Putative Tumorstammzellen mit SP-Phänotyp in aggressiven B-Zell-Lymphomen

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(Prof. Dr. med. L. Tr¨ umper) im Zentrum Innere Medizin

der Medizinischen Fakult¨ at der Universit¨ at G¨ ottingen

Putative Tumorstammzellen mit SP-Ph¨anotyp in aggressiven B-Zell-Lymphomen

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades

der Medizinischen Fakult¨at

der Georg-August-Universit¨at zu G¨ottingen

vorgelegt von

Nina Diering

aus Hamburg

G¨ottingen 2015

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. H. K. Kroemer

I. Berichterstatter: Prof. Dr. med. G. G. Wulf II. Berichterstatter:

Tag der m¨undlichen Pr¨ufung:

Abbildungsverzeichnis VI

Tabellenverzeichnis VIII

Abk¨urzungsverzeichnis X

1 Einleitung 1

1.1 Aggressive Non-Hodgkin-Lymphome . . . 1

1.1.1 Klassifizierung der diffusen großzelligen B-Zell-Lymphome 2 1.1.2 Therapie aggressiver Non-Hodgkin-Lymphome . . . 3

1.2 Konzept der Tumorstammzelle . . . 4

1.2.1 Cancer Stem Cells (CSC) in soliden Tumoren . . . 6

1.3 Side Population . . . 6

1.3.1 Side Population in h¨amatologischen Malignomen . . . 7

1.3.2 Transporter der ABC-Familie . . . 10

1.3.3 Aldehyddehydrogenase 1-Aktivit¨at als Marker f¨ur Progeni- torzellen . . . 12

1.4 Aufgabenstellung und Zielsetzung . . . 13

2 Material, Methoden und Patientenproben 14 2.1 Material . . . 14

2.1.1 Ger¨ate . . . 14

2.1.2 EDV . . . 15

2.1.3 Verbrauchsmaterialien . . . 16

2.1.4 Chemikalien . . . 17

2.1.5 Enzyme . . . 18

2.1.6 Kits . . . 19

2.1.7 Proteine . . . 19

2.1.8 Antik¨orper . . . 19

III

Inhaltsverzeichnis IV

2.1.9 Primer . . . 20

2.1.10 PBS-Pufferl¨osung . . . 20

2.1.11 Plasmide . . . 21

2.1.12 Chemotherapeutika . . . 23

2.1.13 Hitzeinaktiviertes FCS . . . 23

2.1.14 Zellkulturmedien . . . 24

2.1.15 Zelllinien . . . 24

2.2 Zellbiologische Methoden . . . 25

2.2.1 Kultivieren von Zellen . . . 25

2.2.2 Kryokonservierung von Zellen . . . 25

2.2.3 Revitalisieren von Zellen . . . 25

2.2.4 Zellzahlbestimmung mittels Neubauer-Z¨ahlkammer . . . . 26

2.2.5 Durchflusszytometrie . . . 26

2.2.5.1 H¨ochstf¨arbung . . . 27

2.2.5.2 Kombinierte F¨arbung mit Hoechst 33342 und ei- nem Chemotherapeutikum . . . 28

2.2.5.3 Aldefluor^R-F¨arbung . . . 28

2.2.6 Antik¨orperf¨arbung . . . 30

2.2.7 Zytotoxizit¨atstests . . . 30

2.2.7.1 MTT-Assay . . . 30

2.2.7.2 Annexin-V-F¨arbung . . . 31

2.2.8 Isolation mononukle¨arer Zellen mittels Dichtegradienten- zentrifugation . . . 32

2.2.9 Klonogenit¨atsassay . . . 33

2.2.10 Anlegen von Mischkulturen . . . 34

2.2.11 Lentivirale Transfektion . . . 34

2.3 Molekularbiologische Methoden . . . 36

2.3.1 RNA-Extraktion . . . 36

2.3.2 DNA-Extraktion . . . 37

2.3.3 RNA/DNA-Konzentrationsbestimmung . . . 37

2.3.4 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) . . . 38

2.3.5 Quantitative Real-time-PCR f¨ur ABCA3 . . . 39

2.3.6 IgH-PCR . . . 40

2.3.6.1 GeneScan^R . . . 42

2.3.7 Genearray . . . 42

2.3.7.1 Statistik . . . 43

2.3.8 Patientenproben und Ethik . . . 44

3 Ergebnisse 45 3.1 H¨ochstf¨arbungen . . . 45

3.2 Prozentualer Anteil der Side Population . . . 47

3.3 Aldehyddehydrogenase 1 . . . 48

3.4 Klonogenit¨atsanalyse von SP- und NSP-Zellen . . . 50

3.5 Isolationskulturen . . . 53

3.6 Resistenz der Side Population gegen¨uber Chemotherapeutika . . . 55

3.7 Bestimmung der EC50 Werte . . . 56

3.8 Einfluss der Behandlung mit einem Zytostatikum auf die SP- und NSP-Zellen . . . 58

3.9 Expressionslevel von ABCA3 . . . 61

3.10 Mischversuche mit GFP-markierten Zellen . . . 62

3.11 Genearray . . . 63

3.11.1 Differentiell exprimierte Gene . . . 66

3.12 Nachweis einer Side Population in Prim¨armaterial . . . 67

3.12.1 Zugeh¨origkeit der detektierten Side Population zum mali- gnen Klon . . . 69

3.12.1.1 IgH-PCR . . . 70

4 Diskussion 71 4.1 Detektion der Side Population und ihr prozentualer Anteil . . . . 71

4.2 Eigenschaften der CSC . . . 73

4.3 Dynamik und Heterogenit¨at der Side Population . . . 75

4.3.1 Genexpressionsdaten der aggressiven B-Zell-Lymphome . . 76

5 Zusammenfassung 80

6 Literaturverzeichnis 81

Abbildungsverzeichnis

1.1 Rolle der CSC bei der Tumorentstehung und dem Tumorerhalt . . 5

1.2 Darstellung der Side Population mit und ohne Zugabe von Verapamil 7 2.1 Aufbau des ABCA3-Plasmids - pEGFP-N1+ABCA3 . . . 21

2.2 Aufbau des pLKO.1-Plasmids . . . 22

2.3 Aldefluor-F¨arbung . . . 29

2.4 Prinzip der Annexin-V-F¨arbung . . . 32

3.1 H¨ochstf¨arbungen . . . 46

3.2 Prozentualer Anteil der Side Population in B-NHL-Zelllinien . . . 47

3.3 Aldefluor^R-F¨arbung von Lymphomzellen . . . 49

3.4 Makroskopisches und Mikroskopisches Bild der Colony Assays . . 51

3.5 Colony Assays untersuchter Zelllinien . . . 52

3.6 Colony Assay - Daten aller Zelllinien zusammengefasst . . . 53

3.7 Wachstumskurven der Kulturen isolierter SP- und NSP-Zellen . . 54

3.8 H¨ochstf¨arbungen nach isolierter Kultur von SP- und NSP-Zellen. von OCI-Ly3 . . . 55

3.9 Resistenz der Side Population gegen¨uber Chemotherapeutika . . . 56

3.10 Ermittlung der EC50 . . . 57

3.11 Durchflusszytometeranalyse der SP- und NSP-Zellen nach 24-st¨undiger Inkubation mit Doxorubicin und anschließender Annexin-V-F¨arbung 59 3.12 Vitalit¨at der SP- versus NSP-Zellen nach Behandlung mit Doxoru- bicin . . . 60

3.13 ABCA3-Expression . . . 61

3.14 Mischkulturen von OCI-Ly3 . . . 63

3.15 Principal Component Analysis von BALM-3, Karpas 422, OCI- Ly3, Ramos und SU-DHL-4 . . . 65

3.16 Differentiell exprimierte Gene in SP- und NSP-Zellen. . . 67

3.17 H¨ochstf¨arbungen von Prim¨armaterial . . . 68

VI

3.18 Zugeh¨origkeit der detektierten SP-Zellen zum malignen Klon . . . 69 3.19 Genescan der SP- und NSP-Zellen aus Prim¨armaterial . . . 70

Tabellenverzeichnis

1.1 Tumorstammzellen in soliden und h¨amatopoetischen Malignomen 9

2.1 Ger¨ate . . . 14

2.2 EDV . . . 15

2.3 Verbrauchsmaterialien . . . 16

2.4 Chemikalien . . . 17

2.5 Enzyme . . . 18

2.6 Kits . . . 19

2.7 Proteine . . . 19

2.8 Antik¨orper . . . 19

2.9 Primer . . . 20

2.10 Pufferl¨osung . . . 20

2.11 Chemotherapeutika . . . 23

2.12 Zellkulturmedien . . . 24

2.13 Zellinien . . . 24

2.14 Annexin-Puffer . . . 31

2.15 Plasmidmix . . . 34

2.16 Verd¨unnung des Transfektionsreagenzes . . . 35

2.17 Mastermix f¨ur die cDNA-Synthese . . . 38

2.18 Einstellungen am Thermocycler f¨ur die cDNA-Synthese . . . 39

2.19 Mastermix f¨ur die Real-time-PCR . . . 40

2.20 Einstellungen am Thermocycler f¨ur die TaqMan^TM Real-time-PCR 40 2.21 Mastermix f¨ur die IgH-PCR . . . 41

2.22 Einstellungen am Thermocycler f¨ur die IgH-PCR . . . 42

3.1 Prozentualer Anteil der Side Population in B-NHL-Zelllinien . . . 47

3.2 EC50 Werte f¨ur Doxorubicin und Mitoxantron . . . 57 3.3 Anzahl der differenziell exprimierten Gene in SP- und NSP-Zellen 64

VIII

3.4 Prozentualer Anteil der Side Population in Patientenproben mit B-Zell NHL . . . 68

Abk¨ urzungsverzeichnis

ABC ATP binding cassette ABC-Typ activated B-cell-like type ALDH Aldehyd-Dehydrogenase AML akute myeloische Leuk¨amie APC Allophycocyanin

