et al., 2008). Die Inaktivierung eines NBD-Monomers des Dimers führt zu einem kompletten Funktionsverlust des Transporters (Davidson, 2002). In die Signalübertragung zwischen den TMDs und den NBDs sind sowohl die Q-Schleife, die die NBD-Subdomänen miteinander verbindet, als auch die strukturell-diversen Regionen der NBDs involviert (Hollenstein et al., 2007; Linton, 2007). Letztere interagieren mit den cytoplasmatischen Schleifen der TMDs des ABC-Transporters und übermitteln so Informationen zu dem momentanen Zustand der NBDs (Schmitt et al., 2003). Auch verursacht die durch die ATP-Bindung induzierte Dimerisierung der NBDs sehr wahrscheinlich intramolekulare Konformationsänderungen in den benachbarten TMDs, die letztendlich zu einem Import oder Export des zu transportierenden Substrates über die Lipidmembran führen.
4. ATP-Hydrolyse und Transportzyklus der ABC-Transporter
Die hohe medizinische Relevanz und das Interesse an der Aufklärung der molekularen Zusammenhänge des Transportmechanismus waren und sind der Antrieb, die dreidimensionale Struktur der ABC-Transporter zu bestimmen und so den Mechanismus der ATP-Bindung und -Hydrolyse und den Substrattransport zu untersuchen und im Detail verstehen zu wollen.
In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl an Kristallstrukturen von NBDs und vollständigen ABC-Transportsystemen gelöst. Diese strukturellen Daten ergaben zusammen mit den Ergebnissen zahlreicher biochemischer Untersuchungen eine genaue Vorstellung der einzelnen Konformationszustände, die der Transporter in den verschiedenen Stadien des Transportzyklus durchläuft. Diese Erkenntnisse bilden die Grundlage für das derzeitige Modell für die Translokation von Substraten durch ABC- Transportsysteme. Als Schlüsselereignis wird dabei die durch die Bindung des ATP induzierte Dimerisierung der NBDs angesehen. Diese mechanische Bewegung verursacht große Konformationsänderungen in den TMDs, die zu einer Öffnung des Translokationskanals für das Substrat führen. Es findet also eine Kopplung der ATP- Hydrolyse mit Konformationsänderungen der TMDs statt, wodurch der Translokationskanal entweder zum Zellinneren oder zum extrazellulären Raum geöffnet
wird (Davidson und Chen, 2004; Davidson et al.; 2008; Locher et al., 2009). Dieses Modell wird auch alsbasic two-state scenariobezeichnet.
Aufgrund der hohen Konservierung einzelner Motive in der Sequenz von NBDs wird davon ausgegangen, dass die ATP-Bindung und -Hydrolyse in allen ABC- Transportern nach einem ähnlichen Prinzip abläuft. Dazu werden zwei Mechanismen als möglich angesehen und kontrovers diskutiert. Beim sogenannten processive clamp-Modell ist in jeder der beiden Bindetaschen des NBD-Dimers ein ATP-Molekül gebunden. Beide ATP-Moleküle werden sequentiell hydrolysiert. Anschließend dissoziiert das NBD-Dimer wieder (Janaset al., 2003; van der Doeset al., 2006; Jumpertzet al., 2009). Dasalternating site- Modell geht ebenfalls von einem NBD-Dimer mit zwei gebundenen ATP-Molekülen aus.
Nach der Hydrolyse des einen ATP öffnet sich das Dimer nur im Bereich der entsprechenden Bindetasche und ADP wird durch neues ATP ersetzt, worauf sich das Dimer wieder schließt. Danach erfolgt die Hydrolyse des ATP-Moleküls in der zweiten Bindetasche (Senior et al., 1995; Sharma und Davidson, 2000; Oloo und Tieleman, 2004;
Tombline et al., 2005; Jones und George, 2009; Jumpertz et al., 2009). Beide Modelle beruhen auf Untersuchungen an unterschiedlichen Proteinen, so dass es denkbar ist, dass beide Mechanismen – bei jeweils verschiedenen Transportern – vorkommen.
5. Funktion der ABC-Importsysteme
Bislang wurden ABC-Importsysteme ausschließlich in Prokaryoten gefunden.
Allerdings gibt es in letzter Zeit zunehmend Hinweise darauf, dass diese Systeme auch in Pflanzen, Hefezellen und in Protozoa für den Substrattransport über die Plasmamembran in die Zellen von Bedeutung sein könnten. ABC-Importer werden in SBP-abhängige Importer und ECF-Importer unterschieden (siehe auch Abbildung 1).
5.1 Substrat-Bindeprotein-abhängige ABC-Importer 5.1.1 Die extrazellulären SBPs der ABC-Importer
Die SBPs sind bei den bakteriellen ABC-Importern für die Substratspezifität der Transportsysteme verantwortlich (Boos und Lucht, 1996; Quiocho und Ledvina, 1996). Sie binden ihre extrazellulären Substrate wie z.B. Ionen, Zucker oder Aminosäuren mit hoher Affinität (KD: 0,01 µM bis 0,1 µM) und geben sie an die TMDs der ABC-Importer ab (Wilkinson und Verschueren, 2003; Shilton, 2008).
