STAT3-Inhibitor und Rho Kinase Inhibitor zeigen einen Einfluss auf das Auswachsen und die Länge von sensiblen murinen Nervenfasern.
Rho Kinase Inhibition führt zu einer Zunahme und die STAT3 Inhibition zu einer Verringerung des Nervenfaserwachstums.
Es konnten also zwei Faktoren aufgezeigt werden, welche einen Einfluss auf das Auswachsen neuronaler Fasern im 2D in vitro Modell zeigen.
Evaluation der Effekte von STAT3-Inhibitor und Rho Kinase Inhibitor auf die korneale Nervenregeneration
Cosima Rose, Gerd Geerling , Stefan Schrader, Sonja Mertsch
Klinik für Augenheilkunde, Universitätsklinikum Düsseldorf
Fazit
E-Mail: Cosima.Rose@uni-duesseldorf.de
Methoden Einleitung
Zellvitalitäts Assay
Single Neuron Assay mit STAT3-Inhibitor Single Neuron Assay mit Rho Kinase Inhibitor
Scratch Assay
0 10 20 30 40 50 60 70 80
24h 48h
Gesamtfaserlänge pro well(mm)
Kontrolle Inhibitor
**
**
0 1 1 2 2 3 3 4 4 5
24h 48h
Gesamtfaserlänge pro well(mm)
Kontrolle Inhibitor
**
A
B
(A,B) Immunfluoreszenzfärbung (beta- III-Tubulin) der Neurone im Scratch Assay. (A) zeigt die Kontrolle nach 48 Stunden Wachstum und (B) die mit dem Rho Kinase Inhibitor (Y27632) behandelten Neurone zum gleichen Zeitpunkt. (C,D) zeigt die Kontrolle eines Scratch Assays nach 48 Stunden Wachstum und die mit dem STAT3- Inhibitor (SH545) behandelten Neurone nach 48 Stunden.
(1) zeigt die Auswertung des 2D Scratch
Assays bezogen auf die
durchschnittliche Gesamtfaserlänge pro Versuchsansatz. Verglichen werden unbehandelte Neurone (Kontrolle) mit Y27632. Die Gesamtfaserlänge mit Y27632 nach 24h: 47,7±3,3mm,
Kontrolle nach 24h: 33,2±2,2mm Y27632 nach 48h: 71,3±4,9mm, Kontrolle nach 48h 48,7±3,8mm.
Sowohl nach 24 Stunden als auch nach 48 Stunden zeigt sich eine Steigerung der Gesamtnervenfaserlänge.
(2) zeigt die Auswertung des 2D Scratch Assays bezogen auf die Gesamtfaserlänge unter Behandlung mit SH545.
Die Gesamtfaserlänge mit SH545 nach 24h: 0,645±1,9mm, Kontrolle nach 24h:
1,9±2,1mm (p=0,00096), SH545 nach 48h: 0,791±1,4mm, Kontrolle nach 48h 2,7±4,2mm (p=0,00012). Sowohl nach 24 Stunden als auch nach 48 Stunden zeigt sich eine signifikante Abnahme der Gesamtnervenfaserlänge.
Für die Auswertung der Trypanblau Färbung wurden jeweils die vitalen Zellen und die toten Zellen ausgezählt (10 HPF/well und 3 wells pro Versuchsansatz) (A).
Nach Auswertung der
Trypanblaufärbung konnte nachgewiesen werden, dass die genutzten Konzentrationen der Substanzen keinen negativen Einfluss auf das Zellüberleben zeigen.
Die Ratio vital/tot bei den Neuronen, die mit dem Rho Kinase Inhibitor (Y27632) behandelt wurden, war 0,980. Die Zugabe von STAT3 Inhibitor (SH545) führte ebenfalls nicht zu einem negativen Einfluss auf das Zellüberleben der Neurone. Der Quotient zwischen vitalen und toten Zellen beträgt 0,944 (B). A: 100µm
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Kontrolle Y27632
GESAMTCROSSINGSNACH 48H
C
(A) unbehandeltes Neuron nach 48 Stunden
(B) Neuron mit Rho Kinase Inhibitor nach 48 Stunden
(C) Auswertung des Single Neuron Assays bezogen auf die durchschnittliche Gesamtanzahl der Schnittpunkte („Crossings“) mit den sieben konzentrischen Kreisen. Die Gesamtanzahl der
„Crossings“ mit Y27632 nach 48 Stunden: 83,67±7,86, Kontrolle nach 48 Stunden: 69±6,53 (p=0,17061).