API Application Programming Interface ATP Adenosintriphosphat

BCNU Bis-Chlorethyl-Nitroso-Urea

bp Basenpaare

BSA bovine serum albumin CD cluster of differentiation CFU colony-forming unit

CHOP Cyclophosphamid, Hydroxydaunorubicin, Vincristin, Prednisolon CML chronische myeloische Leuk¨amie

COO cell of origin (Ursprungszelle) CR complete remission (Vollremission)

CSC Cancer Stem Cell(s) (Tumorstammzelle(n)) DEAB Diethylaminobenzaldehyd

DLBCL diffuse large b-cell lymphoma(diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom) DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleins¨aure EBV Epstein-Barr-Virus

X

EC50 half maximal effective concentration (in vitro)

FACS fluorescence activated cell scan (Durchflusszytometrie) FCS fetal calf serum (F¨otales K¨alberserum)

FDR false discovery rate FITC Fluoresceinisothiocyanat FKS f¨otales K¨alberserum FL1 Fluoreszenzkanal 1

xg x-fache Erdbeschleunigung GCL-Typ germinal center-like type GCP good clinical practice

GFP Gr¨un fluoreszierendes Protein

IgH immunoglobulin heavy chain (Immunglobulinschwerkette) IMDM Iscove’s Modified Dulbecco’s Media

IPI International Prognostic Index KI Karnofsky-Index

LDH Laktatdehydrogenase L-Glut L-Glutamin

MDR1 multidrug resistance protein 1

MRP multidrug resistance-associated protein

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

MW Mittelwert

NADH Nicotinamid-Adenin Dinucleotid; reduzierte Form

NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat; reduzierte Form NHL Non-Hodgkin-Lymphom

NOD/SCID non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency NSP Non Side Population

Abk¨urzungsverzeichnis XII

PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzl¨osung) PCA principal component analysis

PCR Polymerase Kettenreaktion PE Phyocoerythrin

Pen/Strep Penicillin-Streptomycin PI Propidiumiodid

REAL Revised-European-American-Lymphoma RNA Ribonukleins¨aure

rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) RPMI Roswell Park Memorial Institute Medium 1640

RT Raumtemperatur

SP Side Population

TAL Transkriptomanalyselabor UV Ultraviolett

WHO World Health Organization

1.1 Aggressive Non-Hodgkin-Lymphome

Nachdem seit der Erstbeschreibung des M. Hodgkin in 1858 durch R. Virchow im 19ten und 20sten Jahrhundert die heute bekannten Typen der Lymphome histopathologisch beschrieben worden waren, bestanden zun¨achst mehrere zu- sammenfassende Klassifikationssysteme f¨ur Lymphome parallel. In Deutschland dominierte die Kiel - Klassifikation, w¨ahrend in den USA vermehrt die Working Formulation of Non-Hodgkin’s Lymphoma for Clinical Usage verwendet wurde.

Die erste einheitliche Klassifikation erm¨oglichte die REAL (Revised-European- American-Lymphoma)-Klassifikation im Jahr 1994 (Taylor und Hartsock 2011).

Hier flossen sowohl immunhistochemische und genetische Merkmale als auch zel- lul¨are Herkunft und klinisch relevante Eigenschaften der Lymphome in die Ein- teilung mit ein. Außerdem wurde das Hodgkin-Lymphom mit seinen Unterfor- men (klassischer Morbus Hodgkin versus Lymphozyten-pr¨adominanter Morbus Hodgkin) ebenfalls integriert. Anschließend stellte dieWorld Health Organization (WHO) ein Expertenteam zusammen und ¨uberarbeitete die REAL-Klassifikation erneut. So entstand die seit 2001 g¨ultige ”WHO-Klassifikation der Malignen Lym- phome”(Stein 2000).

Die aggressiven B- und T-Zell-Lymphome (hochmaligne NHL nach der Kiel- Klassifikation) umfassen auf Basis der WHO-Einteilung alle Pr¨a- und Post- Keim- zentrumslymphome sowie die Lymphome aus Vorl¨auferzellen. Hierbei handelt es sich zu 85% um B- und zu 15% um T-Zell-Lymphome (Tr¨umper et al. 2012). Das weitaus h¨aufigste aggressive Non-Hodgkin-Lymphom ist mit 30%-40% das diffuse großzellige B-Zell-Lymphom (diffuse large b-cell lymphoma (DLBCL)), das unter anderem die zentroblastische-, die immunoblastische- und die anablastische Vari- ante nach der Kiel-Klassifikation umfasst (Anagnostopoulos und Stein 2000). Das Burkitt-Lymphom umfasst etwa 4% aller aggressiven Non-Hodgkin-Lymphome und ist somit eine sehr seltene Erkrankung. Es ist in den meisten F¨allen EBV

1

1.1 Aggressive Non-Hodgkin-Lymphome 2

(Epstein-Barr-Virus)-assoziiert. Das Burkitt-Lymphom wurde urspr¨unglich ver- mehrt in den Malariagebieten Afrikas beobachtet und stellt eine der h¨aufigsten Tumorerkrankungen bei Kindern in diesen Gebieten dar. Des Weiteren finden sich HIV-assoziierte Formen und das sporadische Burkitt-Lymphom, welches ei- ne ¨außerst seltene Tumorentit¨at darstellt (Kompetenznetz Maligne Lymphome, http://www.lymphome.de/InfoLymphome/PathologieUndKlassifikation/

KlassNHL/index.jsp). Klinisch ¨außert sich ein NHL vorwiegend mit meist schmerz- losen Lymphknotenschwellungen sowie mit Allgemeinsymptomen wie M¨udigkeit, Abgeschlagenheit und Infektanf¨alligkeit. H¨aufig kommt es zu sogenannten B- Symptomen, unter denen man einen Symptomkomplex aus Fieber>38^◦C, Nacht- schweiß oder ungewolltem Gewichtsverlust von>10% des K¨orpergewichtes inner- halb der vergangenen sechs Monate zusammenfasst (Tr¨umper et al. 2012).

1.1.1 Klassifizierung der diffusen großzelligen B-Zell-Lymphome Basierend auf ihren Genexpressionsprofilen wurde vorgeschlagen, innerhalb der Gruppe der diffusen großzelligen B-Zell-Lymphome drei Subtypen, benannt nach einer vermuteten Ursprungszelle (COO, cell of origin), zu unterscheiden. So be- schrieben im Jahre 2000 Alizadeh et al. zwei dieser Untergruppen: Zum einen den germinal center-like-Typ (GCL-Typ) und zum anderen denactivated B-cell like- Typ (ABC-Typ). Auf molekulargenetischer Ebene ¨ahneln die B-Zellen des GCL DLBCL denen des Keimzentrums, wohingegen die Zellen des ABC-Typs geneti- sche ¨Ahnlichkeit mit aktivierten B-Zellen des Blutes aufweisen (Staudt und Dave 2005). Diese beiden Subtypen unterscheiden sich sowohl in ihren dominierenden onkogenen Signalwegen als auch in ihrer klinischen Prognose. GCL DLBCL wei- sen beispielsweise eine erh¨ohte Expression des Transkriptionsfaktors BCL-6 auf, durch den vermutlich die Differenzierung der B-Zellen mittels Blimp-1 zu Plas- mazellen blockiert wird (Alizadeh et al. 2000; Shaffer et al. 2000). In den DLBCL vom ABC-Typ steht die hohe Aktivit¨at des nukle¨aren Faktors kappa B (NF-kB) im Vordergrund, die f¨ur das ¨Uberleben des malignen Klones von großer Bedeu- tung ist (Davis et al. 2001). Klinisch ist mit der Differenzierung eines DLBCL in den Typ des activated B-cell-Typs eine geringere Chemotherapiesuszeptibilit¨at und k¨urzere ¨Uberlebensdauer assoziiert (Sweetenham 2011).

Der dritte eigenst¨andige Subtyp wurde 2003 durch Savage et al. beschrieben und als mediastinaler Typ bezeichnet (Savage et al. 2003).

1.1.2 Therapie aggressiver Non-Hodgkin-Lymphome

Bei den aggressiven Lymphomen handelt es sich um schnell proliferierende Tu- moren, die in der Regel zeitnah nach Erstdiagnose behandelt werden m¨ussen, um eine unmittelbare Lebensbedrohung f¨ur die Patienten abzuwenden. Prognostisch entscheidend f¨ur eine m¨ogliche Heilung ist das rasche Herbeif¨uhren einer Voll- remission (CR) durch die Prim¨artherapie. Das Ziel einer CR erreichen ca. 90%

aller Patienten, von denen wiederum k¨onnen mehr als 50% geheilt werden. Um weitere Aussagen ¨uber die Krankheitsprognose treffen zu k¨onnen, wird anhand von Risikofaktoren der Internationale Prognostische Index (IPI) berechnet. In den IPI fließen das Alter, das Stadium, extranodale Manifestationen, Karnofsky- Index (KI) und die Laktatdehydrogenase (LDH) mit ein. Bei Patienten unter 60 Jahren werden lediglich die LDH, das Stadium und der KI mit einbezogen. Keine Ber¨ucksichtigung finden die bulky disease (>7,5 cm) sowie die molekular- und zytogenetischen Merkmale, anhand derer die DLBC-Lymphome in den aktivier- ten B-Zell- (ABC) und den Keimzentrums-Typ (GCL) unterteilt werden k¨onnen (Tr¨umper et al. 2012).