Bei gramnegativen Bakterien liegen die SBPs gelöst im Periplasma vor. Im Unterschied dazu sind die SBPs in grampositiven Bakterien und Archaea durch eine an den N-Terminus des Proteins angehängte Lipidgruppe in der Membran verankert (Gilsonet al., 1988; Elferinket al., 2001). In einigen Bakterienstämmen und Archaea, wie z.B.Lactobacillus lactis, Helicobacter pylori und Sulfolobus solfataricus, sind die SBPs mit den TMDs des dazugehörigen ABC-Transporters fusioniert, so dass pro Transporter zwei oder vier Substrat-Bindestellen vorhanden sind (Obiset al., 1999; van der Heide und Poolman, 2002;
Biemanns-Oldewinkel et al., 2006). In der Abbildung 8 sind die unterschiedlichen Möglichkeiten zur strukturellen Organisation der SBPs in verschiedenen Organismen dargestellt.
Abbildung 8: Mögliche Anordnung von SBPs.A) In gramnegativen Organismen liegen die SBPs frei löslich im Periplasma vor. B) In grampositiven Bakterien und in Archaea, die über keine äußere Membran verfügen, sind die SBPs über einen N- terminalen Lipidanker an der Außenseite der Cytoplasmamembran verankert. C) In einigen Archaea sind die SBPs hingegen über ein N-terminales Peptid mit der Cytoplasmamembran verbunden. D) In einigen Bakterien und Archaea kommen SBPs vor, die mit den TMDs der zugehörigen ABC-Importer fusioniert sind, so dass zwei bis vier Substrat-Bindestellen vorkommen. CM steht für Cytoplasmamembran (Eitingeret al.,2011).
SBPs weisen trotz ihrer geringen Sequenzhomologie und ihrer unterschiedlichen Substratspezifität große strukturelle Ähnlichkeiten auf. So bestehen sie meist aus zwei ähnlich gefalteten globulären Domänen, die jeweils wiederum aus einem zentralen β- Faltblatt bestehen, das von α-Helizes flankiert wird. Die SBPs werden anhand der Zahl und der Anordnung der Sekundärstrukturanteile in drei unterschiedliche Klassen Typ 1 bis Typ 3 unterteilt. Bei den Typ 1- und Typ 2-Bindeproteinen sind die Domänen über β- Faltblätter miteinander verbunden (Abbildung 9). Diese gelenkartige Verbindung ermöglicht eine konformationelle Flexibilität innerhalb der SBPs (Wilkinson und Verschuren, 2003). In der Spalte zwischen den beiden Domänen befindet sich die Substrat-
Bindestelle. Die Proteine liegen in Abwesenheit eines Liganden in einer offenen Konformation vor (Sharff et al., 1992; Quicho und Ledvina, 1996; Davidson, 2002). In Abbildung 9 sind die Röntgenkristallstrukturen von ModA aus Methanosarcina acetivoransin offener und geschlossener Konformation mit dem gebundenen Substrat Molybdat dargestellt (Chan et al. 2010). Aus den Strukturen wird deutlich, dass die Substratbindung im Protein zu starken Konformationsänderungen führt.
Abbildung 9: Röntgenkristallstrukturen von ModA aus M. acetivorans in offener und geschlossener Konformation. A) ModA ohne gebundenen Liganden. Die Substratbindetasche ist offen (PDB Code 3K6U; Chanet al., 2010). B) ModA mit gebundenem Molybdatmolekül (rot dargestellt) (PDB Code 3K6W; Chan et al., 2010). Der Abstand der beiden Domänen ist deutlich verringert im Vergleich zum offenen Zustand (Kunert, 2011).
Die Bindung des Liganden induziert Konformationsänderungen im SBP, die zum Schließen der Spalte und in den meisten Proteinen zu einem Einschluss des gebundenen Liganden im SBP führt. Dieser Mechanismus wird in der Literatur mit der Venusfliegenfalle verglichen (Quiocho und Ledvina; 1996; Quiocho et al., 1997). In dieser geschlossenen Konformation tritt das Substrat-beladene Bindeprotein mit den TMDs der Transportkomplexe in Wechselwirkung. Der Kontakt zu den TMDs des Transporters ist entscheidend für das Öffnen der beiden Bindeproteindomänen und das Freigeben des gebundenen Liganden (Hvorupet al.,2007, Oldham et al., 2007). In den Kristallstrukturen von BtuCD-F und MalFGK2 mit gebundenem Maltose-Bindeprotein kontaktieren die SBPs mit je einer ihrer beiden Domänen ein Membranprotein des jeweiligen ABC- Transporters. Bei dem Vitamin B12-Transporter findet diese Interaktion über Salzbrücken zwischen einem Argininrest der TMDs und Glutamatresten des SBPs statt. Beide Strukturen zeigen, dass für das Entlassen des Substrates in den Translokationskanal nicht
nur das Öffnen der Bindeproteindomänen verantwortlich ist, sondern auch eine periplasmatische Schleife der TMD, die in die Substrat-Bindetasche ragt. Dort nimmt sie den Platz des Vitamin B12 bzw. der Maltose ein und verdrängt so das Substrat aus der Bindestelle.
Die Typ 3-SBPs, zu denen auch das Bindeprotein BtuF des Vitamin B12-ABC- Transporters gehört, besitzen im Gegensatz zu den Typ 1- und Typ 2-Bindeproteinen statt eines beweglichen Gelenks eine starre α-Helix als Verbindung zwischen den Domänen.
Das lässt auf geringere Konformationsänderungen durch die Substratbindung schließen (Lawrenceet al., 1998; Leeet al., 1999; Karpowichet al., 2003). Doch folgen auch die Typ 3- Bindeproteine dem Modell der Venusfliegenfalle, bei dem der Ligand an der Bindestelle zwischen den Domänen eingeschlossen wird (Kandtet al., 2006). Eine detaillierte Übersicht zur strukturellen Klassifizierung von SBPs wurde von Berntsson et al. (2010) zusammengestellt.