Die Zugabe des Rho Kinase Inhibitors führt zu einer vermehrten Anzahl von „Crossings“ im Vergleich zur Kontrolle nach 48 Stunden.
B
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Kontrolle SH545
GESAMTCROSSINGS NACH 48H
A B
A B
(A) unbehandeltes Neuron nach 48 Stunden
(B) Neuron mit STAT3 Inhibitor nach 48 Stunden
(C) durchschnittliche Gesamtanzahl der „Crossings“ pro Neuron mit SH545: 39,11±8,79 nach 48 Stunden, Kontrolle: 78,44±29,92 nach 48 Stunden (p=0,00257).
Die Zugabe des STAT3 Inhibitors führt zu einer verringerten Anzahl von „Crossings“ im Vergleich zur Kontrolle nach 48 Stunden, aufgrund von verminderter Einzelfaserlänge und einem niedrigeren
Verzweigungsgrad pro Nervenfaser.
Die neurotrophe Keratopathie ist eine degenerative Hornhauterkrankung, die aus einer verminderten Innervation der Kornea durch Schädigung der Hornhautnerven resultiert.
In der Folge kann es zu Augenoberflächenstörungen, Ulzera und Perforation mit konsekutiver Erblindung kommen. Das Spektrum der zur Zeit zur Verfügung stehenden
Behandlungsmöglichkeiten ist begrenzt.
Ziel dieses Projektes ist es,
neue Substanzen
aufzudecken, welche die Regeneration der Nerven verbessern und die Innervation der Kornea wiederherstellen können. In dieser Studie wurden die Effekte des STAT3-Inhibitors SH545 und des Rho Kinase Inhibitors Y27632 auf die korneale Nervenregeneration in einem 2D in vitro Modell untersucht.
Als Modell des kornealen sensorischen Nervenplexus wurden frisch präparierte murine dorsale
Hinterwurzelganglienzellen
(DRG) verwendet. Mittels einer Vitalitätsfärbung (Trypan Blau
Färbung) wurden die
eingesetzten Konzentrationen der Substanzen auf mögliche toxische Effekte auf die Neurone untersucht. Der Einfluss der Substanzen Rho Kinase Inhibitor Y27632 und STAT3-Inhibitor SH545 auf das Auswachsen der Nervenfasern wurde mittels
Scratch Assay und Single Neuron Assay untersucht. Für den Scratch Assay wurden 7500 Zellen/well auf Poly-D/Laminin beschichtete 48-well Platten ausgesät. Nach 48 Stunden
wurden die bereits
ausgewachsenen Nervenfasern gescratcht und die Inhibitoren hinzugegeben. Die Nervenfasern, die in den Scratch eingewachsen sind, wurden nach 0, 24 und 48 Stunden dokumentiert und mit der Software NeuronJ ausgewertet.
Für den Single Neuron Assay wurden vereinzelte Neurone
ausgesät und die Inhibitoren nach 24 Stunden hinzugegeben. Die ausgewachsenen Nervenfasern wurden nach 0, 24 und 48 Stunden dokumentiert und ausgewertet. Anhand von sieben konzentrischen Kreisen wurden die Schnittpunkte („Crossings“) der Nervenfasern mit diesen Kreisen innerhalb eines Durchmessers von 200µm ausgezählt.
A
Enzymatische Zelldissoziation DRG Präparation
vereinzelte Zellen präparierte
DRGs DRGs
Substanz-Zugabe
Single Neuron Assay Scratch Assay Trypan Blau Assay
Versuchsaufbau
1
2
C D
C
**
**
Interessenkonflikt: 1.nein 2.nein 3.nein 4.nein 5.nein gefördert durch das DOG-Doktorandenstipendium 2017