Zur Prim¨artherapie der DLBCL wird bei Stadium I-IV eine Kombination von Zy- tostatika nach dem R-CHOP-Schema eingesetzt, i.e. eine Zusammenstellung aus Cyclophosphamid (Alkylanz), Hydroxy-Doxorubicin (TopoisomeraseII-Hemmer, Anthrazyklin), Vincristin (Mitosespindelgift), Prednisolon (Glukokortikoid) und Rituximab (CD20-Antik¨orper). Die Addition des CD20 Antik¨orpers zeigte signifi- kante Vorteile im Vergleich zur alleinigen Chemotherapie und wird daher in allen Alters-und Risikogruppen eingesetzt (Boye et al. 2003). In der Regel umfasst die prim¨are Therapie sechs bis acht Zyklen mit den oben genannten Therapeutika, teilweise mit nachfolgender Radiotherapie. Da mehr als die H¨alfte der Patien- ten ¨uber 60 Jahre alt ist, ist in vielen F¨allen mit einer geringeren Belastbarkeit und begleitenden Vorerkrankungen zu rechnen, wodurch die Chemotherapie ggf.

angepasst werden muss.

Rezidive treten meist in den ersten drei Jahren auf, in ihrer H¨aufigkeit mit deut- licher Abh¨angigkeit vom initialen Stadium und den weiteren Faktoren des IPI.

Tritt das Rezidiv bereits im ersten Jahr nach Chemotherapie auf, so ist die Pro- gnose schlecht. Zu sp¨ateren Zeitpunkten kann immer noch ein kurativer Ansatz mittels Zweitlinientherapie, z.B. mit dem Dexa-BEAM-Schema (Dexamethason

1.2 Konzept der Tumorstammzelle 4

plus Carmustin (Bis-Chlorethyl-Nitroso-Urea (BCNU)) plus Etoposid plus Cyta- rabin plus Melphalan) oder R-DHAP-Schema (Rituximab, Dexamethason, hoch- dosis Cytarabin und Cisplatin) gew¨ahlt werden; wobei auch beim Dexa-BEAM- Schema eine erneute Gabe von Rituximab m¨oglich ist. Spricht ein junger Patient (< 65 Jahre) auf die wiederholte Chemotherapie gut an, sollte eine autologe Stammzelltransplantation angestrebt werden. Ist es nach f¨unf Jahren noch zu keinem Rezidiv gekommen, ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass es auch in Zu- kunft nicht mehr dazu kommen wird. Nach Ablauf von etwa 10 Jahren ist jedoch ein vermehrtes Auftreten von Zweitmalignomen zu beobachten (Gisselbrecht et al. 2010; Tr¨umper et al. 2012).

1.2 Konzept der Tumorstammzelle

Die drei entscheidenden Eigenschaften einer Stammzelle sind die F¨ahigkeit zur langfristigen Selbsterneuerung, die F¨ahigkeit zur asymmetrischen Teilung mit Hervorbringen eines Funktionsgewebes (Parenchym) und die Regulation dieser beiden Prozesse. Bevor die Idee der Existenz einer Tumorstammzelle (cancer stem cell (CSC)) 1997 durch die Arbeit von Bonnet und Dick ein Gesicht bekam, galt die Theorie der klonalen Evolution als Basismodell der Tumorentstehung.

Dieses Modell geht von der Annahme aus, dass beliebige Zellen in einem Zellver- band durch Mutationen die F¨ahigkeit zur klonalen Expansion erwerben. Dieses Potenzial wurde jeder Zelle im entstandenen Tumorverband zugesprochen (No- well 1976). Ein kritikw¨urdiger Aspekt dieses Modells ist, dass ausdifferenzierte Zellen zumeist lediglich ¨uber eine kurze Lebensspanne verf¨ugen und der Zeitraum, um genetische Mutationen zu akkumulieren und zu entarten somit sehr gering ausfallen w¨urde. Stammzellen hingegen haben eine durchaus gr¨oßere

”Chance“, Ver¨anderungen in der Erbsubstanz anzuh¨aufen (F´abi´an et al. 2009). Des Wei- teren liefert dieses Modell keine Erkl¨arung f¨ur die zellul¨are Heterogenit¨at inner- halb eines Tumors oder die Tatsache, dass eine große Anzahl an Tumorzellen erforderlich ist, um neues Tumorwachstum zu initiieren (Sengupta und Cancelas 2010). Die Grundlage f¨ur ein hierarchisches Tumormodell lieferten Bonnet und Dick 1997. Sie beschrieben, dass an der Basis einer hierarchisch strukturierten Leuk¨amieerkrankung eine Population von Vorl¨auferzellen steht, die in der Lage ist, in NOD/SCID (Non-Obese Diabetic/Severe Combined Immunodeficiency)-

M¨ausen eine akute myeloische Leuk¨amie (AML) zu erzeugen. Leuk¨amie initiieren- de Zellen sind - wie gesunde h¨amatopoetische Progenitorzellen - durch gleichzeitig vorliegende CD34-Positivit¨at und CD38-Negativit¨at gekennzeichnet und liefern dadurch einen Hinweis auf ihre Verwandtschaft mit primitiven h¨amatopoetischen Vorl¨auferzellen (Bonnet und Dick 1997). Neben der Annahme, dass eines dieser Modelle die Tumorentstehung korrekt widerspiegelt, ist gleichzeitig eine Kombi- nation beider Modelle denkbar, indem auch die CSC durch genetische Aberra- tionen zu einer neuen CSC-Population mit klonalem Evolutionspotenzial mutiert (Barabe et al. 2007). Uneinigkeit besteht noch dar¨uber, ob es sich bei den CSC um Stammzellen im eigentlichen Sinne handelt, die durch Mutationen zu Tumorzellen geworden sind oder um Zellen, die zum Zeitpunkt der malignen Transformation in ihrer Differenzierung schon weiter fortgeschritten waren und durch genetische Ver¨anderungen die Eigenschaften einer Stammzelle (Selbsterneuerung, asymme- trische Teilungsf¨ahigkeit und Langlebigkeit) zur¨uckgewonnen haben (Visvader und Lindeman 2008). Zur Erl¨auterung soll die folgende Abbildung aus einem Review-Artikel von F´abi´an et al. aus dem Jahre 2009 dienen.

Abbildung 1.1: Rolle der CSC bei der Tumorentstehung und Tumorerhalt. Durch genetische Aberrationen erhalten Stamm-, Progenitor- oder ausdifferenzierte Zellen eines gesunden Gewebes die Eigenschaften der CSCs. Sie sorgen durch ihre Langlebig- keit und F¨ahigkeit zur asymmetrischen Teilung f¨ur den Erhalt des Tumorgewe- bes. Innerhalb des Tumorgewebes k¨onnen wiederum Zellen die F¨ahigkeit zur klo- nalen Evolution erwerben und ggf. sogar zur dominierenden und Tumorbiologie- bestimmenden Population werden. (F´abi´an et al. 2009, S. 68. Mit freundlicher Genehmigung des Verlages John Wiley & Sons, ^c 2008 International Society for Advancement of Cytometry)

1.3 Side Population 6

Eine weitere Erg¨anzung zum oben genannten Tumormodell lieferten Liang et al.

und Hu et al. Beide Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass artifiziell hervorgeru- fene DNA-Sch¨adigung durch UVA-Licht bzw. Zytostatika die Ausbildung von CSCs induziert. Damit liefern sie einen entscheidenden Hinweis daf¨ur, dass CSC m¨oglicherweise obendrein aus Zellen innerhalb der heterogenen Tumormasse ent- stehen k¨onnen (Liang et al. 2010; Hu et al. 2012).

1.2.1 Cancer Stem Cells (CSC) in soliden Tumoren

F¨ur die Entwicklung tumorspezifischer Therapiekonzepte k¨onnen die Identifi- zierung und Charakterisierung der oben genannten CSC von Bedeutung sein.

Als Marker f¨ur Tumorstammzellen dienen bei soliden Tumoren im Wesentlichen Oberfl¨achenproteine. So wird beispielsweise CD133 f¨ur die Identifizierung einer kleinen Zellpopulation mit hoher Tumorigenit¨at in Prostata- (Tang et al. 2007;

Mimeault und Batra 2009), Leber- (Suetsugu et al. 2006) und auch Bronchialkar- zinomen (Eramo et al. 2008) verwendet. Auch CD44 wurde als m¨oglicher Marker f¨ur CSC in soliden Tumoren vorgeschlagen. CD44 wird, h¨aufig auch in Kombina- tion mit weiteren Oberfl¨acheneigenschaften, unter anderem bei Kolonkarzinomen (Ricci-Vitiani et al. 2007), Mammakarzinomen (Al-Hajj et al. 2003), Blasenkar- zinomen (Chan et al. 2009) und HNO-Tumoren (Prince et al. 2007) in erh¨ohtem Maße auf Zellen exprimiert, die sich durch ihre Langlebigkeit und F¨ahigkeit zur Tumorregenerationin vitro oderin vivo auszeichneten.

1.3 Side Population

Als Hilfsmittel f¨ur die Identifizierung von Tumorstammzellen hat sich neben spe- zifischen Oberfl¨achenproteinen ebenfalls die H¨ochstf¨arbung etabliert, mittels de- rer die sogenannte Side Population (SP) detektiert werden kann. Sie findet vor- wiegend bei Malignomen h¨amatologischen Ursprungs Anwendung.

Der Grundstein zur Erforschung der Side Population wurde von Peggy Goodell und ihrer Arbeitsgruppe im Jahre 1996 gelegt. Im Fokus ihrer Arbeit stand ur- spr¨unglich die Frage, inwiefern sich der Zellzyklusstatus auf das Anwachsen der h¨amatopoetischen Stammzellen im Transplantatmodell auswirkt. F¨ur die Zellzy- klusanalysen wurde der Farbstoff Hoechst 33342 verwendet. Das Knochenmark

von M¨ausen wurde mit diesem DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoff gef¨arbt und im Durchflusszytometer analysiert. Hierbei fiel eine kleine Zellpopulation auf, die sich seitlich der Hauptzellpopulation befand (daher der Name Side Population) und mit h¨amatopoetischen Stammzellen angereichert war (Goodell et al. 1996).