5.1.2 Mechanismus und Bedeutung SBPs-abhängiger ABC-Importer
Bis heute wurden Röntgenkristallstrukturen von insgesamt acht prokaryotischen ABC-Importern gelöst, drei davon im Komplex mit ihrem SBP. Dazu gehören der Maltose-Transporter, der Histidin-Transporter, der Wolframat/Molybdat-Transporter sowie der Vitamin B12-Transporter, dessen Struktur die erste war, die veröffentlicht wurde (Locher et al., 2002). Sie dienen als Modelle zur näheren Untersuchung und Charakterisierung des Aufbaus und des Mechanismus der SBP-abhängigen ABC-Importer.
Einen Überblick über die bisher veröffentlichten Strukturen und der daraus erhaltenen strukturellen Informationen gibt der Übersichtsartikel von Reeset al.(2009).
Anhand der Kristallstrukturen und der Ergebnisse der vielfältigen biochemischen Untersuchungen wurden die ABC-Importer je nach Anzahl der TMHs in Typ I und Typ II unterteilt (Locher, 2009). Typ I-Importer, wie z.B. der Methionin-Transporter MetI aus E.
coli, besitzen insgesamt zehn bis 14 TMHs und Typ II-Transporter, wie z. B. BtuCD-F aus E. coli, bis zu 20 TMHs (Abbildung 10). Zu den SBP-abhängigen Typ I-Importsystemen gehören der Histidin-Transporter HisQMP2sowie der Maltose-Transporter MalFGK2. Die spezifischen Substrate der SBP-abhängigen Typ II-Importer sind dagegen Metallchelate, Häm und Vitamin B12. Die Röntgenstrukturanalysen der Typ I-ABC-Importer zeigen, dass ihre TMDs eine ähnliche Faltung aufweisen (Hollenstein et al., 2007; Oldham et al., 2007;
Gerber et al., 2008; Kadaba et al., 2008; Khare et al., 2009). Dabei bilden sechs zentrale
TMHs im Zentrum eine pseudo-doppelte Symmetrie aus (pseudo-twofold symmetry), die den Translokationskanal für das Substrat über die Membran darstellt.
Abbildung 10: Vergleich von Typ I- und Typ II-Importern.Hier sind die Kristallstrukturen von BtuCD (PDB Code IL7V) und MetI (PDB Code 3DHW) gezeigt, wobei die TMDs in orange und die NBDs in grün dargestellt sind. Das NBD-Dimer ist in beiden Strukturen geöffnet, jedoch gibt es deutliche Unterschiede in Zahl und Anordnung der TMHs (Kunert, 2011).
SBP-abhängige ABC-Importsysteme sind auch an der Aufrechterhaltung des Zellinnendrucks und des Zellvolumens beteiligt, indem sie Kaliumionen und kompatible Solute, wie z.B. Zucker oder Aminosäuren, in das Cytoplasma der Zellen transportieren (Wood, 1999). Dazu gehört beispielsweise der OpuA-Transporter aus Lactococcus lactis,der für den Import von Glycinbetain und Prolin verantwortlich ist. Das Besondere an diesem System ist, dass hier die SBPs direkt mit den TMDs des Transporters fusioniert sind (Abbildung 8D)und dass der C-Terminus der cytoplasmatisch assoziierten NBDs als Sensoren gegenüber Änderungen der Ionenstärke im Inneren der Zelle dienen (Patzlaff et al., 2003). Weitere Beispiele und die bereits beschriebenen SBP-abhängigen ABC-Importer, ihre zugehörigen Substrate und deren zelluläre Funktion sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Beispiele für SBP-abhängige ABC-Importer(Licht und Schneider, 2011).
Transporter Substrat(e) Zelluläre Funktion Referenz Bakterien/Archaea
MalEFGK2 Maltose, Maltodextrine Versorgung mit
Kohlenhydraten Bordignonet al., 2010
HisJQMP2 positiv geladene Aminosäuren Nährstoffversorgung Schneider, 2003 Ameset al.,2001
OppABCDF Oligopeptide Nährstoffversorgung,
Signaltransduktion Doevenet al., 2004
FhuDBC Eisenhydroxamat
(Eisenspeichermolekül) Eisenaufnahme Braunet al.,2004
BtuFCD Vitamin B12 Versorgung mit
Spurenelementen Borthset al., 2005 LsrABCD Al-2 (Autoinduzierer) Quorum Sensing* Liet al., 2007 OpuAA-OpuAB Glycinbetain Osmoregulation Patzlaffet al., 2003
* Chemische Kommunikation zwischen Bakterienzellen zur Messung der sie umgebenden Zelldichte.
Anhand der Röntgenkristallstrukturen von ModBC-A und MalFGK2-E wurde ein möglicher Mechanismus für den Translokationsprozess von Typ I-Importern postuliert (Locher, 2009; Bordignon et al., 2010). Die Autoren stellen den durch die ATP-Bindung induzierten Wechsel der TMD-Konformation von einer zur cytoplasmatischen Seite der Membran geöffneten Form (inward-facing state) zur extrazellulären Seite der Lipidmembran erweiterten Form (outward-facing state) in den Mittelpunkt des skizzierten Ablaufs (Abbildung 11).