Da diese Subpopulation nach Behandlung mit Verapamil nicht mehr detektiert wurde, konnte bereits an dieser Stelle die Beteiligung von ABC-Transportern am Hoechst-Efflux vermutet werden, denn der inhibierende Effekt des Calciumant- agonisten Verapamil war f¨ur das P-Glykoprotein bereits bekannt (Lelong et al.

1991).

Abbildung 1.2: Darstellung der Side Population mit und ohne Zugabe von Verapamil. Das gesamte Knochenmark von M¨ausen wurde mit Hoechst 33342 gef¨arbt und mit- tels Durchflusszyometrie analysiert. (A) Etwa 0,1% aller Zellen stellte sich als schmaler Zellausl¨aufer abseits der Hauptpopulation (Pfeil) dar. (B) Durch Be- handlung mit Verapamil war die Side Population kaum noch detektierbar (Goo- dell et al. 1996, S. 1802. Mit freundlicher Genehmigung des Verlages Rockefeller University Press).

Im Verlauf konnte in zahlreichen gesunden Geweben eine Side Population de- tektiert werden: Lunge (Summer et al. 2003), Herz (Martin et al. 2004), Haut (Larderet et al. 2006), Leber (Shimano et al. 2003), Skelettmuskulatur (Martin et al. 2004; Meeson et al. 2004), Gehirn (Kim und Morshead 2003) und Brustdr¨use (Alvi et al. 2003).

1.3.1 Side Population in h¨amatologischen Malignomen

Wissend, dass die SP im gesunden Gewebe regelhaft mit h¨amatopoetischen Vor- l¨auferzellen angereichert ist, versuchten Forschergruppen die Informationen f¨ur die Detektion pathologisch ver¨anderter h¨amatologischer Stammzellen zu nutzen (Asakura und Rudnicki 2002). Im Jahre 2001 konnte mittels H¨ochstf¨arbung bei

1.3 Side Population 8

61 Patientenproben mit AML in>80% die Existenz einer Side Population nach- gewiesen werden. Zudem zeigten die SP-Zellen eine erh¨ohte Resistenz gegen Dau- norubicin und Mitoxantron, waren also auch dazu in der Lage, lipophile Chemo- therapeutika auszuschleusen und somit deren zytotoxischer Wirkung in gewissem Umfang zu entgehen (Wulf et al. 2001).

Neben der AML wurde bereits der Nachweis f¨ur die Existenz einer SP in der chronischen myeloischen Leuk¨amie (CML) erbracht. Hierf¨ur wurde Material von Patienten untersucht, die sich in der chronischen Phase ihrer CML-Erkrankung befanden. Zellen, die sowohl zum Hoechst-Efflux bef¨ahigt als auch CD34-positiv und CD38-negativ waren, riefen in immunkompromittierten M¨ausen die Produk- tion von bcr-abl-positiven Leuk¨amiezellen hervor (Jørgensen und Holyoake 2007).

Matsui et al. isolierten 2008 eine CD138-negative Subpopulation in humanen Multiplen Myelom-Zelllinien, die sich durch ihre Resistenz gegen Dexametha- son, Lenalidomid, Bortezomib und Cyclophosphamid auzeichnete. Verglichen mit der restlichen Tumormasse wiesen diese Zellen eine signifikant erh¨ohte Aldehyd- Dehydrogenase (ALDH)-Aktivit¨at auf und waren zum Hoechst-Efflux bef¨ahigt (Matsui et al. 2008).

Zusammenfassend l¨asst sich feststellen, dass die F¨arbung mittels Hoechst 33342 die M¨oglichkeit bietet, eine kleine Subpopulation zu identifizieren, die Stamm- zelleigenschaften aufweist und maßgeblich das Therapieansprechen und dessen Verlauf zu beeinflussen vermag.

Der Nachweis einer solchen Side Population in aggressiven Non-Hodgkin-Lympho- men steht bisher jedoch noch aus. Eine ¨Ubersicht ¨uber CSC in soliden Tumoren und h¨amatologischen Malignit¨aten kann der Tabelle 1.1 entnommen werden.

Gewebetyp/

Zelllinie

Art der Iden- tifikation

Charakteristika der Tumor-

stammzellen Autor

Akute myeloische

Leuk¨amie - Mensch Hoechst-Efflux Chemoresistenz,

Tumorwachstum in vivo (Wulf et al. 2001)

Chronisch myeloische

Leuk¨ammie - Mensch Hoechst-Efflux Chemoresistenz, CD34+, CD38- (Jorgensen und Ho- lyoake 2007)

Hodgkin Lymphom -

Mensch Hoechst-Efflux Chemoresistenz, Tumorwachs- tum in vitro

(Nakashima et al.

2010)

Mantelzelllymphom - Maus (transgenes Mantlezelllymphom-

Blastoid Modell)

Hoechst-Efflux

ABCG2+, BCL-2+ sowie u.a.

JAG1+ und NOTCH2+, Langlebigkeit, Tumorwachstum

in vitro und in vivo

(Vega et al. 210)

Multiples Myelom -

Mensch Hoechst-Efflux CD138- (Matsui et al. 2008)

Neuroblastom - Mensch Hoechst-Efflux ABCG2+ und ABCA3+, Chemoresistenz

(Hirschmann-Jax et al.

2004)

Blasenkarzinom -

Xenograft Mausmodell CD44+ Tumorwachstum in vivo,

CD47+ (Chan et al. 2009)

HNO-Tumoren - Mensch CD44+ Tumorwachstum in vivo,

BMI1+ (Prince et al. 2007)

Mammakarzinom -

Xenograft Mausmodell CD44+/CD24- Tumorwachstum in vivo (Al-Hajj et al. 2003)

Prostatakarzinom - Xenograft Mausmodell

CD44+ und CD133+

Klonogenit¨at und Tummorwachstum in vitro und

in vivo

(Tang et al. 2007; Pa- trawala et al. 2006)

Bronchialkarzinom -

Mensch CD133+ Langlebigkeit in vitro und

Tumorwachstum in vivo (Eramo et al. 2008)

Hepatozellul¨ares Karzinom - Humane

Zelllinie

CD133+ Tumorwachstum in vitro und in

vivo (Suetsugu et al. 2006)

Kolonkarzinom - Mensch CD133+ Langlebigkeit in vitro und Tumorwachstum in vivo

(Ricci-Vitiani et al.

2007)

Tabelle 1.1: Tumorstammzellen in soliden und h¨amatologischen Malignomen (ohne Anspruch auf Vollst¨andigkeit)

1.3 Side Population 10

1.3.2 Transporter der ABC-Familie

ABC-Transporter geh¨oren zu einer Familie von Transmembranproteinen, deren gemeinsames Charakteristikum eine ATP (Adenosintriphosphat)-bindende Kas- sette ist, welcher sie ihren Namen verdanken. Unter dem Verbrauch von ATP werden mit ihrer Hilfe Substrate ¨uber intra- oder extrazellul¨are Membranen trans- portiert (Steinbach und Legrand 2007). Bislang sind 48 Proteine dieser Familie bekannt und ihre tragende Rolle bez¨uglich Chemotherapiesuszeptibilit¨at und -re- sistenz wurde durch multiple Arbeiten untermauert (Szak´acs et al. 2004; Dean 2009). Basierend auf ihrem molekularen Aufbau werden die ABC-Transporter in sieben Untergruppen von A-G eingeteilt (Ding et al. 2010).

Die vermehrte Expression dieser Transporter steht bei einer Vielzahl von h¨amato- logischen Malignomen in direktem Zusammenhang mit einem verminderten The- rapieansprechen und einer schlechteren Prognose. Besonders bei der AML, dem Non-Hodgkin-Lymphom und dem diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom wurde diese Korrelation beobachtet (van der Kolk et al. 2000; Greaves et al. 2012; Singh et al. 2011).

Der weitaus am l¨angsten bekannte Transporter dieser Familie ist das P-Glykopro- tein, kodiert durch das MDR1-Gen (multidrug resistence portein 1 (MDR1, AB- CB1)). Juliano und Ling wiesen dieses membranst¨andige Protein 1976 in mul- tidrogenresistenten Zellen aus Ovarien chinesischer Hamster nach (Juliano und Ling 1976). ¨Uberdies untersuchten Cole et al. im Jahr 1996 durch Doxorubicin selektierte Zellen einer Bronchialkarzinom-Zelllinie. Diese wiesen jedoch keine ein- heitliche ¨Uberexpression des P-Gykoproteins auf. Die Ursache f¨ur die geringere Suszeptibilit¨at gegen¨uber Doxorubicin war hier nicht auf die erh¨ohte Aktivit¨at des Transporters zur¨uckzuf¨uhren. Daf¨ur exprimierten diese Zellen vermehrt das multidrug resistance-associated protein (MRP), welches ebenfalls der Familie der ABC-Transporter zuzuordnen ist (Cole et al. 1992). Bis heute konnten mindestens 15 dieser energieabh¨angigen Transporter mit Multidrogenresistenz in Verbindung gebracht werden (Wu et al. 2011). Neben MDR1 und MRP sind ABCG2 und AB- CA3 als weitere relevante Vertreter der ABC-Familie zu nennen.

ABCG2 wurde urspr¨unglich als Breast Cancer Resistance Protein in Mamma- karzinomen beschrieben und ist unter anderem mit einer erh¨ohten Resistenz gegen¨uber Mitoxantron, Doxorubicin und Daunorubicin assoziiert (Doyle et al.