Abbildung 11: Translokationsmechanismus von Typ I-Importsystemen.Das SBP ist in blau und das Substrat in rot dargestellt. (nach Locher, 2009; Kunert, 2011).
ABC-Importer erhalten diesem Modell nach in der ATP-gebundenen, nach außen hin geöffneten Konformation ihr Substrat vom jeweiligen SBP. Die anschließende Hydrolyse des ATP führt zu einer Destabilisierung und Dissoziation des NBD-Dimers, wodurch
erneute strukturelle Änderungen in den TMDs hervorgerufen werden. Diese führen zu einer Öffnung des Transporters zur cytoplasmatischen Seite der Membran und zu einem Entlassen des Substrats in das Cytoplasma (Davidson und Chen, 2004; Oldham et al., 2007). Nach Dissoziation von SBP, ADP und Phosphat befindet sich der Transporter wieder in der Ausgangskonformation. Die Röntgenkristallstrukturen von MalFGK2-E in intermediären Zuständen unterstützen dieses Modell (Oldham und Chen, 2011a; 2011b).
Die Konformationsänderungen der NBDs, die zwischen dem Nukleotid-freien, monomeren und dem ATP-gebundenen, dimeren Zustand wechseln, ist wahrscheinlich innerhalb der gesamten ABC-Transporter-Familie konserviert. Die Konformationen der TMDs sind in den bisher bekannten Strukturen hingegen divers. Möglicherweise entwickelten die TMDs aufgrund der Verschiedenartigkeit der transportierten Substrate und der Transportrichtungen unterschiedliche Wege, die konformationellen Änderungen der NBDs an die Substrattranslokation zu koppeln. Auch geht man aufgrund der hohen Konservierung einzelner Motive in der Sequenz der NBDs davon aus, dass die ATP- Bindung und -Hydrolyse in allen ABC-Transportern nach einem ähnlichen Prinzip abläuft.
Es wird angenommen, dass das für Typ I-ABC-Importer beschriebene alternate access- Modell (Abbildung 11) ähnlich auch für die ABC-Exportsysteme gilt. Für die ABC- Importer des Typs II wird hingegen ein anderer Mechanismus vermutet (Licht und Schneider, 2011). Die Strukturen der Typ II-Importer zeigen, dass hier die TMHs der beiden TMDs eng zusammenlagern (Locheret al., 2002; Hvorup et al., 2007; Pinkett et al., 2007). In ihrer Mitte befindet sich die Translokationspore für das Substrat. Hier ist bemerkenswert, dass diese Pore wesentlich kleiner ist, als bei den Typ I-Importern, obwohl deutlich größere Substrate transportiert werden. Zudem deuten Ergebnisse biochemischer und biophysikalischer Studien an BtuFCD (Goetz et al., 2009; Lewinson et al., 2010) auf weitere Unterschiede im Mechanismus der Transportzyklen beider Untergruppen der SBP- abhängigen ABC-Importer hin. Zur Entwicklung eines gültigen Modells für die Typ II- Importer sind strukturelle Informationen und hochaufgelöste Strukturen eines ABC- Transportkomplexes des Typ II nötig, der sich in verschiedenen Zuständen innerhalb des Translokationszyklus befindet. Dabei sind besonders die Übergangszustände zwischen der geöffneten und der geschlossenen Form interessant, da diese von denen der Typ I- Importer und von denen der Exporter abzuweichen scheinen. Des Weiteren würden solche Strukturen zu einem verbesserten molekularen Verständnis des Translokationsprozesses an sich und der damit verbundenen Mechanismen beitragen.
5.2Energy coupling factor-ABC-Importer
Die erst kürzlich identifizierte Klasse der ECF-ABC-Transporter ist für die Aufnahme von Spurenelementen wie Vitamine, deren Vorstufen und bestimmten Übergangsmetalle in Bakterien und Archaea verantwortlich. Beispiele für diese Importer und die zugehörigen Substrate sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2: Beispiele für ECF-ABC-Importer(Licht und Schneider, 2011).
Transporter Substrat Zelluläre Funktion Referenz Bakterien/Archaea
BioYNM Biotin Versorgung mit:
Spurenelementen Eitingeret al., 2011 RibU Riboflavin (Vitamin B2,
Vorstufe zu FAD, FNM) Spurenelementen
und Vorstufen Eitingeret al., 2011
ThiT Thiamin (Vorstufe zu
Vitamin B1) Spurenelementen
und Vorstufen Eitingeret al., 2011 CbiMNQO Kobalt (Cofaktor für
Enzyme) Übergangsmetallen Eitingeret al., 2011 Wie die zuvor besprochenen ABC-Importsysteme sind auch die ECF-Transporter aus zwei NBDs aufgebaut, die auch hier den Transportzyklus energetisieren. Sie heißen in diesen Transportsystemen A-Komponenten. Der wesentliche Unterschied zwischen den ECF-Systemen und den zuvor beschriebenen ABC-Importern besteht jedoch in dem weiteren modularen Aufbau der ECF-Transporter und im Fehlen eines extrazellulären SBPs. Zusätzlich zu den A-Komponenten bestehen die ECF-Importer aus einer konservierten TMD, T-Komponente genannt, und einer kleineren, Substrat-bindenden TMD, der S-Komponente, welche die Substratspezifität bestimmt (siehe Abschnitt 3.1, Abbildung 1). Über die genaue Anzahl und Stöchiometrie der Untereinheiten in den ECF- Transportern wird zurzeit noch diskutiert (Finkenwirth et al., 2010; ter Beek et al., 2011).
Kürzlich wurden mittels bioinformatischer Analysen über 20 unterschiedliche Familien der S-Komponenten identifiziert, die jeweils wiederum verschiedene Substratspezifitäten aufweisen (Rodionovet al., 2009).
Erst vor kurzem wurde die erste Röntgenkristallstruktur einer S-Komponente, der membranintegralen Substrat-bindenden Untereinheit, gelöst. Dabei handelt es sich um RibU der Gruppe der Riboflavin-Transporter aus S. aureus. Die Struktur zeigte, dass RibU aus sechs transmembranen Segmenten besteht, von denen drei TMHs und eine extracytoplasmatische Schleife für die Bindung des Substrates Riboflavin verantwortlich sind (Zhanget al., 2010). Die Transmembran-Untereinheit, die sogenannte T-Komponente, ist wie die TMDs der klassischen ABC-Importsysteme nur wenig charakterisiert. Sie unterscheiden sich in der Anzahl der TMHs, haben jedoch zwei hoch konservierte
Sequenzmotive gemeinsam (A-R-G), die der EAA-Sequenz in den SBP-abhängigen ABC- Importern entsprechen. Anhand von Mutationsanalysen wird für die beiden konservierten A-R-G-Bereiche eine Bedeutung für die Signalübertragung zwischen den Untereinheiten und für die Stabilität des Proteinkomplexes angenommen (Neubaueret al.,2009). Sonst ist die Art der Signalübertragung und der Interaktion der Untereinheiten miteinander noch unklar. Hier sind weitere Untersuchungen zur strukturellen Natur der ECF-ABC- Transporter und zu ihren biochemischen Eigenschaften erforderlich. Eine detaillierte Übersicht zu den ECF-ABC-Transportern findet sich in dem Artikel der Autoren Eitinger et al.(2011).
5.3 ABC-Importsysteme in Eukaryoten
Bisher galt die Annahme, dass eukaryotische ABC-Transporter nur exportierende Funktionen besitzen. Neueste Untersuchungen haben jedoch Hinweise darauf gegeben, dass auch in Pflanzen, Hefe und dem einzelligen Parasiten Toxoplasma gondii ABC- Importsysteme zu finden sein könnten. Das Vorkommen von ABC-Transportern mit importierender Funktion ist allerdings noch nicht anerkannt und eindeutig bewiesen, da diese Annahmen aufgrund von Ergebnissen vonin vivo-Studien getroffen wurden. Für eine zuverlässige Aussage sind Ergebnisse von biochemischen und biophysikalischen Untersuchungen nötig, die an isolierten und gereinigten ABC-Importproteinen eukaryotischen Ursprungs durchgeführt worden sind (Licht und Schneider, 2011). In der Tabelle 3 sind die eukaryotischen ABC-Transporter aufgeführt, für die eine importierende Funktion angenommen wird.
Der erste Hinweis darauf, dass auch in Eukaryoten ABC-Importer auftreten könnten, kam im Jahr 2002 von Wilcox und Mitarbeitern. Sie zeigten, dass die ABCG1-ähnlichen Lipidtransporter Aus1 und Pdr11 aus Saccharomyces cerevisiae unter anaeroben Bedingungen an der Aufnahme von Sterol beteiligt sein können (Wilcoxet al., 2002). Im Jahr 2010 wurde dann von Ehrenman et al. ein weiterer Vertreter der ABCG-Exporter-Unterfamilie beschrieben, der an dem Import von Lipiden beteiligt sein soll. Es handelt sich dabei um ein Homolog zu ABCG5 ausT. gondii. Dessen Überexpression führt zu einer Anreicherung von Cholesterol im Zellinneren (Licht und Schneider, 2011).
Tabelle 3:Eukaryotische ABC-Transporter, für die eine Importfunktion vermutet wird(Licht und Schneider, 2011).
Transporter Substrat Zelluläre Funktion Referenz Toxoplasma gondii
ABCG5(TgABCG107) Cholesterin Transport von Lipiden Ehrenmanet al., 2010 HefeAus1, Pdr11 Cholesterin Transport von Lipiden Wilcoxet al., 2002 Pflanzen
AtABCB14 Malat Regulation der Bewegung
von Spaltöffnungen Leeet al.,2008 (AtPDR12)/ABCG40 Abscisinsäure
(Phytohormon) Beteiligung an
Trockentoleranz Kanget al., 2010
Auch in Pflanzen wurden Transporter identifiziert, die Charakteristika von ABC- Transportern zeigen und zudem putative importierende Funktionen besitzen. So wurde von Lee et al. (2008) der Proteinkomplex ABCB14 beschrieben, der in A. thaliana für den Transport von Malat verantwortlich zu sein scheint. Malat wird dabei anscheinend zur Regulation der Spaltöffnungen von dem freien Diffusionsraum außerhalb der Plasmamembran in die Schließzellen der Stomata transportiert. Eine Überexpression von ABCB14 erhöhte sowohl inE. colials auch in HeLa-Zellen die Malataufnahmeaktivität (Lee et al., 2008). Es gibt noch weitere Beispiele für eukaryotische ABC-Importer wie das CjMDR1-System aus Coptis japonica (Shitan et al., 2003). Licht und Schneider (2011) beschreiben, dass bei Sequenzanalysen putative Homologe zu ECF-Transportern auch in Genomen von Pflanzen gefunden wurden. Es sind jedoch noch zahlreiche biochemische und biophysikalische Untersuchungen nötig, um das Transportverhalten dieser putativen ABC-Importsysteme eindeutig aufzuklären.