1998). Eine erh¨ohte Expression von ABCG2 ist sowohl bei an AML erkrank-

ten Kindern als auch bei Erwachsenen mit einer schlechteren Prognose assozi- iert (Steinbach et al. 2002; Uggla et al. 2005). Bei Patienten mit einem diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom korreliert eine vermehrte ABCG2-Expression so- wohl mit einem verk¨urzten Gesamt- als auch Rezidiv-freien ¨Uberleben (Kim et al. 2009). Durch die Aktivierung des Hedgehog-Signalweges und der damit ver- bundenen vermehrten Pr¨asenz des Transkriptionsfaktors GLI1, wird die ABCG2- Expression in Zellen eines diffusen großzelligen B-Zell-Lymphoms hochreguliert und die Toleranz gegen¨uber Chemotherapeutika auf diese Weise erh¨oht. Beson- ders im Beisein stromaler Zellen steigt die Aktivit¨at des Hedgehog-Signalweges und damit verbunden auch die ABCG2-Expression (Singh et al. 2011).

Neben lipophilen Chemotherapeutika z¨ahlt auch der DNA-bindende Farbstoff Hoechst 33342 zu den Substraten des ABCG2-Transporters (Robey et al. 2003).

Bereits 2001 wiesen Zhou et al. nach, dass ABCG2 in h¨amatopoetischen Stamm- zellen vermehrt vorliegt, die Zelldifferenzierung zu unterdr¨ucken scheint und f¨ur den SP-Ph¨anotyp mitverantwortlich ist (Zhou et al. 2001).

Ein weiterer Transporter, der mit einer erh¨ohten Resistenz gegen¨uber Chemothe- rapeutika in Verbindung gebracht wird, ist der intrazellul¨are ABC-Transporter A3. Er wurde 1996 erstmals von Klugbauer und Hofmann beschrieben und als ABC-C bezeichnet. Die genetische Information f¨ur dieses Protein liegt in unmit- telbarer N¨ahe zum MRP1 (ABCC1)-kodierenden Gen auf Chromosom 16p13.3 und weist sequenzielle ¨Ahnlichkeiten mit den Genen f¨ur MRP1 und MDR1 (AB- CB1) auf (Klugbauer und Hofmann 1996). Hirschmann-Jax et al. zeigten, dass die mittels Hoechst 33342 identifizierten SP-Zellen weniger sensitiv auf Mitoxantron reagieren als die NSP (Non Side Population)-Zellen und, neben ABCG2-, auch eine erh¨ohte ABCA3-Expression aufwiesen (Hirschmann-Jax et al. 2004). Cha- puy et al. untersuchten den Zusammenhang zwischen der ABCA3-Expression und dem Krankheitsverlauf anhand von Prim¨armaterial an AML erkrankter Patien- ten. Eine erh¨ohte Expression dieses Proteins korrelierte dabei mit einer schlech- teren Prognose. Des Weiteren konnte in Zelllinien und Prim¨arproben von ag- gressiven B-Zell-Lymphomen mittels Realtime PCR eine stark erh¨ohte ABCA3- Expression festgestellt werden (Chapuy et al. 2008). Die Arbeitsgruppe von Aung et al. konnte zeigen, dass die Resistenz von aggressiven B-Zell-Lymphomen ge- gen¨uber therapeutischen anti-CD20 Antik¨orpern durch Bindung der Antik¨orper an Exosomen verst¨arkt werden kann. F¨ur die Exosomenproduktion scheint ein

1.3 Side Population 12

ABCA3-abh¨angiger Signalweg zu existieren. Die Blockade dieses Transporters verbesserte das Ansprechen der Zellen auf die Therapie deutlich (Aung et al.

2011). Zusammenfassend l¨asst sich feststellen, dass ABCG2 und ABCA3 ver- mehrt in den SP-Zellen h¨amatopoetischer Malignome exprimiert werden und zur Multidrogenresistenz beitragen.

1.3.3 Aldehyddehydrogenase 1-Aktivit¨at als Marker f¨ur Progenitorzellen

Aldehyddehydrogenase (ALDH) ist ein ubiquit¨ar vorkommendes Enzym, welches der Detoxifikation auf Ebene der Einzelzelle dient, indem es intrazellul¨are Alde- hyde oxidiert (Yoshida et al. 1998). Gleichzeitig spielt es eine wichtige Rolle bei der Metabolisierung von Alkohol, Vitamin A und Cyclophosphamid, wodurch es einen wichtigen Beitrag zum Schutz der Zellviabilit¨at leistet (Jones et al. 1995).

Die erh¨ohte Aktivit¨at des Isoenzyms ALDH1 ist eine gut erforschte Eigenschaft h¨amatopoetischer Stamm- und Vorl¨auferzellen (Pearce et al. 2005; Fallon et al.

2003; Christ et al. 2007). Neben vermehrtem Vorkommen in gesundem Gewe- be ist eine erh¨ohte ALDH1-Expression in Tumorstammzellen der AML und des Multiplen Myeloms nachgewiesen worden (Pearce et al. 2005; Matsui et al. 2008).

Des Weiteren wurde eine erh¨ohte Aktivit¨at dieses Enzyms in CSC von multiplen soliden Tumoren festgestellt (Huang et al. 2009; Croker et al. 2009; Liang und Shi 2012). In den CD44-positiven Zellen des Mammakarzinoms ist eine erh¨ohte ALDH1-Aktivit¨at mit einer erh¨ohten Resistenz gegen radioaktive Strahlen und Chemotherapeutika assoziiert (Croker et al. 2009).

Die Methodik zur Bestimmung der Aktivit¨at dieses zytosolischen Enzyms wurde maßgeblich durch Jones et al. gepr¨agt. Multiple humane Leuk¨amie-Zelllinien wur- den mit dem hydrophoben Substrat Dansylaminoacetaldehyd (DAAA) behan- delt, welches problemlos in die Zelle diffundieren kann. Die Aldehyddehydrogen- ase der Zellen oxidiert das Substrat zu Dansylglycin, das aufgrund seiner physiolo- gischen Polarit¨at die Zelle nicht mehr verlassen und bei 521 nm im Durchflusszy- tometer detektiert werden kann (Jones et al. 1995). Um Negativkontrollen f¨ur die Analyse zu erhalten, kann die ALDH mit DEAB (4-(Diethylamino)benzaldehyde) als Inhibitor behandelt werden (Russo et al. 1988). Die in dieser Arbeit verwen- dete Aldefluor-F¨arbung basiert auf dem o.g. Prinzip (vgl. 2.2.5.3).

1.4 Aufgabenstellung und Zielsetzung

Cancer Stem Cells sind Zellen, die eine verminderter Suszeptibilit¨at gegen¨uber multiplen Noxen aufweisen und eine entscheidende Rolle beim Tumorerhalt und dessen Repopulierung spielen. Um die therapeutischen Strategien zu verbessern gilt es, den Tumor in seiner Heterogenit¨at besser zu verstehen und nicht nur die Tumormasse, sondern auch die m¨oglicherweise existenten, tumorinitiierenden Zellen angreifen zu k¨onnen. Daf¨ur m¨ussen Wege gefunden werden, diese Zellen zu demaskieren und eingehend zu charakterisieren.

Vor diesem Hintergrund sollen in dieser Arbeit f¨ur das diffuse aggressive B-Zell- Lymphom nun folgende Fragen adressiert werden:

1. L¨asst sich in Zelllinien und Prim¨armaterialien von aggressiven B-Zell-Lympho- men reproduzierbar eine Side Population detektieren?

2. Wenn ja, besitzen diese Zellen Stammzelleigenschaften, wie die F¨ahigkeit zur langfristigen Expansion, ausgehend von einzelnen Zellen, und eine verminderte Suszeptibilit¨at gegen¨uber Chemotherapeutika?

3. Bestehen innerhalb eines aggressiven B-Zell-Lymphoms hierarchische Struktu- ren der Differenzierung von Populationen oder handelt es sich um ein dynamisches System?

4. Gibt es auf molekulargenetischer Ebene Hinweise auf die Aktivierung von Si- gnalwegen, die f¨ur die Auspr¨agung des SP-Ph¨anotyps von Bedeutung sind?

2 Material, Methoden und Patientenproben

2.1 Material

2.1.1 Ger¨ate

Analysewaage Sartorius, G¨ottingen

CO2 Inkubator HERA cell Heraeus, Osterode

Dampfsterilisator Varioclav^R Thermo Scientific, Karlsruhe

Eismaschine ZIEGRA, Isernhagen

ELISA-Reader, Modell 680 BioRad, M¨unchen

FACSAria^TM II BD Bioscience, Heidelberg

FACScan BD Bioscience, Heidelberg

Gefrierschr¨anke:

- -80^◦C; -150^◦C SANYO, Wiesloch

- -20^◦C Liebherr, Biberach

3130 Genetic Analyzer Applied Biosystems Kamera:

- hp Photosmart R742 Palo Alto, USA

Magnetr¨uhrer IKA-COMBIMAG RCT Heidolph, Bremen Mikroskope:

Axiovert 100 Zeiss, Oberkochen

Standard 25 Zeiss, Oberkochen

Stereomikroskop Stemi SV11 Zeiss, Oberkochen

NanoDrop^R ND-1000 PeqLab, Erlangen

UV/Vis-Spektralphotometer

Neubauer-Z¨ahlkammer 0,00025mm² Brand Gl¨aser, Wertheim Pipetten:

Einfach-Pipetten: 10µl, 200µl,1000µl Eppendorf, Hamburg

Tabelle 2.1: Ger¨ate

14

pH-Meter, pH 211 HANNA Instruments, Kehl Sch¨uttler Rotamax 120 Heidolph Instruments, Schwabach Sterilbank HERA safe Heraeus, Osterode

Taqman-Reader 7500 HAT (ABI PRISM)

Applied Biosystems

Thermocycler T3000 Biometra, G¨ottingen

Trockenschrank Memmert, Schwabach

Vortex Genie^R 2 Scientific Industries, Bohemia, USA Wasserbad (250 V; 0,5 AMP-T) K¨ottermann, H¨anigsen

Wipptisch, SSL4 (Stuart) Barloworld Scientific, Staffordshire, GB Zentrifugen:

- Biofuge pico Heraeus, Osterode

- Multifuge 3, Ausschwingmotor Heraeus, Osterode - Tischzentrifuge Centrifuge 5415 D Eppendorf, Hamburg

Tabelle 2.1: Ger¨ate

2.1.2 EDV

Axio Vision 3.1 Zeiss, Oberkochen

BibTeX 0.99d Oren Patashnik,

GNU Lesser General Public License

FlowJo 5.7.26 Tree Star Inc., USA

GraphPad Prism^R 5.03 f¨ur Windows GraphPad Software, San Diego, USA (http:// www.graphpad.com)

JabRef, reference manager Open source Microplate Manager 2.6 BioRad, M¨unchen

MiKTeX 2.9 Christian Schenk, Berlin

OpenOffice.org 3.4.1 Apache Software Foundation, USA R Development Core Team (2009): R Foundation for Statistical

R: A language and environment for Computing, Vienna, Austria statistical computing

Tabelle 2.2: EDV

2.1 Material 16

SDS 2.1 Applied Biosystems, USA

Texmaker Version 3.1 Pascal Brachet, France Windows7 Home Premium Version 6.1 Microsoft, Redmond, USA

Tabelle 2.2: EDV

2.1.3 Verbrauchsmaterialien

Ampuwa^R Fresenius Kabi, Bad Homburg

Deckgl¨aschen Menzel Gl¨aser, Braunschweig Eindr¨uckstopfen Sarstedt, Braunschweig

Einfrierboxen Nalgene Labware, Rochester (USA)

Einmalkan¨ulen:

- BD Microlance 0,45×13mm; 26G1/2 BD Bioscience, Heidelberg

- mit Lanzettenschliff 2× 70 mm Erhardt-S¨ohne GmbH, Geislingen Einmalspritzen:

- Omnifix^R 10 ml / 40 I. U. Insulin- spritze

Braun, Melsungen

Gewebekulturflaschen :

- 25cm²,75cm²,175cm² Sarstedt, Braunschweig Gewebekulturschalen:

- Ø 35mm greiner bio-one, N¨urtingen

Multi-Well-Platten:

- 6-Well-Platte greiner bio-one, N¨urtingen - 24-Well-Platte BD Bioscience, Heidelberg - 96-Well-Platte (Rund- und Flachbo-

den)

Sartstedt, Braunschweig

- 386-Well-Platte Abgene, Hamburg

Objekttr¨ager, 76 × 26 mm Mattrand Knittel Gl¨aser, Braunschweig

Parafilm^R American National Can, Chicago

Pipetten:

- Pasteuerpipetten, 230 mm Brand, Wertheim

Tabelle 2.3: Verbrauchsmaterialien

- Serologische Pipetten, 5 ml, 10 ml, 25 ml

Sarstedt, Braunschweig

Pipettenspitzen, 10µl, 200µl, 1000µl Sarstedt, Braunschweig Reaktionsgef¨aße, 0,5ml, 1,5ml Eppendorf, Hamburg R¨ohrchen:

- FACS Analyse R¨ohrchen 5ml Sarstedt, Braunschweig - FACS Analyse R¨ohrchen 5ml, Rund-

boden

BD Bioscience, Heidelberg

- Kryor¨ohrchen 1,8 ml Nalgene Labware, Rochester (USA) - Sterile Plastikr¨ohrchen 15ml, 50ml Sarstedt, Braunschweig

Sterilfilter, 50µm, Syringe-Type BD Biosceince, Belgien

Tabelle 2.3: Verbrauchstmaterialien

2.1.4 Chemikalien

ALDEFLUOR^R Assay Buffer STEMCELL Technologies, France ALDEFLUOR^R reagent STEMCELL Technologies, France bisBenzimide H33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich^R, Deisenhofen Diethylaminobenzaldehyd (DEAB) STEMCELL Technologies, France Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt

Dinatriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt Dithiothreitol (DTT, 0,1 M) Invitrogen, Karlsruhe

dNTP Mix (10 mM) Invitrogen, Karlsruhe

Ethanol absolut Merck, Darmstadt

FACSFlow^TM BD Bioscience, Heidelberg

Fugene 6 Reagenz Roche, Mannheim

F¨otales K¨alberserum (FCS) Biochrom AG, Berlin

Genescan 400HD Rox Applied Biosystems

Hepes Sigma-Aldrich, Deisenhofen

HiDi Formamid Applied Biosystems

IMDM Invitrogen, Karlsruhe

Tabelle 2.4: Chemikalien

2.1 Material 18

Isopropanol J. T. Baker, Griesheim

L-Glutamin Biochrom AG, Berlin

Lymphoprep^TM Axis-Shield, Oslo

MethoCult^R H4230 Methylcellulose STEMCELL Technologies, France without cytokines

ß-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt

Natriumchlorid Merck, Darmstadt

Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) Invitrogen, Karlsruhe Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Polybrene^R Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Pop7 Laufgel f¨ur Genetic Analyzer Applied Biosystems

Propidiumiodid (PI) Sigma-Aldrich, Deisenhofen Puffer:

- 5× 1stP uf f er Invitrogen, Karlsruhe

- 10fach PBS PAN, Biotech GmbH, Aidenbach

- 10fach Puffer f¨ur Genetic Analyzer Applied Biosystems Random Hexamers (50 ng/µl) Invitrogen, Karlsruhe

RNase-free DNase Set QIAGEN, Hilden

RNaseOut^TM (5.000 U, 40 U/µl) Invitrogen, Karlsruhe

RPMI Invitrogen, Karlsruhe

Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (98%)

Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Trypan-Blau (0,4%) Sigma-Aldrich, Deisenhofen

Tabelle 2.4: Chemikalien

2.1.5 Enzyme

AmpliTaq Gold (5 U/µl) Applied Biosystems SuperScript^R II RT (10.000 U; 300

U/µl)

Invitrogen, Karlsruhe

Tabelle 2.5: Enzyme

2.1.6 Kits

ALDEFLUOR^R Kit STEMCELL Technologies, France

AmpliTaq Gold Polymerase Applied Biosystems QIAamp^R DNA Mini Kit QIAGEN, Hilden

RNeasy^R Mini Kit QIAGEN, Hilden

SYBR^R Green Kit QIAGEN, Hilden

SuperScript^R II Transkriptase Invitrogen, Karlsruhe

Tabelle 2.6: Kits

2.1.7 Proteine

Annexin-V-FLUOS (# 11 828 681 001) Roche Diagnostic GmbH, Mannheim

Tabelle 2.7: Proteine

2.1.8 Antik¨orper

Zielantigen Reaktivit¨at Label Herkunft

CD19 Anti-Human

(Klon J4.119) APC Beckman Coulter GmbH, Krefeld kappa/lambda

Leichtketten Anti-Human FITC/PE Beckman Coulter GmbH, Krefeld

CD44 Anti-Human FITC BD Bioscience, Heidelberg

Tabelle 2.8: Antik¨orper

2.1 Material 20

2.1.9 Primer

Primer Sequenz, 5’ nach 3’ Gr¨oße Herkunft

ABCA3 fw. RTQ TTC TTC ACC TAC ATC CCC TAG 139 bp IBA, G¨ottingen ABCA3 rev. RTQ CCT TTC GCC TCA AAT TTC CC

ß-Aktin fw RTQ CAC ACT GTG GCC CAT CT 99 bp IBA,

G¨ottingen ß-Aktin rev. RTQ TGA GGA TCT TCA TGA GGT AGT CAG

IgH-PCR 320-

355bp

IBA, G¨ottingen JH Fam-Primer CTT ACC TGA GGA GAC GGT GAC C

(an 5’ mit 6-fam markiert)

FR1 VH1 GGC CTC AGT GAA GGT CTC CTG CAA G FR1 VH2 GTC TGG TCC TAC GCT GGT GAA ACC C FR1 VH3 CTG GGG GGT CCC TGA GAC TCT CCT G FR1 VH4 CTT CGG AGA CCC TGT CCC TCA CCT G FR1 VH5 CGG GGA GTC TCT GAA GAT CTC CTG T FR1 VH6 TCG CAG ACC CTC TCA CTC ACC TGT G

Tabelle 2.9: Primer

2.1.10 PBS-Pufferl¨osung

72 g N a2HP O4·2H2O PBS 10 g KH2P O4

ad 5l Aqua bidest., pH 7,4 Tabelle 2.10: Pufferl¨osung

2.1.11 Plasmide 1.

Zur Herstellung einer Verd¨unnungsreihe, um f¨ur die TaqMan^TM Real-time-PCR (vgl. 2.3.5) eine Standardkurve zu erzeugen, wurde nachfolgendes ABCA3-tragendes Plasmid eingesetzt.

(a)

(b)

Abbildung 2.1: Aufbau des ABCA3-Plasmids - pEGFP-N1+ABCA3 (a) und diemultiple clo- ning site, in welche das humane ABCA3 mit einer Gr¨oße von 6,4 kB eingef¨ugt wurde (b) (Abb. mod. nach Cheong et al. 2006, mit freundlicher Genehmigung von Clontech).

2.1 Material 22

2.

F¨ur die Transfektion mit GFP wurde mit einem modifizierten pLKO.1-Vektor (Addgene, USA) gearbeitet, in dem die Puromycinresistenz-Kassette mittels Klo- nierung durch eine GFP-Kassette ausgetauscht wurde.

Abbildung 2.2: Aufbau des pLKO.1-Plasmids. Die Puromycinresistenz-Kassette wurde durch eine GFP-Kassette ersetzt (Schnittstellen: Kpn1/BamH1 und Ngo- MIV/Spe1)(Abb. mod. nach www.addgene.org, 2007, mit freundlicher Geneh- migung von Addgene).