6. Funktion der ABC-Exportsysteme
6.1 Verbreitung und Bedeutung der ABC-Exporter
ABC-Exporter sind in den Genomen aller Organismen zu finden, deren Sequenz bisher bestimmt worden ist. Viele Organismen besitzen dabei verschiedene ABC-Exporter, die wiederum eine Vielzahl an physiologischen Funktionen inne haben. So wurden zum Beispiel im menschlichen Genom bisher 48 ABC-Exportsysteme identifiziert (Dean, 2005).
ABC-Exportsysteme transportieren hydrophobe Verbindungen vom Cytoplasma oder von der Innenseite der Cytoplasmamembran in den extrazellulären Raum oder in das Lumen von Organellen, wie z.B. Mitochondrien, Peroxisomen und das Endoplasmatische Retikulum (Holland et al., 2003). Sie vermitteln die Translokation einer Vielzahl an
Substraten, die sowohl in Größe als auch in ihren chemischen Eigenschaften stark variieren können. Dazu gehören Stoffwechselzwischenprodukte, Lipide, Sterole, Antibiotika und Arzneimittel, Proteine sowie Kohlenhydratbestandteile der bakteriellen Zellwand (Davidsonet al., 2008).
Mutationen in den Genen von ABC-Exportern können schwerwiegende Krankheiten auslösen. Dazu gehören die Mukoviszidose, die durch eine Genmutation im Chloridkanalprotein CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) verursacht wird (Kirk und Wang, 2011) sowie die Stargardtsche Makuladegeneration. Bei letzterer handelt es sich um eine Netzhauterkrankung, bei der die schärfste Stelle des Sehens, die Makula, zerstört wird (Allikmets, 2000; Tsybovsky et al., 2011). Auch die Adrenoleukodystrophie (ALDP) beruht auf einem Gendefekt eines ABC-Exportsystems (Mosseret al.,1993). Diese Erbkrankheit tritt meist im Kindesalter auf und führt in ihrem Verlauf zu einem schnellen neurologischen Verfall bis hin zur Demenz. Einige Transporter wie das humane P- Glykoprotein spielen eine große Rolle bei der Entwicklung von Multiwirkstoff-Resistenzen von Tumorzellen gegen Chemotherapeutika (Gottesman et al., 2002). In der Tabelle 4 ist eine Auswahl an ABC-Exportern zusammen mit ihren Substraten und den durch ihren Defekt hervorgerufenen Krankheiten dargestellt. Schon anhand dieser wenigen aufgelisteten Beispiele wird die immense medizinische Bedeutung dieser Transportsysteme deutlich. Das Interesse an einem detaillierten Verständnis sowohl der Struktur der ABC- Transporter als auch des molekularen Mechanismus der Kopplung von ATP-Hydrolyse und Substrat-Translokation ist weiterhin enorm hoch.
Tabelle 4: Beispiele von ABC-Exportsystemen, dargestellt zusammen mit den von ihnen transportierten Substraten und der durch ihren Defekt hervorgerufenen Krankheit (Licht und Schneider, 2011).
Transporter Substrat(e) Funktion bzw. verursachte Krankheit Referenz Bakterien
HlyBDTolC LmrA LolCDE
Hämolysin
multiple Wirkstoffe Lipoproteine
Virulenzfaktor einigerE. coliStämme bestimmte Multiwirkstoff-Resistenz Komponente der bakteriellen äußeren Membran
Zaitsevaet al., 2005b
van Veenet al., 2000
Tokuda, 2009 Hefe
Pdr5 multiple Wirkstoffe bestimmte Multiwirkstoff-Resistenz Guptaet al., 2011 Pflanzen
AtABCC1 Gluthationkonjugate Fremdstoffmetabolismus, Detoxifikation Yazakiet al., Mensch 2009
TAP1/TAP2 (ABCB2/ABCB3) P-Glykoprotein (MDR1, ABCB1) ALDP (ABCD1) ABCR (ABCA4) CFTR (ABCC7)
Antigenpräsentation Lipide der
Cytoplasmamembran langkettige
Fettsäuren Retinal Chloridionen
Transport zum endoplasmatischen Retikulum
Überexpression in bestimmten Tumorzellen führt zu Multiwirkstoff- Resistenz gegenüber Chemotherapeutika Defekt führt zur erblichen Krankheit Adrenoleukodystrophie
Defekt führt zur erblichen Krankheit Stargardtsche Makuladegeneration Mutation führt zur erblichen Krankheit Mukoviszidose
Schölz und Tampé, 2009 Zubenet al., 2007
Mosseret al., 1993
Allikmets, 2000;
Tsybovskyet al., 2011Kirk und Wang, 2011
6.2 Die Rolle der ABC-Exporter in der Biotransformation
Die ABC-Exportsysteme sind auch an dem Prozess der Biotransformation beteiligt.
Darunter versteht man die Umwandlung von körperfremden, d.h. apolaren und lipophilen, Verbindungen in polare und wasserlösliche Metabolite, die so über den Harn und die Gallenflüssigkeit ausgeschieden werden können. Dieser auch Fremdstoffmetabolismus genannte Vorgang findet hauptsächlich in den Zellen der Leber statt.
Die Biotransformation wird in drei Phasen unterteilt. In der Phase 1 werden die körperfremden Stoffe, oder Xenobiotika, modifiziert, in dem sie oxidiert oder seltener reduziert werden. So entstehen reaktive Gruppen. In Phase 2 werden durch die entstandenen Verbindungen an polare Substanzen gekoppelt, wodurch sie ausreichend hydrophil werden. In der Phase 3 werden die nun wasserlöslichen Metabolite über spezifische ABC-Exporter in die Galle oder ins Blut transportiert (Abbildung 12). Durch ihre Beteiligung an der Detoxifikation bzw. der Ausscheidung von körperfremden
Substanzen aus dem Körper wird die Wichtigkeit des Verständnisses der Struktur und des Transportmechanismus dieser Proteine unterstrichen.
Abbildung 12: Schematische Darstellung der Biotransformation mit ihren einzelnen Phasen. In der Phase 1 werden die hydrophoben Xenobiotika meist durch Oxidation, seltener durch Reduktion modifiziert. In Phase 2 werden die in Phase 1 entstandenen funktionellen Gruppen an hydrophile Verbindungen, wie z.B. Glucuronat, gekoppelt. In Phase 3 werden die so entstandenen hydrophilen Metabolite über spezifische ABC-Exporter in die Galle oder ins Blut abgegeben. So können die nun wasserlöslichen Stoffe über den Harn oder die Gallenflüssigkeit ausgeschieden werden (Löffleret al.,2007).
6.3 Mechanismus der ABC-Exporter
Als erste hoch aufgelöste Kristallstruktur eines ABC-Exporters wurde die des Multiwirkstoff-Transporters Sav1866 aus S. aureus bestimmt (Dawson und Locher, 2007).
Sav1866 ist homolog zu anderen Multiwirkstoff-ABC-Transportern und zeigt signifikante Ähnlichkeiten zu den Sequenzen der humanen ABC-Transportsysteme der Unterfamilie B, die das P-Glykoprotein und TAP1/TAP2 enthalten. Biochemische Untersuchungen an Sav1866 ergaben, dass seine ATPase-Aktivität durch Chemotherapeutika wie Doxorubicin, Vinblastin und andere stimuliert wird (Velamakanni et al., 2008). Das deutet auf eine ähnliche Substratspezifität wie das P-Glykoprotein hin, so dass ein gemeinsamer Transportmechanismus vermutet wird. Sav1866 ist ein Halb-Transporter bestehend aus zwei jeweils homologen TMDs und NBDs. Die Struktur zeigt Sav1866 in einem
Adenylyl-β,γ-Imido-Diphosphat (AMP-PNP)-gebundenen Zustand. AMP-PNP ist ein nicht-hydrolysierbares ATP-Analogikum, das zur Ausbildung des prähydrolytischen Zustands des Transportsystems führt. Dabei bilden die NBD-Moniomere ein Dimer, an deren Innenseite zwei Nukleotidmoleküle gebunden sind. Die beiden TMDs liegen im Transporter nicht separat getrennt nebeneinander, sie sind im Gegenteil ineinander verdreht (Abbildung 13).
Abbildung 13: Röntgenkristallstruktur des bakteriellen Multiwirkstoff-Exporters Sav1866 aus S. aureus(PDB Code 2ONJ; Dawson und Locher, 2007). Die TMDs sind ineinander verdreht, wobei jede der beiden Domänen jeweils beide NBDs kontaktiert. Der Translokationskanal ist hier zur extrazellulären Seite geöffnet.
Die Struktur zeigt den Exporter in einer Form, in der sich der aus den TMDs geformte Translokationskanal zur extrazellulären Seite der Membran öffnet (Dawson und Locher, 2007). Dieser Kanal ist relativ hydrophil und besitzt nur wenig oder gar keine Affinität dem transportierten Substrat gegenüber. Allerdings befindet sich in seinem Inneren eine Bindungsstelle für das jeweilige Substrat.
Es wird angenommen, dass die Bindung von ATP an den NBDs zu einer Konformationsänderung der TMDs führt (siehe Abschnitt 4), so dass die Öffnung des Translokationskanals von der cytoplasmatischen Seite zur extrazellulären Seite wechselt.
Dabei wird das hydrophobe Substrat direkt aus dem Translokationskanal herausgedrückt bzw. -gestoßen. Nach der Substratabgabe, der ATP-Hydrolyse und der nachfolgenden Dissoziation von ADP und Pi aus den Bindetaschen der NBDs kommt es erneut zu einer Konformationsänderung der TMDs, so dass der Translokationskanal nun wieder zum
Cytoplasma hin geöffnet ist. Damit ist der Transportzyklus beendet und kann von neuem beginnen. Diese Annahme wird durch biochemische Daten gestützt (Ramachandra et al., 1998; van Veen et al., 2000) und stimmt mit dem bereits erläuterten Mechanismus der Kopplung von ATP-Hydrolyse mit dem Substrattransport überein. Die Röntgenkristallstruktur von Sav1866 zeigt den Transporter in dieser Nukleotid- gebundenen und daher zur extrazellulären Seite geöffneten Konformation (Abbildung 13).
Für die Kommunikation zwischen den TMDs und den NBDs ist vermutlich das innerhalb der bereits beschriebenen strukturell-variablen Region der NBDs lokalisierte konservierte Sequenzmotiv TEVGERG verantwortlich (Schmitt et al., 2003; Dawson und Locher, 2006). Dieses Motiv scheint für ABC-Transporter mit exportierender Funktion spezifisch zu sein; in den bislang bekannten Importsystemen kommt es nicht vor.