2.1.12 Chemotherapeutika

Zytostatikum Stockl¨osung Molekulargewicht Firma Novantron^R

(Mitoxantronhydrochlorid) 2 mg/ml 517,41 g/mol Wyeth, Phil- adelphia

Daunoblastin^R

(Daunorubicinhydrochlorid) 2 mg/ml 563,99 g/mol Pfizer, New York

Doxorubicinhydrochlorid 2 mg/ml 579,98 g/mol

Sigma- Aldrich, Deisenhofen Tabelle 2.11: Chemotherapeutika

2.1.13 Hitzeinaktiviertes FCS

Das verwendete FCS (Biochrom AG) wurde vor Gebrauch bei 56^◦C f¨ur 30 min im Wasserbad hitzeinaktiviert, in 50 ml-R¨ohrchen aliquotiert und bei -20^◦C auf- bewahrt.

2.1 Material 24

2.1.14 Zellkulturmedien

Zelllinie Medium Herkunft

Ramos RPMI 1640(1x), 1% L-Glut, 10% FCS, 1%

Pen/Strep.

Invitrogen, Karlsruhe Karpas 422 RPMI 1640(1x), 1% L-Glut, 10% FCS, 1%

Pen/Strep.

Invitrogen, Karlsruhe SU-DHL-4 RPMI 1640(1x), 1% L-Glut, 10% FCS, 1%

Pen/Strep.

Invitrogen, Karlsruhe BALM-3 RPMI 1640(1x), 1% L-Glut, 10% FCS, 1%

Pen/Strep.

Invitrogen, Karlsruhe OCI-Ly1 IMDM, L-Glut, 20% FCS, 1% Pen/Strep. Invitrogen,

Karlsruhe OCI-Ly3 IMDM, L-Glut, 20% FCS, 1% Pen/Strep. Invitrogen,

Karlsruhe HEK293T DMEM, 1% L-Glut, 10% FCS, 1% Pen/Strep. Invitrogen,

Karlsruhe Medium f¨ur die

Transfektion OPTI-MEM GIBCO-BRL,

Eggenstein Tabelle 2.12: Zellkulturmedien

2.1.15 Zelllinien

Zelllinie Entit¨at Herkunft Referenz

BALM-3 DLBCL B. Glass LOK ET AL. 1979

HEK293 Humane Nierenzelllinie Cheong et al. 2006 Graham et al. 1977, Cheong et al. 2006 HL-60 Myeloische Leuk¨amie DSMZ, Braunschweig

Karpas 422 GCLDLBCL DSMZ, Braunschweig DYER ET AL.

1990 OCI-Ly1 GCLDLBCL Mark Minden - UHN Re-

search Toronto, Kanada

OCI-Ly3 ABCDLBCL Mark Minden - UHN Re-

search Toronto, Kanada

Ramos Burkitt Lymphom DSMZ, Braunschweig KLEIN ET AL.

1975

SU-DHL-4 GCLDLBCL DSMZ, Braunschweig EPSTEIN ET AL.

1976 Tabelle 2.13: Zellinien

2.2 Zellbiologische Methoden

2.2.1 Kultivieren von Zellen

Die Zellen wurden in einem 37^◦C warmen Inkubator mit 5% CO₂-Atmosph¨are kultiviert. Zweimal pro Woche wurden die Suspensionszellen gesplittet, um ihnen optimale Wachstumsbedingungen zu verschaffen. Je nach Zelllinie wurden sie in einem Verh¨altnis von 1:3 bis 1:10 mit frischem, 37^◦C warmem Medium versorgt.

Zum Erhalt der Kultur wurden sie in 75 cm² i.d.R. mit 0,5-1×10⁶ Zellen/ml gehalten. Alle 4 Wochen erfolgte die Umsetzung in neue Kulturflaschen, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren. Um ausreichend Zellen f¨ur die Experimente zur Verf¨ugung zu haben, wurden sie bis zu vier Tage zuvor aus 75 cm² großen in 175 cm² große Kulturflaschen umgesetzt.

2.2.2 Kryokonservierung von Zellen

Um dem Verlust von Zelllinien durch Kontaminationen oder menschliche Feh- ler vorzubeugen, wurden in regelm¨aßigen Abst¨anden Zellen weggefroren. Hierf¨ur wurden jeweils 100 µl DMSO je Kryor¨ohrchen vorgelegt. Nach der Zellz¨ahlung mittels Neubauer Z¨ahlkammer wurden die Zellen auf eine Zielkonzentration von 1-2×10⁶ Zellen/900 µlMedium gebracht. Je nachdem um welche Zelllinie es sich handelte, wurde entweder RPMI oder IMDM mit 20% FCS und 1% Pen/Strep.

verwendet. In jedes Kryor¨ohrchen wurden 900µl Zellsuspension gegeben, so dass sich ein Gesamtvolumen von 1 ml ergab. Um eine zu schnelle Abk¨uhlung der Zel- len zu verhindern, wurden die Kryor¨ohrchen f¨ur mindestens einen Tag in einem mit Isopropanol gef¨ullten Einfrierbeh¨alter bei -80^◦C gelagert. Dieser gew¨ahrleistet eine kontinuierliche Abk¨uhlung von 1^◦C pro Minute. Am Folgetag wurden die ge- frorenen Zellen in eine -150^◦C kalte Gefriertruhe umgesetzt und dort bis zur weiteren Verwendung gelagert.

2.2.3 Revitalisieren von Zellen

Das Kryotube mit der gew¨unschten Zelllinie wurde aus dem Stickstofftank ent- nommen und kurz ins Wasserbad gehalten, um die Zellen unter Sicht aufzutauen.

Um das bei 37^◦C zytotoxisch wirkende DSMO schnellstm¨oglich zu entfernen,

2.2 Zellbiologische Methoden 26

wurde die Zellsuspension, in nicht vollst¨andig aufgetautem Zustand, mit ca. 5 ml kaltem PBS vermischt und bei 1200 rpm f¨ur 12-15 min zentrifugiert. Danach wurde das Zellpellet mit 1 ml 37^◦C warmem Medium (RPMI mit 10% FSC und 1% Pen/Strep. bzw. IMDM mit 20% FCS und 1% Pen/Strep.) resuspendiert und in eine T25-Kulturflasche ¨uberf¨uhrt, in der ca. 1 ml Medium vorgelegt wurde. Je nach Zelldichte wurde noch Medium hinzugegeben. Die Kulturflasche wurde in einen 37^◦C warmen Brutschrank gestellt, bei 5%CO₂. Gegebenenfalls wurden die Zellen am folgenden Tag erneut mit PBS gewaschen um tote Zellen und DSMO Reste zu entfernen.

2.2.4 Zellzahlbestimmung mittels Neubauer-Z¨ahlkammer

Die Zellzahlbestimmung erfolgte mittels Neubauer-Z¨ahlkammer. Mit Trypan-Blau wurde eine 1:10 bis 1:100 Verd¨unnung hergestellt. Es wurden 4 Großquadrate nach Anleitung des Herstellers ausgez¨ahlt und die Zellzahl nach folgender Formel berechnet:

Zellzahl = (Mittelwert aus 4 Großquadraten) × 10⁴× Verd¨unnung × Volumen der Probe

2.2.5 Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie erm¨oglicht es, mittels Lasertechnik relative Gr¨oße (for- ward scatter-FSC) und relative Granularit¨at (side scatter-SSC) von Einzelzellen zu detektieren. Die Zellen werden in ein Tr¨agermedium wie PBS aufgenommen und bei Durchtritt durch eine Messk¨uvette durch Laserlicht einer definierten Wellenl¨ange angeregt. Die oben genannten Eigenschaften sowie die zelleigenen Fluoreszenzeigenschaften erzeugen auf diesem Wege ein Streulicht, welches mit Hilfe sensibler Detektoren quantifiziert werden kann. Des Weiteren lassen sich, unter zur Hilfenahme fluochrom-markierter Antik¨orper, Oberfl¨achenproteine wie ABC-Transporter, aber auch Fluoreszenzen aus dem Zellinnern, wie zum Beispiel durch GFP (gr¨un fluoreszierendes Protein), messen. Die Zytostatika Doxorubi- cin und Daunorubicin wurden im PE (Phyocoerythrin, Emissionsmaximum bei 578 nm) Kanal gemessen, wohingegen Mitoxantron im APC (Allophycocyanin, Emissionsmaximum bei 660 nm) Kanal detektiert wurde. GFP wurde im FL1 (Fluoreszenzkanal 1, 500 bis 565 nm) Kanal detektiert und zur Darstellung des

Farbstoffs Hoechst 33342 wurde ”Hoechst blue”(Emissionsmaximum bei 465 nm) gegen ”Hoechst red”(Emissionsmaximum bei 670 nm) aufgetragen. Das Fluores- zenzverhalten wurde mit Hilfe eines 450/20 BP nm (”Hoechst blue”) und 670/50 BP nm Filters (”Hoechst red”) detektiert. F¨ur diese Arbeit wurde, neben dem FACScan, das FACSAria^TM II von BD Bioscience verwendet. Dieses Ger¨at ist mit einem Ultraviolett-Laser ausgestattet, welcher die Anregung und somit die Detektion von Hoechst 33342 erm¨oglicht. Gleichzeitig kann hiermit eine Zellsor- tierung anhand manuell markierter Zielzellpopulationen vorgenommen werden.

Zur Auswertung der FACS Daten wurde das Programm Flow Jo verwendet.

2.2.5.1 H¨ochstf¨arbung

BisBenzimid H 33342 trihydrochlorid (Hoechst 33342) ist ein Farbstoff, der an die adenin-thyminreichen Abschnitte der DNA bindet und diese markiert. Die gesuchte Side Population (SP) verf¨ugt ¨uber Transportproteine, mit deren Hilfe sie diesen Farbstoff in gewissen Mengen aus der Zelle ausschleusen kann. Dies erm¨oglicht sp¨ater eine Differenzierung der Side Population. Zum ersten Mal wur- de diese F¨arbemethode 1996 in einer Publikation von Goodell et al. im Journal of experimental medicine beschrieben (Goodell et al. 1996). Inzwischen ist es ein etabliertes Verfahren, um Side Population-Zellen zu identifizieren (vgl. 1.3).