7. ABC-Proteine ohne Transportfunktion
Wie bereits in der Einführung erwähnt, kommen neben den ABC-Transportern auch ABC-Proteine vor, die keine zugehörigen TMDs und keine aktive Transportfunktion besitzen. Diese ABC-Proteine, auch als ABC-Systeme bezeichnet, sind Dimere, die je aus zwei hintereinander wiederholt auftretende NBDs besteht (siehe Abbildung 1). Das Fehlen der TMDs lässt darauf schließen, dass die NBDs und die mit ihnen verbundenen Domänen selbst für die Substratspezifität verantwortlich sind. In der Tabelle 5 sind Beispiele solcher ABC-Systeme zusammen mit ihrer Funktion in der Zelle aufgeführt.
Tabelle 5: Beispiele für ABC-Systeme ohne Transportfunktion(Licht und Schneider, 2011).
Transporter Zelluläre Funktion Referenz
Rad50 DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur Hopfner und Tainer, 2003
MutS DNA-mismatch-Reparatur Kunkel und Erie, 2005
eEF3 Elongationsfaktor während Translation
(Proteinbiosynthese) Andersenet al.,2006 Uup DNA-Bindeprotein/Entfernung von
Transposons Zepedaet al., 2010
ABCE1 Initiation der Translation und Biogenese der
Ribosomen (Proteinbiosynthese) Karcheret al., 2008
Für die ABC-Systeme ohne Transportfunktion wird eine Beteiligung an der Regulation von grundlegenden Prozessen in der Zelle wie die DNA-Reparatur oder die Proteinbiosynthese angenommen. Als Beispiele für die ABC-Systeme sind hier das Rad50-
Protein aus Pyrococcus furiosus und das UvrA-Protein aus Bacillus stearothermophilus (Pakotiprapha et al., 2008) genannt, die beide an der DNA-Reparatur beteiligt sind (für einen Überblick siehe Hopfner und Tainer, 2003). An Rad50 wurde erstmals beobachtet, dass die NBD-Monomere im ATP-gebundenen Zustand ein einander entgegengesetzt ausgerichtetes Dimer (head-to-tail arrangement) bilden. Andere bakterielle ABC-Systeme sind an der Ausbildung von Wirkstoff-Resistenzen beteiligt. Einige Vertreter der ABC-Systeme der ABCF-Unterfamilie in Mensch und Hefe sind an der Regulation der Proteinbiosynthese beteiligt, hauptsächlich an der Kontrolle des korrekten Aufbaus der Ribosomen (Davidsonet al., 2008; Andersenet al.,2006).
8. Zusammenfassung und Perspektiven für die Zukunft
Diese Arbeit gibt einen Überblick über die verschiedenen ABC-Transporter mit ihren unterschiedlichen Funktionen. Es wird der Mechanismus der Kopplung zwischen Energiegewinnung aus der ATP-Bindung und Hydrolyse mit der Substrattranslokation dargelegt. Zudem werden die unterschiedlichen Typen an ABC-Transportern vorgestellt und ihre physiologische und medizinische Bedeutung sowie Besonderheiten im Mechanismus näher erläutert.
ABC-Transporter sind an einem so breiten Spektrum von physiologischen Prozessen beteiligt, dass eine eingehende Untersuchung ihrer biochemischen und strukturellen Eigenschaften von höchstem Interesse ist. Insbesondere die ABC-Exporter besitzen aufgrund ihrer Beteiligung an der Biotransformation von Xenobiotika und ihrer Bedeutung für die Ausbildung von schweren Krankheiten eine hohe medizinische und pharmakologische Relevanz.
Besonders die Aufklärung der Kristallstrukturen der prokaryotischen ABC- Importsysteme hat zusammen mit den Daten der zahlreichen biochemischen Untersuchungen dazu beigetragen, ein Modell zum Ablauf des Transportzyklus aufzustellen. Doch trotzdem so in den letzten Jahren eine große Menge an Wissen generiert werden konnte, sind einige Aspekte der Kopplung zwischen ATP-Hydrolyse und Substrattranslokation sowie des molekularen Mechanismus dieser Transportsysteme noch immer nicht eindeutig geklärt und verstanden. So haben die Unterschiede, die zwischen den Kristallstrukturen der Typ I- und Typ II-Importer festgestellt wurden, gezeigt, dass hier noch weitere Studien nötig sind – auch um den Mechanismus der Exporter vollständig zu verstehen. Generell sind besonders Strukturen von ABC-Transportern in den Übergangszuständen innerhalb des Translokationszykluses von Interesse. Auch sollen zunehmend ABC-Transportkomplexe in ihrer natürlichen Lipidumgebung untersucht werden. Die größte Herausforderung für die Forschung in den nächsten Jahren wird es sein, eine hoch aufgelöste Struktur eines humanen oder Säugetier-ABC-Exporters zu erhalten. Erstrebenswert dabei wäre, dass der Transporter sein Substrat gebunden hat und seine Struktur jeweils in den verschiedenen Zuständen des Transportvorgangs vorliegt. Mit einem solchen Wissen zu den Strukturen der ABC-Transportsysteme, zusammen mit den Ergebnissen der vielfältigen biochemischen und biophysikalischen Untersuchungen, wird es in der Zukunft hoffentlich möglich, neue Wege für Therapien der auf Defekten in ABC- Transportern beruhenden Krankheiten und für die Behandlung von Tumoren zu finden.
Literaturverzeichnis
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