Die F¨arbung

Die Zellsuspension aus der Brutflasche wurde in 50 ml-R¨ohrchen ¨uberf¨uhrt und f¨ur 10 min bei 1200 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1 ml PBS resuspen- diert und die Zellzahl wurde mit Hilfe der Neubauer Z¨ahlkammer berechnet (vgl.

2.2.4). F¨ur 1×10⁶ Zellen wurde 1 ml 37^◦C warmes Medium (RPMI mit 10% FCS, 1% Pen/Strep. bzw. IMDM mit 20% FCS, 1% Pen/Strep.) und 10 µl Hoechst (Endkonzentration: 10µg/ml) hinzugegeben. Die nachfolgende Inkubation erfolg- te f¨ur 90 min bei konstanten 37^◦C im geschwenkten Wasserbad. Nach Ablauf der 90 min wurde die Suspension f¨ur 10 min bei 4^◦C mit 1200 rpm zentrifugiert.

Die K¨uhlung beendet den Hoechst-Efflux und bildet den Endpunkt der F¨arbung.

Das Zellpellet wurde in 1 ml kaltem PBS resuspendiert und ¨uber einen Sterilfilter in ein FACS-R¨ohrchen ¨uberf¨uhrt. Nach Hinzugabe von 10µl Propidiumiodid (50 µg/ml, Emissionsmaximum: 617 nm), zur Demarkierung toter Zellen, erfolgte die Analyse mit dem Durchflusszytometer (FACSAria^TM II). Bis dahin wurden die Proben auf Eis gelagert.

2.2 Zellbiologische Methoden 28

2.2.5.2 Kombinierte F¨arbung mit Hoechst 33342 und einem Chemotherapeutikum

Um eine Idee davon zu bekommen, ob die SP-Zellen neben Hoechst auch Che- motherapeutika ausschleusen k¨onnen, wurden die Zelllinien im Rahmen einer H¨ochstf¨arbung einer zus¨atzlichen Zytostatikabehandlung unterzogen. Zu Beginn erfolgte eine H¨ochstf¨arbung (vgl. 2.2.5.1) f¨ur 60 min bei 37^◦C im Wasserbad. Dann wurde z¨ugig das Chemotherapeutikum (Daunorubicin, Doxorubicin oder Mitox- antron) hinzugegeben. Die Zielkonzentration f¨ur Mitoxantron lag bei 0,1µg/ml, w¨ahrend bei Daunorubicin und Doxorubicin 0,5 µg/ml eingesetzt wurden. Das Reaktionsgef¨aß wurde gevortext und f¨ur weitere 30 min im Wasserbad bei 37^◦C inkubiert. Beim Wasserbad war der Schwenkmechanismus zu jedem Zeitpunkt angeschaltet. Die verwendeten Chemotherapeutika interkalieren in die DNA und k¨onnen nachfolgend durch ihre fluoreszierenden Eigenschaften im Durchflusszy- tometer detektiert werden. Um nach Ablauf der 30 min eine zu starke Abk¨uhlung der Proben zu vermeiden, wurden sie im Anschluss nur f¨ur 5 min bei 1200 rpm zentrifugiert. Dann folgte eine erneute H¨ochstf¨arbung. Nach 15 min wurde die F¨arbung durch eine 10-min¨utige Zentrifugation bei 4^◦C und 1200 rpm beendet.

Das Zellpellet wurde in 1 ml kaltem PBS resuspendiert, durch einen Sterilfilter in ein FACS-R¨ohrchen ¨uberf¨uhrt und bis zur Analyse auf Eis gelagert. Kurz vor der Analyse mit dem FACSAria^TM II wurden 10 µl Propidiumiodid (50 µg/ml) hinzugegeben, um tote Zellen zu demarkieren. Die Auswertung der Rohdaten erfolgte mit Flow Jo.

2.2.5.3 Aldefluor^R-F¨arbung

Alle verwendeten Reagenzien entstammen dem Aldefluor^R Kit von STEMCELL Technologies und wurden nach Protokoll des Herstellers vorbereitet und verar- beitet. Aldefluor^R diffundiert als nicht toxisches Substrat der Aldehydehydrogen- ase (ALDH) ¨uber die Zellmembran und wird dort in das negativ geladene, fluo- reszierende Produkt BODIPY^R-Aminoacetat (BAA^-) umgesetzt. Der beigef¨ugte Assay Buffer verhindert den aktiven Efflux des Produktes durch Transporter der ABC-Familie. Die St¨arke der emittierten Fluoreszenz bei 512 nm ist ein direktes Korrelat f¨ur die Aktivit¨at der ALDH in viablen Zellen. Um die Fluoreszenz quan- titativ bestimmen zu k¨onnen, ben¨otigt man einen Nullwert. Dieser wird mit Hilfe

einer Negativkontrolle ermittelt, welche mit Diethylaminobenzaldehyd (DEAB) versetzt wird, einem spezifischen Inhibitor der ALDH.

Abbildung 2.3: Funktioneller Ablauf der Aldefluor^R-F¨arbung. (Mit freundlicher Genehmigung von STEMCELL Technologies^TM)

Vorbereitung des Aldefluor^R Reagenz

Nachdem alle Reagenzien Raumtemperatur (RT) hatten, wurden 25 µl DMSO zum trockenen Aldefluor^R Reagenz gegeben, gut gemischt und 1 min bei RT inku- biert. Im Anschluss wurden 25µl2N HCl dazu geben und nach gutem Mischen 15 min bei RT inkubiert. Zu guter Letzt kamen 360µlAldefluor^R Assay Buffer hin- zu. Das nun aktivierte Aldefluor^R Reagenz wurde in Eppendorf-Reaktionsgef¨aße aliquotiert und entweder f¨ur den sofortigen Gebrauch (bis zu einer Woche) im K¨uhlschrank bei -7^◦C gelagert oder f¨ur eine sp¨atere Verwendung bei -20^◦C weg- gefroren.

Die F¨arbung

F¨ur die F¨arbung wurden Ans¨atze mit je 1×10⁶ Zellen/ml angesetzt und mit Aldefluor^R Assay Buffer auf ein Gesamtvolumen von 2 ml aufgef¨ullt. Zu jedem Ansatz wurden 10µlaktiviertes Aldefluor^R Reagenz gegeben und die Proben f¨ur 45 min bei 37^◦C Grad im Wasserbad inkubiert. Als Kontrollen wurden f¨ur jeden Ansatz ein R¨ohrchen mit 5 µlDEAB versetzt, welches die ALDH inhibiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Proben f¨ur 5 min bei 250×g pelettiert, in 500µlAssay Buffer resuspendiert und bis zur nachfolgende Analyse am FACScan auf Eis gelagert. Die Aldefluor-F¨arbung bleibt laut Hersteller bis zu 24 Stunden stabil.

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2.2.6 Antik¨orperf¨arbung

F¨ur die Antik¨orperf¨arbungen wurden markierte Antik¨orper von Beckmann Coul- ter verwendet. Im Anschluss an eine regul¨are H¨ochstf¨arbung (vgl. 2.2.5.1) wur- den die Proben mit jeweils 5 µl des jeweiligen Antik¨orpers versetzt. F¨ur die An- tik¨orperf¨arbungen des Prim¨armaterials wurde ein Antik¨orper gegen CD19 (APC- markiert) mit einer Antik¨orperkombination gegen die Kappa (FITC-markiert) und Lambda (PE-markiert) Leichtkette kombiniert. Nach einer 20-min¨utigen In- kubation im Dunkeln auf Eis erfolgte nach Zugabe von 10 µl PI (50 µg/ml, Emissionsmaximum: 617 nm) die Analyse im FACSAria^TM II. Als Kontrollen wurden immer Proben mitgef¨uhrt, die nur mit Hoechst 33342 gef¨arbt wurden.

2.2.7 Zytotoxizit¨atstests 2.2.7.1 MTT-Assay

Die EC₅₀ Konzentrationen der Zelllinien Ramos, Karpas-422, SU-DHL-4 und BALM-3 wurden mit Hilfe des MTT-Testes ermittelt (Denizot und Lang 1986).

Dieser Test dient der Vitalit¨atsbestimmung von Zellen. Die verwendete MTT- 1-L¨osung besteht aus wasserl¨oslichem, gelbem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid; einem Tetrazoliumsalz (0,05 g Thiazolyl blue tatra- zolium bromide, ad 10 ml PBS). Dieses dringt in die Zellen ein und wird dort, zum Beispiel durch die mitochondriale Succinat-Dehydrogenase sowie durch die Reduktions¨aquivalenten NADH und NADPH, in wasserunl¨osliches, violettes For- mazan umgewandelt. Die MTT-2 L¨osung enth¨alt, neben 33% DMSO und 5%

Ameisens¨aure, 62% Isopropanol, welches die Zellen zerst¨ort und dadurch das Formazan freisetzt. Dieses kann nun photometrisch bestimmt werden.

Auf 100 µl Zellsuspension mit 1×10⁵ Zellen wurden aufsteigende Konzentra- tionen von Daunorubicin, Doxorubicin oder Mitoxantron gegeben. Nach einer 24-st¨undigen Inkubationszeit wurden in jedes Well 10 µl MTT-1 L¨osung pipet- tiert. Nach weiteren 4 Stunden wurden die Platten f¨ur 15 min bei 1200 rpm zentrifugiert. Nach vorsichtigem Abnehmen der ¨Uberst¨ande wurden die Zellpel- lets in jeweils 100µlMTT-2-L¨osung resuspendiert. Die Extinktionen wurden mit Hilfe des ELISA-Readers bestimmt und die Ergebnisse mit GraphPad Prism^R 5.03 f¨ur Windows ausgewertet. Mit Hilfe der curve fitting function (sigmoidal